Embed Size (px)
Citation preview
Deleción de adhE y sobrexpresión de ppc en Escherichia
coli K12 wild type para aumentar la producción de ácido
succínico a partir de glicerol.
Héctor Felipe Borrego Muñoz; Natalia Flórez Vargas
Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia
Objetivo general
Aumentar la producción de ácido succínico a partir de glicerol en Escherichia coli K12
wild type, por medio de deleción y sobrexpresión de genes específicos.
Objetivos específicos
Realizar la deleción del gen adhE en Escherichia coli por medio de la estrategia de
recombinación por homología.
Establecer un mecanismo para sobrexpresión del gen ppc en Escherichia coli por
medio de la transformación de células con el plásmido pCA24N.
1
Deleción de adhE y sobrexpresión de ppc en Escherichia
coli K12 wild type para aumentar la producción de ácido
succínico a partir de glicerol.
Héctor Felipe Borrego Muñoz; Natalia Flórez Vargas
Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia
Resumen
Con el objetivo de darle un valor agregado al glicerol, subproducto de la producción de biodiesel, se
va a manipular la red metabólica del microorganismo Escherichia coli K12 con el fin de aumentar
la producción de ácido succínico, el cual es ampliamente utilizado en industrias como la
farmacéutica, polimérica, de textiles y de alimentos. Para cumplir este propósito se llevará a cabo la
deleción del gen adhE el cual codifica para la enzima alcohol deshidrogenasa, y la sobreexpresión
del gen ppc, encargado de sintetizar la enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa. Por diferentes
razones, la deleción no fue factible, pero en cuanto a la sobrexpresión del gen ppc, se logró una
producción de 2,13 mg/mL de ácido succínico, induciendo con IPTG 1mM, lo cual resultó en un
valor mayor al del cultivo sin inducir (1,82mg/mL).
Palabras clave: Ingeniería de redes metabólicas, Escherichia coli K12 wild type, ácido succínico,
deleción, sobreexpresión, plásmido, adhE, ppc, IPTG.
Abstract
Aiming to give some added value to glycerol, which is a derived product from biodiesel production
process, the metabolic network of the microorganism Escherichia coli K12 is going to be
manipulated with the purpose of increasing the synthesis of succinic acid, which is widely used in
pharmaceutical, polymeric, food and textile industries. In order to achieve this objective adhE gene
–which encodes alcohol dehydrogenase – deletion and ppc –which is in charge of the
phosphoenolpyruvate carboxylase production – overexpression are going to be executed. For
different reasons, the deletion was not achievable, but regarding the overexpression of the ppc gene,
a production of 2,13 mg/mL of succinic acid was reached with IPTG 1mM as inducer. This value
was greater than the amount produced by the not induced culture (1,82 mg/mL).
Key words: metabolic engineering, Escherichia coli K12 wild type, succinic acid, deletion,
overexpression, plasmid, adhE, ppc, IPTG.
2
Agradecimientos
Agradecemos de manera muy especial a:
Andrés González, Ph.D, ingeniero química, asesor del proyecto de grado, por su
orientación, compresión y confianza.
Vanesa Núñez¸ ingeniera química, por su paciencia, colaboración e incondicional ayuda en
cada una de las actividades llevadas a cabo en la realización de este proyecto.
Deicy Tique, técnico de laboratorio, por su constante ayuda y guía en la realización del
procedimiento experimental.
Johana Husserl, Ph.D, ingeniera ambiental, por facilitarnos el uso de reactivos necesarios
para la realización del proyecto.
Paola Borrego, licenciada en química, por ayudarnos en la obtención de reactivos
necesario para la realización del proyecto.
Nuestras familias, por el apoyo incondicional en cada uno de los pasos de nuestras vidas.
3
1. Introducción
Con el pasar de los años, se ha hecho cada vez más importante el cuidado del medio
ambiente y la interacción que se puede lograr con este para obtener beneficios. Dada la
problemática que se ha venido desarrollando en torno al uso de combustibles fósiles, la
contaminación que producen y el futuro agotamiento de sus fuentes, el mundo entero se ha
preocupado por buscar tipos de energía alternativos (Santibañez et al., 2011). Una de las
nuevas opciones que ha tenido más acogida es el biodiesel (Santibañez et al., 2011). Este es
producido a partir de aceites vegetales o animales (Santibañez et al., 2011), como el aceite
de palma o aceite de soya. Dicho combustible proporciona diversas ventajas frente al diesel
corriente, entre ellas su bio-degradabilidad, el hecho de que sea una fuente de energía
renovable, su baja toxicidad y una menor cantidad producida de gases SOx que son
contaminantes (Santibañez et al., 2011). Además el biodiesel se puede utilizar directamente
en cualquier motor diseñado para operar con diesel corriente, sin necesidad de realizar
cambio alguno (Vidal Santo et al., 2012) teniendo una eficiencia similar, aunque
aproximadamente en un 5% menor (Vidal Santo et al., 2012).
La reacción de trans-esterificación para producir biodiesel, parte de un aceite (compuesto
en su mayoría por triglicéridos (Legaz Berbel, 2010)). Este se hace reaccionar con un
alcohol, generalmente metanol, para producir un cambio de los grupos acilo entre el alcohol
y el triglicérido.
Figura 1. Reacción de trans-esterificación para la producción de biodiesel a partir de aceite y metanol.
Tomado de (Dufour, 2009).
Como productos de esta reacción se obtienen esteres, los cuales corresponden al nuevo
combustible, y un subproducto llamado glicerol. En procesos de producción estándar de
biodiesel, el glicerol corresponde a un 16-18% de la masa inicial del aceite usado
(Santibañez et al., 2011).
El auge en el uso de biodiesel, como sustituto del diesel proveniente de crudo de petróleo,
ha causado un aumento en la cantidad de glicerol producido, lo que a su vez ha conllevado
a una disminución significativa de su precio de venta (Santibañez et al., 2011), además de
generar una preocupación por la creciente cantidad de este sub-producto que queda
almacenado y la contaminación que esto pueda causar a corto y largo plazo.
4
Observando la estructura molecular del glicerol, se puede ver que este posee tres carbonos
por molécula, lo que lo convierte es una buena fuente de carbono para la realización de
diferentes procesos. Haciendo uso de este potencial, se plantea este proyecto, con miras a
darle al glicerol un valor agregado para así poder aumentar el valor de venta del mismo y
disminuir la cantidad almacenada.
Siguiendo este orden de ideas, se pensó en un mecanismo con el cual se pudiera aprovechar
el glicerol de una manera amigable con el medio ambiente. Desde las últimas décadas el
uso de microorganismos para obtener diferentes productos ha aumentado (RM, 2005), no
solo por ser ambientalmente amigable sino por el rendimiento que puede llegar a obtenerse.
La manipulación de las redes metabólicas de microorganismos se presenta como una buena
opción para el desarrollo de este proyecto, ya que muchos de ellos tienen la capacidad de
producir diferentes metabolitos que tienen un alto valor agregado en el mercado actual. La
manipulación de estas redes metabólicas se basa en la alteración del genoma de los
microorganismos para potencializar la producción de algún compuesto de interés (RM,
2005). Esta se presenta entonces como una oportunidad de desarrollo para el presente
trabajo.
Escherichia coli es uno de los microorganismos más fáciles de manipular, ya que se conoce
el genoma completo de la bacteria. Esta se encuentra presente en todas las personas ya que
es un componente básico de la flora intestinal (Eslava Campos et al., s.f.). Fue descrita por
primera vez en 1885 (Eslava Campos et al., s.f.) y desde entonces se han dedicado diversos
estudios a descifrar su código genético. Una de las rutas metabólicas más importantes es el
ciclo del carbono ya que este es fundamental para la obtención de energía. Al final del
ciclo, E. coli es capaz de producir diferentes metabolitos, dentro de los cuales se encuentran
etanol, ácido acético y ácido succínico. Nuestro interés para el desarrollo de este proyecto
va a ser la producción de este último.
El ácido succínico es un compuesto que se ha usado tradicionalmente en la industria de
alimentos como saborizante y aditivo, como contra-ión en la industria farmacéutica, como
surfactante y agente humidificador en el área de textiles y últimamente como monómero
para la producción de polímeros biodegradables (Thakker et al., 2012), los cuales cada vez
se hacen más importantes en la industria, en la carrera por disminuir la contaminación
producida por plásticos no degradables derivados del petróleo (Meneses et al., 2007). Las
aplicaciones que tiene este compuesto hacen de él un producto de alto interés por lo que
sería beneficioso poder potencializar la obtención de este producto a partir de una fuente
ambientalmente amigable como lo es el uso de bacterias. Los diferentes usos que se le dan
a este compuesto se pueden ver de manera resumida en la figura 2.
5
Figura 2. Usos en la industria del ácido succínico y sus derivados de mayor uso. Tomada de (Dias de
Oliveira et al., 2013).
Estudiando el recorrido que realiza el glicerol en el interior de la bacteria fue posible
seleccionar dos genes principales, uno objeto de deleción y otro para sobre-expresión, los
cuales nos permitirían aumentar la producción de ácido succínico a partir de glicerol, ya
que por lo general la producción de este compuesto de manera natural es bajo (Thakker et
al., 2012). Para lograr este propósito es necesario conocer las rutas metabólicas por las
cuales se produce succinato (anión del ácido succínico) en E. coli. Estas son la ruta
aeróbica (por medio de la activación del bypass de glioxilato en el ciclo del ácido cítrico) y
la ruta anaeróbica (fermentación ácida mixta mientras el ciclo de Krebs está desactivado)
(Thakker et al., 2012).
