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Cronobacter sakazakii

Javier Castro Rosas, Carlos Alberto Gómez Aldapa, Esmeralda Rangel Vargas

Centro de Investigaciones Químicas. Instituto de Ciencias Básicas e Ingeniería, Universidad Autónoma

del Estado de Hidalgo, Centro Universitario, Carretera Pachuca-Tulancingo Km. 4.5. Mineral de la

Reforma, Hgo., C.P. 42183. México.

Introducción

Cronobacter sakazakii (anteriormente Enterobacter sakazakii) es un patógeno oportunista emergente que

puede causar meningitis, encefalitis, septicemia y enterocolitis necrosante en infantes. Aunque también se

han reportado casos en niños mayores, en adolecentes y en adultos. La infección por este microorganismo

es poco frecuente, no obstante, su tasa de mortalidad es elevada (40–80%) y puede comportar graves

secuelas neurológicas como retraso del desarrollo neuronal, tetraplejia o hidrocefalia en los individuos

sobrevivientes.

Este patógeno recientemente se ha convertido en un microorganismo de preocupación para la industria de

alimentos, los gobiernos y para la comunidad científica. De hecho, la mayor información sobre éste

microorganismo (por ejemplo, clasificación, patogenia, identificación, perfil genético, ecología,

epidemiología, etc.) se ha generado en los últimos 10 años. Los primeros casos registrados de la

enfermedad en infantes se produjeron en 1958 en Europa y los Estados Unidos de Norte América. En

muchos casos, particularmente aquellos reportados hasta mediados de 1980, la fuente de la infección era

desconocida, no obstante, en los últimos años las fórmulas en polvo de leche infantil han sido

identificadas como la fuente principal del microorganismo en las infecciones clínicas. La contaminación

de éstas formulas lácteas por C. sakazakii puede tener lugar durante el proceso de fabricación en el

momento de la adición de micronutrientes posterior a la pasteurización ó bien en los hogares u hospitales

al momento de la hidratación o preparación de la formula láctea.

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Aunque actualmente la mayor información que se ha publicado sobre éste patógeno es usando el nombre

E. sakazakii, debido a la reciente inclusión del patógeno en el nuevo género Cronobacter, en la mayor

parte de este capítulo se empleará el nombre C. sakazakii para referirse al patógeno.

Descripción del microorganismo

C. sakazakii es un bacilo gram-negativo, no esporulado, móvil y pertenece a la familia

Enterobacteriaceae. Inicialmente, éste microorganismos se clasificó como una cepa de E. cloacae

distinguible de otros miembros de la especie por la producción de un pigmento amarillo. En 1980 fue re-

nombrado como E. sakazakii en honor del científico japonés Riichi Sakazaki. Recientes estudios

taxonómicos llevaron a la clasificación alternativa de E. sakazakii en varia especies y un nuevo género:

Cronobacter (Iversen y col., 2007a).

C. sakazakii tiene capacidad para crecer entre 6 ° y 47 °C. Al igual que como muchas especies, su

resistencia al calor varía entre las cepas. Lo que explica el porqué algunos investigadores lo describen

como un microorganismos sensibilidad al calor (como otras enterobacterias), mientras que otros

investigadores han reportado una resistencia ligeramente superior que el de las enterobacterias. Por otro

lado, C. sakazakii parece ser relativamente más resistentes al estrés provocado por una baja activad

acuosas, que otras enterobacterias, lo que puede ser un factor importante en su transmisión. C. sakazakii se

considera un microorganismo ubicuo: se ha aislado de una gran variedad de fuentes tales como alimentos,

agua, leche materna almacenada en un banco de leche, viviendas, hospitales, entre muchos otros

materiales.

Dentro de las enterobacterias, las especies de Enterobacter representan un grupo extenso y heterogéneo;

se han descrito 14 especies reconocidas taxonómicamente (Kämpfer y col., 2005). Entre ellas, las especies

cloacae, sakazakii y gergoviae son las más significativas a nivel clínico como causa de las infecciones

nosocomiales en el humano. E. cloacae es el miembro del género que se aísla con mayor frecuencia en los

hospitales, por lo que se ha convertido en un importante patógeno nosocomial (Hoffmann y Roggenkamp,

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2003). Ésta especie está claramente asociada con enfermedad pulmonar, invasión al torrente sanguíneo, y

otras infecciones extra-intestinales en el humano. E. cloacae muestra una gran heterogeneidad genética,

con 12 grupos definidos a partir de árboles filogenéticos basados en tres genes diferentes y siete nuevas

especies que ahora están individualizados dentro del grupo “cloacae” A parte de la especie cloacae, E.

gergoviae es una especie frecuente también en los hospitales que puede causar infección de vías urinarias

y pulmonares (Brenner y col., 1980). Esta especie también ha sido recientemente descrita como causa de

un brote nosocomial en una unidad de cuidados intensivos neonatales (Ganeswire y col., 2003).

Por último, E. sakazakii, anteriormente incluido en la especie cloacae, fue descrito como una nueva

especie en 1980 (Farmer y col., 1980). E. sakazakii presenta un comportamiento bioquímico muy similar

al de E. cloacae, pero se distinguen sobre la base de las diferencias en la relación del ADN, la producción

de pigmentos, algunos caracteres bioquímicos y la sensibilidad a antibióticos. Se cree que los primeros

casos reportados de meningitis neonatal en 1958 fueron causados por E. sakazakii (Urmenyi y Franklin,

1961). Se ha demostrado una clara correlación epidemiológica entre E. sakazakii aisladas de pacientes y

las fórmulas lácteas para infantes (Clark y col., 1990). Esta especie está considerada como un patógeno

oportunista implicado en las enfermedades transmitidas por los alimentos, causando enterocolitis

necrozante y, sobre todo, la sepsis neonatal y meningitis (FAO ⁄WHO, 2004).

Iversen y col. (2004a; 2007a; 2008), después de efectuar una serie de estudios genéticos propusieron un

nuevo género llamado Cronobacter en el que se incluyó a E. sakazakii. Originalmente se integraron en

este género a seis especies (sakazakii, malonaticus, turicensis, muytjensii, dublinensis y genomospecies 1)

se clasificaron en 16 biogroups. Una nueva especie (C. condimenti) fue identificada recientemente por

Joseph y col., (2011), y además, C. universalis ahora sustituye a la original genomospecies C. 1.

Esta nueva clasificación propuesta por Iversen y col. (2007a, 2008), fue apoyada posteriormente por otros

investigadores tras realizar estudios de mapeo genético d de varias cepas de Cronobacter (Kotewicz y

Tall 2009; Kucerova y col., 2010). Aunque C. sakazakii y C. malonaticus están estrechamente

relacionados y son difíciles de distinguir por análisis de secuenciación del rADN 16S, no obstante, pueden

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diferenciarse por un análisis de la secuencia de 7 loci (TPAT, Fusa, GLNs, gltB, gyrB, INFB, PPSA) del

multilocus (Baldwin y col., 2009). Joseph y Forsythe (2011), identificaron una secuencia altamente estable

(indicada como ST4) dentro de C. sakazakii y que fue responsable de una gran cantidad de infecciones

neonatales graves, especialmente meningitis neonatal. Otro método de clasificación de Cronobacter es por

serotipificación del antígeno-O mediante el cual de describen la naturaleza del antígeno-O (Mullane y col.,

2008a; Jarvis y col., 2011). El antígeno O es un componente de los lipopolisacáridos (LPS) y es una

estructura situada en la superficie externa de las bacterias gram negativas y es responsable de la diversidad

serológica. Mullane y col. (2008a), inicialmente desarrollaron un método serotipificación molecular, sobre

la base de largo alcance amplificación del locus rfb (en bacterias Gram-negativas entéricas éste está

situado entre galF-gnd) seguido por la digestión MboII. Usando este enfoque, se generó un perfil de PCR-

RFLP (reacción en cadena de la polimerasa- Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción

específico). Basándose en procedimiento, se clasificaron los primeros dos serotipos denotados como O:1 y

O:2. Más recientemente, otros cinco antígenos O adicionales fueron identificados serológicamente por

Sun y col. (2011), y estos correlacionaron con los perfiles PCR-RFLP. Jarvis y col. (2011), extendió el

esquema original de caracterización molecular para incluir otras especies de Cronobacter y definir un

nuevo serotipo-O de grupo de genes.

Las pruebas útiles para la diferenciación de las especies de Enterobacter incluyen la fermentación adonitol

y sorbitol, así como el crecimiento de KCN, arginina dihidrolasa, lisina y ornitina descarboxilasa (Tabla

1). Las cepas de E. cloacae son arginina, ornitina, KCN, y el sorbitol son positivos, pero lisina

descarboxilasa negativa (Tabla 2). La mayoría de las cepas aisladas son también adonitol negativo.

Tabla 1. Características bioquímicas de Citrobacter, Pantoea, Kluyvera y Enterobacter

Carcterísticas Citrobater Pantoea Kluyvera Enterobacter Citrato de simmons + V + + LDC - - V V ODC V - + + VP - + - + Fermentación del D-Sorbitol + v + V

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Resistencia a cefalotina + + Símbolos: -, <10% de las cepas positivas; +, > 80% de las cepas positivas; v, entre el 10 al 79% de las cepas positivas.

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Tabla 2. Diferenciación bioquímica de las especies de Enterobactera . Reacciones por especieb.

Prueba cloacae subsp. cloacae

cloacae subsp. dissolvens

asburiae

kobei

ludwigii hormaechei Subsp. hormaechei

cancerogenus nimipressuralis gergoviae sakazakii

Pigmentación amarilla ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ + ADH + + + + + + + + ─ + LDC ─ ─ ─ ─ d ─ ─ ─ + ─ ODC + + + + + + + + + + Desarrollo en KCN ─ d d D d + + + ─ + Prueba de VP + + d +c d + + + + + Hidrólisis de esculina ─ + + ─ (d) ─ + + + + Prueba de la ADNsa ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ (+) Fermentación de adonitol d ─ ─ ND ND ─ ─ ─ ─ ─ Fermentación de lactosa ─ ─ d + ND (+) (+) + d + Fermentación de D-sorbitol + + + + ND ─ ─ + ─ ─ d Utilización de D-arabinosa + + + + + + + ─ ND ND Utilización de dulcitol ─ ─ ─ d ─ + ─ ─ ─ d Utilización de lactulosa ─ ─ d d d d ─ ─ (+) + Utilización de malonato ─ (d) ─ (d) (d) + (d) ─ d (d) Utilización de melobiosa + + d + + ─ ─ + + + Utilización de fenilacetato (+) + (+) (d) + + + + + ─ Utilización de me-gluco-piranosa ─ ─ ─ ─ + ─ + ─ ─ ─ Utilización de L-ramnosa + + D + + + + + + + Utilización de D-sorbitol + + (+) + + ─ + + ─ ─ Utilización de sacarosa + + + + + + ─ ─ + d Utilización de xilitol ─ ─ ─ + ─ ─ ─ ─ ─ ─

a Tomados de Dickey y Zumoff (1988); O’Hara y col. (1989); Schonheyder y col. (1994); Brenner y Farmer (2005); y Hoffmann y col. (2005b, 2005c). b Simbolos: +, positivo para el 90 a 100% de las cepas; ─, negativo para el 90 a 100% de las cepas; d, positivo o negativo ;( ),después de 7 días; ND, no determinado.

c inicialmente descrito como VP negativo en Kosako y col. (1996).

d algunas cepas fermentan el d-sorbitol tal como se reportó en Gurtler y col. (2005).

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E. asburiae se diferencia de E. cloacae por ser esculina positiva, Voges-Proskauer (V-P), malonato,

melibiosa y l-ramnosa negativa, y posiblemente por su utilización de la lactulosa, melibiosa, y L-ramnosa.

E. cancerogenusis en un bacilo que fermenta la lactosa y se diferencia de E. cloacaeby por crecer en KCN

y ser esculina positivo. E. cloacae subsp. dissolvensis es fenotípicamente indistinguibles de E. cloacae,

excepto por los resultados de la prueba de esculina: positivo para E. dissolvens y negativo para E. cloacae

(Hoffmann y col., 2005b). E. gergoviae difiere de E. cloacae por ser negativa para adonitol, arginina,

KCN, y el sorbitol, mientras que E. hormaechei difiere de E. cloacae por ser d-sorbitol, melibiosa y

esculina negativa y dulcitol y malonato positivo. E. kobei tiene las mismas características bioquímicas que

E. cloacae la única diferencia que se describe es que E. kobei en varios estudios fue negativo en la prueba

de V-P (Kosako y col., 1996). Sin embargo, recientes estudios reportan aislamiento de cepas de E. kobei

VP positivas (Hoffmann y col., 2005b). Después de analizar 120 pruebas bioquímicas incluidas en el API

20E y el sistema Biotipo100 (BioMerieux Inc., Marcy l'Etoile, Francia), 4 pruebas bioquímicas (el

crecimiento de xilitol, dulcita, y fenil acetato, pero no en la lactulosa) se identificaron como

potencialmente para diferenciar este nuevo biotipo de E. cloacae. E. ludwigii difiere de E. cloacae por la

posibilidad de tener una lisina descarboxilasa, por hidrólisis de esculina, y por el crecimiento de KCN.

