ĐỀ CƯƠNG ÔN TẬP

“KỸ THUẬT THU HỒI VÀ HOÀN THIỆN SẢN PHẨM”

Phần 1.

1. Định nghĩa quá trình thu hồi và hoàn thiện sản phẩm. Mục đích của quá trình

thu hồi và hoàn thiện sản phẩm. Đặc điểm của sản phẩm sinh học? Các sản

phẩm đi kèm với sản phẩm sinh học trong quá trình sinh học là gì? Các yếu tố

ảnh hưởng đến quá trình thu hồi và hoàn thiện sản phẩm

Câu 1:

- Định nghĩa quá trình thu hồi hoàn thiện sản phẩm

- Mục đích của qúa trình thu hồi và hoàn thiện sản phẩm: Bằng các phương pháp

khác nhau người ta có thể thu được những chất hay những sản phẩm quan tâm ra

khỏi hỗn hợp các chất trong dung dịch lên men hoặc từ hỗn hợp các chất. Sản

phẩm thu được phải đạt các yêu cầu:

+ Hoạt tính cao

+ Độ tinh sạch cao

+ Hiệu suất thu hồi cao

+ chi phí thấp

- Đặc điểm của sản phẩm sinh học là dễ bị biến tính và phân hủy, không chịu được

PH, nhiệt độ, áp suất, ưa nước, kị nước, hòa tan trong các dung môi khác nhau.

- Các sản phẩm đi kèm với sản phẩm sinh học trong quá trình lọc là những sản

phẩm có kích thước gần bằng hoặc sấp xỉ bằng sản phẩm mình mong muốn.

- Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thu hồi và hoàn thiện sản phẩm:

+Độ nhớt của dịch lên men

+ Nhiệt độ, PH, thời gian trong quá trình thu hồi

+ Lựa chọn công nghệ phù hợp, xác lập các bước trong quá trình tách

+ Nồng độ, kích thước, hình thái, khả năng kết lắng của tế bào vi sinh vật trong canh

trường.

+

Câu 2 .Phương pháp lọc. Định nghĩa, Nguyên tắc, các yếu tố ảnh hưởng các phương

pháp lọc và ứng dụng của pp lọc trong CNSH

Câu 2: Phương pháp lọc:

- Định nghĩa:

Trước: Quá trình phân tách pha rắn khỏi pha lỏng dựa vào sự khác nhau về kích thước

qua lớp vật liệu lọc. Phần trong đi qua màng gọi là dịch lọc(filtrate), phần rắn còn lại

dính trên vật liệu lọc gọi là cặn lọc(filter cake).

Nay: Phân tách các thành phần hòa tan khỏi pha lỏng dựa vào sự khác nhau về kích

thước vật liệu lọc. Phần trong đi qua màng gọi là dịch lọc (filtrate), phần rắn còn lại

dính trên vật liệu lọc gọi là cặn lọc (rententate).

- Nguyên tắc: + Dựa vào sự chênh lệch áp suất dòng vào áp suất sau khi lọc

+ Dựa vào kích thước tế bào và kích thước lỗ của vật liệu lọc

- Các yếu tố ảnh hưởng:

+ Áp suất chên lệch giữa 2 bên bề mặt lọc

+ Diện tích bề mặt lọc

+ Độ nhớt của chất lỏng

+ Trở lực của vật liệu lọc và cặn lọc

- Ứng dụng của phương pháp lọc trong CNSH: Lọc sản phẩm cần quan tâm ra khỏi

dung dịch các hợp chất. Được ứng dụng trong y, dược, nông nghiệp…

Câu 3: Phương pháp li tâm. Định nghĩa, Nguyên tắc, các yếu tố ảnh hưởng, các

phương pháp li tâm và ứng dụng của pp li tâm trong CNSH

Phương pháp li tâm:

+) Định nghĩa: dựa vào lực ly tâm, lực ly tâm là một lực quán tính xuất hiện trên mọi

vật nằm yên trong hệ quy chiếu quay so với một hệ quy chiếu quan tính.

+) Nguyên tắc: roto quay tròn với tốc độ cao, làm cho các chất bên trong nó bị ném ra

phía ngoài và dựa vào hỗn hợp các chất có tỉ trọng khác nhau.

+) Các yếu tố ảnh hưởng:

- Tốc độ lắng li tâm

- Độ chênh lệch trọng lượng riêng

- Độ nhớt của môi trường

- Kích thước hạt lắng

- Hình dạng hạt lắng

+) Các phương pháp ly tâm:

Các phương pháp li tâm khác biệt nhau ở tốc độ khác nhau hoặc theo gradient tỉ trọng

Li tâm trong công nghiệp:

Trong phòng thí nghiệm sử dụng li tâm giản đoạn, RCF 5000 – 500000g còn trong công

nghiệp liên tục hay bán liên tục, RCF khá thấp.

Có 3 loại li tâm chính:

- Li tâm ống: Đạt RCF 13000 – 17000g

Roto hình ống dài tạo điều kiện cho chất huyền phù đi qua. Bơm dưới đáy và đi

ngang qua Rotor. Hạt lắng bị bắn ra vách. Chất lỏng đã lọc trong đi lên trên. Quá

trình liên tục cho tới khi ông li tâm đầy. Quá trình li tâm dừng và Hạt lắng được

định kì lấy ra. Phương pháp này hay được dùng cho các hạt có hệ số lắng thấp như

protein kết tủa.

- Li tâm đĩa: RCF 5000 – 15000g

Trong quá trình quay các hạt bắn theo đĩa và tụ lại ở thành. Có vùng lắng cao có

thể gián đoạn hay liên tục lấy chất rắn ra. Có thể dùng để li tâm tế bào hay xác tế

bào. Có thể lấy ra định kì trong quá trình li tâm: khác nhau chủ yếu ở nguyên tắc

láy ra.

- Li tâm nằm ngang; RCF 1500 – 500g

Dùng cho sinh khối tế bào lớn lắng nhanh và có thể rửa như tinh thế kháng sinh

hay quá trình loại nước: dùng thu sinh khối nấm sợi hay nấm men hay xử lí bùn

thải. Roto nằm ngang hình xilanh – nón, bên trong lắp vít tải. Vít tải và xi lanh

quay cùng một chiều, nhưng khác số vòng quay. Dưới tác động của lực li tâm,

huyền phù phân tách và các cáu tử rắn lắng trên tường của Roto.

+) Ứng dụng:

- Tách sinh khối sau lên men

- Tách xác tế bào thu dịch protein sau quá trình phá vỡ tế bào

- Kết tủa protein

- Kết tủa phân đoạn

1. Phương pháp lắng và tuyển nổi. Định nghĩa, Nguyên tắc, các yếu tố ảnh hưởng

các phương pháp lắng và ứng dụng của pp lắng trong CNSH

Phương

pháp

Định

nghĩa

Nguyên tắc Các yêu tố ảnh hướng Ứng dụng

Phương

pháp

lắng

Là

phương

pháp lắng

tự do dưới

tác dụng

của trọng

lực

Khối lượng

hạt càng

nặng hay

kích thước

càng lớn thì

lắng càng

nhanh

+) Trọng lực của hạt

lắng

Trong đó:

d- đường kính hạt

- Chênh lệch trọng

lượng riêng giữa hạt

lắng và môi trường

xung quanh (kg.m-3-)

g- lực hấp dẫn (9,81

m.s-2)

+) Lực va chạm lên hạt

Đây là phương

pháp rẻ tiền, chậm,

thường dùng để

loại sinh khối tế

bào.

Là phương pháp

hay được sử dụng

trong sản xuất đồ

uống có cồn (bia)

hay xử lí nước thải

(bùn hoạt tính),

SCP

Trong sản xuất bia

dùng chủng nấm

lắng

Trong đó:

η – Độ nhớt của môi

trường (kg.m-1.s-1)

v – Tốc độ lắng

(m.s-2)

Để quá trình lắng xảy

ra nhanh:

Chênh lệch trọng lượng

riêng lớn

Độ nhớt của môi

trường thấp

Đường kính hạt lớn.

Muốn tăng khả năng

lắng có thể dùng chất

keo tụ như: muối nhôm

và sắt, các chất keo tụ

polime:

polivinylalcohol

men chìm để tăng

khả năng lắng

Phương

pháp

tuyển

nổi

Là

phương

pháp dùng

bọt khí để

tách chất

rắn ra

Trong sản xuất bia

hay rượu vang

dùng albumin của

trứng để kết hợp

với tế bào nấm

men. Trong sản

khỏi dịch

lên men

xuất SCP từ

Acinertobacter

cerificans: protein

được thu trowng

dịch lên men được

cô đặc lại bằng

phương pháp

tuyển nổi

2. Các phương pháp phá vỡ tế bào. Nguyên tắc, ứng dụng của từng pp, các yếu tố

ảnh hưởng và ưu nhược điểm của từng phương pháp

Phương pháp phá vỡ tế bào:

Phương pháp phá vỡ tế bào được áp dụng để thu hồi các sản phầm sinh học nội

bào(protein nội bào), có một số phương pháp phá vỡ tế bào như sau:

+) Phương pháp cơ học.