Se puede ver de manera más detallada, que el ingreso de glicerol a la célula está controlado
por un facilitador de difusión, una proteína de membrana que cataliza el equilibrio de los
gradientes de concentración de glicerol a través de la membrana citoplasmática (Beijer et
al., 1993). Al ingresar a la célula este es transformado en glicerol-3-fosfato por medio de la
enzima glicerol quinasa (GlpK), la cual utiliza ATP como donor de grupo fosfato para
realizar su labor de fosforilación del glicerol.
𝐶3𝐻8𝑂3 + 𝐴𝑇𝑃𝐺𝑙𝑝𝐾→ 𝐶3𝐻7𝑂6 + 𝐴𝐷𝑃 + 𝐻
+
En E. coli el glicerol-3-fosfato puede ser metabolizado a dihidroxiacetona fosfato por dos
proteínas de membrana diferentes dependiendo de las condiciones de crecimiento de la
bacteria. Este último producto del proceso de transformación del glicerol entra a jugar un
papel importante en el proceso de glicólisis. La dihidroxiacetona fosfato presenta equilibrio
químico con la especie química D-gliceraldehído-3-fosfato:
𝑑𝑖ℎ𝑖𝑑𝑟𝑜𝑥𝑖𝑎𝑐𝑒𝑡𝑜𝑛𝑎 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑜 ↔ 𝐷 − 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑎𝑙𝑑𝑒ℎí𝑑𝑜 − 3 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑜
6
D-gliceraldehído-3-fosfato sigue la ruta de la glicólisis, pasando por una serie de reacciones
hasta convertirse en fosfoenolpiruvato (PEP, por sus siglas en inglés), el cual puede ser
transformado a piruvato y seguir con rutas metabólicas como por ejemplo el ciclo de Krebs
o puede entrar directamente en la fermentación ácida mixta en forma de PEP o de piruvato,
dependiendo esto principalmente de las condiciones del medio en el cual está creciendo el
microorganismo.
Por su parte, el ciclo de Krebs, o también conocido como ciclo del ácido tricarboxílico
(TCA cycle por sus siglas en inglés) es un ciclo vital en las células que realizan procesos de
respiración celular, pues este permite la generación de energía en forma de ATP y NADH
en presencia de oxígeno. La conexión entre la glucólisis y el ciclo TCA está dada por la
oxidación del piruvato a AcetilCoA, proceso que se presenta a continuación.
𝑃𝑖𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷 + 𝐶𝑜𝐴 → 𝐴𝑐𝑒𝑡𝑖𝑙𝐶𝑜𝐴 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐶𝑂2
Los grupos acetilo, aportados por la especie acetil coenzima A se incorporan al ciclo de
Krebs degradándose progresivamente hasta CO2 cediendo en el proceso un gran número de
átomos de hidrógeno, los cuales entran a la cadena respiratoria y son oxidados por el
oxígeno, dando lugar a la formación de moléculas de agua. A partir de estos procesos de
oxidación y degradación se sintetizan moléculas de ATP (Peña, 2004).
El proceso consiste en una serie de reacciones consecutivas que termina en el compuesto
inicial, en la siguiente figura se pueden observar las reacciones involucradas, al igual que
las entradas y salidas del sistema.
Figura 3. Ciclo de Krebs en detalle (Peña, 2004).
7
Sin embargo, dada la complejidad e importancia del ciclo del ácido cítrico para la
supervivencia del microorganismo, es una cuestión delicada realizar mutaciones de genes
que tengan relación con las proteínas involucradas en este proceso, por lo cual no es
conveniente que este proyecto tome este sentido.
Por otro lado la fermentación ácida mixta presenta una buena alternativa en lo que respecta
a la producción de succinato, principalmente dado a que se puede dirigir con facilidad la
ruta en esa dirección, además de que no es un proceso cíclico sino que da lugar a la
generación de metabolitos disponibles. A continuación se observa la ruta fermentativa del
glicerol en E. Coli en un medio micro aeróbico.
Figura 4. Ruta del glicerol en E. coli, medio micro aeróbico (Blankschein et al., 2010).
La formación de succinato por esta ruta se da a partir de la reacción del PEP y bicarbonato
para formar oxaloacetato y un ión fosfato. Esta reacción está catalizada por la enzima
reguladora fosfoenolpiruvato carboxilasa (codificada por el gen ppc). Posteriormente el
oxaloacetato es convertido en malato mediante la siguiente reacción:
𝑂𝑥𝑎𝑙𝑜𝑎𝑐𝑒𝑡𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻+ ↔ 𝑀𝑎𝑙𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷+
8
Esta reacción es catalizada por la enzima malato deshidrogenasa (codificada por el gen
mdh). Luego, el producto de esta reacción reversible puede ser transformado a fumarato, y
por último se da la formación de succinato por medio de la intervención de la enzima
fumarato reductasa, la cual está compuesta por 4 subunidades (codificadas por el operón
frdABCD) y dos dominios diferentes (Cecchini et al., 2002).
En lo que respecta a esta ruta, existen varias alternativas para la mutación (deleción y
sobrexpresión) de genes. Realizando un análisis de la ruta metabólica que sigue el glicerol
en el interior de las células de E. coli se optó por escoger el gen adhE, el cual codifica para
la enzima alcohol deshidrogenasa, como gen objetivo de la deleción, ya que esto bloquearía
la ruta de síntesis del etanol dejando que una mayor cantidad de carbonos sigan otras vías.
Finalmente, en lo que concierne a la sobreexpresión del gen, quisimos enfocarnos en las
enzimas que interfieren en la etapa final de la producción de succinato, por lo cual se
seleccionó el gen que codifica para la enzima más cercana disponible, la cual es fumarasa A
(fumA). Esta enzima es la encargada de catalizar la transformación de malato a fumarato
(producto previo a la síntesis de succinato). Después de realizadas varias pruebas en el
laboratorio no fue posible obtener el plásmido de sobrexpresión para el gen fumA por lo que
se optó por seleccionar el gen ppc que codifica para la enzima fosfoenolpiruvato
carboxilasa, la cual también se encuentra en la ruta de producción del ácido succínico.
Como el objetivo de nuestro proyecto es obtener células de E. coli con las mutaciones
anteriormente mencionadas, y ninguna otra mutación, se va a partir de la cepa K12 wild
type la cual es una cepa silvestre, lo que nos asegura que esta no tendrá alteración alguna
cuando se empiece a manipular.
2. Marco teórico
2.1. Deleción del gen adhE
Con el objetivo que aumentar la producción de ácido succínico, se va a hacer una
disrupción de uno de los genes que llevan a producir un metabolito diferente a nuestro
compuesto de interés, en este caso el gen adhE que codifica para la enzima alcohol des-
hidrogenasa, la cual cataliza la producción de etanol. Este proceso de disrupción genética es
conocido como deleción.
Para realizar este procedimiento se va a hacer uso de kit “E. coli Gene Deletion” de
Red®/ET® Recombination. Este kit utiliza la recombinación por homología para hacer la
disrupción del gen objetivo. La recombinación por homología se basa en el intercambio de
material genético entre dos cadenas de ADN en un lugar específico en el que presentan
complementariedad (Gene Bridges, 2012).
9
Para la realización de la deleción se tienen básicamente dos pasos principales. El primero es
la inserción de un plásmido de expresión que es proporcionado en el kit, el cual expresa las
enzimas recombinasas, que hacen posible que suceda la recombinación. El segundo paso es
la inserción de un casete lineal el cual se va a posicionar en el lugar del gen que se quiere
delecionar y el cual va a ser objetivo de las recombinasas.
La recombinación que realiza el kit es también conocida como λ-asistida ya que el
plásmido de expresión pRedET que viene con el kit, contiene el fago λ el cual es capaz de
expresar los pares de enzimas RecE/RecT y Redα/Redβ. Las enzimas RecE y Redα son
exonucleasas de dirección 5’-3’ (Muyrers et al., 2000). Por su parte las enzimas RecT y
Redβ son proteínas de enlace. Cualquiera de los dos pares de enzimas funcionan de manera
similar (Muyrers et al., 2000), pero es fundamental que las dos enzimas dentro del par
trabajen de manera coordinada para lograr la recombinación.
El procedimiento que realizan estas enzimas es llamado reparación de ruptura de cadena
doble (DSBR por sus siglas en inglés) (Muyrers et al., 2000). Este comienza cuando las
exonucleasas RecE o Redα digieren parte de la cadena en dirección 5’-3’, dejando libre un
fragmento 3’ terminal. Seguidamente, las enzimas de enlace RecT o Redβ se unen al
fragmento libre. Esta parte de la cadena queda lista para enlazarse con otra cadena con la
cual encuentre complementariedad.
Figura 5. Mecanismo del DSBR. Tomada de (Muyrers et al., 2000).
El plásmido que será insertado contiene un operón que controla la expresión de las
recombinasas, el cual actúa bajo la acción del promotor pBAD que es inducido con L-
arabinosa. Este promotor es controlado por el producto del gen araC (presente en el
plásmido), el cual forma un complejo con la L-arabinosa el cual permite que la
transcripción empiece (Gene Bridges, 2012).
10
Figura 6. Mapa del plásmido de expresión pRedET proporcionado por el kit de deleción, el cual es
capaz de expresar las recombinasas que hacen posible la deleción por recombinación homóloga. Este
plásmido le confiere a la célula resistencia a tetraciclina con la cual es posible realizar un tamizado de
las células con el plásmido insertado. Tomado de (Gene Bridges, 2012).
La inserción de este plásmido se va a realizar por medio de una electroporación,
procedimiento en el cual se somete la célula a una carga eléctrica la cual causa que los
poros de esta se abran permitiendo el paso hacia el interior celular del material que se
encuentre presente en solución.
Después de tener las recombinasas dentro de la célula, se introduce por medio de
electroporación el casete FRT-flanked el cual viene con el kit. Este casete funcional está
diseñado para insertarse en el lugar del gen que se desea delecionar. Para que la
recombinación por homología funcione es necesario añadir mediante una reacción en
cadena de polimerasa (PCR por sus siglas en ingles), unos brazos homólogos diseñados
especialmente para que se unan al gen de interés y a los extremos del casete. Una vez el
casete con los brazos homólogos se encuentra dentro de la célula, las recombinasas actúan
dando paso a la recombinación.