También difiere de las otras especies de Enterobacter por el uso de 3-O-metil-D-glucopiranosa. E.

nimipressuralis difiere de E. cloacae por ser sacarosa y d-arabinosa negativa.

C. sakazakii da reacciones bioquímicas muy similares a las de E. cloacae, pero es negativa a d-sorbitol, y

la mayoría de las cepas producen colonias con pigmentación amarilla. No obstante, existen cepas de C.

sakazakii sorbitol positivas así como no productoras de pigmentos, lo que ha contribuido a una

identificación incorrecta de E. cloacae (Iversen y Forsythe, 2004; Iversen y col., 2004b). Además C.

sakazakii a diferencia de E. cloacae, es arginina, ornitina y KCN positivo y da una reacción lenta de

ADNsa (entre 2 -7 días). La actividad de la tween 80 esterasa y glucosidasa, a demás de la falta de la

actividad de la fosfoamidasa también apoyan en diferenciar a C. sakazakii de otras especies de

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Enterobacter (Nazarowec-White y Farber, 1997c). Se ha construido una red neuronal artificial para

distinguir C. sakazakii de organismos semejantes o relacionados (Iversen y col., 2006a; 2006b).

Hábitat

El hábitat natural de C. sakazakii es actualmente desconocido. Sin embrago, sobre la base de algunas de

las funciones fisiológicas del organismo, lo más probable es que pueda tener un nicho en los vegetales

(Iversen y col., 2004b).

Incidencia y Reservorios

Debido a los brotes de enfermedad producida en infantes a C. sakazakii se le asocia frecuentemente con

fórmulas en polvo para lactantes o infantes. Sin embargo, C. sakazakii se encuentra ampliamente

distribuido en el ambiente y en los alimentos, siendo las fuentes de contaminación más probables el agua,

el suelo, y los vegetales. Gassem (1999), aisló C. sakazakii de pan Khamir el cual es a base de semilla de

sorgo. El patógeno también se ha aislado de semillas de arroz, lechuga, germinado de alfalfa y tomates. A

partir de diferentes hierbas y especias también se ha aislado a C. sakazakii (Iversen y Forsythe, 2004). C.

sakazakii se ha aislado además de agua, sedimentos y suelo (Muytjens Kollee, 1990). C. sakazakii también

se ha aislado de diferentes animales como por ejemplo, ratas (Gakuya y col., 2001) y moscas de la fruta

(Kuzina y col., 2001). Kandhai y col. (2004a), aislaron C. sakazakii de diferentes muestras ambientales,

incluyendo las instalaciones de fabricación de leche en polvo y de productos de limpieza empacados al

vacío. Todas estas evidencias confirman la naturaleza ubicua de este organismo patógeno.

Fuentes y mecanismos de contaminación

Las posibles fuentes y los mecanismos de transmisión de la infecciones por C. sakazakii han sido objeto

de debate. El único vehículo que ha sido epidemiológicamente y microbiológicamente asociada con la

infección es el polvo de las fórmulas para infantes o bien el equipo utilizado para prepararlas (Muytjens y

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col., 1983; Muytjens y col, 1988; Biering y col., 1989; Simmons y col., 1989; Noriega y col., 1990; Van

Acker y col., 2001; Iversen y Forsythe, 2004).

En varios estudios se ha identificado a las fórmula infantil en polvo como fuente de infecciones de C.

sakazakii. Aunque a menudo es difícil de detectar al patógeno en las fórmulas infantiles en polvo debido a

que la contaminación es esporádica o el patógeno se encuentra en baja concentración (Muytjens y col.,

1988).

Sin embargo, no en todos los casos se ha identificado a los preparados en polvo como fuente de

infecciones en los bebés; y algunos niños que se han infectado no fueron alimentados con formulas en

polvo para infantes (Barreira y col., 2003; Stoll y col., 2004). Además, las infecciones por C. sakazakii en

los adultos, indican que las fuentes de infección han sido distintas de aquellas de los preparados en polvo

para lactantes. Algunas fuentes potenciales incluyen la transmisión materna, la transmisión nosocomial, el

ambiente del hogar, alimentos y entornos de fabricación de alimentos y reservorios animales tales como

insectos. Dado que muchos de los casos reportados ocurrieron entre los recién nacidos, la transmisión

vertical se ha sugerido como una potencial fuente de infección. Sin embargo, el mecanismo de

contaminación intestinal y vaginal de las madres al niño durante el nacimiento no se ha reportado, no

obstante que el patógeno se ha aislado de la descarga vaginal de mujeres no embarazadas con vaginitis

(Ongradi, 2002). Se ha reportado además infección por el patógeno en por lo menos seis niños que

nacieron por cesárea (Urmenyi y Franklin, 1961; Muytjens y col., 1983; Bar-Oz y col., 2001; Himelright y

col., 2002). Por último, las infecciones en los lactantes durante los primeros 3 días de vida son raras;

además, las infecciones se han observado en los lactantes más allá del período neonatal (Simmons y col,

1989.). En consecuencia, la transmisión vertical, por lo tanto, es poco probable que sea un mecanismo de

infección (Monroe y Tift, 1979; Adamson y Rogers, 1981; Muytjens y Kollee, 1990).

Se han propuesto también fuentes de infección de origen nosocomial, sin embargo, la información

epidemiológica sólo ha implicado a los utensilios o equipo usado para preparar la fórmula. Durante los

brotes de la enfermedad, se han recolectado muestras de superficies de diferentes materiales y equipos de

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distintas áreas los hospitales, tales como superficies de la enfermería y unidad de cuidados intensivos de

neonatales (UCIN), áreas de preparación de la fórmulas, fluidos médicos (Biering y col.,1989),

incubadoras (Arseni y col., 1987), el agua utilizada para preparar fórmulas (Van Acker y col., 2001; Block

y col., 2002), manos y muestras rectales del personal de enfermería (Biering y col., 1989; Van Acker y

col., 2001; Block y col., 2002), no obstante, en ninguno de ellos se aisló C. sakazakii. Además, durante

un estudio realizado por la CDC (2002), el uso del ventilador, el uso incubadora humidificada y los

medicamentos orales no resultaron significativamente asociado con la enfermedad o la colonización por

C. sakazakii (Himelright y col., 2002). Tampoco se han reportado evidencias de que ocurra transmisión

del patógeno de un paciente a otro, ya sea directa o indirecta (Simmons y col., 1989; Van Acker y col.,

2001; Himelright y col., 2002).

A diferencia de los hospitales, C. sakazakii se ha aislado de diferentes materiales no hospitalarios:

alimentos deshidratados para lactantes, leche en polvo, quesos, hierbas y especias, proteína de soya, arroz,

maíz molido, carne picada, chorizo y verduras (Leclercq y col., 2002; Iversen y Forsythe, 2003; Iversen y

Forsythe, 2004). Kandhai y col. (2004), reportaron aislamiento del patógeno en el 23% de las casas y

fabricas de alimentos analizados. C. sakazakii también ha sido recuperado del intestino medio de la mosca

de los establos, Stomoxys calcitrans, que tiene una distribución mundial y se asocia típicamente con

animales de granja (Hamilton y col., 2003).

Aunque la contaminación de los preparados en polvo para infantes durante el proceso de fabricación se ha

consolidado como una fuente de infección en los recién nacidos, la relación entre otras fuentes C.

sakazakii identificadas y la enfermedad humana no está clara.

A diferencia de los alimentos para infantes listos para el consumo (estériles), las fórmulas lácteas en

polvos no son estériles, por lo que existe la posibilidad que estos productos estén contaminados con C.

sakazakii. Se tienen evidencias que sugieren la posibilidad de que desde la primera vez que fueron

lanzadas al mercado las formulas lácteas ya presentaran contaminación por este patógeno (Thornley,

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1960; Urmenyi y Franklin, 1961). Por lo que es probable que C. sakazakii ha estado presente en los

productos lácteos en polvo desde hace varias décadas.

Se han reconocido tres mecanismos generales de contaminación a través de los cuales puede llegar C.

sakazakii a las formulas en polvo para infantes:

1. Durante el procesamiento, ya sea por ingredientes contaminados con el patógeno que son

incorporados a la mezcla después de que esta ha sido secada o pasteurizada o bien por

contaminación por cualquier material interno de la fábrica y que tiene contacto con el producto

antes del empacado.

2. Por contaminación durante la hidratación del polvo ya sea por contaminación directa o cruzada

(por ejemplo, por el agua, utensilios, manipulador, etc.)

Factores extrínsecos e intrínsecos

C. sakazakii muestra un perfil de resistencia/sensibilidad al efecto de los factores extrínsecos e intrínsecos

semejante al de muchas enterobacterias. Este patógeno puede crecer a concentraciones de 1M de NaCl a

temperatura ambiente. A 45 °C todavía muestra un buen crecimiento a 0.5 M de NaCl (Guillaume-Gentil

y col., 2005). Esta característica de desarrollo se utiliza en un medio de enriquecimiento selectivo, ya que

la flora competitiva más importante, como Citrobacter spp., Serratia spp. Pantoea agglomerans,

Escherichia vulneris y otros, en general no pueden crecer bien en estas condiciones. En general, se ha

demostrado que C. sakazakii puede crecer entre aproximadamente 5.5 y 47 °C, y el tiempo de generación

en medios enriquecidos, como caldo de infusión cerebro-corazón y los preparados para lactantes a 37° C

es de alrededor de 20 minutos (Nazarowec White y Farber, 1997a; Breeuwer y col., 2003; Iversen y col.,

2004a; Kandhai y col., 2006). C. sakazakii puede tener una fase de latencia relativamente corta

(aproximadamente 1.7 h) en fórmulas infantiles a temperatura óptima de crecimiento.

La importancia de las características de crecimiento de este patógeno fue rápidamente reconocido por

instituciones como la Sociedad Europea de Gastroenterología Hepatología Pediátrica y Nutrición, la

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agencia de estandarización de alimentos del Reino Unido, la administración de alimentos y medicamentos

de los Estados Unidos de Norteamérica, y la Organización Mundial de la Salud. Estas organizaciones

hicieron recomendaciones específicas para evitar el crecimiento del patógeno después de la hidratación de

la formula láctea en polvo de tal manera que si es posible, debe ser recién preparada para cada toma

(Agostoni y col., 2004; FAO/WHO, 2004; 2007). El enfriamiento después de la hidratación del la formula

es una medida adecuada para limitar el crecimiento de C. sakazakii. No obstante, se debe procurar que el

enfriamiento se la formula hidratada se realice adecuadamente (en 1 h). Además, el almacenamiento de

volúmenes grandes de la formula rehidratada aumenta considerablemente el tiempo necesario para

alcanzar la temperatura de enfriamiento por lo que se aumenta el riesgo de crecimiento de C. sakazakii. Se

ha reportado además que C. sakazakii puede sobrevivir sobre placas de agar a 4 °C por lo menos 140 días

(Lehner, 2005) y en caldo de cultivo a la misma temperatura por lo menos 210 días. La resistencia al calor

de C. sakazakii ha sido estudiado por varios investigadores (Nazarowec-White y Farber, 1997b; Breeuwer

y col., 2003; EdelsonMammel y Buchanan, 2004; Iversen y col., 2004a). No obstante se ha observado que

la resistencia al calor entre las diferentes cepas de C. sakazakii es muy diversa y que al parecer existe un

subgrupo con mayor termotolerancia (valor medio de D a 58 º C de 9.9min) que la mayoría de las

enterobacterias (Edelson-Mammel y Buchanan, 2004). Al parecer las cepas de este subgrupo

termotolerante producen una proteína homóloga a una proteína que produce la bacteria termotolerante

Methylobacillus flagellatus (Williams y col., 2005). No obstante, no se ha confirmado si esta proteína

participa en la resistencia al calor que exhibe el subgrupo termotolerante de C. sakazakii. Cabe señalar, sin

embargo, que una pasteurización estándar (72°C / 15 s) puede provocar una reducción de más de 8 log de

incluso las cepas más termotolerantes de este patógeno. Del mismo modo, con un tratamiento de 68 °C /16

s se puede lograr una reducción de 5 log (Nazarowec White y col., 1999). Con base en esta información, la

Organización Mundial de la Salud llegó a la conclusión de que la inactivación de C. sakazakii puede

lograrse en corto tiempo a temperaturas superiores a 70 °C, por lo que propuso este tratamiento térmico

como una estrategia para reducir el riesgo de C. sakazakii en la fórmula reconstituida para infantes

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(FAO/WHO, 2004,2006). No obstante, es importante considerar que estos tratamientos térmicos son para

su aplicación en los hogares, hospitales, guarderías y todos aquellos en donde se ofrezcan cuidados a

infantes, por lo que se deben instruir de forma adecuada a todos éste personal involucrado tanto para

lograr la temperatura deseada como para evitar accidentes (como quemaduras de la madre y los bebés) por

manejo inadecuado de los productos calientes.