Một số phương pháp cơ học được sử dụng cho việc phá vỡ tế bào là:

Phương pháp Nguyên tắc Ứng dụng Các yếu tố ảnh

hưởng

Đồng hóa áp suất

cao

Dịch huyền phù tế bào đi vào

qua van với vận tốc không đổi

dạng plus (xung ) và bị phá bởi

áp lực tức thời. Mỗi xung van

đóng và nén huyền phù tế bào

vào vòng đệm bằng kim loại

cứng đóng vai trò như tường

trong của buồng. Khi van mở,

dịch tế bào được giải phóng và

chu trình mới lại bắt đầu

Số lần phá vỡ.

Cấu tạo van

Tốc độ dòng

Nhiệt độ

Áp suất

+) Thiết bị đồng

hóa bằng tay

+) Áp suất

+) Thiết bị đồng

hóa Manton -

Gaulin

Tế bào ép qua lỗ nhỏ, phá màng

tế bào.

Tế bào được đưa vào lỗ nhỏ với

một áp suất cao, lực xé phá vỡ

tế bào

Tương tự phương pháp áp suất

nhưng cho quy mô lớn hơn

Phá vỡ tế bào Mô

gan

Vi khuẩn, tế bào

thực vật

Dịch huyền phù tế

bào.

Xay, nghiền cắt

+) Xay, nghiền

+) Đồng hóa bằng

dao

+) Nghiền bằng các

chất mài (nhôm,

cát)

+) Nghiền bằng bi

Lực cơ học cắt

Băm các mảnh lớn và xé nát các

mảnh vụn hơn

Xé thành tế bào bởi các ma sát

micro

Lắc nhanh cùng với các bi thủy

tinh phá vỡ tế bào

Phá vỡ tế bào mô cơ

Các mô cơ, phần lớn

tế bào động vật và

thực vật

Tế bào thực vật và vi

khuẩn

Dịch huyền phù tế

bào

+) Siêu âm Sử dụng sóng tần số cao để phá

vỡ thành và màng tế bào

20kHz/s. Có thiết bị chuyển dao

động sóng thành dao động cơ

học

Dịch huyền phù tế

bào

Loại tip

Nhiệt độ

Nồng độ tế

bào

Cốc đựng dịch

huyền phù tế

bào và hình

dạng cốc

+) Phương pháp hóa học

Phá vỡ tế bào bằng các tác nhân hóa học như:

- Kháng sinh: Ampicillin, cycloserine đối với tế bào đang sinh trưởng.

- Tác nhân chelates (tạo phức với kim loại), EDTA (lấy đi các ion trong thành tế

bào)

- Dung môi hữu cơ: aceton, butanol, chloroform, methanol.

- Chất sát trùng: triton X-100, sodium lauryl sunphate

- Kiềm

- Chaotropic agent(chất phá vỡ cấu trúc bậc 3 protein hay ADN): biến tính như

urea.

*)Ưu điểm:

*)Nhược điểm: Thường làm vô hoạt Protein

+) Phương pháp vật lý:

- Tự phân: Nấm men

*) Ưu điểm: Giá thành rẻ, dùng enzyme của chính tế bào để phá hủy màng tế bào,

không cần sử dụng thêm chất lạ nào khác.

- Áp suất thẩm thấu: hay dùng cho enzyme Periplasma: Cân bằng trong dịch đường

20% rồi nhanh chóng chuyển vào nước 4C.

- Đông/tan.

*)Ưu điểm

*) Nhược điểm: Chỉ áp dụng được với từng trường hợp cụ thể (periplasma)

+) Phương pháp Enzyme:

Sử dụng Enzyme để phá vỡ tế bào, thành tế bào bị thủy phân phá vỡ bằng thẩm

thấu

Một số enzyme thủy phân thường sử dụng:

- Lyzozyme cho Vi khuẩn gram (+)

- Lyzozyme và EDTA cho vi khuẩn Gram (-)

- Chitinaza cho nấm

- Proteaza và β-glucanaza cho nấm men.

*) Ưu điểm: an toàn

*) Nhược điểm:

- Phương pháp đắt tiền, chỉ dùng cho quy mô nhỏ

Cả hai phương pháp hóa học và enzyme chủ yếu không làm phá vỡ tế bào mà đục lỗ

hay làm thẩm thấu tế bào hơn là phá vỡ tế bào ra, dựa trên liên kết chọn lọc với các

chất ở thành tế bào làm thay đổi tính chất màng, do đó SP có thể đi qua.

3. Phương pháp lọc màng, phân loại, ứng dụng, các yếu tố ảnh hưởng và các vấn

đề hay gặp, cách chọn màng lọc.

Phương pháp lọc màng:

Màng là vật liệu dùng để phân tách các chất một cách chọn lọc. Màng có thể từ

polymer, gốm, các sợi cacbon và các cơ chất kim loại xốp.

Tiến hành lọc màng: Dịch lọc qua gọi là dịch thẩm thấu, dịch còn lại gọi là dịch cô

đặc. Việc thẩm thấu chọn lọc là cơ sở của phương pháp lọc màng.

Các thí dụ điển hình của phương pháp lọc màng: siêu lọc (thu hồi protein), thẩm thấu

ngược (loại muối trong nước), bốc hơi nước qua màng (tách cồn).

Đây là phương pháp tốn ít năng lượng, có thể thay thế phương pháp tách bằng nhiệt

thông thường (phương pháp bốc hơi hay chưng cất); rất tốt cho các sản phẩm ít chịu

nhiệt và có thể tiến hành liên tục tuy nhiên phương pháp này có thể gây ra hiện tượng

báo trên bề mặt màng lọc nên hay phải sửa chữa và vệ sinh thường xuyên.

+) Phân loại:

Một số loại màng lọc

- Loại porous: có lỗ, chính là tính chọn lọc của màng. Kích thước của lỗ có thể từ

<10 angstroms (1 nm) đến 100 microns (10-5 nm). Tuy nhiên nếu lỗ lọc nhỏ sẽ gây

lực cản lớn cho quá trình lọc. Để giải quyết vấn đề này người ta nghĩ ra loại màng

không đối xứng.

- Loại Non-porous: Loại màng không có lỗ. Liên kết giữa vật liệu màng và phân tử

chất lọc đóng vai trò quan trọng. Tính thẩm thấu của màng đối với hỗn hợp chất

lọc tỉ lệ khả năng hòa tan của phân tử chất lọc trong vật liệu lọc và khả năng

khuếch tán.

- Loại màng không đối xứng:

Gồm có 2 lớp: Lớp mỏng có lỗ quyết định tính chọn lọc của màng và tốc độ dòng lọc

Lớp dày có tác dụng đỡ và không có tính chọn lọc với hỗn hợp lọc và

không gây lực cản cho dòng lọc.

Theo kích thước lỗ lọc thì chia làm 4 loại:

- Vi lọc

- Siêu lọc

- Lọc nano

- Lọc thẩm thấu ngược

+) Ứng dụng:

- Trong công nghệ sinh học: Thanh trùng môi trường (lọc vô trùng); thu tế bào; loại

bỏ xác tế bào; cô đặc; loại bỏ Pyrogen (độc tố VSV); xử lý nước thải; thiết bị lên

men dạng màng; thoát hơi nước qua màng; thẩm tích máu cho thận nhân tạo.

- Trong công nghệ sinh học cổ điển: Trong công nghiệp bia (thanh trùng bia, bia có

nồng độ cồn thấp, thu hồi bia); Trong sản xuất rượu vang (tiệt trùng, làm trong và

ổn định, rượu vang có nồng độ cồn thấp). Sử dụng phương pháp lọc màng sẽ đạt

được các tiêu chí: không làm ảnh hưởng đến mùi vị, loại cái protein không bền

nhiệt, tannin, hợp chất màu, nấm men, hợp chất phenol bị oxi hóa.

+) Các yếu tố ảnh hưởng:

- Tốc độ dịch đầu vào

- Kích thước lỗ lọc

- Kích thước vật liệu lọc

- Độ nhớt của dịch lọc

- Áp suất qua màng lọc

- Độ dày của màng lọc

+) Các vấn đề gặp phải trong quá trình lọc

- Trở lực của màng thay đổi (Fouling). Hiện tượng mà chất tan đọng lại trên bề mặt

màng và trong các lỗ lọc, làm giảm dòng chảy và thay đổi tính chất khả năng phân

tách của màng.