Figura 7. Casete FRT-flanked proporcionado por el kit. Esta secuencia lineal de ADN se inserta en el
lugar del gen objetivo de la deleción, en donde debe encontrar secciones homólogas. Para ello es
necesario diseñar oligómeros que se pegarán al casete a cada uno de los extremos para generar las
regiones homólogas. Tomado de (Gene Bridges, 2012).
11
Este proceso termina con células de E. coli que ya no contienen el gen objetivo de la
deleción y que en lugar de él, tienen ubicado en la misma posición el casete funcional FRT-
flanked, el cual confiere resistencia a kanamicina y que además posee el gen manXYZ el
cual va a ser usado para corroborar la correcta deleción mediante una PCR y posterior
electroforesis.
2.2. Diseño de los oligonucleótidos
La estrategia que se va a utilizar para realizar la deleción del gen adhE es la recombinación
por homología. Para ello es necesario crear regiones homologas en donde va suceder el
intercambio de cadenas de ADN, entre el casete FRT-flanked y el gen seleccionado.
Las regiones homólogas deben encontrarse a los extremos del casete y del gen para que en
el centro suceda el intercambio. Para ello, la primera parte del oligómero “upstream” debe
tener un brazo homólogo a los primeros 50 pares de bases del gen de interés en dirección
5’-3’, seguidas de una cadena complementaria a la secuencia del casete con la resistencia a
kanamicina (Gene Bridges, 2012).
En lo que respecta al “downstream”, la primera parte debe tener los últimos 50 pares de
bases correspondientes al gen a delecionar en dirección inversa a la que se encuentra y,
dado que debe adherirse al casete en la parte inferior, la cadena debe ser la complementaria
al templado. Igualmente estos 50 pares de bases deben estar seguidos de una cadena
complementaria al casete para su debida adición (Gene Bridges, 2012).
Figura 8. Esquema general del funcionamiento de la recombinación por homología con las regiones
necesarias para el desarrollo del proceso del deleción.
2.3. Sobrexpresión del gen ppc
El mecanismo principal que va a ser utilizado para lograr la sobrexpresión del gen ppc en
las células de E. coli es la electroporación del plásmido pCA24N, el cual ya contiene la
12
cadena de ADN que codifica para la enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa. El objetivo es
transformar las células con el plásmido y realizar una inducción para que el gen se exprese.
Para poder obtener el plásmido que contiene el gen ppc es necesario realizar una
purificación de este, ya que se encuentra en el interior de otra cepa de E. coli. Este
microorganismo está disponible en el laboratorio de Bioquímica Docente (ML-414). A
continuación se muestra el mapa del vector (generado en la herramienta CLC Main
Workbench®) que va a ser utilizado para la sobreexpresión del gen ppc, el cual tiene
resistencia a cloranfenicol, una región de replicación en la que se incluye la expresión del
gen de interés y diferentes sitios de restricción como se muestra en la figura 9.
Figura 9. Mapa del plásmido pca24N con sus respectivos sitios de restricción
Para poder obtener solo el plásmido y no la cepa bacteriana, es necesario hacer uso del kit
de purificación PureLink® Quick Plasmid Miniprep, el cual viene con instrucciones de uso
estandarizadas. En este kit, a partir de un cultivo de las bacterias que contienen el plásmido,
realizado en medio líquido, se obtiene un pellet con alta concentración celular al cual se le
agrega un buffer que contiene glucosa para que la solución sea isotónica, EDTA para quelar
los cationes divalentes que son liberados en la lisis bacteriana y que pueden inactivar
enzimas que causan daños al plásmido, tris Cl que actúa como buffer, y finalmente RNasa
A, la cual ayuda a remover RNA de la preparación del plásmido (esta última enzima se
encarga de digerir el RNA de la bacteria una vez se ha realizado la lisis de la membrana)
(Birnboim & Doly, 1979).
Luego de que se ha preparado la muestra se realiza la lisis bacteriana en la cual se elimina
la membrana bacteriana dejando libre el material genético que se quiere obtener. Para ello
se trata la solución anterior con dodecilsulfato sódico (SDS por sus siglas en inglés) y
NaOH. El SDS es un detergente que solubiliza la membrana fosfolipídica de la célula y
13
denatura componentes proteicos de la membrana celular, dando lugar a la ruptura de la
célula y a la liberación del contenido celular al medio. Las condiciones altamente alcalinas
del medio, otorgadas por la presencia del hidróxido de sodio, denaturan el ADN tanto de la
bacteria como del plásmido (Birnboim & Doly, 1979).
El lisado debe ser neutralizado con un buffer de precipitación, el cual contiene ácido
acético y acetato de potasio. Este último permite la neutralización de la solución y por ende
la renaturación del ADN. Mientras que el ADN del plásmido recupera su forma original, el
ADN cromosomal de la célula se enreda con otras cadenas de ADN, dada a asociaciones
aleatoria de cadenas, y con otros componentes de la célula como lípidos y proteínas, por lo
cual no vuelve a restablecerse. Seguidamente debe centrifugarse la solución para obtener
una solución de plásmidos en el sobrenadante y separarla del pellet que contiene el ADN de
la célula (Birnboim & Doly, 1979).
Al final del proceso se realiza una limpieza haciendo uso de una columna con una
membrana de sílica de 2mL. El uso de esta membrana permite la remoción de otros
componentes (RNA, proteínas y otras macromoléculas) presentes en la solución dejando
que los plásmidos permanezcan en la columna mientras que el resto de componentes pasan
a través de ella. Finalmente a la columna se le agrega una solución de buffer TE (PH 8.0)
para remover los plásmidos de la membrana de sílica, se vuelve a centrifugar y finalmente
se obtiene la solución con los plásmidos de interés purificados (Invitrogen, 2011).
Después de realizar el proceso de purificación se debe verificar que esta haya sido llevado a
cabo de manera correcta, por lo cual se corre un gel de agarosa en el cual se pueden separar
fragmentos de distinto tamaño de ADN, debido a que según su peso molecular, estos
migran a diferente velocidad al ser sometidos a una corriente eléctrica. A este proceso se le
conoce como electroforesis.
Finalmente, para sobre-expresar la enzima Ppc es pertinente generar células competentes
del microorganismo objetivo, para poder electroporar el plásmido en ellas. Después de la
electroporación es necesario crecer el microorganismo transformado en cloranfenicol, para
que la bacteria tenga la necesidad de retener el plásmido, puesto que este último tiene
resistencia al antibiótico mencionado. Finalmente se obtienen entonces los
microorganismos mutados, con sobreexpresión del gen ppc.
Figura 10. Mecanismo de funcionamiento de la electroporación de un plásmido. Tomada de
http://alexamolinavalenzuela.blogspot.com/
14
Para poder obtener datos de las células sobrexpresadas es necesario realizar una inducción
con lactosa o isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido, de ahora en adelante IPTG, ya que el
plásmido de sobrexpresión contiene el operón lac el cual, al ser activado en presencia de
cualquiera de los dos compuestos mencionados anteriormente, inicia la expresión del gen
de interés.
3. Materiales y métodos
3.1. Preparación de medios de cultivo (fases sólida y líquida)
Con el fin de crecer el microorganismo Escherichia coli K12 wild type, se preparó medio
Luria Bertani, de ahora en adelante llamado medio LB, con los reactivos que se presentan
en la tabla 1.
Tabla 1. Reactivos para la preparación del medio
Reactivo Cantidad [g/L]
Cloruro de Sodio 10
Agar-Agar 15
Extracto de Levadura 5
Triptona 10
Nota: para la realización del medio líquido se utilizan las mismas cantidades de reactivos
a excepción del Agar-Agar, el cual no se utiliza, pues es el que le da la propiedad de gel al
medio.
Para las cepas celulares que poseen resistencias a antibióticos, se agregaron, después de la
esterilización, las cantidades del antibiótico apropiadas para crecer los cultivos en las
concentraciones necesarias. Para el crecimiento de células con resistencia a cloranfenicol se
trabajó una concentración final de 50 μg/mL, mientras que para los medios con tetraciclina
se trabajó una concentración final de 3 μg/mL.
3.2. Sembrado de Escherichia coli en medio solido
Para sembrar la cepa no mutada (Escherichia coli K12 wild type) se tomó como base el
microorganismo disponible en el cepario (C3E20) del laboratorio de Bioquímica Docente
(ML-414). Para realizar el sembrado en las cajas de Petri (medio sólido) se utilizó el
método de sembrado por agotamiento, esto con el fin de obtener colonias aisladas del
microorganismo que posteriormente servirán para sembrar el microorganismo en medio
líquido. Las cajas sembradas deben llevarse a incubadora a 37°C durante toda la noche.
15
Imagen 1. Cajas de Petri recién sembradas (a la izquierda). Cajas de Petri crecidas y con presencia de
colonias aisladas de E. coli K12 wild type (a la derecha).
De la misma manera, para realizar el sembrado de las células con el plásmido de
sobrexpresión insertado (con resistencia a cloranfenicol), se prepararon cajas de Petri con
cloranfenicol a una concentración de 50 μg/mL y se sembraron las células con la misma
técnica de sembrado. De igual forma se dejaron las cajas toda la noche a 37°C en
incubación. Para las células con el plásmido pRedET que expresa las enzimas recombinasas
necesarias para la deleción, se tiene una resistencia a tetraciclina, por lo cual se sigue el
mismo procedimiento anterior, pero con cajas a una concentración de 3 μg/mL del
antibiótico. A diferencia de los otros dos cultivos, estas últimas células deben dejarse al
menos 48 horas a 30°C ya que el plásmido pRedET se desintegra a una temperatura de
37°C.