Con respecto a la producción de las formulas en polvos para lactantes a nivel industrial, las evidencias

científicas demuestran C. sakazakii no sobrevive a las etapas primarias del procesamiento, incluyendo la

pasteurización. En consecuencia, los esfuerzos deberán centrarse en evitar la contaminación después de la

pasteurización, ya sea a través del ambiente de la fábrica o de los ingredientes que son incorporados a la

mezcla en seco después de la pasteurización. Existe limitada información publicada sobre la resistencia de

C. sakazakii a la acidez. No obstante, algunos estudios muestran que el pH mínimo de crecimiento del

patógenos en caldo soya tripticaseina a 30 °C fue de alrededor de 3.9. Sin embargo, a este pH, el tiempo

de detección de crecimiento fue muy largo (5 días para llegar a una densidad óptica a 600 nm de 0.2 a

partir de un nivel de inoculación de 105 UFC/ml). A un pH de 4.3 el tiempo de detección fue de

aproximadamente 20 horas. Sin embargo, en cereal de arroz reconstituido con jugo de manzana a un pH

de 4.3 a 30 °C no se detectó crecimiento de C. sakazakii dentro de 72 h de almacenamiento (Richards y

col., 2005). Esto se debe probablemente a la presencia agentes antimicrobianos en la mezcla de cereal

reconstituido, por ejemplo, ácido málico. En la práctica, la acidificación es un concepto bien probado para

limitar el crecimiento de patógenos entéricos. Esto se ilustra en un estudio sobre el comportamiento de

bacterias patógenas, incluida la C. sakazakii, en fórmulas infantiles liquidas que muestra que la

acidificación de las formulas mediante la adición de ácido láctico (o por fermentación) a un pH inferior a

5 inhibe el desarrollo de los patógenos (Joosten y Lardeau, 2004). Una de las particularidades de C.

sakazakii es la expresión constitutiva de su gen α-glucosidasa. De hecho, esta característica es utilizada

para la identificación de C. sakazakii. Al parecer, la función de la enzima α-glucosidasa es la hidrolisis de

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la maltosa en glucosa. Sin embargo, la relevancia de esta enzima en el metabolismo de C. sakazakii y el

porqué es expresada constitutivamente esta enzima, no se han investigado.

Características de la enfermedad

Aunque C. sakazakii es mejor conocido como causa de una infección potencialmente mortal para los

recién nacidos (Himelright y col., 2002), puede provocar una variedad de infecciones en muchos grupos

de edad. Dentro de los padecimientos que provoca C. sakazakii se incluyen meningitis, bacteriemia,

infecciones del tracto urinario e infecciones de heridas. No obstante, C. sakazakii también ha sido

asociado con cuadros de neumonía, conjuntivitis, apendicitis vaginitis y enterocolitis necrozante en

lactantes prematuros. De todos estos padecimientos, la infección del sistema nervioso central (SNC) es la

mejor descrita. En un niño de 20 meses de edad se detectó un absceso cerebral debido a la infección del

patógeno (Tekkok y col., 1996). En otros infantes con infecciones del SNC se manifestaron cuadros de

meningitis, con o sin encefalitis. Es impórtate mencionar que aproximadamente la mitad de los niños

afectados fueron prematuros y tuvieron bajo peso al nacer. Los bebes afectados desarrollan signos típicos

de sepsis, incluyendo irritabilidad o letargo, inestabilidad de la temperatura e intolerancia a la

alimentación, generalmente durante la primera semana de vida. Pueden presentarse también convulsiones

y ocasionalmente estas son intratables. Otras complicaciones incluyen ventriculitis y absceso cerebral que

puede ser difícil de distinguir clínica y radiográficamente de quistes cerebrales y puede presentarse

hidrocefalia (Kleiman y col., 1981; Kline, 1988; Willis y Robinson, 1988; Gallagher y Ball, 1991;

Burdette y Santos, 2000). La meningitis a menudo desencadena rápidamente en hemorragia cerebral,

infarto, necrosis, licuefacción y finalmente la cavitación y la formación de quistes o accesos cerebrales.

(Bowen y Braden, 2006). Se ha reportado que entre los niños con meningitis por C. sakazakii el 42%

murió y de los sobrevivientes, el 74% mostró resultados neurológicos adversos tales como retrasos en el

desarrollo (Bowen y Braden, 2006).

15

La bacteriemia por C. sakazakii se ha presentado en todos los grupos de edad y se presenta con síntomas

típicos de infecciones del torrente sanguíneo producido por bacterias gram-negativas, especialmente la

inestabilidad de temperatura o fiebre, alteración del estado mental e hipotensión. También se puede

presentar bacteriemia sin meningitis (Bowen y Braden, 2006).

En adultos el patógenos ha afectado a personas con tratamientos quirúrgicos, algunos de los cuales

fallecieron a pesar del tratamiento con agentes antimicrobianos apropiados (Lai, 2001). Los pacientes

adultos que han sobrevivido a la infección por este patógeno han cursado diferentes padecimientos

secundarios como urosepsis secundaria por retención urinaria o sepsis (Jimenez y Gimenez, 1982;

Hawkins y col., 1991). Se ha reportado también que el patógeno ha provocado osteomielitis en un

adolecente después de que sufrió una lesión traumática del pie (Murray y col., 1990). El patógenos

también ha afectado a personas con padecimientos crónicos degenerativos como la diabetes

produciéndoles diferentes trastornos (Pribyl y col., 1985; Dennison y Morris, 2002).

Se han reportado infecciones por este patógeno en heridas de adolescentes y adultos; o infecciones de la

ingle y lesiones en los dedos en adultos jóvenes sanos (Reina y col., 1989). El estado de portadores

asintomáticos también se ha reportado (Biering y col., 1989; Bar-Oz y col., 2001; Himelright y col., 2002;

Loc-Carillo y col., 2006).

Debido a que la ruta de exposición es generalmente poco entendida en el momento de la infección, el

período de incubación es desconocido. Sin embargo, en brotes asociados con fórmulas infantiles en polvo,

la enfermedad comenzó después de 3 o 4 días de la exposición inicial con el producto preparado

(Simmons y col., 1989; Van Acker y col., 2001). Se ha reportado que el patógeno puede sobrevivir de 8 a

18 semanas en muestras rectales incluso después del tratamiento con cefotaxima (Arseni y col., 1987; Bar-

Oz y col., 2001).

Epidemiología

16

La epidemiología de C. sakazakii es poco entendida ya que la infección es poco frecuente y no es una

padecimiento que se reporte en la mayoría de los países. Sin embargo, la incidencia parece diferir según el

grupo demográfico y estado de salud subyacente, siendo los niños y personas inmunodeprimidas las que

están en mayor riesgo de infección. No obstante, se han reportado pocos casos de enfermedad en personas

mayores a los infantes.

Aunque C. sakazakii es mejor conocido como causa de infección potencialmente mortal para los recién

nacidos (Himelright y col., 2002), puede conducir a una variedad de infecciones en muchos grupos de

edad. Sin embargo, la incidencia parece diferir según el grupo demográfico y estado de salud subyacente;

además los niños y personas inmunodeprimidas parecen ser las más susceptibles. Se han reportado por lo

menos 47 casos de infecciones invasivas (sangre, sistema nervioso central [SNC], o infecciones del tracto

urinario) y 31 casos no-invasivas en recién nacidos (Urmenyi y Franklin, 1961; Joker y col., 1965;

Monroe y Tift, 1979; Adamson y Rogers, 1981; Jiménez y Giménez, 1982; Muytjens y col., 1983; Arseni

y col., 1987; Biering y col., 1989; Reina y col., 1989; Simmons y col., 1989;. Clark y col., 1990; Noriega

y col., 1990; Gallagher y Ball, 1991; Nazarowec-White y Farber, 1997; Bar-Oz y col., 2001; Van Acker y

col., 2001; Himelright y col., 2002; Block y col., 2002; Barreira y col., 2003; Stoll y col., 2004) sólo se

han reportado 8 casos para niños mayores (Arseni y col., 1987; Reina y col., 1989; Murray y col., 1990;

Lai, 2001) y 11 casos en adultos (Jiménez y Giménez, 1982; Pribyl y col., 1985; Reina y col., 1989;

Hawkins y col., 1991; Lai, 2001; Dennison y Morris, 2002; Ongradi, 2002). Países como Israel, Brasil,

Nueva Zelanda, 11 países Europeos, una provincia canadiense, y los Estados Unidos de Norte América

han notificado casos entre 1958 y 2005. No obstante, es posible que la incidencia de infección invasiva en

recién nacidos actualmente pueda estar aumentando según la opinión de diferentes expertos. Sin embargo,

las tendencias aparentes geográficas y temporales en la infección por C. sakazakii puede reflejar

diferencias en materia de vigilancia y presentación de informes de los países y los cambios en la vigilancia

en el tiempo en lugar de las tendencias reales.

17

Sin embargo, en general, las infecciones por C. sakazakii son raras y muchas veces no se notifican,

especialmente en los países en desarrollo (Estuningsih y Sani, 2008; Friedemann 2009). Por lo tanto, la

epidemiología de C. sakazakii es incierta y con frecuencia se describe de manera deficiente. Bowen y

Braden (2006), intentaron describir por primera vez la epidemiología relacionada con estas infecciones.

Los autores analizaron la información de casos clínicos de 46 infecciones invasivas por C. sakazakii en

niños entre 1961 y 2005. Esta incluyó la información de 12 recién nacidos que presentan bacteremia, 33

con meningitis y 1 con una infección del tracto urinario. Los niños que se presentaron bacteremia tuvieron

mayores pesos al nacer (2454 g) y una edad gestacional de 37 semanas, las infecciones en estos niños

ocurrieron a los 6 días de nacidos la cual fue una edad menor en la que ocurrió la infección en

comparación con los niños que presentan meningitis. Se reportó que los niños con meningitis tuvieron una

tasa de mortalidad alta (42%) y muchos de los sobrevivientes (más del 74 %) sufrieron complicaciones

crónicas neurológicas y de desarrollo (Reij y Zwietering, 2008). Más recientemente, Friedemann (2009),

analizó 120-150 casos confirmados de infecciones neonatales por Cronobacter a partir de datos

publicados entre 2000 y 2008. En este informé se reportó una letalidad global de 67 infecciones invasivas

de 26.9%. Mientras que la letalidad de meningitis, bacteriemia y la enterocolitis necrozante por

Cronobacter se reportó fueron de 41.9% (P <0.0001), <10% y 19.0% (P <0.05), respectivamente.

Curiosamente, este estudio identificó dos factores de riesgo principales: una mayor edad gestacional en los

infantes al momento de nacer, y ser de razas no Europeas.

Muchas de las infecciones en los bebés recién nacidos se transmiten de la madre al niño a través del canal

del parto de la madre; y este mecanismo se ha sugerido para infecciones por Cronobacter (Townsend y

Forsythe 2008; Kandhai 2010), No obstante, hasta el momento no hay evidencias solidad que sustenten

tales señalamientos.

En la mayoría de los casos, tanto la vía de exposición y el período de incubación de la enfermedad en

general son poco conocidos. Dos de los primeros brotes descritos demostraron una clara relación entre el

aislamiento de Cronobacter de pacientes infectados y el aislamiento de cepas Cronobacter a partir de

18

latas cerradas de formulas en polvo para infantes del mismo lote del cual consumieron los pacientes (Clark

y col., 1990; Block y col., 2002). Aunque la fórmula infantil en polvo se considera como una fuente

importante de éste patógeno, no deben descuidarse o descartarse fuentes ambientales o extrínsecas

(Noriega y col., 1990). Se ha informado de que el material vegetal puede ser el hábitat natural de las

especies Cronobacter (Schmid y col., 2009). Por otra parte, los reportes sobre las infecciones de especies

de Cronobacter en los adultos inmunocomprometidos (Gosney y col., 2006; See y col., 2007) siguieren

otras posibles fuentes de contaminación, como el ambiente en el hogar, entre otros. Se estima que la tasa

de incidencia anual entre los niños con peso bajo al nacer (es decir, peso <2500 g; niños <12 meses de

edad) es de 8.7 por 100 000 niños en los Estados Unidos de Norte América (FAO / OMS 2006). Del

mismo modo, en otros estudios se ha calculado una tasa de incidencia de 9.4 por 100 000 entre los

lactantes de muy bajo peso al nacer (es decir, peso <1500 g) (Stoll y col., 2004).