- Hiện tượng phân cực màng

- Hiện tượng tắc màng

- Hiện tượng hấp phụ

- Tạo lớp gel.

+) Cách chọn màng lọc

Có thể tiến hành chọn màng lọc theo kích thước lỗ lọc, kích thước của vật liệu lọc.

Theo kích thước lỗ lọc chia ra làm 4 loại:

- Vi lọc: Chủ yếu dùng để lọc sinh khối vi khuẩn, kích thước màng 0.1 – 10 μm. Do

có thể loại được vi sinh vật nên còn gọi là lọc vô khuẩn. Thao tác với chênh lệch

áp suất thấp. Màng lọc có thể đối xứng hay không. Được ứng dụng rộng rãi trong

lọc vô khuẩn cho công nghiệp dược, đồ uống, thực phẩm, cô đặc sinh khối.

- Siêu lọc: Các phân tử chất hòa tan có kích thước1.0 – 100 nm hay 500 – 500,000

daltons bị giữ lại phụ thuộc vào molecular weight cutoff của màng. Molecular

weight cutoff được coi là kích thước phân tử của chất mà tại đó hệ số giữ lại 90 –

95%. Màng siêu lọc cần có chênh lệch áp suất 2 – 10 bar đến 25 – 30 bar. Thường

màng không đối xứng. Ứng dụng để cô đặc protein và tách protein có kích thước

nhỏ hơn.

- Lọc nano: Loại các chất có kích thước > 0,1 – 1 nm và khối lượng phân tử > 500 –

1000 daltons. Thường loại muối trong các sản phẩm thực phẩm, đồ uống, sữa.

Màng cellulose acetat loại 95% muối hóa trị 2 và 40% muối hóa trị 1.

- Lọc thẩm thấu ngược . Dựa trên nguyên tắc lực đẩy là do chênh lệch áp suất (áp

suất dùng và áp suất thẩm thấu). Loại các chất có kích thước < 0.1 nm và khối

lượng phân tử < 500 daltons. Màng cellulose acetat loại 96 – 99% muối NaCl.

Ứng dụng trong xử lí nước uống, nước thải, nước cho dược, cho thực phẩm.

4. Phương pháp trích li hai pha lỏng. Nguyên tắc, ứng dụng, hệ số phân bố

Phương pháp trích ly:

Là quá trình thu hồi 1 chất hay 1 nhóm các chất vào pha lỏng. Dùng để phân tách,

cô đặc, và tinh sạch sản phẩm. Thường là quá trình trước quá trình tinh sạch và

điển hình là trước bước sắc kí.

Quá trình trích ly là bước đầu trong sản xuất thuốc kháng sinh sau phân tách tế

bào. Ưu điểm của quá trình này là làm giảm đáng kể thể tích của sản phẩm.

+) Nguyên tắc: Dựa vào độ hòa tan khác nhau của các chất trong các dung dịch

khác nhau.

Phương pháp trích ly hai pha lỏng:

+) Nguyên lý: Trích ly lỏng lỏng là phương pháp sử dụng 2 chất lỏng không trộn

lẫn với nhau. Chất muốn trích ly có khả năng hòa tan khác nhau trong 2 chất lỏng

này Chất tan chuyển từ chất lỏng này sang chất lỏng khác.

+) Ứng dụng: Chất tan và dung môi có độ bay hơi giống nhau; Chất tan chịu nhiệt

kém; Nồng độ chất tan thấp Các sản phẩm sinh học và sản phẩm dược phẩm

phần lớn trích li lỏng lỏng.

+) Hệ số phân bố:

- Hệ số phân bố (Partition coeficient) K: là sự phân chia của chất tan tại điều kiện

cân bằng giữa hai pha lỏng.

K = y/x

Trong đó:

y- nồng độ chất tan trong pha trích ly

x- nồng độ chất tan trong pha raphinat

K- Hệ số phân bố.

Mong muốn K càng nhỏ càng tốt. Nếu K nhỏ cần trích ly nhiều và thể tích chất

trích ly lớn. Nếu K 0 thì không thể trích ly.

Hệ số phân bố phụ thuộc vào nhiều thông số: kích thước phân tử bị trích li, pH,

dạng dung môi, nhiệt độ, nồng độ và Mw của polime hay muối trong các pha

5. Tính tan của protein. Phương pháp kết tủa protein băng muối và dung môi

Tính tan của protein: là khả năng liên kết với các phân tử nước trong môi trường.

*) Các yếu tố ảnh hưởng tới tính tan của Protein:

- Cấu trúc và kích thước phân tử: Trong môi trường lỏng, protein ở dạng cấu trúc

giảm thiểu các liên kết của các axit amin kỵ nước với các phân tử nước và gia tăng

các liên kết của các gốc có cực và tích điện với phân tử nước. Các lực ổn định cấu

trúc protein: lực liên kết hidro, lực Van der Waal, lực dung môi khiến cho xu

hướng các gốc kỵ nước hướng vào bên trong phân tử Protein, các gốc mang cực và

điện tích hướng ra bên ngoài. Khi kích thước phân tử protein lớn thì độ tan kém.

- Sự tích điện protein: Điện tích của protein có ản hưởng trực tiếp tới tính tan của

protein. Điện tích của protein tăng sẽ làm cho tính tan của protein tăng do liên kết

của phân tử nước lưỡng cực. Cách đơn giản nhất để thay đổi điện tích của protein

là thay đổi pH. Giá trị pH mà tại đó điện tích của Protein =0 gọi là pI. Khả năng

hòa tan của protein nhìn chung kém nhất tại pI. Tuy nhiên do sự phân bố điện tích

không đều dẫn đến sự tạo thành phân tử moment lưỡng cực, do vậy làm tăng tính

tan và sự dịch chuyển độ tan kém nhất khỏi giá trị pI.

- Các dung môi sử dụng để hoàn tan protein: Dung môi ảnh hưởng tới tính tan của

protein thong qua tính kị nước và lực ion. Tại nhiệt độ cao, dung môi có thể làm

biến tính protein. Khả năng làm biến tính có thể tránh được tại nhiệt độ thấp. Mức

độ khả năng làm biến tính protein của một số loại dung mội:

Methanol < etanol < propanol < butanol.

Cồn với các gốc alkyl dài sẽ liên kết mạnh hơn đến các nhóm không phân cực của

protein, làm yếu các liên kết kỵ nước bên trong phân tử protein và do vậy chúng

làm biến tính protein. Lực ion có hai tác dụng trái ngược nhau là hòa tan (Salting –

in: nồng độ ion tăng làm tăng tính tan của protein; các ion chắn các điện tích và

cho phép protein gấp nếp tạo cấu trúc fold) và kết tủa (Salting – out: các ion cạnh

tranh với nước để liên kết các protein. Khi nồng độ muối cao protein sẽ kết tủa.)

protein.

*) Phương pháp kết tủa protein bằng muối hoặc dung môi.

Các bước xảy ra trong quá trình kết tủa:

- Khuấy ban đầu

- Tạo nhân

- Tăng kết tủa nhờ khuếch tán

- Tăng kết tủa nhờ chuyển động của chất lỏng.

Phân tử protein không tan nếu không có muối tại pI nhưng nếu thêm ít muối trở nên

tan(euglobulin). Một số protein lại tan trong nước cũng như trong dịch có nồng độ

muối cao(albumin). Tương tự nguyên tắc này nhưng theo chiều ngược lại, người ta

cũng có thể tiến hành kết tủa protein bằng muối hoặc bằng dung môi.

Mô hình Cohn mô tả quá trình kết tủa khi nồng độ ion cao:

Log S = β – KsI

Trong đó:

Ks là hằng số kết tủa phụ thuộc vào protein và muối mà không phụ thuoscj vào nhiệt

độ và pH khi pH >pI

β – độ tan giả thiết của protein khi lực ion =0 chỉ phụ thuộc vào nhiệt độ khi pH bé

nhất tại pI.

Ứng dụng :

Kết tủa là phương pháp phổ biến để thu hồi protein từ hỗn hợp protein; thu hồi protein

từ dịch ngoại bào.

Cách dùng:

- Dùng các muối vô cơ (Sulfat amon, sulfat natri………..)

- Dùng dung môi hữu cơ (axeton, etanol)

Phần II:

A- Phương pháp tinh chế sản phẩm:

Câu 1: Đặc điểm của quá trình tách sản phẩm sinh học:

- Nguyên liệu ban đầu:

+ dịch lên men ( vi sinh vật), dịch huyền phù tế bào (động vật, thực vật ) hoặc môi trường hỗn hợp.

+ Vật liệu sinh học ( máu, tế bào…)

- Các tính chất sử dụng trong phương pháp tách: tính kích thước, trọng lượng, tính hòa tan, điện tích, tính kỵ nước hay lien kết đặc hiệu.

- Chất lượng sản phẩm: Độ tinh khiết, hoạt tính, tạp chất, tính sinh học, độ bền.