3.3. Sembrado de Escherichia coli en medio líquido
Para conseguir sembrar en medio líquido se preparan 50 mL de medio LB con los reactivos
mencionados anteriormente en un Erlenmeyer de 250 mL, se esteriliza, y posteriormente se
toma una muestra de una colonia de los cultivos en fase sólida y se diluye en el medio
líquido preparado. Esta preparación debe llevarse a incubadora-shaker por al menos 12
horas a 37°C y 250 RPM.
Al igual que en el sembrado en medio sólido, para realizar en sembrado en medio líquido
de las cepas que contienen resistencia a antibióticos, se deben preparar los medios con las
concentraciones adecuadas para el crecimiento de estas. El cultivo con cloranfenicol se
maneja a una concentración de 50 μg/mL y el de tetraciclina a 3 μg/mL. Es importante que
este antibiótico se agregue luego de que se realice la esterilización.
16
3.4. Construcción de la curva de crecimiento de Escherichia coli
K12 wild type
La construcción de la curva de crecimiento debe realizarse de la siguiente manera: primero
se prepara un pre-inóculo (ver sección 2.3 de este artículo), el cual se deja en un equipo de
incubación y agitación a 250 RPM y 37°C durante toda la noche (overnight culture). Al día
siguiente, se realiza un inóculo tomando 5 mL del pre-inóculo y diluyéndolos en 195 mL de
medio LB líquido (preparado y autoclavado previamente en un Erlenmeyer de 1000 mL).
El inóculo se deja en una incubadora/agitadora a 250 RPM y 37°C. A partir de este
momento se comienzan a tomar muestras de 1 mL cada hora y se mide la absorbancia a una
longitud de onda de 600 nm.
3.5. Deleción del gen adhE
3.5.1. Diseño de oligonucleótidos
Para poder realizar el diseño de los brazos homólogos se partió del gen seleccionado para la
deleción, adhE. Teniendo definida la cepa de E. coli con la cual se va a trabajar (K12 wild
type), se pasó a revisar su genoma para encontrar la secuencia de bases que comprenden el
gen seleccionado (Ver anexos 1 y 2). Una vez definida la cadena se escogieron los
extremos del gen y de acuerdo con las indicaciones dadas anteriormente se diseñaron los
oligómeros, los cuales se pueden ver en la sección 4.1.1.
3.5.2. Electroporación del plásmido pRedET
Antes de realizar la transformación de las células es necesario tener listas cajas de Petri con
medio LB y tetraciclina a una concentración final de 3 µg/mL. Además es necesario que el
cultivo se encuentre en fase exponencial para qua la recepción del plásmido se dé más fácil.
Para tener seguridad de que las células se encuentran en esta fase (aproximadamente
OD600 de 0.3) se realizó primero una curva de crecimiento para determinar el tiempo que
demoran las células en llegar a las condiciones adecuadas (la realización de una curva de
crecimiento fue expuesta en la sección 3.4). La incubación de estas debía realizarse a 37°C
y 1000 rpm de agitación.
Para que la recombinación que hace posible la disrupción del gen adhE sea efectiva, este
plásmido debe estar insertado en las células, para lo que se realiza una electroporación. Una
vez el cultivo llega a fase exponencial se toma una muestra de este la cual se concentra y
partir de esta muestra de células se sigue el resto del procedimiento. Primero se deben
generar células competentes para la electroporación, ya que estas deben prepararse para el
choque eléctrico que van a recibir. Seguidamente se agrega a la solución 1 µL del plásmido
17
procurando mantener todo el tiempo la mezcla en hielo. Esta mezcla se transfiere a una
cubeta de electroporación y se pasan al electroporador ajustando el equipo a 1350 V, 10 µF,
600 ohm y pulso de 5 ms (condiciones de operación).
Después de realizada la inserción del plásmido, se pasa inmediatamente la solución a 1,5
mL de medio LB y se deja a 30°C por 70 minutos para que las células se estabilicen.
Después de eso se siembran 100 µL del producto de la electroporación en cajas de Petri con
medio LB y tetraciclina y se dejan en incubación a 30°C por al menos 48 horas.
Además de las células electroporadas se sembraron dos controles, uno positivo y uno
negativo. El primero consta de un cultivo que viene con el kit el cual ya tiene insertado el
plásmido con resistencia tetraciclina, el cual debe crecer en presencia del antibiótico. Como
control negativo se sembró el producto de la electroporación en cajas de Petri con medio
LB sin antibiótico.
3.5.3. PCR para la generación del fragmento de disrupción
Para poder realizar el proceso de deleción es necesario que el casete funcional FRT que
vienen con el kit se adhiera justo en la parte del genoma de E. coli K12 wild type que
codifica para la alcohol des-hidrogenasa. Para ello se diseñaron unos oligonucleótidos, los
cuales se pueden ver en la sección 4.1.1, que deben ser insertados en los extremos del
casete funcional. La manera de realizar esta unión es a través de una reacción en cadena de
polimerasa o PCR.
Para la preparación de la reacción se necesitan los reactivos con las cantidades
mencionadas en la tabla 2. En esta preparación se debe incluir la cantidad necesaria para
todas las reacciones que se vayan a llevar a cabo. En este caso se prepararon dos reacciones
de 25 µL. La idea de tener una sola preparación es asegurarse de que todas las reacciones
van a tener la misma concentración de todos los reactivos.
Tabla 2. Reactivos para la reacción de PCR
Reactivo Concentración Cantidad para 1 PCR (µL)
Agua MilliQ - 18.05
MgCl2 50 nM 1.25
Buffer 10x 2.5
dNTP’s 10 nM 0.5
Downstream primer 10 nM 0.75
Upstream primer 10 nM 0.75
Taq polimerasa 5 U/mL 0.2
18
De esta mezcla se depositan 24 µL en tubos eppendorf de 0.2 mL y a cada uno de ellos se
les agrega 1 µL del casete funcional FRT-flanked que viene con el kit usado para hacer la
deleción. Estos tubos son llevados a termociclador en donde se lleva a cabo la reacción.
El perfil con el cual se corre la reacción es el siguiente:
CICLO 1
Denaturación inicial Temperatura: 98°C Tiempo: 30 segundos
CICLO 2
Denaturación Temperatura: 98°C Tiempo: 10 segundos
Anillaje Temperatura: 55°C-68°C Tiempo: 30 segundos
Extensión Temperatura: 72°C Tiempo: 90 segundos
CICLO 3
Extensión final Temperatura: 72°C Tiempo: 10 minutos
Los valores de las temperaturas y los tiempos de cada uno de los ciclos de la reacción se
obtuvieron del protocolo que acompaña al kit “E. coli Gene Deletion” de Red®/ET®
Recombination que se está usando. En el ciclo 2 se agregó un gradiente de temperatura en
la sección del anillaje para poder experimentar con diferentes temperaturas. Como se
prepararon 2 reacciones diferentes, una de ella se dejó en una temperatura de anillaje de
55°C, la cual es la que dice el kit que se debe usar, y otra a 68°C.
3.5.4. Electroforesis en gel de agarosa después de PCR
Para corroborar que efectivamente el casete y los oligonucleótidos quedaron correctamente
adheridos es necesario correr una electroforesis en gel de agarosa, en donde, dependiendo
del peso molecular que se lea en la prueba se puede concluir si el producto de la reacción
fue el deseado.
Para la preparación de la cama de agarosa en donde se va a correr la electroforesis se usan
los reactivos que se encuentran en la tabla 3. Este gel se prepara a al 1% de agarosa:
Tabla 3. Reactivos para la preparación del gel de agarosa
Reactivo Cantidad
Buffer TBE 1X 50 mL
Agarosa 0.5 g
Gel Red 0.5 µL
19
Inicialmente se deben mezclar el buffer con la agarosa en un Erlenmeyer, el cual se debe
llevar a calentamiento, hasta que la mezcla hierva y la solución se vea incolora. Una vez
realizado esto se adiciona el Gel Red, el cual es un colorante que permite ver el recorrido
del material genético a través del transiluminador.
Una vez preparado el gel se procede a sembrar las muestras y a correr la prueba. Esta
electroforesis se corrió a 100 voltios por una hora y 15 minutos. Transcurrido este tiempo
se toma el gel y se observa la muestra en el transiluminador, el cual somete el gel a rayos
UV los cuales actúan sobre el Gel Red haciendo visible el recorrido del material genético.
3.6. Sobrexpresión del gen ppc
3.6.1. Purificación del plásmido que contiene el gen ppc
Tal como fue expuesto en la sección 2.3, para realizar la purificación del plásmido de
sobrexpresión se usará el kit PureLink® Quick Plasmid Miniprep. El microorganismo a
partir del cual se va a obtener el material genético es la cepa de Escherichia coli W3110
que se encuentra disponible en el cepario (C2E66-68) del laboratorio de Bioquímica
docente (ML_414).
El procedimiento, que ya es estándar para el uso del kit mencionado, se expone de manera
resumida en el siguiente diagrama:
Diagrama 1. Procedimiento de uso de kit PureLink® Quick Plasmid Miniprep utilizado para hacer a
purificación del plásmidos de sobrexpresión.
Recolección de bacterias del cultivo
Lisis bacteriana
Denaturación de la membrana bacteriana
Renaturación del ADN y precipitado
Remoción de componentes no deseados
Lavado con buffer de etanol 70%
Remoción de los plásmidos de la membrana de sílica
20
3.6.2. Electroforesis en gel de agarosa después de purificación
Para tener certeza de que el plásmido fue correctamente purificado es necesario correr una
electroforesis en gel de agarosa en donde se depositan las muestras obtenidas después de la
purificación y según el peso molecular que se lea en la prueba se determina si el producto
es el deseado. Para la preparación de la cama de agarosa se sigue el mismo procedimiento
descrito en la sección 3.5.4 de este mismo documento.