Además, la prevalencia de las infecciones por especies de Cronobacter en los adultos es mayor en los

ancianos que han sufrido accidentes que han afectado su capacidad para tragar (disfagia) y por lo tanto

pueden requerir suplementos de proteína en polvo reconstituidos como parte de su dieta diaria (Gosney y

col., 2006; FAO / OMS 2008).

Es posible que las infecciones por C. sakazakii se conviertan en un problema mundial debido al

envejecimiento de la población y por las tendencias de proporcionar para el consumo de esta población de

la tercera edad fórmulas sintéticas deshidratadas o en polvo.

Mecanismos de patogenicidad

C. sakazakii es un patógeno emergente de origen alimentario que a partir de la década de los 80’s ha

provocado un incrementó en su interés entre la comunidad científica, los profesionales del área de la salud

y de la industria alimentaria. Sin embargo, todavía falta de información sobre su hábitat natural, los

mecanismos de virulencia y patogenicidad, y sobre su dosis mínima infectante para el humano.

19

La patogénesis de la meningitis neonatal por C. sakazakii no ha sido completamente descrita. Un

mecanismos posible es la translocación de la bacteria a través del “plexo corideo” con la posterior

invasión celular del patógeno mediada por la síntesis y liberación diferentes compuestos (por ejemplo,

elastasas, glicopéptidos, endotoxinas, colagenasas y proteasas) que se utiliza para aumentar permeabilidad

de la barrera hematoencefálica, provocando así su acceso a la materia cerebral rica en nutrientes (Iversen y

Forsythe, 2003; Hurrell y col., 2006). Otros autores ha sugerido un mecanismos de patogenicidad de C.

sakazakii similar al tropismo de Citrobacter koseri, aunque no se ha reportado que la infección por C.

koseri implique el plexo chorideo (Willis y Robinson, 1988; Kline, 1988; Burdette y Santos, 2000;

Townsend y col., 2003). Sondheimer y col. (1985), demostraron que los niños de 2 semanas de edad

tienen un pH gástrico más ácido (entre 2,9 a 5,2) que los infantes de 1semana de edad (que van desde pH

4,6 a 5,8), mientras que Dinsmore y col. (1997), y Mehall y col. (2001), demostraron en un modelo

neonatal de conejo que las condiciones menos ácidas en el intestino facilitan la translocación de E.cloacae

desde el intestino hasta los ganglios linfáticos mesentéricos, bazo e intestino ciego. Dado que la mayoría

de las infecciones por C. sakazakii implican recién nacidos, es posible que el bajo nivel de acidez en el

tracto gastrointestinal neonatal juegue un papel importante en la colonización y la translocación de este

microorganismo. Una vez que C. sakazakii invade más allá del tracto gastrointestinal, como los capilares

sanguíneos, es probable que se una a las células endoteliales y entonces de alguna manera cruza a través

de la barrera sangre-cerebro para infectar las meninges y el cerebro.

No obstante, es necesario una mayor investigación al respecto para comprender mejor los mecanismos de

los cuales se vale C. sakazakii para provocar enfermedad o daño, no solo en los infantes o niños sino

también en adultos jóvenes y personas de la tercera edad.

Sobrevivencia

Dentro de los rasgos fisiológicos que le ayudan al microorganismo a sobrevivir en el medio ambiente, se

encuentra la capacidad para producir un pigmento amarillo que protege a la célula contra los rayos UV de

20

la luz solar, formación de una capsula, la formación de fimbrias que le facilitan su adhesión a las

superficies, y su capacidad para resistir la desecación por más de 2 años (Caubilla-Barron y Forsythe,

2007). Esto también puede explicar el porqué el microorganismo se aísla con cierta frecuencia de

productos vegetales, incluyendo cereales, harina de papa, pastas, hierbas y especias. Las características del

patógeno también influyen en su sobrevivencia durante la fabricación fórmula para infantes y en su

presencia en ambientes domésticos.

La sobrevivencia de C. sakazakii en fórmulas lactantes en polvo para infantes y su potencial para

multiplicar en las fórmulas para lactantes son factores críticos en relación con el riesgo de infección de los

bebés. Uno de los indicios de que C. sakazakii es capaz de sobrevivir en entornos con baja actividad de

agua es su frecuente aislamiento de las fórmulas en polvo para lactantes (Muytjens y col, 1988; Iversen y

Forsythe, 2004). Además, C. sakazakii puede sobrevivir por tiempos prolongados en este tipo de fórmulas

contaminadas artificialmente (Edelson-Mammel y col., 2005; Caubilla-Barron y Forsythe, 2006). El

patógenos puede sobrevivir mejor al estrés osmótico y al secado al aire que, Escherichia coli, Salmonella,

y cepas de Citrobacter (Breeuwer y col., 2003). El mecanismo por el cual C. sakazakii sobrevive en

ambientes secos no está claro. Lo más probable es que la trehalosa este participando en la resistencia, ya

que este soluto compatible se pude sintetizar y acumular como respuesta al estrés por desecación

(Breeuwer y col., 2003). Hay por lo menos tres vías para la biosíntesis de la trehalosa, pero la más común

en las bacterias es la vía OtsA-OtsB. Otra hipótesis es que los polisacáridos extracelulares (EPS) juegan

un papel en la resistencia frente al estrés por desecación. C. sakazakii es capaz de producir EPS, como la

celulosa y estructuras similares al ácido colanic (Lehner y col., 2005).

La comprensión de los mecanismos moleculares asociados con las características de las cepas del

patógeno podría ser útil para prevenir su llega a la empresa, eliminarlas o controlarlas. Walsh y col.

(2011), proporcionaron información sobre la variabilidad entre las cepas de este patógeno en cuanto a sus

características de sobrevivencia. Las cepas aisladas del ambiente sobrevivieron mejor en los ingredientes

secos (338 días). A diferencia, las cepas clínicas resultaron ser más termotolerantes que sus contrapartes

21

ambientales. Esta resistencia puede estar vinculada a la producción de polisacáridos extracelulares (EPS).

Walsh y col. (2011), propusieron que la capacidad de producir EPS reduce la termotolerancia. Basándose

en estas observaciones, las cepas clínicas pueden tener pato-adaptación resultando en un fenotipo menos

resistente a la desecación.

Gajdosova y col. (2011), caracterizó una región de 18-Kpb de una colección de cepas de Cronobacter y se

comparó este locus con miembros que pertenecen a otros géneros, tales como Enterobacter, Citrobacter y

Escherichia, se observó correlacionó positivamente entre la presencia de este locus con mayor

termotolerancia. Farmer y col. (1980), observó que muchas de las cepas aisladas tenía originalmente dos

tipos diferentes de colonias denominadas tipos A y B. las colonias tipo A fueron descritas como secas o

mucoides y “gomosas” que formaban una especie de filamento cuando se tocaban con una asa. Las

colonias tipo B fueron descritas como “colonia suaves, que no se adherían al asa”.

Se ha reportado que al igual que otras bacterias, las cepas de Cronobacter recuperadas del ambiente

pueden producir colonias con morfología rugosa (Zogaj y col., 2003). Diversos estudios efectuados con

otros microorganismos entéricos como Salmonella (Anriany y col., 2006), Vibrio cholerae (Ali y col.,

2002) y Grimontia hollisae (antes Vibrio hollisae) (Curtis y col., 2007) han demostrado que las cepas que

expresan el fenotipo rugoso presentan: (i) resistencia a la desecación y agentes antimicrobianos, tales

como el hipoclorito; (ii) una mayor capacidad para formar biopelículas. Se ha reportado que las especies

de Cronobacter pueden sintetizar un exopolisacárido compuesto de celulosa el cual sea relacionado con la

rugosidad de la colonia (Grimm y col., 2008).

La comprensión de la evolución de los fenotipos de Cronobacter a nivel molecular que contribuyen a su

sobrevivencia en el medio ambiente podría facilitar el desarrollo de estrategias para eliminar o controlar la

población persistente de Cronobacter.

Distribución en agua y alimentos

22

El microorganismo ha sido aislado a partir de una amplia gama de productos lácteos (queso, leche

pasteurizada, leche en polvo, y de fórmula en polvo para lactantes) y en productos no lácteos (pan

fermentado, tofu y té amargo), incluida la carne (embutidos, carne picada y carne de salchicha) (Muytjens

y Collee, 1990). C. sakazakii también se ha aislado de formulas lácteas preparadas en diferentes países

(Nazarowec-White y Farber, 1999), lo que muestra la gran dispersión del patógeno en el ambiente y

además que la contaminación de las formulas lácteas por este patógeno es un problema generalizado.

Es importante destacar que hasta el momento no se ha reportado aislamiento de C. sakazakii a niveles

superiores a 1 UFC/g a partir de formulas lácteas en polvo.

Además, el patógenos se ha aislado de utensilios utilizados para la preparación de formulas para lactantes,

de mezcladores y cucharas (Jaspar y col., 1990; Noriega y col., 1990; Bar-Oz y col., 2001; Block y col.,

2002). En un estudio realizado en Alemania, C. sakazakii fue aislado de jarras de cerveza lo que indica

que los procedimientos de lavado de platos ineficientes o antihigiénicos pueden desempeñar un papel

importante en la epidemiología de microorganismos clínicamente relevantes (Schindler y Metz, 1990).

A pesar de la gran lista de alimentos, animales y materiales a partir de los cuales se ha aislado C.

sakazakii, es necesaria más información ya que la frecuencia de la contaminación es desconocida, y por lo

tanto el riesgo de exposición no se puede cuantificar con fiabilidad.

Es necesario mejora de la higiene durante la elaboración de las formulas lácteas en las empresas

productoras así como también implementar o mejorar la practicas de higiene durante preparación o

hidratación y almacenamiento de la fórmula infantil

Métodos para su aislamiento a partir de formulas en polvo

Procedimientos de cultivo.

El primer procedimiento de detección fue desarrollado para especies de Enterobacter y fue descrito por

Muytjens y col. (1988). Con base a este protocolo, la FDA recomendó un procedimiento para aislar y

enumerar C. sakazakii en la fórmula en polvo para lactantes en 2002. En 2006, la Organización

Internacional para la Estandarización (ISO, 2009) y la Federación Internacional de productos lácteos

23

desarrollaron un protocolo de normas técnicas para la detección de especies de Enterobacter a partir de

formulas lácteas conocida como ISO/TS 22964 (Anónimo 2006a, b). Más recientemente, el método de la

FDA se revisó y se incluyó un ensayo de PCR y dos medios de cultivo cromogénicos recientemente

desarrollados para la detección del patógeno (Chen y col., 2009; Chen, 2011). El pre-enriquecimiento de

las muestras de las formulas en polvo a ensayar es un requisito en estos tres protocolos y la duración de

tiempo varía de un período máximo de 18 a 24 h a un período de tiempo mínimo de 6 h, seguido de

enriquecimiento selectivo y aislamiento en medios sólidos selectivos. Las colonias típicas se confirmó

utilizando medios selectiva, pruebas bioquímicas y un ensayo de PCR. En la versión actual del

procedimiento de la FDA hay una etapa de enriquecimiento seguida por una confirmación rápida por un

método molecular. Esta etapa elimina dos días del procedimiento de detección en comparación con el

protocolo original.