Câu 2: Nguyên tắc thực hiện quá trình tách sản phẩm sinh học:

- Cần xác định mục tiêu để tinh sạch, thu hoạt tính hay chất lượng ở sản phẩm cuối cùng.

- Xác định tính chất của protein và mức độ tinh sạch để lựa chọn kỹ thuật phù hợp.

- Chọn phương pháp phân tích nhanh, hoạt tính protein, thu hồi, tạp chất.

- Giảm tối thiểu chất bổ sung, phụ trợ

- Loại bỏ các chất có thể gây cản trở quá trình, ví dụ như protease…

- Sử dụng các kỹ thuật tách khác nhau ở cá bước, dựa vào kích thước, điện tích, tính kỵ nước, hay liên kết đặc hiệu.

- Giảm tối thiểu số bước thực hiện: tránh giảm năng suất, tiết kiệm thời gian.

Câu 3: Các tính chất của protein ảnh hưởng đến quá trình tinh sạch:

- Tính bền nhiệt: Protein không bền ở nhiệt độ cao, vì vậy cần thao tác nhanh ở nhiệt độ thấp và chọn dung dịch đệm thích hợp để tách chiết.

- Tính bền pH: chọn điều kiện trao đổi ion, sắc ký ái lực và sắc ký đảo pha.

- Tính bền dung môi: lựa chọn điều kiện sắc ký đảo pha.

- Kết tủa bằng muối: chọn điều kiện kết tủa, sắc ký trao đổi ion, tương tác kỵ nước.

- Các tác nhân khác: chọn chất bổ sung, chất đệm, pH thích hợp.

- Nhạy với protease: Cần loại bỏ, hoặc dung chất ức chế.

- Phản ứng với kim loại nặng: bổ sung them EDTA hay EGTA vào đệm.

- Tính oxy hóa: cần dung tác nhân khử.

- Trọng lượng phân tử: Lựa chọn môi trường lọc gel.

- Tính tích điện: Lựa chọn điều kiện trao đổi ion.

- Tính kỵ nước: chọn môi trường tương tác kỵ nước.

- Biến đổi tính chất: sắc ký ái lực.

B- Các phương pháp sắc ký:

Câu 1: Khái niệm và nguyên tắc của các phương pháp sắc ký:

Khái niệm của Mikhail S. Tsvett (1960): sắc ký là một phương pháp tách trong đó các cấu tử của một hỗn hợp được tách trên một cột hấp thụ đặt trong một hệ thống đang chảy.

Khái niệm của IUPAC (1993): Sắc ký là một phương pháp tách trong đó các cấu tử được tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định.

Thuật ngữ sắc ký để chỉ một tập các kỹ thuật phân tích và điều chế cho phép tách biệt các hợp phần khác nhau của một hỗn hợp.

-Nguyên tắc tách bằng sắc ký: dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất tan giữa pha động (mobile phase) và pha tĩnh ( stationary phase).

- Hệ số phân tách:

K= Cs / Cm

Trong đó: Cs: nồng độ chất tan trong pha tĩnh

Cm: nồng độ chất tan trong pha động.

Câu 3: Nguyên tắc của sắc ký trao đổi ion:

- Sự tách xảy ra di ái lực khá nhau của các ion trong dung dịch đối với các trung tâm trao đổi ion ( nhóm chứa ion) trên chất rắn là pha tĩnh ( nhựa trao đổi ion).

-Dung môi là nước hoặc hỗn hợp nước- dung môi hữu cơ trong môi trường có độ điện môi tương đối lớn để các ion có thể tồn tại tự do và bền.

- Protein là một đại phân tử mang điện tích, có vùng tích điện thay đổi theo pH. pH mà tại đó protein có điện tích bằng 0 ( trung hòa về điện) được gọi là điểm đẳng điện. Ở trên điểm đẳng điện, protein tích điện âm và ở dưới điểm đẳng điện, protein tích điện dương. Ở một pH nhất định, các protein sẽ có một điện tích không giống nhau, do đó chúng được giữ nhiều hay ít bằng tương tác ion trên một nhựa ion đã cho và với một pha di động đã cho.

Câu 4: Các dạng sắc ký trao đổi ion:

Có 2 dạng sắc ký trao đổi ion, được phân loại dựa vào khả năng lien kết với các nhóm chức tích điện trái dấu: dạng sắc ký trao đổi anion và dạng sắc ký trao đổi cation.

- Dạng sắc ký trao đổi anion:

+ Một khung có các nhóm chức tích điện dương được bao quanh bởi chất mang không tan và ion đối tích điện âm được gọi là nhựa trao đổi anion.

+ Những Protein tích điện âm có thể thế chỗ các ion đối và được bao quanh bởi nhựa trao đổi ion.

+ ion đối trong dung dịch đệm rửa giải sau đó trao đổi với hỗn hợp các protein, và giải phóng ra protein mong muốn từ nhựa trao đổi ion.

+ Sự phân tách được dựa trên độ mạnh liên kết của protein với nhựa trao đổi ion.

- Dạng sắc ký trao đổi cation:

+ Một khung có các nhóm chức tích điện âm được bao quanh bởi chất mang không tan và ion đối tích điện dương được gọi là nhựa trao đổi cation.

+ Những protein tích điện dương sẽ thế chỗ các ion đối và được bao bởi nhựa trao đổi ion.

+ Ion đối trong đệm rửa giải trao đổi với hỗn hợp các protein, và giải phóng ra protein mong muốn từ nhựa trao đổi ion.

+ Sự phân tách dựa vào độ mạnh liên kết của protein với nhựa trao đổi ion

Câu 2: Phân biệt các phương pháp sắc ký: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký trao đổi ion và sắc ký rây phân tử:

* Giống nhau: đều dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất tan giữa pha động, và pha tĩnh.

- Được sử dụng để tinh sạch các sản phẩm.

* khác nhau:

Sắc ký hấp phụ

Sắc ký phân bố

Sắc ký trao đổi ion

Sắc ký rây phân tử

Nguyên tắc

Dựa vào ái lực khác nhau của các chất hấp phụ rắn ( pha

Dựa vào độ tan khác nhau ( sự phân bố khá nhau) của các

Sự tách xảy ra do ái lực khác nhau của các ion trong

sử dụng các vật liệu rắn, có độ xốp lớn, có các lỗ với kích

tĩnh) chất giữa pha tĩnh lỏng (được giữ bởi chất mang rắn) và pha động

dung dịch đối với cá trung tâm trao đổi ion ( nhóm chứa ion) trên chất rắn là pha tĩnh. Pha tĩnh là nhựa trao đổi ion.

thước nhất định để rây chọn lọc các cấu tử tùy theo kích thước và hình dạng phân tử.

- Đối với các chất hấp phụ phân cực, ái lực chủ yếu do tương tác các cực. Do nhóm phân cực trong phân tử ảnh hưởng tới kết quả tách mạnh hơn các mạch hydratcarbon không phân cực

- Trong sắc ký lỏng, pha tĩnh thường phân cực hơn pha động, tuy nhiên cũng có nhiều trường hợp ngược lại.

- Độ phân cực của các chất được sắc ký cũng như của các pha tĩnh và động có ảnh hưởng tới quá trình tách.

- Dung môi là nước hoặc hỗn hợp nước- dung môi hữu cơ trong môi trường có độ điện môi tương đối lớn để các ion có thể tồn tại tự do và bền.

- Các zeolit tổng hợp có giá trị rất lớn trong sắc ký rây các chất khí.

- Các chất xốp vô cơ, hữu cơ, polime tổng hợp để tách các chất vô cơ và hữu cơ.

- Nhóm polime ưa nước ( loại dextran mạng) được dung để tách các chất có hoạt tính sinh học

Câu 5: Mục đích sử dụng sắc ký trao đổi ion trong quá trình tinh sạch tách sản phẩm:

Sắc ký trao đổi ion được ứng dụng như một bước trong quá trình tinh sạch protein, được sử dụng sau khi kết tủa protein hoặc sau lọc gel, nếu kết tủa bằng muối thì cần thẩm tích trước khi sắc ký, có thể dùng trực tiếp ngay sau khi lọc gel.

Ngoài ra có thể sử dụng phương pháp này trước sắc ký ái ái lực và sắc ký tương tác kỵ nước.

Câu 6: Các bước và thao tác thực hiện quá trình trao đổi ion:

- Hấp phụ thuận nghịch protein- enzyme cần tinh sạch ( và các protein có điện tích gần giống) vào nhựa trao đổi ion: protein mang điện tích sẽ thế chỗ cho ion đối mang điện tích trái dấu và được hấp thụ vào nhựa trao đổi ion.