Luego de que se corre la primera electroforesis para verificar la correcta purificación, se
debe obtener el plásmido que quedo en el gel. Para ello se prepara otro gel el cual contiene
las mismas cantidades anteriormente mencionadas, pero esta vez sin el Gel Red. Luego se
corre la electroforesis de nuevo y se procede a purificar haciendo uso de una columna spin.
3.6.3. Preparación de medios para inducción con IPTG
El plásmido de sobrexpresión que contiene el gen ppc contiene el operón lac el cual al
activarse inicia la codificación de la enzima de interés. Por lo general la inducción se
realiza con lactosa, pero esta con el paso del tiempo es consumida por las células, por lo
que se opta por un sustituto no hidrosoluble el cual es el IPTG y que realiza en manera
similar la inducción.
Inicialmente se preparó un stock de IPTG a 0.2 M el cual se obtuvo con 0.476 g de IPTG
disueltos en 10 mL de agua destilada y esterilizada. Para la inducción se probaron dos
concentraciones de IPTG en las muestras, una con concentración final de 1mM y otra con 2
mM. Los medios de crecimiento fueron preparados con 180 mL medio LB y cloranfenicol a
una concentración final de antibiótico de 50 µg/mL en erlenmeyers de 500 mL. Cada uno
de los medios fue inoculado con 20 mL de preinóculo de la cepa con la sobrexpresión para
completar un volumen de 200 mL. Se prepararon tres cultivos de la siguiente manera.
Diagrama 2. Diseño experimental para la inducción de la sobrexpresión del gen ppc.
Cultivos en volumen de 200 mL
Inducción con 1 mL de
IPTG 0.2 M
Inducción con 2 mL de
IPTG 0.2 M
Cultivo sin inducción con
IPTG (Blanco)
Concentración IPTG:
1 mM
Concentración IPTG:
2 mM
Concentración IPTG:
0 mM
21
3.6.4. Fermentación a partir de glicerol
En miras de cumplir el objetivo principal planteado por este proyecto, se va a realizar una
fermentación a partir de glicerol, realizada por las células de E. coli que contienen la
sobrexpresión del gen ppc. Para ello, en los cultivos que se prepararon para la inducción
con IPTG, se agregan 5.4734 mL de glicerol al 43.5%, para obtener una concentración final
de 15 g/L en cada erlenmeyer. Se dejan los cultivos en condiciones de 37°C y 250 rpm de
agitación.
3.6.5. Lectura de muestras
Con el fin de cuantificar el avance de la fermentación a partir de glicerol realizada por los
cultivos mencionados anteriormente se realizaron tres medidas diferentes:
Cuantificación de biomasa en peso seco: Para tener conocimiento del cambio en la
biomasa del cultivo a medida que sucedía la fermentación se realizaron medidas de
la absorbancia de la muestra cada hora desde el inicio de la reacción. La medición
fue realizada a una longitud de onda de 600 nm. Teniendo conocimiento de que 1
OD equivale aproximadamente a 0.34 gramos de peso seco por litro (Murarka et al.,
2008) se sabe que con el aumento de la absorbancia se evidencia un aumento en el
peso seco de la muestra.
Cantidad de glicerol: Con el objetivo de observar como varía la concentración de
glicerol en cada uno de los cultivos se realizaron medidas del índice de refracción
de la muestra a partir del cual, usando una curva de calibración, es posible conocer
la concentración de este compuesto. De igual manera, estas mediciones se
realizaron cada hora desde el inicio de la fermentación.
Cantidad de ácido succínico producido: Se realizaron lecturas de las muestras
haciendo uso del método de cromatografía líquida de alta resolución, o HPLC por
sus siglas en ingles. Para la obtención de las muestras, cada hora se tomaron
aproximadamente 1,5 mL del cultivo los cuales fueron filtrados y debidamente
almacenados y marcados. Una vez obtenido todas las muestras se alimentaron a la
columna de HPLC, la cual opera con un 97% de buffer, 3% de acetonitrilo, a una
temperatura de 25°C y un flujo de 1 mL/min. Para el ácido succínico se tomó un
tiempo de retención de 2,5.
Los cultivos que se estudiaron se crecieron en volúmenes de 200 mL. El volumen fue
escogido especialmente para que al retirar las muestras necesarias para las mediciones no se
variara en más del 10% el volumen de la fermentación para no alterar de manera drástica la
relación medio/oxigeno presente en la reacción. Las mediciones fueron realizadas para un
periodo de 6 horas.
22
4. Resultados y discusión
4.1. Curva de crecimiento de Escherichia coli K12 wild type
Siguiendo el procedimiento descrito anteriormente se obtuvo la curva de crecimiento para
el cultivo de E. coli K12 wild type.
Figura 11. Curva de crecimiento del cultivo de E. coli K12 wild type midiendo la absorbancia a 600 nm
Comparando la curva obtenida con el comportamiento normal de las curvas de crecimiento
medidas a la misma longitud de onda se puede ver que se presentan ciertas zonas diferentes
y otras similares.
Figura 12. Comportamiento típico de una curva de crecimiento de E. coli con OD600. Tomada de
(Granada, s.f.).
Inicialmente se puede ver que en la curva obtenida se inicia con una pequeña fase Lag en la
que hay un leve aumento en la absorbancia. En esta etapa las células se están adaptando al
23
medio en el que se encuentran por lo que la cantidad de estas no varía de manera
considerable.
Comparando las dos gráficas se puede ver que en la experimental se obtiene una fase Log
en la cual la densidad de las muestras aumenta con mayor velocidad, lo que quiere decir
que, en este periodo, las células crecen más rápido.
En cuanto a la fase estacionaria, se puede ver en la gráfica obtenida que la densidad de las
muestras intenta estabilizarse. Sin embargo no se puede observar una completa
estabilización debido a que no se tomó un tiempo suficientemente largo de muestreo.
Finalmente se puede ver que en la gráfica resultante no se presenta la fase de decaimiento.
Esto pudo darse debido a que el tiempo de muestreo no fue suficiente para que la fuente de
alimento disminuyera causando la muerte de células. Es posible que si se hubieran tomado
más muestras, la fase de decaimiento hubiera sido visible.
4.2. Deleción del gen adhE
4.2.1. Oligonucleótidos diseñados
Los oligómeros obtenidos para la deleción del gen adhE son los siguientes:
Upstream Primer:
5’atgGCTGTTACTAATGTCGCTGAACTTAACGCACTCGTAGAGCGTGTAAAAATT
AACCCTCACTAAAGGGCG 3’
Downstream Primer:
5’TTAAGCGGATTTTTTCGCTTTTTTCTCAGCTTTAGCCGGAGCAGCTTCTTTAAT
ACGACTCACTATAGGGCTC 3’
Donde la primera parte de los oligómeros corresponde a la secuencia complementaria al
gen de interés, mientras que la secuencia subrayada es la que permite la adición de las
cadenas complementarias al casete FRT-flanked.
4.2.2. Electroporación del plásmido pRedET
Siguiendo el procedimiento que fue presentado en la metodología, se obtuvieron tres
cultivos diferentes. Un control positivo que contiene células que ya tienen insertado el
plásmido pRedET con resistencia a tetraciclina, un control negativo con células
electroporadas crecidas en medio LB sin antibióticos, y las muestra de interés con células
electroporadas crecidas en medio LB con 3 μg/ml de tetraciclina.
24
Las tres siembras fueron dejadas por aproximadamente 50 horas a 30°C. Como resultados
se obtuvo crecimiento en el control positivo, lo que nos permite concluir que el antibiótico
adquirido y el stock preparado funcionaron de manera correcta. De la misma manera creció
el control negativo, por lo cual sabemos que las células están creciendo después del
impacto eléctrico.
En cuando al cultivo de interés, no se presentó crecimiento alguno de este, lo que quiere
decir que el plásmido que le confiere la resistencia a tetraciclina a la célula no fue
electroporado, por lo que el antibiótico impidió el crecimiento de las células. Esto pudo
darse debido a diferentes razones. En primer lugar, el protocolo establecía que la
incubación del inóculo debía llevarse a cabo a 1000 rpm. En los laboratorios a los que
teníamos acceso no se contaba con incubadoras que llegaran a esas velocidades, por lo que
fue necesario realizar el procedimiento a una velocidad menor, de 350 rpm. Para compensar
la disminución en las revoluciones de agitación se decidió dejar más tiempo la muestra en
incubación, hasta que alcanzara la fase exponencial, lo que para nuestra curva de
crecimiento representa un OD600≈0.175.
Por otro lado, en el protocolo se especificaba que la electroporación debía realizarse cuando
las células presentaran un OD600≈0.3. Sin embargo esto no fue posible para nuestros
cultivos, ya que como se ve en la curva de crecimiento, los valores de OD no llegan más
allá de 0.24. Por esta razón se decidió realizar la electroporación basándonos solo en el
criterio del cultivo en la fase exponencial.
Con el fin de descartar que la absorbancia de la muestra no fuera la causante de la
electroporación fallida de las células se realizó un inóculo y se tomaron mediciones hasta
lograr el valor de absorbancia especificado en el kit (OD600≈0.3). Nuevamente, los
resultados fueron negativos, indicando que el valor de la absorbancia tampoco era el
problema principal.
El problema en esta etapa podría estar entonces en el método utilizado para generar células
competentes, al igual que el hecho de que la incubación del inóculo no fuera llevada a cabo
en las condiciones establecidas por el kit.
4.2.3. PCR para la generación del fragmento de disrupción
Después de realizada la PCR tal y como se describe en la sección 3.5.3 de este documento,
se procedió a correr una electroforesis para determinar si la PCR fue exitosa. Para ello se
sembraron 5 pozos del gel. Tomando como referencia la imagen 2, en la primera columna
de la izquierda se puede ver una franja blanca muy nítida, la cual es el recorrido del
marcador de peso, a partir del cual se puede determinar el peso molecular de las muestras.