Se han desarrollado diferentes medios selectivos para C. sakazakii basados en el marcador de enzima α-

glucosidasa (Iversen y col., 2004b) identificado por Muytjens y col. (1984), y la actividad de la β-

celobiosidasa (Restaino y col., 2006) que está presente en todas las cepas de C. sakazakii, algunos de estos

medios son: Leuschner-Bew agar (Leuscher y Bew, 2004), Druggan Fosythe-Iversen agar (Iversen y col.,

2004b), Kang Oh-agar (Oh y Kang, 2004), agar ESPM (Restaino y col., 2006) y HiCrome Cronobacter

spp. agar (Sigma-Aldrich, Suiza). Además también se pueden emplear los medios tradicionales selectivos

para las bacterias gram-negativas como el agar de bilis y rojo violeta (ABRV), agar MacConkey agar

desoxicolato (Druggan y Iversen, 2009; Forsythe, 2009). Sin embargo, a pesar de la disponibilidad de

medios selectivos, algunos no permitieron el crecimiento de todas las cepas de C. sakazakii (Iversen y

Forsythe, 2007) y crecieron otras especies afines que se encuentra a menudo en el mismos nichos

ecológicos como E. helveticus, E. pulveris y E. turicensis. Por lo tanto, es necesario mejorar los medios

selectivos para el aislamiento e identificación de C. sakazakii. O'Brien y col. (2009), describieron un

procedimiento que consta de un pre-enriquecimiento y un enriquecimiento utilizando un medio

cromogénico. En esta estrategia de detección, según los autores, el caldo específico desarrollado

24

[nombrado como caldo de enriquecimiento Cronobacter (CEB)] reduce a dos días la detección de C.

sakazakii a partir de las formulas en polvo. Mullane y col. (2006), utilizaron una técnica de captura

magnética para mejorar la sensibilidad de detección de C. sakazakii.

Existen diferentes kits comerciales que se han propuesto para la detección del patógeno. Sin embargo, la

precisión y confiabilidad de tales dispositivos han sido cuestionados ya que dan resultados falsos

negativos y falsos positivos (Restaino y col., 2006; Iversen y Forsythe, 2007).

Procedimientos basados en inmunoensayos.

Los procedimientos basados en inmunoensayos permiten detectar bacterias específicas. Los ensayos que

utilizan anticuerpos monoclonales se usan ampliamente en la investigación como herramientas de rápida

detección. Estas herramientas pueden mejorar la sensibilidad y especificidad de la detección de patógenos.

Se han desarrollado diversos kits comerciales basados en la tecnología de enzimas ligadas (ELISA); el

sistema de inmunoensayo diagnóstico VITEK® (denotado como VIDAS®, bio-Merieux Vitek Inc.,

Hazelwood, MO, EE.UU.) se ha utilizado como una plataforma para la detección rápida Salmonella, E.

coli O157: H7, Listeria, Campylobacter jejuni y enterotoxinas de especies de Staphylococcus. El método

VIDAS-Salmonella ha sido validado y certificado por la Asociación Oficial de Químicos Analíticos

(AOAC) como un método aprobado para su uso en alimentos. Actualmente la AOAC se encuentra

evaluando el método VIDAS-Cronobacter.

Procedimientos basados en técnicas moleculares.

Las técnicas moleculares de detección siempre han sido consideradas como instrumentos útiles para la

investigación de patógenos. Por lo general, estos ensayos están diseñados para detectar genes únicos

presentes en el patógeno de interés. Muchos de los procedimientos recientes para la detección de E.

sakazakki se basan en la técnica de PCR en tiempo real (Malorny y Wagner, 2005; Seo y Brackett, 2005;

Drudy y col., 2006; Nair y Venkitanarayanan, 2006; Kothary y col., 2007, Zhou y col., 2008; Stoop y col.,

2009; Yan y col., 2011). Las aplicaciones de estos protocolos basados en la PCR pueden servir de apoyo a

los procedimientos tradicionales de cultivo.

25

Mullane y col. (2007b), han usado electroforesis de campo pulsados (PFGE) para caracterizar y realizar un

seguimiento de C. sakazakii en formulas en polvo. El estudio sirvió de base para el desarrollo de medidas

eficaces tendientes a disminuir la presencia de C. sakazakii en las fabricas productoras de formulas en

polvo para lactantes. Un enfoque similar utilizando el método de subtipificación de segunda generación,

análisis de multilocus número-variable de repetición-tandem (MLVA), se aplicó posteriormente a una

colección de cepas diversas de Cronobacter para clasificarlas por subtipos (Mullane y col., 2008b). Sin

embargo, un protocolo estandarizado PFGE para Cronobacter está en evaluación por una red de

laboratorios con experiencia en análisis de alimentos y se espera contar pronto con este protocolo. Se han

empleado otros diferentes métodos moleculares para la identificación y clasificación de las cepas de

Cronobacter, como por ejemplo, una análisis de secuencias de multilocus (MLAS) basado en los genes

recN, rpoA y thdf fue utilizado en la descripción de la similitud genómica de los genes de cepas de

Cronobacter (Kuhnert y col., 2009). El-Sharoud y col. (2009), usaron un análisis de la secuencia del gen

recN sobre cepas de Cronobacter aisladas de leche en polvo y productos relacionados. Un esquema de

tipificación MLAS similar al reportado por Kuhnert y col. (2009), fue desarrollado por Baldwin y col.

(2009), en el que se empelan siete diferentes genes: atpD, fusA, glnS, gltB, gyrB, infB, ppsA.

Se ha utilizado el análisis conocido como de micro-arreglos para el estudios de Cronobacter (Healy y col.,

2009). Más recientemente, la secuenciación de nueva generación se ha utilizado para el análisis completo

de ocho genomas de Cronobacter para entender mejor la patogenicidad y la evolución del género junto a

la caracterización de los genes de virulencia (Ji, 2011). Si bien este enfoque podría revelar información

genómica especie-especifica, en esencia, este es un método que proporcionará mucho más detalle

necesario para la clasificación de un organismo.

Tratamiento

No hay estudios comparativos que sirvan como guía para seleccionar opciones de tratamiento para las

infecciones por C. sakazakii. Sin embargo, la inferencia a partir de estudios de susceptibilidad

26

antimicrobiana puede ser útil. La descripción original de E.sakazakii como una especie en 1980 incluyó

pruebas de sensibilidad a antibióticos (Farmer y col., 1980). La resistencia antimicrobiana fue poco

frecuente, con sólo una cepa que mostró resistencia a múltiples antibióticos. Sin embargo, las pruebas en

cepas recientemente aisladas han demostrado aumento de la resistencia de C. sakazakii a los

antimicrobianos. Cepas aisladas de casos clínicos y ambientales en tres brotes mostraron resistencia a la

cefazolina o cefalotina, pero fueron susceptibles a la ampicilina, penicilinas de última generación,

cefalosporinas, carbapenems, fluoroquinolonas, aminoglucósidos, tetraciclinas, trimetoprim-

sulfametoxazol y cloranfenicol (Clark y col., 1990; Block y col., 2002). Block y col. (2002), encontraron

que todas las cepas asociadas con un brote producían β-lactamasas. Resultados similares han sido

reportados por otros investigadores a partir de cepas aisladas de hospitales en Canadá (Nazarowec-White

y Farber, 1999). Lai (2001), también ha reportado resistencia de cepas del patógeno a la ampicilina,

cefazolina y con un espectro extendido para penicilinas. Estos datos sugieren que la resistencia

antimicrobiana en C. sakazakii está aumentando en paralelo al incremento similar en la resistencia

observado en otras especies de Enterobacter (Lai, 2001).

Con base en lo anterior podría suponerse que los tratamientos que se aplican para la meningitis aguda o

sepsis (Tunkel y Scheld, 2005), incluyendo combinaciones de ampicilina y gentamicina (en recién

nacidos), ampicilina y una cefalosporina de tercera generación (en infantes), o un carbapenem más

vancomicina (de mayor edad que los infantes), proporcionaría terapia adecuada para infecciones por C.

sakazakii de acuerdo con los datos de susceptibilidad disponibles. En el contexto de una infección grave

por este patógeno se debe de considerar la terapia de combinación con un aminoglucósido o trimetoprim-

sulfametoxazol. No obstante, se deben de realizar pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos a las cepas

de C. sakazakii aisladas de los casos clínicos como apoyo para guiar la terapia. Hay poca información

disponible para determinar la duración óptima de la terapia. Las infecciones graves tales como encefalitis,

ventriculitis o abscesos cerebrales, pueden requerir una terapia prolongada, y el drenado puede ser

necesario si se presenta aumento de la presión intracraneal o hidrocefalia.

27

Resistencia a los Antibióticos

La susceptibilidad de C. sakazakii a los antibióticos es de interés ya que tiene un impacto directo en el

tratamiento de los pacientes en los hospitales por que permite determinar la efectividad del tratamiento

seleccionado o bien seleccionar los antibióticos más efectivos. Stock y Wiedemann (2002), investigaron

las susceptibilidades natural de 35 cepas de C. sakazakii a 69 agentes antimicrobianos diferentes;

observaron que las cepas de C. sakazakii eran susceptibles a la mayoría de antibióticos β-lactámicos y a

las cefalosporinas, aunque la bacteria mostró una resistencia natural relativamente alta a la

bencilpenicilina y a la oxacilina. Resultados semejantes han sido reportados por otros investigadores

(Farmer y col., 1980; Muytjens y van derRos-van de Repe, 1986), aunque en los últimos estudios se ha

observado que tanto la cefalotina como el sulfamethoxazol mostraron una concentración mínima

inhibitoria (CMI) relativamente alta. Una de las principales preocupaciones en relación con el uso de

antibióticos para el tratamiento de las infecciones de Enterobacter es la aparición de cepas resistentes a

antibióticos. Un estudio reciente indica que aproximadamente el 14% de las cepas de Enterobacter

aisladas del ambiente contenían un espectro extendido de beta-lactamasa, lo que confiere resistencia al

microorganismo contra los antibióticos β-lactámicos (Paterson y col., 2005). Se ha reportado que el

espectro extendido de beta-lactamas se encuentra en varias especies de Enterobacter, incluido C. sakazakii

(Pitout y col., 1997; Girlich y col., 2001). En otros estudios se ha reportado aislamiento de cepas

resistentes a la amoxicilina, cefalozin, cefoxitina y cefixim lo que sugiere que estas cepas pudieron haber

adquirido genes de resistencia a antibióticos (Stock y Wiedemann, 2002). Además, algunos investigadores

han reportado aislamiento de una cepa de C. sakazakii a partir de una infección de la herida en un adulto,

con una resistencia inusual a la ampicilina, gentamicina y cefotaxima (Dennison y Morris, 2002); y otros

han reportado aislamiento de cepas del patógeno con resistencia a la cefazolina (Block y col., 2002). En

resumen, para evitar la resistencia antibiótica y para lograr un mejor efecto antimicrobiano, en el

tratamiento de la meningitis por C. sakazakii se ha recomendado el uso de cefalosporinas a veces en

combinación con un segundo agente, por ejemplo, trimetoprim (Lai, 2001; Block y col., 2002).

28

Medidas de control

Ámbito familiar

La Organización Mundial de la Salud y la Academia Americana de Pediatría recomiendan como medida

preventiva la lactancia materna exclusiva durante los primeros 6 meses de vida (Kramer y Kikumo, 2002).

La lactancia materna exclusiva durante este período podría proteger a los bebés de infecciones por C.

sakazakii. Es necesario por tanto el fomento de la educación sobre lactancia materna, capacitación

perinatal a los familiares y personal de salud, condiciones laborales y sociales para el fomento a la

lactancia materna y en restricción en el usos de las formula lácteas antes de los 6 meses de vida del infante

(Howard y col., 1997; DiGirolamo y col., 2001; Sheehan y col., 2001; Ryan y col., 2002; Merewood y

col., 2003; Taveras y col., 2004; Anonymous, 2005). Es importante también la concientización a los

padres, o a quienes cuidarán a los infantes, acerca de los riesgos de la fórmula en polvo para lactantes,

sobre las prácticas seguras para la preparación de las formulas y la alimentación del infante, así como

sobre las opciones o alternativas de alimentación tales como la lactancia materna y las fórmulas estériles.

La educación o concientización sobre lo anterior, probablemente contribuiría a la reducción del riesgo

para los infantes.

Ámbito hospitalario

Es necesario un esquemas estricto de higiene del personal que tendrá contactos con los infantes, tales

como lavado de manos, limpieza y desinfección de superficies, equipos y utensilios, empleo de formulas

lácteas estériles o bien el calentamiento de la formula hidratada a una temperatura mínima de 70 °C.

Medidas semejantes pueden implementarse para niños y los adultos inmunocomprometidos. El uso de

medicamentos inhibidores o que disminuyen la liberación del ácido en el estomago también se han

asociado con un mayor riesgo por patógenos como Salmonella (Dial y col., 2005; Bowen y col., 2005), la

limitación de su uso en personas de riesgo puede ayudar a prevenir la enfermedad por otros patógenos

entéricos como C. sakazakii. Es necesario proporcionar información puntual sobre C. sakazakii a los

29

funcionarios locales de salud pública, también sobre cómo llevar acabo investigación epidemiológica

rápida y ambiental, sobre cómo pueden identificar otros factores de riesgo de la enfermedad y sobre

métodos de prevención. Cuando se identifique un caso nosocomial, es necesario llevar a cabo un barrido

rápido de laboratorio de diferentes muestras (por ejemplo, muestras rectales o faríngeas) estas ayudaran a

identificar casos adicionales, mientras que la investigación epidemiológica puede identificar el vehículo de

la infección y para cancelarlo.