- Khử hấp phụ các protein đã được hấp phụ:

+ bằng cách thay đổi pH của dịch rửa sẽ dẫn đến thay đổi độ ion hóa và do đó thay đổi điên tích tổng của protein.

+ hoặc bằng các tăng lực ion và tăng nồng độ ion đối cạnh tranh. Các protein, enzmyme nào có ái lực với nhựa trao đổi ion yế nhất sẽ được đẩy ra trước tiên và ngược lại.

+ Các protein- enzyme khác nhau sẽ được tách chiết ra khỏi cột theo từng phần tách chiết (phân đoạn chiết) khác nhau, trong đó phần chiết enzyme cần thu có nồng độ cao nhất.

- Khả năng xác định bởi nhóm chức, trao đổi mạnh hay yếu tùy theo khả năng ion hóa khi thay đổi pH.

+ khả năng mạnh: ion hóa trong dải pH rộng.

+ Định lượng khả năng trao đổi ion để lien kết ion, tùy thuộc vào số nhóm chức.

Câu 7: Tính chất các loại nhựa trao đổi ion và phạm vi ứng dụng:

* Carboxymethyl sephadex ( CM sephadex):

- Đặc tính:

+ kích thước hạt: 40- 125 µm ( khô)

+ kích thước lỗ: giới hạn loại trừ 200000.

+ pH = 6- 10.

- Phạm vi ứng dụng: sử dụng trong sắc ký trao đổi cation liên kết yếu.

* Diethylaminoethyl Sephadex ( DEAE sephadex):

- Đặc tính:

+ Kích thước hạt: 40- 125 µm ( khô)

+ kích thước lỗ: giới hạn loại trừ 30000 Da.

+ pH = 2-9

+ Công suất: 3-4 meq/g

- Phạm vi ứng dụng: sử dụng trong sắc ký trao đổi anion lien kết mạnh và yếu.

* Sulfopropyl Sephadex:

- Đặc tính:

+ kích thước hạt: 40- 125 µm ( khô)

+ kích thước lỗ: giới hạn loại trừ 200000 Da

+ pH= 2- 10.

+ công suất: 2- 2.6 meq/g.

- Phạm vi ứng dụng: sử dụng trong sắc ký trao đổi cation mạnh.

Câu 8: Nguyên tắc và bản chất của phương pháp sắc ký lọc gel? Mục đích và ứng dụng của phương pháp?Trả lời: Bản chất SKLG: - Dựa vào sự khác nhau của kích thước phân tử của các hợp chất. người ta cũng gọi

là lọc gel hay sắc ký rây.- Pha tĩnh là dung môi trong các lỗ gel- Pha động chính là dung môi đó chạy qua

Nói cách khác, pha động và pha tĩnh cùng là 1 dung môi hay hỗn hợp các dung môi.

Nguyên tắc SKLG:Hình vẽ trong slide nhé

Hình vẽ nguyên tắc sắc ký lọc gel(A) Các hình tròn lớn biểu diễn các phân tử có kích thước lớn đi ở bên ngoài lỗ gel.

Các chấm nhỏ là các phân tử có kích thước nhỏ nằm trong lỗ gel(B) Hình sắc ký đồ. Có thể tính hệ số phân bố Kav đối với các peak , tương tự như Kf của sắc ký lớp mỏng.Kav = (Ve – Vo)/(Vt-Vo)Kav = 0 đối với protein kích thước lớn và Kav =1 khi protein có kích thước nhỏ nhất. có thể xây dựng mối tương quan giữa Kav với kích thước phân tử protein Ve = Vt= Vo+Vi

Ve: trong thể tích rửaVo: thể tích trống và Vt : thể tích tổngThể tích bên trong hat Vi= Vt – Vo. Cuối cùng một lượng thể tích hạt Vg không chứa các phần tử

Ứng dụng của SKLG: SKLG được dùng để xác định sự phân bố của các phân tử polyme theo kích thước phân tử: được dùng để làm sạch, tách các polypeptide, protein, các hợp chất cao phân tử khác.

Mục đích của SKLG:

Loại muối:

- Tách nhóm

- Sử dụng tách muối khỏi protein- Protein thu được trong thể tích trống - Sử dụng Sephadex G-25, Bio-Gel-P6- Sử dụng cột mini (ví dụ Bio-Spin-6)

Phân đoạn:

- Sử dụng hạt gel có kích thước tương ứng để tách phân tử protein mong muốn

- Thể tích mẫu 1-3% thể tích Vt

- Khoảng đệm pH= 2-10- Kích thước gel lớn thì tốc độ dòng lớn nhưng kết quả tách không tốt.

Câu 9: Đăc điểm các loại gel sử dụng trong phương pháp sắc ký gel? Nguyên tắc lựa chọn Pha động

Trả lời:

- Các loại gel được sử dụng: Gel mềm Gel cứng Gel nửa cứng

Gel được tạo thành từ dextran, polyacrylamid hoặc polymer thiên nhiên haytổng hợp khác.

a. Gel mềm Là những hợp chất cao phân tử có số liên kết ngang ko đáng kể. loại này có tỷ số

VT/VN =3 (tỷ số thể tích dung môi bên trong gel và bên ngoài gel). Loại gel mềm khi trương, thể tích tăng đáng kể.

Dùng để tách các hợp chất có khối lượng phân tử thấp.

b. Gel nửa cứngĐược chế tạo bằng phương pháp trùng hợp. loại gel phổ biến nhất là sản phầm

đồng trùng hợp của styrol và divinylbenzen hay sản phẩm trùng hợp của vinylaxetat. Hệ số thể tích của gel này là: 0.8 - 1.2.

Khi trương, thể tích của chúng tăng lên không nhiều: 1.2 - 1.8 lần Loại sắc ký nửa gel được gọi là sắc ký gel xuyên thấu(permeation)c. Gel cứng

Thường là silicagen hay thủy tinh xốp với lỗ xốp có kích thước xác định. Thực chất những vật liệu này không phải là gel. Loại gel cứng có hệ số thể tích không lớn: 0.8 – 1.1

Loại gel này được dùng trong sắc ký gel cao áp.

- Nguyên tắc lựa chọn pha động: các dung môi trong sắc ký gel phải hòa tan được cấu tử trong hỗn hợp, thấm ướt trên bề mặt gel nhưng ko bị gel hấp phụ.

Câu 10: Các bước và thao tác thực hiện sắc ký lọc gel

Trả lời:

I/ Chuẩn bị gel

a. Trương hơp sư dụng gel khô

1a- Tính lượng gel khô cần thiết, dựa vào hệ số trương nở của gel và thể tích của cột. Đưa toàn bộ lượng gel đã tính toán vào dung dịch đệm có thể tíchgấp 2 lần thể tích gel cuối cùng.

2a- Khuấy đều gel bằng đũa thủy tinh.Để cho gel nở trong thời gian 1 đêm, ở nhiệt độ thường hoặc 3 h trong điều kiện 90oC bằng bồn ổn nhiệt, khuấy đều để gel luôn ở dạng huyền phù.

(Chú ý: Không được dùng khuấy từ , sẽ làm vỡ gel)

3a- Để lớp gel lắngxuống, sau đó loại các hạt gel bé và vỡ bằng cách gạn lớp đục ở trên. Lặp lại việc gạn 4-5 lần nếu cần thiết cho tới khi thấylớp gel lắng xuống phân lớp ro ràng, rồi bổ sung dung dịch đệm saocho lớp gel chiếm 50% thể tích.

( Muc đich cua bươc nay la đê tranh sư tăc côt sau nay do cac phân hạt nho gây ra).

b. Nêu gel đươc cung cấp dươi dang trương nơ tư trươc

1b- Rửa gel bằng dung dịch đệm bằng phễu thủy tinh Buchner để loại bỏ dịch lỏng trong đó.

2b- Nếu gel có chứa các phần hạt nhỏ thì cần gạn lọc như bước 2 ở phần a

3b- Hòa gel với dung dịch đệm để có tỷ lệ 50% thể tích là dung dịch đệm

II/ Chuẩn bị cột

4. Kiểm tra độ sạch của cột, kiểm tra lưới trong cột không bị hỏng

5. Đặt giá lên bàn, kiểm tra độ thẳng đứng của cột. Chuẩn bị cột có thể tích lớn hơn gấp 2 lần so với thể tích gel đã có.

6. Loại bỏ không khí trong cột bằng cách bơm dung dịch đệm vào cột từ đáy (bằng xilanh hoặc bơm) cho đến khi ngập quá lưới chăn 0,5 cm. Đóng nắp.

7. Đưa dung dịch đệm vào cột từ phía trên bằng ống nối cho đến khi lưới ngấm ướtvà giữ cho van thoát ở trạng thái đứng để không khí được đẩy ra khỏi lưới trên. Đặt ống nối vào cốc chứa dung dịch đệm cho đến khi kết thúc.