En la segunda columna se encuentra la reacción llevada a cabo con una temperatura de
anillaje de 55°C. Seguida de esta hay un control, puesto a 55°C pero sin el casete FRT-
25
flanked. A la derecha de este se encuentra la reacción realizada a 68°C en la temperatura de
anillaje y al lado su respectivo control.
Imagen 2. Gel de electroforesis posterior a la PCR de generación del casete para la deleción.
Como se puede ver en el rectángulo naranja, se presenta en el gel una franja suave la cual
se encuentra cercana a las 1700 bp. Según el peso del casete adherido a los
oligonucleótidos diseñados, este debería tener un peso de 1783 bp. Esto podría dar indicios
de que efectivamente el casete se adhirió de manera correcta a los brazos homólogos, sin
embargo, como la línea es tan tenue fue necesario correr otra electroforesis, en la cual se
observó de manera clara que no hubo unión.
Esto pudo presentarse debido a la temperatura de anillamiento utilizada. Aunque la
temperatura de 55°C es la que mencionan en el protocolo, siempre existe la probabilidad de
que en medio de la reacción, las cadenas se anillen entre ellas misma, en lugar de generar la
unión con el casete. Además, en el protocolo las instrucciones para realizar la PCR incluían
el uso de la polimerasa “Phusion DNA”, y aunque mencionaban que el protocolo se podía
seguir usando cualquier tipo de polimerasa, es posible que este cambio en la enzima no
haya permitido que la reacción se haya realizado de la manera correcta.
4.3. Sobrexpresión del gen ppc
4.3.1. Purificación del plásmido de sobrexpresión
26
Siguiendo el procedimiento descrito tanto en el protocolo del kit usado como en las páginas
anteriores de este documento, se realizó la purificación del plásmido que contiene la
sobrexpresión del gen ppc. La cepa de la cual fue obtenido el plásmido es Escherichia coli
W3110. Luego de realizado el protocolo se procedió a realizar una electroforesis para
corroborar la correcta purificación del plásmido de interés.
Tomando como referencia la imagen 3 se puede ver el gel que se obtuvo en la prueba.
Empezando de izquierda a derecha, en la primera columna se encuentra el marcador de
peso el cual permite leer los resultados mediante el peso molecular. A la derecha de este
hay dos columnas pertenecientes a otro experimento fuera del marco de este proyecto. Las
cuatro columnas siguientes pertenecen al plásmido de interés del presente trabajo.
Las dos columnas que se encuentran más a la derecha son el resultado de una purificación
realizada de manera incorrecta ya que uno de los buffers no contenía la RNAasa necesaria
para digerir el RNA liberado de las células. Por esta razón, esas bandas no se ven
delimitadas, y contrario a eso presentan muchas trazas a lo largo del recorrido, lo cual es
evidencia de que la purificación no fue realizada de la manera correcta.
Por su parte, las bandas que se encuentran encerradas por el rectángulo amarillo son los
resultados de una purificación realizada de la manera correcta. Hay dos columnas ya que se
realizó una réplica para el procedimiento.
Imagen 3. Gel de electroforesis posterior a la purificación del plásmido que contiene el gen ppc para la
sobrexpresión.
27
Según el marcador de peso utilizado, la banda se encuentra en un peso molecular de
aproximadamente 5000 bp, a partir de lo cual se puede concluir que el plásmido fue
correctamente purificado, ya que el vector de interés es el pCA24N el cual tiene un peso de
5240 bp.
4.3.2. Cuantificación de Biomasa en peso seco
Una vez realizada la inducción de las células con IPTG para que inicie la expresión del gen
ppc, e iniciada la fermentación se tomaron datos cada hora, durante 6 horas, de la
absorbancia de los cultivos para conocer la variación de la biomasa en peso seco. Los
resultados obtenidos se presentan en la figura 13.
Como se puede ver en los tres cultivos preparados se presenta un aumento de la
absorbancia a medida que pasa el tiempo, lo que a su vez nos da una idea de que la biomasa
aumenta en la misma medida. Se puede observar que mientras que para el cultivo no
inducido y el inducido a una concentración de 2 mM el aumento en la biomasa es casi el
mismo, desde el inicio de las mediciones la muestra inducida a 1 mM de IPTG presenta un
crecimiento mayor. Esto puede hacernos pensar esta es concentración adecuada para la
inducción.
Figura 13. Cantidad de biomasa en peso seco de los cultivos en fermentación. Se tienen muestras de dos
cultivos inducidos con IPTG a concentraciones diferentes y un blanco sin inducción de la
sobrexpresión.
1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 60
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6Cantidad de Biomasa en peso seco
Absorb
ancia
(600nm
)
Tiempo(h)
2mM IPTG
No Inducido
1mM IPTG
28
Teniendo en cuenta la relación de que 1 OD equivale aproximadamente a 0.34 gramos de
peso seco por litro (Murarka et al., 2008) se tienen que al final de las 6 horas de
fermentación los cultivos no inducido y el inducido a 2 mM terminan con un peso seco
aproximado de 0.47 g/L. Por su parte, la muestra inducida a 1mM termina la fermentación
con una concentración de peso seco de 0.52 g/L.
Era de esperarse que los cultivos aumentaran en biomasa ya que con la incubación se ayuda
a que haya crecimiento en el número de células. Sin embargo, la preponderancia del cultivo
inducido a 1 mM nos permite ver que en cierto modo, la sobrexpresión permite que las
células crezcan a mayor velocidad, lo que puede ser causado por un aumento en la
velocidad de reacción en la producción de ácido succínico, el cual hace parte del TCA, el
que a su vez es de gran importancia en la producción de energía y por ende de biomasa en
la célula.
Sin embargo, otra perspectiva podría apuntar a que, dado el hecho de que las células tienen
la carga de realizar una sobreexpresión y procesos a los cuales no están acostumbradas, el
cultivo de sobreexpresión podría tener un comportamiento de crecimiento un poco más
lento o menor que el cultivo que no tiene esta mutación.
4.3.3. Concentración de glicerol
El objetivo del proyecto es realizar una fermentación a base de glicerol a partir de la cual se
produzca en mayor proporción ácido succínico comparado con las células sin mutar. Para
saber si efectivamente la sobrexpresión permite que se tome el glicerol como alimento de la
reacción en necesario realizar una cuantificación de este en los cultivos. Los resultados
obtenidos se presentan en la figura 14. El método utilizado para medir la concentración de
glicerol fue el índice de refracción (IR), el cual se relaciona de manera directamente
proporcional con la concentración de glicerol presente, es decir que si el IR aumenta la
concentración de glicerol también lo hace. Estos datos se pueden corroborar en la curva de
calibración que se encuentra en el anexo 3 de este documento.
29
Figura 14. Concentración de glicerol presente en los cultivos en fermentación. Se tienen muestras de
dos cultivos inducidos con IPTG a concentraciones diferentes y un blanco sin inducción de la
sobrexpresión.
Se puede ver de nuevo que los valores para los cultivos no inducido e inducido a una
concentración de 2 mM son muy similares, por lo que se podría decir que a esa
concentración de IPTG no se está produciendo inducción alguna. Por su parte, para el
cultivo inducido a 1 mM de IPTG se ven fluctuaciones grandes de la concentración de
glicerol presente en donde este aumenta y disminuye de manera oscilatoria.
Sin embargo, la concentración de glicerol varía de una manera que no es esperada, puesto
que el glicerol es la única fuente de carbono en los cultivos, lo que implica que ésta debería
disminuir con el tiempo, dado que los cultivos se encuentran en crecimiento y que las
células no producen este compuesto.
Los resultados en lo que respecta a la concentración de glicerol en el cultivo no son muy
coherentes con la producción de biomasa, por lo cual es necesario establecer otro método
de medición diferente al índice de refracción y realizar réplicas de los experimentos para
observar una tendencia o un comportamiento generalizado de la concentración en el tiempo
en los cultivos en cuestión.
1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 623
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33Concentración de Glicerol
Concentr
ació
n (
mg/m
L)
Tiempo(h)
2mM IPTG
No Inducido
1mM IPTG
30
4.3.4. Producción de ácido succínico
Como última medición, para poder cuantificar si efectivamente la sobrexpresión del gen
ppc permite que haya un aumento en la producción de ácido succínico, se realizan
mediciones usando HPLC. Los resultados obtenidos para las tres muestras se presentan en
la figura 15.
Figura 15. Producción de ácido succínico cuantificada por HPLC como producto de la fermentación. Se
tienen muestras de dos cultivos inducidos con IPTG a concentraciones diferentes y un blanco sin
inducción de la sobrexpresión.
Como se puede ver en la gráfica se observa que en las primeras cinco horas de la
fermentación el cultivo no inducido es el que presenta la mayor cantidad de ácido succínico
producido. Sin embargo después de este tiempo, la producción de este cultivo empieza a
disminuir mientras que la de los dos cultivos inducidos con IPTG aumenta de manera
exponencial. Aunque al final del periodo de muestro se evidencia un aumento en la
concentración de ácido succínico, esto no asegura que al transcurrir más horas el
comportamiento vaya a seguir en crecimiento por lo que es necesario aumentar el tiempo de
experimentación para conocer si el comportamiento del cultivo continúa de la manera
esperada, o presenta alteraciones en tiempos mayores a las 6 horas, ya que como se puede
ver, la concentración de este compuesto varía de manera oscilante en cada hora.