Ámbito industrial

El describir la epidemiología de Cronobacter en los sitios de producción de las formulas en polvo para

lactantes puede considerarse como un primer paso útil en un intento de reducir la carga bacteriana y

controlar su diseminación. Mullane y col. (2008c), investigaron especies de Cronobacter en una planta de

productora de proteína de leche en polvo y destacaron la importancia que tiene la correcta instalación y

mantenimiento de los filtros de aire para reducir la diseminación de Cronobacter y otros peligros

biológicos en dentro de los sitios de producción de las formulas. Además, estas estrategias facilitan la

distinción entre bacterias transitorias de aquellas que pueden persistir por largos períodos de tiempo

(Osaili y Forsythe, 2009). Estos últimos microorganismos podrían ser considerados como ha adaptados al

entorno de producción. Recientes se ha aislado un fenotipo de C. sakazakii con una tolerancia a

temperaturas de 60 º C por mayores periodos de tiempo que las cepas no tolerantes o que otras

enterobacterias. Este fenotipo también mostró tolerancia a la desecación y sobrevivió por varias semanas

en un ambiente seco. Este hallazgo apoya claramente la necesidad de vigilar de manera continua a las

especies de Cronobacter en los sitios de producción así como también identificar y estudiar a las cepas

que persisten por periodos largos de tiempo.

Es importante destacar que una medida adecuada para el control de la inocuidad de las formulas en polvo

para infantes, es la correcta implementación de sistemas enfocados a la generación de alimentos con alto

grado de inocuidad tales como el sistema de análisis de peligros y puntos críticos de control [Hazard

Analysis and Critical Control Points (HACCP)] o el estándar ISO 22000.

30

Adicionalmente, los fabricantes de las fórmulas para infantes podrían incluir en la etiquetas de sus

productos la advertencia al público de que su producto no es estéril, así como informar sobre de las

prácticas de manejo y opciones alternativas de alimentación a los consumidores; podría ser también

adecuado que los productores de formulas establecieran programas de difusión de información sobre los

riesgos de los productos en polvo y del cuidado del recién nacido (Howard y col., 1997; Sheehan y col.,

2001; Ryan y col., 2002; Taveras y col., 2004).

Referencias

Adamson, D., and Rogers, J. 1981. Enterobacter sakazakii meningitis with sepsis. Clin. Microbiol. Newsl.

3:19–20.

Agostoni, C., Axelsson, I., Braegger, C., Goulet, O., Koletzko, B., Michaelsen, K. F., Rigo, J., Shamir, R.,

Szajewska, H., Turck, D., and Weaver, L. T. 2004.Probiotic bacteria in dietetic products for infants: a

commentary by the ESPGHAN Committee on Nutrition. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 38:365–374.

Ali, A., Rashid, M. H., and Karaolis, D. K. 2002. High frequency rugose exopolysaccharide production by

Vibrio cholerae. Appl. Environ. Microbiol. 68:5773-5778.

Anonymous. 2006a. Milk and Milk Products – Detection of Enterobacter sakazakii. Technical

Specification ISO ⁄ TS 22964. ISO ⁄ TS 22964:2006 (E) and IDF ⁄RM 210:2006 (E), 1st edn. Geneva:

International Organization for Standardization.

Anonymous. 2006b. Enterobacter sakazakii and Salmonella in powdered infant formula. Available at:

http://www.who.int/foodsafety/publications/micro/mra10.pdf Second Risk Assessment Workshop. Joint

FAO/WHO Workshop: Rome, Italy.

Anonymous. 2005. Policy statement.Breastfeeding and the use of human milk.Pediatrics 115:496-506.

Anriany, Y., Ahu, S. N., Wessels, K. R., McCann, L. M. and Joseph, S. W. 2006. Alteration of the rugose

phenotype in waaG and ddhC mutants of Salmonella enterica serovars Typhimurium DT104 is associated

with inverse production of curli and cellulose. Appl. Environ. Microbiol. 72:5002-5012.

31

Arseni, A., Malamou-Ladas, E., Koutsia, C., Xanthou, M., and Trikka. E. 1987.Outbreak of colonization

of neonates with Enterobacter sakazakii.J. Hosp. Infect. 9:143-150.

Baldwin, A., Loughlin, M., Caubilla–Barron, J., Kucerova, E., Manning, G., Dowson, C., and Forsythe, S.

2009. Multilocus sequence typing of Cronobacter sakazakii and Cronobacter malonaticus reveals stable

clonal structures with clinical significance which do not correlate with biotypes. BMC Microbiol. 9:223.

Bar-Oz, B., Preminger, A., Peleg, O., Block, C., and Arad. I. 2001. Enterobacter sakazakii Infection in the

newborn. Acta. Paediatr. 90:356-358.

Barreira, E., de Souza, D., Gois, P., and Fernandez, J., 2003. Meningite por Enterobacter sakazakii em

recen-nascido: relato de caso. Pediatria 25:65-70.

Biering, G., Karlsson, S., Clark, N. V. C., Jonsdottir, K. E., Ludvigsson, P., and Steingrimsson, O. 1989.

Three cases of neonatal meningitis caused by Enterobacter sakazakii in powdered milk. J. Clin.

Microbiol. 27:2054-2056.

Block, C., Peleg, O., Minster, N., Bar-Oz, B., Simhon, B. A., Arad, I., and Shapiro, M. 2002. Cluster of

neonatal infections in Jerusalem due to unusual biochemical variant of Enterobacter sakazakii. Eur. J.

Clin. Microbiol. Infect. Dis. 21:613-616.

Bowen, A., Newman, A., Estivariz, C., Gilbertson, N., Archer, J., Srinivasan, A., Lynch, M., and Painter,

J. 2005.The role of acid-suppressing medication in a sustained outbreak of salmonellosis in a long-term

care facility. Abstr. Infect. Dis. Soc. Am. 43rd Annu. Meet., San Francisco, CA.

Bowen, A., and Braden, C. 2006. Clinical characteristics and outcomes of infants with invasive

Enterobacter sakazakii disease. Emerg. Infect. Dis.12:1185-1189.

Breeuwer,P., Lardeau, A., Peterz, M., and Joosten, H. M. 2003. Desiccation and heat tolerance of

Enterobacter sakazakii. J. Appl. Microbiol. 95:967-973.

Brenner, D. J., and Farmer, J. J. 2005. Order XIII “Enterobacteriales” family I. Enterobacteriaceae, vol.2,

part B, Pp.587-607. En: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed. Brenner, D. J. Krieg, N. R.

Staley, J. T., and Garrity, G. M. (ed.). The Williams & Wilkins Co., Baltimore, Md.

32

Brenner, D. J., Richard, C., Steigerwalt, G. A. Asbury, M. A. and Mandel, M. 1980. Enterobacter

gergoviae sp.nov.:a new species of Enterobacteriaceae found in clinical specimens and the environment.

Int. J. Syst. Bacteriol. 30:1-6.

Burdette,J., and Santos. C. 2000. Enterobacter sakazakii brain abscess in the neonate: the importance of

neuroradiologic imaging. Pediatr. Radiol. 30:33-34.

Caubilla-Barron, J., and Forsythe, S. J. 2006.Long-term persistence and recovery of Enterobacter

sakazakii and other Enterobacteriaceae from powdered infant milk formula, abstr.P-019, Pp.444.

Abstr.106th Gen. Meet. Am. Soc. Microbiol. American Society for Microbiology, Washington, DC.

Chen, Y. 2011. Development and validation of a revised FDA method for the detection of Cronobacter in

powdered infant formula. Department Seminar Series in University of Helsinki, Latokartanonkaari,

Finland.

Chen, Y., Hammack, T. S., Song, K. Y., and Lampel, K. A. 2009. Evaluation of a revised U.S. Food and

Drug Administration for the detection and isolation of Enterobacter sakazakii in powdered infant formula:

precollaborative study. J. AOAC. Int. 92:862-872.

Clark, N. C., Hill, B. C., O’Hara, C. M., Steingrimsson, O., and Cooksey, R. C. 1990. Epidemiologic

typing of Enterobacter sakazakii in two neonatal nosocomial outbreaks. Diagn. Microbiol. Infect. Dis.

13:467–472.

Curtis, S. K., Kothary, M. H., Blodgett, R. J., Raybourne, R. B., Ziobro, G. C., and Tall, B. D. 2007.

Rugosity in Grimontia hollisae. Appl. Environ. Microbiol. 73, 1215-1224.

Dennison, S. K., and Morris, J. 2002.Multiresistant Enterobacter sakazakiiwound infection in an adult.

Infect. Med. 19:533-535.

Dial, S., Delaney,J., Barkun,A., and Suissa, S. .2005. Use of acid-suppressive medications and the risk of

community-acquired Clostridium difficile-associated disease. JAMA. 294:2989-2995.

Dickey, R. S., and Zumoff, C H. 1988. Emended description of Enterobacter cancerogenus comb.nov.

(formerly Erwinia cancerogena). Int. J. Syst. Bacteriol. 38:371-374.

33

DiGirolamo, A., Grummer-Strawn, L., and Fein, S. 2001. Maternity care practices: implications for

breastfeeding. Birth. 28:94-100.

Drudy, D., O’Rourke, M., Murphy, M., Mullane, N., O’Mahony, R., Kelly, L., Fischer, M., Sanjaq, S.,

Shannon, P., Wall, P., O'Mahony, M., Whyte, P., Fanning, S. 2006. Characterization of a collection of

Enterobacter sakazakii isolates from environmental and food sources. Int. J. Food Microbiol. 110:127-

134.

Druggan, P., and Iversen, C. 2009. Culture media for the isolation of Cronobacter spp. Int. J. Food

Microbiol. 136:169-178.

Edelson-Mammel, S. G., and Buchanan, R. L. 2004. Thermal inactivation of Enterobacter sakazakii in

rehydrated infant formula. J. Food Protect. 67:60-63.

El-Sharoud, W. M., O’Brien, S., Negredo, C., Iversen, C., Fanning, S., and Healy, B. 2009.

Characterization of Cronobacter recovered from dried milk and related products. BMC Microbiol. 9:24.

FAO/WHO (Food and Agriculture Organization-World Health Organization). 2004. Workshop on

Enterobacter sakazakii and other microorganism in powdered infant formula. FAO/WHO, Geneva.

Available at: http://www.who.int/foodsafety/micro/jemra/meetings/feb2004/en/

FAO/WHO (Food and Agriculture Organization-World Health Organization). 2006. Enterobacter

sakazakii and Salmonella in powdered infant formula: meeting report. Microbiological Risk Assessment

Series 10. World Health Organization-Food and Agriculture Organization of the United Nations, Geneva

and Rome. WHO Press,Geneva,Switzerland. Available at:

http://www.who.int/foodsafety/publications/micro/mra10/en/index.html

FAO/WHO (Food and Agriculture Organization-World Health Organization). 2007. Guidelines for the

safe preparation, storage and handling of powdered infant formula. Available at:

http://www.who.int/foodsafety/publications/micro/pif2007/en/

Farmer, J., Asbury, M., Hickman, F., and Brenner, D. 1980. Enterobacter sakazakii:a new species of

“Enterobacteriaceae” isolated from clinical specimens. Int. J. Syst. Bacteriol. 30: 569-584

34

Forsythe, S. 2009. Cronobacter species. Culture 31:1.

Gajdosova, J., Benedikovicova, K., Kamodyova, N., Tothova, L., Kaclikova, E., Stuchlik, S., Turna, J.,

and Drahovska, H. 2011. Analysis of the DNA region mediating increased thermotolerance at 58 °C in

Cronobacter spp. and other enterobacterial strains. Antonie Van Leeuwenhoek. 100:279-289.

Gallagher, P. G., and Ball, W. S. 1991. Cerebral infarctions due to CNS infection with Enterobacter

sakazakii. Pediatr. Radiol. 21:135-136.

Ganeswire, R., Thong, K. L. and Puthucheary, S. D. 2003. Nosocomial outbreak of Enterobacter

gergoviae bacteraemia in a neonatal intensive care unit. J. Hosp. Infect. 53:292-296.

Gassem, M. A. A. 1999. Study of the microorganisms associated with the fermented bread (khamir)

produced from sorghum in Gizan region, Saudi Arabia. J. Appl. Microbiol. 86:221-225.

Girlich, D., Poirel, L., Leelaporn, A., Karim, A., Tribuddharat, C., Fennewald, M., and Nordmann, P.