8. Lắc đều gel đã chuẩn bị và đổ vào cột dọc theo đũa thủy tinh vào thành trong của cột. Đổ dung dịch đệm vào chỗ trống còn lại, đổ dọc thành ống sao cho không làm xáo trộn lớp gel. Đậynắp.

9. Đổ dung dịch đệm vào bình chứa và đặt bình ở vị trí cao hơn bơm. Nối bình chứa dung dịch đệm với bơm.

10. Rửa bơm bằng dung dịch đệm và nối đầu ra của bơm với đầu vào của cột hay cột mở rộng. Mở van ra của cột và bắt đầu bơm với tốc độ đã định. Bơm đều cho đến khi chiều cao của lớp gel ổn định. (khoảng 1-4 h).

11. Tắt bơm, đóng van ra của cột, bỏ cột phụ, bổ sung gel nếucần.

12. Lại nối cột với bơm, mở van thoát của cột và nhắc lại thao tác ở bước 10 trong vòng 1 giờ để ổn định chiều cao cột. Thay ống nối để đổ thêm gel.

13. Kiểm tra lại cột nhồi bằng cách quan sát có sử dụng đèn chiếu từ phía sau cột.

III/ Chạycột

14. Tính thể tích dung dịch đệm cần thiết và bổ sung 50% thể tíchcần, lọc qua màng lọc 0,22 µm. Điều chỉnh pH nếu cần và đổ vào bình chứa dung dịch đệm.

15. Lắp hệ thống lọc gel với hệ thống detector và bộ phận ghi. Nối bình dung dịch đệm với bơm và rửa bơm bằng dung dịch đệm, không qua cột.

16. Nối đầu bơm với cột qua van bơm, chạy hệ thống bằng dung dịch đệm với tốc độ đã định săn, thu các phân đoạn và ghi tốc độ dòng tức thời.

IV/ Xác định thể tích tách

17. Xác định thể tích trống củahệ thống (Vo) bằng cách chạy với marker và thu được thể tích rửa theo bước 20 đến 23

Thể tíchVothường chiếm 30-33% thể tích đối với gel mềm (như agarose) và chiếm 36-40% thể tích của khối đối với gel cứng (silic)

18. Xác định thể tích tổng của hệ thống (Vt) bằng cách chạy với chất đánh dấu và thu được thể tích rửa như ở bước 20 đến 23.

19. Tính thể tích tách của cột Vi = Vt- Vo

Thể tích Vi là lượng chất lỏng đi qua cột từ điểm mà protein lớn bắt đầu xuất hiện cho đến khi những hạt nhỏ được rửa ra. Nó chính là thể tíchlỗ của lớp gel, thường chiếm 50-65% thể tíchlớp gel đối với gel mềm và 30-50% đối với gel cứng.

V/ Chuẩn bị thực hiện mâu phân tích

20. Hòa mẫu và loại muối trong dung dịchđệm. Lọc qua màng lọc 0,22µm.

- Cần để mẫu đạt nhiệt độ phòng trước khi chạy cột để tránh khỏi cản trở của độ nhớt cao. Thông thường sử dụng mẫu có hàm lượng protein 50 mg/ml-70 mg/ml. Còn ở nồng độ 100 mg/ml sẽ nhớt.

21. Mở van đáy, bật bơm, để cho dịch đệm chảy qua cột (2 lần thể tích gel). Bật detector và chạy nền cho ổn định.

22. Chạy mẫu với một thể tích tương ứng để loại muối, không quá thể tích tách đã được xác định ở bước thứ 19. Bật van mẫu vào vị trí “load” và bật vào dấu “start” để chạy giấy in.

23a. Xác định thể tích rửa. Cho dung dịch đệm chạy qua hệ thống với tốc độ tương ứngvà đáp ứng detector khi thu các phân đoạn. Xây dựng sắc ký đồ và tính thể tích rửa bằng cách lấy thời gian kể từ điểm xuất phát cho đến khi đạt peak nhân với tốc độ dòng chảy .

23b. Loại muối. Cho một thể tích dung dịch đệm bằng thể tích trống trừ một nửa thể tích mẫu chạy qua dung dịch và thu phân đoạn. Đặt bình thu ở dưới cột để có thể chứa 1,5 lần thể tích mẫu, sau đó bổ sung thể tích dung dịch đệm bằng với thể tích mẫu. Thu protein đã loạimuối.

24. Rửa cột bằng dung dịch đệm có chứa chất kháng khuẩn với một lượng lớn hơn thể tích cột. Đóng van xả của cột và bảo quản cột.

Câu 11: Bản chất của phương pháp sắc ký ái lực

Trả lời:

SKAL là phương pháp tách hỗn hợp các chất dựa trên tương tác sinh học đặc trưng giữa

- Antigen và antibody- Enzyme và cơ chất- Chất nhận và chất gắn

SKAL xem như là phương pháp sinh học hiện đại để tinh sạch axit nucleic, protein tái tổ hợp, dịch chiết tế bào.

Bản chất:

- Sắc ký hấp phụ- Hấp phụ đặc trưng đối với chất gắn(ligand)-phối tử- Quá trình thuận nghịch- Chất gắn được cố định vào chất mang ko hòa tan(matrix)

Câu 12: Các loại sắc ký ái lực? Có những tương tác liên kết sinh học nào? Ví dụ cụ thể

Trả lời:

Mình tìm được tài liệu không chính thống nhưng cứ viết ra để các bạn tham khảo

Các loại SKAL:

Dựa vào chất được sử dụng trong pha tĩnh:

- Sắc kí ái lực lectin. - Sắc kí ái lực boronate.- Sắc kí ái lực protein hay protein G. - Sắc kí ái lực miễn dịch.

Những tương tác liên kết sinh học:- Enzyme ↔ cơ chất, chất kìm hãm, cofactor- Kháng thể ↔ kháng nguyên, virus, tế bào- Lectin ↔ polysaccharide, glycoprotein, chất nhận bề mặt tế bào, tế bào- Hormone, vitamin ↔ receptor, carrier protein- Glutathione ↔ glutathione – S – transferase hoặc GST fusion proteins - Ion kim loại ↔ poly(His) fusion proteins, native proteins with histidine, cysteine

and/or tryptophan residues on their surfaces

Ví dụ cụ thể:

SKAL lectin là dạng sắc ký ái lực mà trong đó lectin được sử dụng để tách các thành phần trong mẫu. Lectin là protein có thể gắn kết đặc hiệu với phân tử đường. Ứng dụng quan trọng là tách các protein dựa vào các nhóm glycosyl hóa.Lectin là một loại protein không có nguồn gốc miễn dich có khả năng liên kết thuận nghịch, phi hóa trị với carbonhydrate mà ko thay đổi cấu trúc của carbonhydrate được liên kết. lectin gắn kết với những tế bào glycoprotein hoặc glycolipid bề mặt.

Câu 13: Cấu tạo, bản chất của chất gắn kết và chất mang (matrix). Tính chất của các chất mang? Lấy ví dụ cụ thể để chọn chất gắn kết tương ứng với nhóm chức liên kết.

Trả lời:Tính chất của chất mang:

- Trơ về mặt vật lý và hóa học- Không tan

- Có nhóm hóa học phù hợp để gắn phối tử- Phải bền trong suốt quá trình gắn mẫu- Có cấu trúc đồng nhất đối với tốc độ dòng chảy.

Các dang chất mang:- Cellulose- Agarose, cross-linked agarose- Polyacrylamid- Thủy tinh xốp/ gốm xốp

Ví dụ cụ thể để chọn chất gắn kết tương ứng với nhóm chức liên kết:

Ligand(chất gắn kết) Nhóm chức năng

Protein, peptide, aminoacid Amino, cacboxyl, thiol

sugar Hydroxyl, amino

polynucleotide Amino, mercurated base

Coenzyme, cofactor, antibiotic, steroid Amino, cacboxyl, thiol or hydroxyl

Câu 14: Thế nào là sắc ký tương tác kỵ nước? Nguyên tắc của phương pháp? Úng dụng của phương pháp

Trả lời:

SKTTKN (HIC: hydrophobic interaction chromatography)là một kỹ thuật hấp phụ protein nhờ tương tác phi đồng hóa trị giữa các vùng không phân cực trên bề mặt protein và mạng lưới kỵ nước để tách protein ra khỏi các thành phần khác.

Tiến hành đặc trưng ở nồng độ muối cao, rửa giải bằng cách giảm nồng độ muối.

Nguyên tắc:

Hình vẽ trong slide

Các phân tử nước được sắp xếp trật tự quanh mảng protein và phối tử cố định

Khi protein gắn kết với chất mang trên pha tĩnh thì các phân tử nước được sắp xếp sẽ giải phóng ra và tụ tập lại thành 1 khối nước.