Al finalizar las 6 horas de fermentación se tiene que el cultivo no inducido presenta una
concentración de ácido succínico de 1.82 mg/mL, el cultivo inducido a 2 mM de 2.11
1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2Producción de Ácido Succínico
Concentr
ació
n (
mg/m
L)
Tiempo(h)
2mM IPTG
No inducido
1mM IPTG
31
mg/mL y el inducido a 1 mM de IPTG una concentración de 2.13 mg/mL. Las variaciones
de los datos en los diferentes tiempos pueden deberse a que las bacterias estaban en una
fase de crecimiento que no era del todo estable, por lo cual la producción de metabolitos y
el consumo de los mismos era necesario para una estabilización del sistema en tiempos
posteriores.
Figura 16. Resultados final de la producción de ácido succínico al finalizar las 6 horas de fermentación.
Se tienen muestras de dos cultivos inducidos con IPTG a concentraciones diferentes y un blanco sin
inducción de la sobrexpresión.
En estudios anteriormente realizados con cepas de E. coli tomando glicerol como sustrato
para la fermentación, se han obtenido resultados para 110 horas de reacción en donde se
obtienen concentraciones finales de ácido succínico que varías desde 5 hasta 112 g/L (Lin,
H. et al., 2004). Teniendo en cuenta que con tan solo 6 horas de fermentación se obtuvo
una concentración 2.13 g/L del producto de interés, se puede concluir que con un tiempo
mayor se podrían obtener los resultados alcanzados por el estudio mencionado, lo cual da
indicios de una buena ejecución de la sobrexpresión.
La baja producción en las primeras horas puede deberse a que la inducción todavía no se
había realizado de manera completa y la presencia del IPTG en las células causa que estas
se alteren un poco mientras se acoplan al medio en el que están y empiezan a realizar la
expresión del gen de interés. Es de gran importancia entonces que, para corroborar los
resultados esperados, se realicen réplicas de los experimentos ejecutados, aumentando el
tiempo de fermentación y de muestreo, para obtener un rango de estudio mucho más amplio
que nos permita reafirmar lo propuesto en el presente proyecto.
2mM IPTG No Inducido 1mM IPTG0
0.5
1
1.5
2
2.5Producción de Ácido Succínico
Concentr
ació
n (
mg/m
L)
32
5. Conclusiones
La ingeniería de redes metabólicas nos permite modificar genéticamente un
microorganismo con el fin de lograr un objetivo determinado. Sin embargo es necesario
tener en cuenta que los cambios realizados en un gen específico pueden influenciar todo el
sistema y no solamente la región que está siendo tenida en cuenta, razón por la cual no fue
posible realizar modificaciones en ciclo vitales como el ciclo de Krebs.
El proceso de fermentación mixta en Escherichia coli conduce a diferentes rutas, en donde
al final de cada una de ellas se obtiene un metabolito distinto. Los genes seleccionados,
tanto para la deleción como para la sobrexpresión, se escogieron pensando en aumentar el
flujo de los carbonos provenientes del glicerol en la ruta del ácido succínico.
Aunque no se obtuvo una curva de crecimiento igual a la típica en las curvas de este tipo, si
se puede ver que hay cierta similitud en las dos fases iniciales, que son la fase Lac y la fase
exponencial. La ausencia de las otras dos fases, estacionaria y de decaimiento, se dio por un
corto tiempo de muestro respectivamente.
Las condiciones de realización de la electroporación del plásmido pRedET no permitieron
que este procedimiento se realizara de la mejor manera. Se recomienda para futuras
experimentaciones con este kit, el contar con todos los equipos especificados en el
protocolo.
Al momento de realizar una reacción en cadena de polimerasa es necesario tener certeza de
las temperaturas que se ajustan en el termociclador, ya que un error en alguna de ellas
puedes terminar en un anillamiento incorrecto de las cadenas de ADN presentes en la
reacción.
Según las mediciones tomadas se puede afirmar que la sobrexpresión del gen ppc aumenta
la producción de ácido succínico y que la concentración más adecuada para realizar la
inducción es de 1 mM de IPTG ya que para esta concentración se obtuvo la mayor
concentración de ácido succínico al final de la fermentación, además que para este cultivo
de observó la mayor actividad en cuanto a crecimiento y consumo de glicerol.
Teniendo en cuenta estudios realizados anteriormente, se puede ver que los resultados
obtenidos a partir de la sobrexpresión del gen ppc alcanzan rendimientos comparables con
los registrados lo que permite afirmar que la mutación fue correctamente realizada y que
está encaminada en la dirección correcta.
Aunque solo fue posible realizar la sobrexpresión, ya que el procedimiento de la deleción
no arrojó resultados positivos, se puede ver que las modificaciones genéticas están bien
encaminadas. De esta manera se puede predecir que con la deleción es posible que la
33
cantidad de ácido succínico aumente ya que los compuestos carbonados ya no se dirigirían
a la síntesis de etanol.
Es necesario realizar un muestreo en un rango de tiempo más amplio y considerar la
implementación de réplicas de los experimentos para poder reafirmar lo concluido en el
presente documento o replantear el proyecto en cuestión, en caso de que los resultados sean
negativos en cuanto a la producción de biomasa, concentración de glicerol y producción de
ácido succínico.
6. Recomendaciones
Se recomienda que al momento de realizar la curva de crecimiento para la cepa bacteriana
se tome un tiempo de muestreo más largo para poder observar de manera clara todas las
etapas que una curva de esta debe presentar.
Para realizar la electroporación del plásmido pRedET, se recomienda realizar el
crecimiento de las células en tubos eppendorf de 2 mL, a 37°C y 1000 RPM, asegurándose
de que la células alcancen un ODE600≈0.3, tal como se especifica en el protocolo que
acompaña el kit “Gene Deletion in E. coli”.
Es importante realizar varias reacciones de PCR con distintas temperaturas de anillamiento
para poder tener un rango más amplio de posibilidades de que el casete y los oligómeros
diseñados efectivamente se unan.
Se recomienda realizar la fermentación en un rango de tiempo más largo para poder
observar que efectivamente después de que las células inducidas se estabilizan empiezan a
producir ácido succínico en mayor cantidad.
Para realizar la fermentación, se recomienda asegurar una pequeña o nula cantidad de
oxígeno para dirigir el carbono disponible en las células hacia esta ruta metabólica.
Se recomienda hallar una manera más precisa de cuantificar la concentración de glicerol
diferente del índice de refracción, ya que por medio de esta técnica no fue posible ver de
manera concreta la variación en la concentración de este compuesto.
34
Referencias
Beijer, L., Nilsson, R. P., Holmberg, C., & Rutberg, L. (February de 1993). The glpP and
glpF genes of the glycerol regulon in Bacillus subtilis. Journal of general
microbiology, 139(2), 349-359.
Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2002). Acetyl Coenzyme A Carboxylase Plays a
Key Role in Controllong Fatty Acid MEtabolism. En J. M. Berg, J. L. Tymoczko, &
L. Stryer, Biochemistry (Quinta ed.). New York: W H Freeman.
Birnboim, H. C., & Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction for screening recombinant
plasmid DNA. Nucleic Acids Research, 7(6).
Blankschien, M. D., Clomburg , J. M., & Gonzalez, R. (2010). Metabolic engineering of
Escherichia coli for the production of succinate from glycerol. Metabolic
Engineering, 409-419.
Cecchini, G., Schröder, I., Gunsalus, R. P., & Maklashina, E. (January de 2002). Succinate
dehydrogenase and fumarate reductase from Escherichia coli. Biochimica et
biophysica acta, 17(1553), 140-157.
Charrier, V., Buckley, E., Parsonage, D., Galinier, A., Darbon, E., Jaquinod, M., . . .
Claiborne, A. (May de 1997). Cloning and sequencing of two enterococcal glpK
genes and regulation of the encoded glycerol kinases by phosphoenolpyruvate-
dependent, phosphotransferase system-catalyzed phosphorylation of a single
histidyl residue. The Journal of biological chemistry, 272(22), 14166-14174.
Cole, S. T., Eiglmeier, K., Ahmed, S., Honore, N., Elmes, L., Anderson, W. F., & Weiner,
J. H. (June de 1988). Nucleotide sequence and gene-polypeptide relationships of the
glpABC operon encoding the anaerobic sn-glycerol-3-phosphate dehydrogenase of
Escherichia coli K-12. Journal of bacteriology, 170(6), 2448-2456.
Dias de Oliveira, S., de Souza Antunes, A., & Pereira Junior, N. (27 de Septiembre de
2013). Technology Mapping of Processes for Succinic Acid Production from
Renewable Sources: an Analysis un Brazilian Context. Simposio Internacional de
Inovación Tecnológica, 1(1), 239-256.
Dufour, J. (31 de Junio de 2009). Catalizador ecológico para la producción de biodiesel.
Obtenido de Madrid+d:
http://www.madrimasd.org/blogs/energiasalternativas/2009/07/31/122559
Eslava Campos, C. A., Navarro Ocaña, A., Hernández Chiñas, U., & Salazar Jiménez , E.
P. (s.f.). Escherichia coli, microorganismo divergente con actitud dual en su
relación de convivencia con sus hospederos. Obtenido de Departamento de Salud
35
Pública, Facultad de Medicina, UNAM:
http://www.facmed.unam.mx/deptos/salud/ourprofs/ecoli_divergente.htm
Expression Technologies Inc. (2003). Bacteria E. coli Growth Media. Obtenido de
http://www.exptec.com/Expression%20Technologies/Bacteria%20growth%20medi
a.htm
Flint, D. H., Tuminello, J. F., & Emptage, M. H. (October de 1993). The inactivation of Fe-
S cluster containing hydro-lyases by superoxide. The Journal of biological
chemistry, 268(30), 22369-22376.
Gene Bridges. (Junio de 2012). Thechnical Protocol. Cat.No.K006. Quick & Easy E. coli
Gene Deletion Kit. Red/ET Recombination.