2001. Molecular epidemiology of the integron-located VEB-1 extended spectrum beta-lactamase in

nosocomial enterobacterial isolates in Bangkok, Thailand. J. Clin. Microbiol. 39:175-182.

Grimm, M., Stephan, R., Iversen, C., Manzardo, G. G., Rattei, T., Riedel, K., Ruepp, A., Frishman, D.

Lehner A. 2008. Cellulose as an extracellular matrix component present in Enterobacter sakazakii

biofilms. J. Food Prot. 71:13-18.

Guillaume-Gentil, O., Sonnard, V., Kandhai, M. C., Marugg, J. D., and Joosten, H. 2005. A simple and

rapid cultural method for detection of Enterobacter sakazakii in environmental samples. J. Food Protect.

68:64-69.

Gurtler, J. B., Kornacki, J. L., and Beuchat, L. R. 2005. Enterobacter sakazakii: a coliform of increased

concern to infant health. Int. J. Food. Microbiol. 104:1-34.

Hamilton,J., Lehane, M., and Braig, H. 2003. Isolation of Enterobacter sakazakii from midgut of

Stomoxys calcitrans. Emerg. Infect. Dis. 9:1355-1356.

Hawkins, R. E., Lissner, C. R. and Sanford, J.P. 1991. Enterobacter sakazakii bacteremia in an

adult.South. Med. J. 84:793-795.

35

Healy, B., Huynh, S., Mullane, N., O’Brien, S., Iversen, C., Lehner, A., Stephan, R., Parker, C.T., and

Fanning, S. 2009. Microarray- based comparative genomic indexing of the Cronobacter genus

(Enterobacter sakazakii). Int J. Food Microbiol. 136:159-164.

Himelright, I., Harris, E., Lorch, V., and Anderson. M. 2002. Enterobacter sakazakii infections associated

with the use of powdered infant formula-Tennessee, 2001. JAMA. 287:2204-2205.

Hoffmann, H., and Roggenkamp, A. 2003. Population genetics of the nomenspecies Enterobacter cloacae.

Appl. Environ. Microbiol. 69:5306-5318.

Hoffmann,H. Stindl, S., Ludwig, W., Stumpf, A., Mehlen, A., Monget, D., Pierard, D., Ziesing, S.,

Heesemann, J., Roggenkamp, A., and Schleifer, K. H. .2005c. E. hormaechei subsp. ohara subsp. nov., E.

hormaechei subsp hormaecheicomb. nov., and E. hormaecheisu sp. steigerwaltii subsp. nov., three new

subspecies of clinical importance. J. Clin. Microbiol. 43:3297-3303.

Hoffmann,H., Stindl, S., Ludwig, W., Stumpf, A., Mehlen, A., Heesemann, J., Monget, D., Schleifer, K.

H. and Roggenkamp, A. 2005b. Reassignment of Enterobacter dissolvens to Enterobacter cloacae as E.

cloacae subspecies dissolvens comb. nov. and emended description of Enterobacter asburiae and

Enterobacter kobei. Syst. Appl. Microbiol. 28:196-205.

Howard, C., Schaffer,S., and Lawrence. R. 1997.Attitudes, practices, and recommendations by

obstetricians about infant feeding. Birth. 24:240-246.

ISO (International Organization for Standardization). 2009. ISO 9000:2005 – Quality management

systems -- Fundamentals and vocabulary. Switzerland: The International Organization for Standardization.

Iversen, C., Lehner, A., Mullane, N., Bidlas, E., Cleenwerck, I., Marugg, J., Fanning, S., Stephan, R.

Joosten, H. 2007. The taxonomy of Enterobacter sakazakii: proposal of a new genus Cronobacter gen.

nov. and descriptions of Cronobacter sakazakii comb. nov. Cronobacter sakazakii subsp. sakazakii, comb.

nov., Cronobacter sakazakii subsp. malonaticus subsp. nov., Cronobacter turicensis sp. nov.,

Cronobacter muytjensii sp. nov., Cronobacter dublinensis sp. nov. and Cronobacter genomospecies 1.

BMC Evol. Biol. 7:64.

36

Iversen, C., Mullane, N., McCardell, B., Tall, B. D., Lehner, A., Fanning, S., Stephan, R., and Joosten, H.

2008. Cronobacter gen. nov., a new genus to accommodate the biogroups of Enterobacter sakazakii, and

proposal of Cronobacter sakazakii gen. nov., comb. nov., Cronobacter malonaticus sp. nov., Cronobacter

turicensis sp. nov., Cronobacter muytjensii sp. nov., Cronobacter dublinensis sp. nov., Cronobacter

genomospecies 1, and of three subspecies, Cronobacter dublinensis subsp. dublinensis subsp. nov.,

Cronobacter dublinensis subsp. lausannensis subsp. nov. and Cronobacter dublinensis subsp. Lactaridi

subsp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58:1442–1447.

Iversen, C., and Forsythe, S. 2003. Risk profile of Enterobacter sakazakii, an emergent pathogen

associated with infant milk formula. Trends Food Sci.Technol.14:443-454.

Iversen, C., and Forsythe, S. 2004. Isolation of Enterobacter sakazakii and other Enterobacteriaceae from

powdered infant formula milk and related products. Food Microbiol. 21:771–777.

Iversen, C., Lancashire, L., Waddington, M., Forsythe, S., and Ball. G., 2006a. Identification of

Enterobacter sakazakii from closely related species: the use of artificial neural networks in the analysis of

biochemical and 16S rADN data.BMC Microbiol.6:28.

Iversen, C., Waddington, M., Farmer J.J. III, and Forsythe, S. J. 2006b. The biochemical differentiation of

Enterobacter sakazakii genotypes. BMC Microbiol.6:94.

Iversen, C., Druggan, P., and Forsythe, S. 2004a. A selective differential medium for Enterobacter

sakazakii, a preliminary study. Int. J. Food Microbiol. 96:133–139.

Iversen, C., Waddington, M., On, S. L. W., and Forsythe, S. 2004b. Identification and phylogeny of

Enterobacter sakazakii relative to Enterobacter and Citrobacter. J. Clin. Microbiol. 42:5368-5370.

Jarvis, K. G., Grim, C. J., Franco, A. A., Gopinath, G., Sathyamoorthy, V., Hu, L., Sadowski, J. A., Lee,

C. S., and Tall, B. D. 2011. Molecular characterization of Cronobacter lipopolysaccharide O-antigen gene

clusters and development of serotype-specific PCR assays. Appl. Environ. Microbiol. 77:4017-4026.

37

Jaspar, A. H. J., Mutyjens, H. L., and Kolee, L. A. A. 1990.Neonatale meningitis door Enterobacter

sakazakii: melkpoeder is niet sterile in bacterien lusten ook melk.(Neonatal meningitis caused by E

.sakazakii:milk powder is not sterile and bacteria like milk too). Tijdschr. Kindergenee Skd. 58:151-155.

Ji, Y. M. 2011. Next generation sequencing and comparative analysis of eight Cronobacter genomes. The

American Society for Microbiology (ASM), New Orleans, LA, USA.

Jimenez, E., and Gimenez, C. 1982. Septic shock due to Enterobacter sakazakii. Clin. Microbiol. Newsl.

4:30.

Joker, R., Norholm, T., and Siboni, K. 1965.A case of neonatal meningitis caused by a yellow

Enterobacter. Danish Med. Bull. 12:128-130.

Joosten, H.M., and Lardeau, A. 2004. Enhanced microbiological safety of acidified infant formulas tested

in vitro. S. Afr. J. Clin. Nutr. 17:87-92.

Joseph, S., Cetinkaya, E., Drahovska, H., Levican, A, Figueras, M. J., and Forsythe S. J. 2012.

Cronobacter condimenti sp. nov., isolated from spiced meat, and Cronobacter universalis sp. nov., a

species designation for Cronobacter sp. genomospecies 1, recovered from a leg infection, water and food

ingredients. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62:1277-83.

Kämpfer,P., Ruppel, S., and Remus, R. 2005.Enterobacter radicincitans sp.nov. a plant growth promoting

species of the family Enterobacteriaceae. Syst. Appl. Microbiol. 28:213-221.

Kandhai, M., Reij, M., Gorris, L., Guillaume-Gentil, O., and van Schothorst, M. 2004. Occurrence of

Enterobacter sakazakiiin food production environments and households. Lancet. 363:39-40.

Kandhai, M. C., Reij, M. W., Grognou, C., van Schothorst, M., Gorris, L. G., Zwietering, M. H. 2006.

Effects of preculturing conditions on lag time and specific growth rate of Enterobacter sakazakii in

reconstituted powdered infant formula. Appl. Environ. Microbiol. 72:2721-2729.

Kandhai, M. C., Reij, M. W., Gorris, L. G., Guillaume-Gentil, O., van Schothorst, M. 2004a. Occurrence

of Enterobacter sakazakii in food production environments and households. Lancet, 363:39-40.

38

Kleiman, M. B., Allen, S. D., Neal, P., and Reynolds, J. 1981. Meningoencephalitis and

compartmentalization of the cerebral ventricles caused by Enterobacter sakazakii. J. Clin. Microbiol.

14:352-354.

Kline, M. 1988. Pathogenesis of brain abscess caused by Citrobacter diversus or Enterobacter sakazakii.

Pediatr. Infect. Dis. J. 7:891-892.

Kosako, Y., Tamura, K., Sakazaki, R., and Miki, K. 1996. Enterobacter kobei sp. nov., a new species of

the family Enterobacteriaceae resembling Enterobacter cloacae. Curr. Microbiol. 33:261-265.

Kotewicz, M. L., and Tall, B. D. 2009. Optical maps of subgroups of Cronobacter (formerly Enterobacter

sakazakii) show large chromosomal regions of homology and differences among isolates. 1st International

Conference on Cronobacter, Poster Abstract 60, Dublin, Ireland.

Kothary, M. H., McCardell, B. A., Frazar, C. D., Deer, D., and Tall, B. D. 2007. Characterization of the

zinc–containing metalloprotease encoded by zpx and development of a species– specific detection method

for Enterobacter sakazakii. Appl. Environ. Microbiol. 73:4142–4251.

Kramer, M., and Kikumo, R. 2002. The optimal duration of exclusive breast feeding: a systematic review.

World Health Organization, Geneva, Switzerland.

Kucerova, E., Clifton, S. W., Xia, X. Q., Long, F., Porwollik, S., Fulton, L., Fronick, C., Minx, P., Kyung,

K., Warren, W., Fulton, R., Feng, D., Wollam, A., Shah, N., Bhonagiri, V., Nash, W. E., Hallsworth-

Pepin, K., Wilson, R. K., McClelland, M., Forsythe. S. J. 2010. Genome sequence of Cronobacter

sakazakii BAA–894 and comparative genomic hybridization analysis with other Cronobacter species.

PLoS ONE 5, e9556.

Kuhnert, P., Korczak, B. M., Stephan, R., Joosten, H., and Iversen, C. 2009. Phylogeny and prediction of

genetic similarity of Cronobacter and related taxa by multilocus sequence analysis (MLSA). Int. J. Food

Microbiol. 136:152–158.

Lai, K. 2001. Enterobacter sakazakii infections among neonates, children, and adults. Medicine. 80:113-

122.

39

Leclercq, A., Wanegue,C., and Baylac, P. 2002. Comparison of fecal coliform agar and violet red bile

lactose agar for fecal coliform enumeration in foods. Appl. Environ. Microbiol. 68:1631-1638.

Lehner, A., Riedel, K., Eberl, L., Breeuwer, P., Diep, B., and Stephan, R. 2005. Biofilm formation,

extracellular polysaccharide production, and cell-to-cell signaling in various Enterobacter

sakazakiistrains:aspects promoting environmental persistence. J. Food Protect. 68:2287–2294.

Loc-Carrillo, C., Fayet, O., Caubilla Barron, J. and Prere, M.-F., and Forsythe. S. 2006. Fatal outbreak of

Enterobacter sakazakii in a neonatal intensive care unit in 1994: a retrospective study, P-019.Abstr.106th

Gen.Meet.Am.Soc.Microbiol.American Society for Microbiology, Washington, DC.

Malorny,B., and Wagner, M. 2005.Detection of Enterobacter sakazakii strains by real-time PCR. J. Food

Protect. 68:1623-1627.

Merewood,A., Philipp, B., Chawla,N., and Cimo, S. 2003.The baby-friendly hospital initiative increases

breastfeeding rates in a US neonatal intensive care unit. J. Hum. Lact. 19:166-171.

Monroe, P., and Tift, W. 1979. Bacteremia associated with Enterobacter sakazakii (yellow pigmented

Enterobacter cloacae). J. Clin. Microbiol.10:850-851.