Ứng dụng của phương pháp:

- ở bước đầu tiên cho quá trình tinh sạch khỏi môi trường- sau khi kết tủa muối- sau khi chạy sắc ký ion

cả 3 bước này đều luôn sử dụng ở nồng độ muối cao.

HIC được sử dụng kết hợp với các phương pháp tinh sạch khác.

Ví dụ: Quá trình tinh sạch IgG1 của chuột ở quy mô lớn:

Môi trường tế bào→lọc→bổ sung (NH4)2SO4→HIC→cô đặc→lọc gel

Câu 15: Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả sắc ký tương tác kỵ nước. Bản chất của pha tĩnh.

Trả lời:

Các yếu tố ảnh hưởng:

Pha tĩnh: - chất mang(phụ thuộc loại chất mang)

-chất kết gắn (phụ thuộc loại, tỷ trọng của chất kết gắn)

Pha động: - muối (loại muối, nồng độ muối)

-pH

-nhiệt độ

-chất bổ sung

a. Ảnh hưởng của muối

Sử dụng muối: gắn ở nồng độ muối cao, chất quan tâm được giữ lại trên pha tĩnh; rửa giải ở nồng độ muối thấp.

Ảnh hưởng của muối đến kết tủa protein:

Xem danh sách các ion trong slide

Các ion làm tăng cấu trúc của nước→tăng độ mạnh của tương tác kỵ nước

Ảnh hưởng của muối đến sức căng bề mặt của nước

Danh sách các muối xem trong slide

Tăng sức căng bề mặt của nước → tăng khả năng giữ lại của protein trong HIC

Sự giữ lại phụ thuộc vào ái lực của muối với pha tĩnh và các protein

b.Ảnh hưởng của nhiệt độ và pHnhiệt độ: khả năng giữ lại của Pr tăng theo nhiệt độ, rửa trôi Pr giảm theo nhiệt độpH: sự giữ lại phụ thuộc vào pI của Pr, quá trình rửa giải có thể thực hiện bằng cách tăng pH.

c. Chất bổ sung:- Để tăng tính tan của protein- Tăng quá trình rửa trôi của protein- Rửa cột

Water- miscible alcohol(ethanol, ethylenglycol) Aliphatic amines (butylamine) Detergents (triton X-100, Tween 20) Chaotropic salts

Bản chất của pha tĩnh:

Các phối tử kỵ nước được cố định trên chất rắn mang

Mức độ thay thế có thể ảnh hưởng đến sự phân tách

Các loại vật liệu được sử dụng:

Carbohydrates

- Cross-link agarose (sepharose)- Dextran (sephadex)- Cellulose

Silica

Synthetic copolymer (polyme tổng hợp)

Các chất gắn:

Linear alkanes

Methyl<ethyl<propyl<butyl<pentyl<hexyl<octyl

Tính kỵ nước gia tăng của chuỗi làm tăng lực tương tác nhưng cũng có thể làm giảm tính chọn lọc hấp phụ

Aryl(aromatic) group: nhóm chất thơm

Ví dụ: phenyl

Kết hợp tương tác kỵ nước và tương tác của chất thơm (π-π)

Intermediate hydrophobic ligands: cac chất găn kỵ nươc trung gian

Ví dụ: polyethers

PEG(polyethylene glycol) < PPG(polypropylene glycol) < PTMG(polytetramethylene glycol)

Điều kiện rửa giải êm dịu hơn

Câu 16: Phân biệt phương pháp sắc ký tương tác kỵ nước và sắc ký đảo pha

Trả lời:

HIC RPC(reverse phase chrom)

Chất mang thay thế ít Chất mang thay thế nhiều

Ít cấu tử kỵ nước Nhiều cấu tử kỵ nước

Liên kết yếu Liên kết mạnh

Rửa giải bằng nước/ dung dịch đệm loãng Rửa giải bằng dung môi không phân cực

Không làm biến tính protein Làm biến tính protein

Sắc ký hấp phụ Sắc ký phân loại

Sắc ký dưới áp suất thấp Sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Câu 17: Mục đích tạo tinh thể protein - Để xác định cấu trúc protein- Để hiểu được sự liên kết của protein với các cấu tử/ cơ chất/ thuốc- Để hiểu được cơ chế xúc tác enzyme của protein- Để xác định vị trí đúng của nguyên tử trong phân tử protein.- Phương pháp: Tinh thể học tia X( 80% cấu trúc phân tử protein được xác định

bằng tia X)- Không giới hạn về kích thước: tất cả virus và riboxom đều được phân tích- Tinh thể dùng để khuếch đại tín hiệu (1 tinh thể chứa 109 – 1013 phân tử)- Sử dụng cho kết tinh phối hợp với các cấu tử

Câu 18: Tính chất của tinh thể protein

Khác với phân tử muối(sắp xếp chặt), các phân tử protein có đặc tính:- Lớn hơn (>1000 nguyên tử so với 2- 10 nguyên tử)- Hình dạng không đều- Có bề mặt dị thường. Vì vậy các tinh thể protein có diện tích tiếp xúc giữa các

phân tử riêng biệt ít hơn.- Mềm hơn và dễ vỡ hơn- Một loại protein có thể phát triển thành các tinh thể có hình dạng khác nhau, sử

dụng các vùng tiếp xúc giữa các phân tử khác nhau.- Cần có điều kiện pH, nồng độ muối, nhiệt độ để giữ trạng thái ban đầu.- Chứa khoảng 50% nước hình thành các kênh- Khó tạo tinh thể hơn muối nhiều.

Câu 19: Các giai đoạn quá trình tinh thể hóa protein- Thu nhận lượng lớn protein tinh khiết- Chọn lượng dung dịch đệm protein mà protein có thể tan tốt và bền vững. - Làm bão hòa dung dịch protein để có thể xảy ra quá trình tạo nhân tinh thể một

cách tự phát- Các tinh thể lớn dần.

Các yếu tố ảnh hưởng- Độ tinh khiết của protein- Nồng độ protein- Điều kiện ban đầu (chuẩn bị dung dịch protein)- Tác nhân gây kết tủa- Nhiệt độ- pH- Các chất bổ sung (chất tẩy rửa, chất khử, cơ chất, đồng nhân tố)

C/ Các phương pháp sấy

1. Phân biệt vật liệu sinh học và sản phẩm sinh học.

2. Những biến đổi của vi sinh vật trong quá trình sấy?

3. Phương pháp sấy chân không? Ứng dụng?

4. phương pháp sấy đông khô. Ứng dụng?

5. phương pháp sấy tầng sôi. Ứng dụng?

6. Phương pháp sấy phun. Ứng dụng?

7. Hãy cho một ví dụ cụ thể về việc sấy tinh sạch một sản phẩm /vật liệu sinh học

(phân tích cơ sở lựa chọn phương pháp, điều kiện thực hiện quá trình sấy)

Câu 1: - Vật liệu sinh học (biomaterial): là vật chất liên quan đến cơ thể sống hay chức

năng sống và hoạt động sống.

Ví dụ: colagen, dextran, cellulose, chitosan, PLA, PGA- Sản phẩm sinh học (bioproduct): được định nghĩa là 1 vật liệu sinh học hay là sản

phẩm của quá trình chuyển hóa khi sử dụng vi sinh vật, các thành phần hay các chất có hoạt tính sinh học.

Ví dụ: etanol, enzyme…

Câu 2:

Những biến đổi của vi sinh vật trong quá trình sấy- Biến đổi về tính chất

Hóa sinh Enzyme Hóa học Vật lý

Sự teo tế bào (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc)

Mất hoạt tính enzyme và vitamin

Giảm giá trị dinh dưỡng protein, hydratcacbon, chất béo, chất kháng sinh, acid amin và mất hương thơm

Giảm các tính chất hữu ích (tính tan, hồi nước, bị co lại, giảm khối lượng

- Sấy là quá trình đưa vi sinh vật về dạng tiềm sinh, là trạng thái tạm thời nhưng thuận nghịch về chức năng được tạo ra do tác động của các yếu tố bên ngoài. Trong trạng thái này, tốc độ của các quá trình diễn ra chậm và nó lại trở lại hoạt động bình thường khi có đủ điều kiện trở lại.

Câu 3: Sấy chân không- Sấy chân không phù hợp cho các vật liệu dễ bị biến đổi nhiệt nhưng thường mất

thời gian sấy kéo dài 20-100h. Có thể sử dụng sấy chân không liên tục và có thể đạt đổ ẩm 1% ở 40oC sau 10p.

- Nhiệt độ sôi 100oC ở 0,1Mpa, nhưng ở 1kPa, độ sôi là 7oC. Ngoài ra sấy chân không giảm được oxy hóa.

- Ở điều kiện chân không, nhiệt độ hóa hơi của nước sẽ rất thấp, làm tăng cường quá trình thoát ẩm trong vật, do vậy có thể tiến hành sấy thấp hơn nhiệt độ môi trường. Vì thế, sản phẩm sấy chân không không bị tác động gây biến tính của nhiệt độ cao và luôn giữ được gần như đầy đủ các tính chất đặc trưng ban đầu. Do đó, sản phẩm sấy khô bằng phương pháp này giữ được lâu dài và ít bị tác động bởi điều kiện bên ngoài.

Ứng dụng: - Sấy vi khuẩn lactic bằng sấy chân không đảm bảo độ sống sót 52,8- 77,5- Kết tinh bột ngọt ở nhiệt độ thấp- Sấy dược liệu, phấn hoa

- Sấy gỗ cứng, gỗ quí

Câu 4: Sấy đông khô- Sấy đông khô là quá trình làm lạnh đông mẫu ở nhiệt độ -20oC đến -160oC, sau đó

làm bốc hơi nước bên trong và bên ngoài tế bào dưới điều kiện chân không. Độ chân không nhở hơn hoặc bằng 0,05mTorr và các mẫu đông khô thăng hoa nhanh.

- Sau 4-6h hơn 95% lượng nước tế bào bị loại bỏ. Khả năng sống sót của tế bào cao- Có thể sử dụng chất bảo vệ như glycerol (tạo cho vỏ tế bào bền vững hơn)- Öu ñieåm: Saáy ôû nhieät ñoä thaáp neân giöo ñöôïc caùc tính chaát töôi soáng

cuûa saûn phaåm. Neáu duøng ñeå saáy thöïc phaåm seo giöo ñöôïc chaát löôïng vaø höông vò cuûa saûn phaåm, khoâng bò maát vitamin. Tieâu hao naêng löôïng ñeå bay hôi aåm thaáp.

- Nhöôïc ñieåm: Giaù thaønh thieát bò cao, vaän haønh phöùc taïp, ngöôøi vaän haønh caàn coù trình ñoä kyo thuaät cao; tieâu hao ñieän naêng lôùn.

Ứng dụng: - Trong sản xuất vi sinh, sấy thăng hoa được ứng dụng cho các vi sinh vật, nấm

men, vitamin, kháng sinh, các enzim không bền ở nhiệt độ cao. + Áp dụng rộng rãi trong sản xuất dược phẩm để đông khô các chất kháng sinh như

peniciline, streptomycine và đặc biệt là enzyme tinh khiết+Sử dụng để giữ giống vi sinh vật.- Saáy caùc saûn phaåm myo phaåm, döôïc lieäu, thöïc phaåm quyù hieám. - Sử dụng trong công nghệ thực phẩm như: sấy rau quả (thanh long xuất khẩu), thịt

(thịt heo đông khô sử dụng trong quân đội)…..

Câu 5: Sấy phun- Thiết bị sấy phun dùng để sấy các dạng dung dịch và huyền phù trong trạng thái

phân tán nhằm tách ẩm ra khỏi vật liệu giúp tăng độ bền và bảo quản sản phẩm được lâu hơn. Sản phẩm của quá trình sấy phun là dạng bột mịn

- Dung dịch cần sấy khô đã làm đậm đặc bằng cách bốc hơi chân không dưới áp suất nhất định, đưa vào phần trên của thùng hình trụ đáy côn và có tuy-e thích hợp để tạo tia liên tục dưới dạng sương có đường kính 20-100µm. Ở ngang mức của tuy-e , một luồng khí nóng(nhiệt độ không vượt quá nhiệt độ làm ổn định sản phẩm đem sấy), được phóng vào và trộn lẫn với hạt sương.

- Tùy thuộc vào năng suất tách ẩm và sản phẩm cụ thể ta có các thông số kỹ thuật thích hợp. Tuy nhiên, có các thông số chung như sau:

+ Điện thế: 380V- 50Hz- 3 pha+ Nhiệt độ sấy: điều chỉnh tự động trong khoảng 30- 300oC

+ Chế độ làm việc: liên tục+ Điều khiển: bảo vệ chống quá nhiệt- Ưu điểm: + Quá trình sấy nhanh, có thể điều khiển được tỉ trọng sản phẩm.+ Bột sau sấy có độ hòa tan cao (90-100%), độ ẩm thấp (3-4%)+ Vận hành liên tục và có thể tự động hóa hoàn toàn.+ Vận hành và bảo dưỡng đơn giản, chi phí nhân công thấp+ Thiết kế đa dạng cho từng loại sản phẩm, từng loại qui mô nhà máy+ Áp dụng được cho các sản phẩm bền nhiệt và không bền nhiệt, nguyên liệu ở dạng

dung dịch, gel, huyền phù…+ Chất lượng bột được đảm bảo trong suốt quá trình sấy.+ Vật liệu hầu như không tiếp xúc với bề mặt kim loại của thiết bị- Nhược điểm+ Chi phí đầu tư cao.+ Yêu cầu độ ẩm ban đầu cao để đảm bảo nguyên liệu có thể bơm đến thiết bị tạo giọt

lỏng.+ Chi phí năng lượng cao (để tách ẩm)+ Thất thoát các chất dễ bị bay hơi cao hơn. Ứng dụng: - Sử dụng trong công nghệ thực phẩm như: sản xuất sữa bột, bột chanh dây, lòng

trắng trứng sấy, café, trà hòa tan, bột rau quả, bột sữa dừa. - Sấy phun trong công nghiệp vi sinh được sử dụng để sấy khô các chất cô của dung

dịch canh trường các chất kháng sinh động vật, các axit amin, các enzym, các chất trích ly nấm thu nhận được trên các môi trường dinh dưỡng rắn, các dung dịch chất lắng thu nhận được khi làm lắng enzym bằng các dung môi vô cơ hay bằng các muối trung hoà, cũng như các phần cô chất lỏng canh trường

- Sấy phun các chế phẩm probiotic có sử dụng các chất mang-tác nhân bảo vệ: protein, polysaccarit, gum, maltodextrin, gelatin, tinh bột, lactoza, trehalose, skim milk.

Câu 6: Sấy tầng sôi- Là một trong những kĩ thuật thông thường dùng để sấy các hạt rắn. Kỹ thuật này

dựa trên cơ sở dòng khí nóng chuyển động với tốc độ cao mà tạo ra tầng sôi với đặc tính chuyển khối và truyền nhiệt.

- Bộ phận chính của hệ thống sấy tầng sôi là một buồng sấy, phía dưới buồng sấy là bộ phận gia nhiệt. Không khí có áp suất lớn và nhiệt độ thích hợp được thổi từ bộ phận gia nhiệt và làm cho hạt dao động như là “sôi”.

- Vật liệu sấy ở trạng thái sôi nhận nhiệt và nhả ẩm cho tác nhân trở nên nhẹ hơn, theo tác nhân đi lên lớp trên và được lấy ra ngoài ở một độ cao thích hợp đảm bảo đúng độ khô yêu cầu.

- Duøng ñeå saáy caùc vaät lieäu daïng haït, ñoä aåm trung bình- Các thông số kĩ thuật thiết bị sấy tầng sôi:+ Chiều cao vật liệu tầng sôi: 0,1-0,4m+ Tốc độ dòng khí: 0,3-3,5m/s (tùy thuộc vào đặc tính của hạt)+ Chênh lệch áp suất: 300-1800 mmHg- Ưu điểm: Thieát bò saáy taàng soâi coù öu ñieåm laø thích hôïp vôùi vaät lieäu

daïng haït, ñoä khoâ saûn phaåm raát ñoàng ñeàu, cöôøng ñoä saáy maonh lieät do söï tieáp xuùc trieät ñeå giöoa vaät lieäu vaø taùc nhaân saáy, cho pheùp saáy ôû nhieät ñoä cao hôn nhieät ñoä cho pheùp vì thôøi gian tieáp xuùc ngaén. Hieäu suaát söû duïng thieát bò cao, giaù thaønh ñaàu tö thaáp.

- Nhược điểm: + Chênh lệch áp suất tương đối cao nên gây ra khí thổi áp lực cao.+ Hình dạng hạt bị giới hạn với hình cầu hay hình khối.+ Kích thước hạt bị giới hạn, vật liệu phân tán gây ra hiện tượng các vật liệu tinh và

thô không tạo tầng sôi tốt.+ Chiều cao của tầng sôi bị giới hạn bởi chiều cao tối thiểu để đảm bảo tạo tạo tầng

sôi đồng nhất và chiều cao tối đa cho phép giảm áp suất. + Chịu được tầng sôi kết tụ sẽ gây ra sự không ổn định của các hạt và đặc tính chuyển

đổi đã giảm.- Ứng dụng:+ Sấy quặng, khoáng sản+ Sấy men bánh mì+ Sấy thuốc (sấy bột, cốm trong nguyên liệu dược phẩm, thực phẩm, hóa chất)