Mullane, N. R., Healy, B., Meade, J., Whyte, P., Wall, P.G. and Fanning, S. (2008c) Dissemination of

Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) in a powdered milk protein manufacturing facility. Appl.

Environ. Microbiol. 74:5913-5917.

Mullane, N. R., O’Gaora, P., Nally, J. E., Iversen, C., Whyte, P., Wall, P. G. and Fanning, S. 2008a.

Molecular analysis of the Enterobacter sakazakii O–antigen gene locus. Appl. Environ. Microbiol.

12:3783-3794.

Mullane, N. R., Ryan, M., Iversen, C., Murphy, M., O’Gaora, P., Quinn, T., Whyte, P., Wall, P. G., and

Fanning, S. 2008b. Development of multiple–locus variable–number tandem–repeat analysis for the

molecular subtyping of Enterobacter sakazakii. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1223.–1231.

40

Mullane, N. R., Whyte, P., Wall, P. G., Quinn, T. and Fanning, S. 2007b. Application of pulsed–field gel

electrophoresis to characterize and trace the prevalence of Enterobacter sakazakii in an infant formula

processing facility. Int. J. Food Microbiol. 116, 73–81.

Mullane, N. R., Drudy, D., Whyte, P., O’Mahony, M., Scannell, A.G.M. Wall, P.G. and Fanning, S. 2006.

Enterobacter sakazakii: biological properties and significance in dried infant milk formula (IMF).Int. J.

Dairy Technol. 59:102-111.

Murray, M. M., Welch, D. F., and Kuhls, T. L.1990.Serratia osteochondritisafter puncture wounds of the

foot. Pediatr. Infect. Dis. 9:523–524.

Muytjens, H., and Kollee, L. 1990.Enterobacter sakazakiimeningitis in neonates: causative role of

formula? Pediatr. Infect. Dis. J. 9:372–373.

Muytjens, H. L., and .van der Ros-van de Repe, J. 1986.Comparative in vitro susceptibilities of eight

Enterobacterspecies, with special reference to Enterobacter sakazakii.Antimicrob. Agents

Chemother.29:367–370.

Muytjens, H. L., Zanen, T. L., Sonderkamp, H.J., Kollee, L.A., Wachsmuth, I. K., and Farmer, J.J. III.

1983. Analysis of eight cases of neonatal meningitis and sepsis due to Enterobacter sakazakii. J. Clin.

Microbiol.18:115-120.

Muytjens, H. L., Roelofs-Willemse, H., and Jaspar, G. H. 1988. Quality of powdered substitutes for breast

milk with regard to members of the family Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol. 26:743–746.

Muytjens, H. L., van der Ros-van de Repe, J. and van Druten, H. A. M. 1984.Enzymatic profiles of

Enterobacter sakazakiiand related species with special reference to the alpha glucosidase reaction and

reproducibility of the test system. J. Clin. Microbiol. 20:684-686.

Nair, M. K. M., and Ventikanaraynan. K. S. 2006. Cloning and sequencing of ompAgene from

Enterobacter sakazakii and the development of an ompA-targeted PCR for rapid detection of

Enterobacter sakazakii in infant formula. Appl. Environ. Microbiol. 72:2539–2546.

41

Nazarowec-White, M., and Farber, J. M. 1997. Incidence, survival and growth of Enterobacter sakazakii

in infant formula. J. Food Protect. 60:226-230.

Nazarowec-White, M., and Farber J. M. 1997b. Thermal resistance of Enterobacter sakazakii in

reconstituted dried-infant formula. Lett. Appl. Microbiol. 24:9-13.

Nazarowec-White, M., and Farber J. M. 1997c. Enterobacter sakazakii:a review. Int. J. Food Microbiol.

34:103-113.

Nazarowec-White, M., and Farber, J. M. 1999. Phenotypic and genotypic typing of food and clinical

isolates of Enterobacter sakazakii. J. Med. Microbiol. 48:559-567.

Nazarowec-White, M., McKellar, R. C., and Piyasena, P. 1999.Predictive modelling of Enterobacter

sakazakii inactivation in bovine milk during high-temperature short-time pasteurization. Food Res. Int.

32:375-379.

Noriega, F. R., Kotloff, K. L., Martin, M. A., and Schwalbe, R. S. 1990. Nosocomial bacteremia caused

by Enterobacter sakazakii and Leuconostoc mesenteroides resulting from extrinsic contamination of infant

formula. Pediatr. Infect. Dis. 9:447-449.

O’Brien, S., Healy, B., Negredo, C., Fanning, S., and Iversen, C. 2009. Evaluation of a new one-step

enrichment in conjunction with a chromogenic medium for the detection of Cronobacter spp.

(Enterobacter sakazakii) in powdered infant formula. J. Food Prot. 72:1472-1475.

O’Hara, C. M., Steigerwalt, A. G., Hill, B. C., Farmer J.J. 3rd, Fanning, G. R. and Brenner, D. J. 1989.

Enterobacter hormaechei, a new species of the family Enterobacteriaceae formerly known as enteric

group 75. J. Clin. Microbiol. 27:2046-2049.

Oh,S., and Kang, D. 2004. Fluorogenic selective and differential medium for isolation of Enterobacter

sakazakii. Appl. Environ. Microbiol. 70:5692-5694.

Oliver,E. D. 1997. A typical, non-lactose fermenting isolates shown to be total coliforms by the-

galactosidase (ONPG) reaction, p.225–231. Proceedings of the Water Quality Technology Conference.

American Water Works Association, Denver, C.O.

42

Ongradi, J. 2002. Vaginal infection by Enterobacter sakazakii. Sex. Transm. Infect. 78:467-468.

Osaili, T., and Forsythe, S. 2009. Desiccation resistance and persistence of Cronobacter species in infant

formula. Int. J. Food Microbiol. 136:214-220.

Paterson,D.L., Rossi, F., Baquero, F., Hsueh, P. R., Woods, G. L., Satishchandran, V., Snyder, T. A.,

Harvey, C. M., Teppler, H., Dinubile, D. J., and Chow, J. W. 2005. In vitro susceptibilities of aerobic and

facultative gram-negative bacilli isolated from patients with intraabdominal infections worldwide: the

2003 Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends (SMART). J. Antimicrob. Chemother.

55:965-973.

Pitout, J. D., Moland, E.S., Sanders, C.C., Thomson, K. S., and Fitzsimmons S.R. 1997. Beta-lactamases

and detection of beta-lactam resistance in Enterobacter spp. Antimicrob. Agents Chemother. 41:35-39.

Pribyl,C., Salzer, R., Beskin, J., Haddad, R. J., Pollock, B., Beville, R., Holmes, B., and Mogabgab, W. J.

1985. Azteonam in the treatment of serious orthopaedic infections. Am. J. Med. 78:51-56.

Reina, J., Parras, F., Gil, J., Salva, F., and Alomar, P. 1989.Human infections caused by Enterobacter

sakazakii. Microbiologic considerations. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 7:147-150.

Restaino, L., Frampton, E. W., Lionberg,W. C. and Becker. R. J. 2006. A Chromogenic plating medium

for the isolation and identification of Enterobacter sakazakii from foods, food ingredients, and

environmental sources. J. Food Protect. 69:315-322.

Leuscher, R.G. and Bew, J. 2004. A medium for the presumptive detection of Enterobacter sakazakii in

infant formula: interlaboratory study. J. AOAC Int. 87:604-613.

Ryan, A., Wenjun, Z. and Acosta, A. 2002. Breastfeeding continues to increase into the new millennium.

Pediatrics. 110:1103-1109.

Schindler,P.R., and Metz, H. 1990. Coliform bacteria in rinsed mugs—identification with the API 20E

system and resistance behavior. Offentliche Gesundheitswesen. 52:592-597.

43

Schonheyder, H.C., Jensen, K. T., and Frederiksen, W. 1994. Taxonomic notes: synonymy of

Enterobacter cancerogenus (Urosevic 1966) Dickey and Zumoff 1988 and Enterobacter taylorae Farmer

et al. 1985 and resolution of an ambiguity in the biochemical profile. Int. J. Syst. Bacteriol. 44:586-587.

Seo, K. H., and Brackett, R. E. 2005. Rapid, specific detection of Enterobacter sakazakii in infant formula

using a real-time PCR assay. J. Food Protect. 68:59-63.

Sheehan,D., Krueger, P. Watt, S. Sword, W. and Bridle, B. 2001. The Ontario mother and baby study:

breastfeeding outcomes. J. Hum. Lact. 17:211-219.

Simmons, B. P., Gelfand, M. S. Haas, M., Metts, L., and Ferguson, J. 1989. Enterobacter sakazakii

infections in neonates associated with intrinsic contamination of a powdered infant formula. Infect.

Control. Hosp.Epidemiol. 10:398-401.

Stock, I., and Wiedemann, B. 2002. Natural antibiotic susceptibility of Enterobacter amnigenus,

Enterobacter cancerogenus, Enterobacter gergoviae and Enterobacter sakazakii strains. Clin. Microbiol.

Infect. 8:564-578.

Stoll,B., Hansen, N. Fanaroff, A. and Lemons, J. .2004. Enterobacter sakazakii is a rare cause of neonatal

septicemia or meningitis in VLBW infants. J. Pediatr. 144:821-823.

Stoop, B., Lehner, A., Iversen, C., Fanning, S., and Stephan, R. 2009. Development and evaluation of

rpoB-based PCR systems to differentiate the six proposed species within the genus Cronobacter. Int. J.

Food Microbiol. 136:165-168.

Sun, Y. M., Wang, M., Liu, H. B., Wang, J. J., He, X., Zeng, J., Guo, X., Li, K., Cao. B., and Wang, L.

2011. Development of an O-antigen serotyping scheme for Cronobacter sakazakii. Appl. Environ.

Microbiol. 77:2209-2214.

Taveras, E., Li, R., Grummer-Strawn, L., Richardson, M., Marshall, R., Rego, V., Miroschnik, I., and

Lieu, T. 2004. Opinions and practices of clinicians associated with continuation of exclusive

breastfeeding. Pediatrics. 113: e283-e290.

44

Tekkok,I., Baessa, S., Higgins,M., and Ventureyra, E. 1996. Abscedation of posterior fossa dermoid cysts.

Child. Nerv. Syst. 12:318-322.

Thornley, M. J.1960.The differentiation of Pseudomonas from other gram-negative bacteria on the basis

of arginine metabolism. J. Appl. Bacteriol. 23:37-50.

Tunkel, A. R., and Scheld, W. M. 2005. Acute meningitis, p.1083-1084. En: Principles and Practice of

Infectious Diseases, 6th ed. Mandell, G. L., Bennett, J. E., and Dolin, R. (ed.), Churchill Livingstone, New

York, NY.

Urmenyi, A.M.C., and Franklin, A. W. 1961. Neonatal death from pigmented coliform infection. Lancet.

1(7172):313-315.

Van Acker,J., De Smet, F., Muyldermans, G., Bougatef, A., Naessens, A., and Lauwers, S. 2001.

Outbreak of necrotizing enterocolitis associated with Enterobacter sakazakii in powdered milk formula. J.

Clin. Microbiol. 39:293-297.

Walsh, D., Molloy, C., Iversen, C., Carroll, J., Cagney, C., Fanning, S., and Duffy, G. 2011. Survival

characteristics of environmental and clinically derived strains of Cronobacter sakazakii in infant milk

formula (IMF) and ingredients. J. Appl. Microbiol. 110:697-703.

Williams, T. L., Monday, S. R., Edelson-Mammel, S., Buchanan, R., and Musser, S. R. 2005. A top-down

proteomics approach for differentiating thermal resistant strains of Enterobacter sakazakii. Proteomics.

5:4161-4169.

Willis,J., and Robinson, J. 1988. Enterobacter sakazakii meningitis in neonates. Pediatr. Infect. Dis. J.

7:196-199.

Yan, X., Gurtler, J., Fratamico, P. M., Hu, J., Gunther IV, N. W., Juneja, V. K., and Huang, L. 2011.

Comprehensive approaches for molecular biomarker discovery for the detection and identification of

Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) and Salmonella. Appl. Environ. Microbiol. 77:1833-1843.

Zhou, Y., Wu, Q., Xu, X., Yang, X., Ye, Y., and Zhang, J. 2008. Development of an immobilization and

detection method of Enterobacter sakazakii from powdered infant formula. Food Microbiol. 25:648-652.

45

Zogaj, X., Bokranz, W., Nimitz, M., and Romling, U. 2003. Production of cellulose and curli fimbriae by

members of the family Enterobacteriaceae isolated from the human gastrointestinal tract. Infect. Immun.

71:415-4158.