Granada, U. d. (s.f.). Cultivo en sistemas cerrados. Obtenido de Ciclo celular y
crecimiento: http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm
Invitrogen. (25 de Abril de 2011). Catalog K2100-11. PureLink Quick Plasmid Miniprep
Kit. Life Technologies.
Kameshita, I., Tokushige, M., Izui, K., & Katsuki, H. (November de 1979).
Phosphoenolpyruvate carboxylase of Escherichia coli. Affinity labeling with
bromopyruvate. Journal of biochemistry, 86(5), 1251-1257.
Kornberg, H. L. (1966). The Role and Control of the Glyoxylate Cycle in Escherichia coli.
The Biochemical Journal.
Legaz Berbel, R. (Junio de 2010). Estudio de la viscosidad y densidad de diferentes aceites
para su uso como biocombustible. Barcelona, España.
Lin, H., Bennett, G., & Ka-Yiu, S. (2004). Metabolic engineering of aerobic succinate
production system in Escherichia coli to improve process productivity and achieve
the maximum theorical succinate yield. Metabolic Engineering, 7, 116-127.
Meneses, J., Corrales, M. C., & Valencia, M. (Diciembre de 2007). Síntesis y
Caracterización de un Polímero Biodegradables a partir del Almidón de Yuca.
EIA(8), 57-67.
Murarka, A., Dharmadi, Y., Shams, S., & González, R. (2008). A new model for the
anaerobic fermentation of glycerol in enteric bacteria: trunkand auxiliary pathways
in Escherichia coli. Metaboli Engineering, 10, 234-245.
Muyrers, J. P., Zhang, Y., Buchholz, F., & Stewart, A. F. (2000). RecE/RecT and
Redα/Redβ initiate double-stranded break repair by specifically interacting with
their respective partners. Genes & Development.
36
Peña, A. (2004). Bioquímica (2ª edición ed.). Balderas, México: Noriega Editores.
RM, R. (2005). Methabolic engineering. Biotechnol, 1-17. Obtenido de PubMed: US
National Library of Medicine National Institutes of Health.
Santibañez, C., Varnero, M. T., & Bustamante, M. (Julio-Septiembre de 2011). Residual
Glyceron from Biodisel Manufacturing, Waste or Potencial Source od Bioenergy: A
review. Chilean Journal of Agricultural Research, 71(3).
Schryvers, A., Lohmeier, E., & Weiner, J. H. (February de 1978). Chemical and functional
properties of the native and reconstituted forms of the membrane-bound, aerobic
glycerol-3-phosphate dehydrogenase of Escherichia coli. The Journal of biological
chemistry, 253(3), 783-788.
Thakker, C., Martínez, I., San, K.-Y., & Bennet, G. N. (2012). Succinate production in
Escherichia coli. Biotechnol, 7(2), 213-224.
Vidal Santo, A., Rodríguez Toledo, J. A., Vega de la Garza, Á. G., & Rodríguez Fernández,
E. (2012). Análisis del desempeño de motores Diesel operados con biodiesel.
Congreso Internacional de Investigación, 4(2).
Wolfson, K. (22 de Febrero de 2012). Isolating Plasmis DNA. Recuperado el 6 de
Septiembre de 2014, de https://www.youtube.com/watch?v=8xEDEJ0DHFA
37
Anexos
1. Secuencia de aminoácidos de la proteína AdhE
MAVTNVAELN ALVERVKKAQ REYASFTQEQ VDKIFRAAAL AAADARIPLA KMAVAESGMG
IVEDKVIKNH FASEYIYNAY KDEKTCGVLS EDDTFGTITI AEPIGIICGI VPTTNPTSTA
IFKSLISLKT RNAIIFSPHP RAKDATNKAA DIVLQAAIAA GAPKDLIGWI DQPSVELSNA
LMHHPDINLI LATGGPGMVK AAYSSGKPAI GVGAGNTPVV IDETADIKRA VASVLMSKTF
DNGVICASEQ SVVVVDSVYD AVRERFATHG GYLLQGKELK AVQDVILKNG ALNAAIVGQP
AYKIAELAGF SVPENTKILI GEVTVVDESE PFAHEKLSPT LAMYRAKDFE DAVEKAEKLV
AMGGIGHTSC LYTDQDNQPA RVSYFGQKMK TARILINTPA SQGGIGDLYN FKLAPSLTLG
CGSWGGNSIS ENVGPKHLIN KKTVAKRAEN MLWHKLPKSI YFRRGSLPIA LDEVITDGHK
RALIVTDRFL FNNGYADQIT SVLKAAGVET EVFFEVEADP TLSIVRKGAE LANSFKPDVI
IALGGGSPMD AAKIMWVMYE HPETHFEELA LRFMDIRKRI YKFPKMGVKA KMIAVTTTSG
TGSEVTPFAV VTDDATGQKY PLADYALTPD MAIVDANLVM DMPKSLCAFG GLDAVTHAME
AYVSVLASEF SDGQALQALK LLKEYLPASY HEGSKNPVAR ERVHSAATIA GIAFANAFLG
VCHSMAHKLG SQFHIPHGLA NALLICNVIR YNANDNPTKQ TAFSQYDRPQ ARRRYAEIAD
HLGLSAPGDR TAAKIEKLLA WLETLKAELG IPKSIREAGV QEADFLANVD KLSEDAFDDQ
CTGANPRYPL ISELKQILLD TYYGRDYVEG ETAAKKEAAP AKAEKKAKKS A
2. Secuencia de bases del gen adhE
atgGCTGTTA CTAATGTCGC TGAACTTAAC GCACTCGTAG AGCGTGTAAA AAAAGCCCAG
CGTGAATATG CCAGTTTCAC TCAAGAGCAA GTAGACAAAA TCTTCCGCGC CGCCGCTCTG
GCTGCTGCAG ATGCTCGAAT CCCACTCGCG AAAATGGCCG TTGCCGAATC CGGCATGGGT
ATCGTCGAAG ATAAAGTGAT CAAAAACCAC TTTGCTTCTG AATATATCTA CAACGCCTAT
AAAGATGAAA AAACCTGTGG TGTTCTGTCT GAAGACGACA CTTTTGGTAC CATCACTATC
GCTGAACCAA TCGGTATTAT TTGCGGTATC GTTCCGACCA CTAACCCGAC TTCAACTGCT
ATCTTCAAAT CGCTGATCAG TCTGAAGACC CGTAACGCCA TTATCTTCTC CCCGCACCCG
CGTGCAAAAG ATGCCACCAA CAAAGCGGCT GATATCGTTC TGCAGGCTGC TATCGCTGCC
GGTGCTCCGA AAGATCTGAT CGGCTGGATC GATCAACCTT CTGTTGAACT GTCTAACGCA
CTGATGCACC ACCCAGACAT CAACCTGATC CTCGCGACTG GTGGTCCGGG CATGGTTAAA
GCCGCATACA GCTCCGGTAA ACCAGCTATC GGTGTAGGCG CGGGCAACAC TCCAGTTGTT
ATCGATGAAA CTGCTGATAT CAAACGTGCA GTTGCATCTG TACTGATGTC CAAAACCTTC
GACAACGGCG TAATCTGTGC TTCTGAACAG TCTGTTGTTG TTGTTGACTC TGTTTATGAC
GCTGTACGTG AACGTTTTGC AACCCACGGC GGCTATCTGT TGCAGGGTAA AGAGCTGAAA
GCTGTTCAGG ATGTTATCCT GAAAAACGGT GCGCTGAACG CGGCTATCGT TGGTCAGCCA
GCCTATAAAA TTGCTGAACT GGCAGGCTTC TCTGTACCAG AAAACACCAA GATTCTGATC
GGTGAAGTGA CCGTTGTTGA TGAAAGCGAA CCGTTCGCAC ATGAAAAACT GTCCCCGACT
CTGGCAATGT ACCGCGCTAA AGATTTCGAA GACGCGGTAG AAAAAGCAGA GAAACTGGTT
GCTATGGGCG GTATCGGTCA TACCTCTTGC CTGTACACTG ACCAGGATAA CCAACCGGCT
CGCGTTTCTT ACTTCGGTCA GAAAATGAAA ACGGCGCGTA TCCTGATTAA CACCCCAGCG
TCTCAGGGTG GTATCGGTGA CCTGTATAAC TTCAAACTCG CACCTTCCCT GACTCTGGGT
38
TGTGGTTCTT GGGGTGGTAA CTCCATCTCT GAAAACGTTG GTCCGAAACA CCTGATCAAC
AAGAAAACCG TTGCTAAGCG AGCTGAAAAC ATGTTGTGGC ACAAACTTCC GAAATCTATC
TACTTCCGCC GTGGCTCCCT GCCAATCGCG CTGGATGAAG TGATTACTGA TGGCCACAAA
CGTGCGCTCA TCGTGACTGA CCGCTTCCTG TTCAACAATG GTTATGCTGA TCAGATCACT
TCCGTACTGA AAGCAGCAGG CGTTGAAACT GAAGTCTTCT TCGAAGTAGA AGCGGACCCG
ACCCTGAGCA TCGTTCGTAA AGGTGCAGAA CTGGCAAACT CCTTCAAACC AGACGTGATT
ATCGCGCTGG GTGGTGGTTC CCCGATGGAC GCCGCGAAGA TCATGTGGGT TATGTACGAA
CATCCGGAAA CTCACTTCGA AGAGCTGGCG CTGCGCTTTA TGGATATCCG TAAACGTATC
TACAAGTTCC CGAAAATGGG CGTGAAAGCG AAAATGATCG CTGTCACCAC CACTTCTGGT
ACAGGTTCTG AAGTCACTCC GTTTGCGGTT GTAACTGACG ACGCTACTGG TCAGAAATAT
CCGCTGGCAG ACTATGCGCT GACTCCGGAT ATGGCGATTG TCGACGCCAA CCTGGTTATG
GACATGCCGA AGTCCCTGTG TGCTTTCGGT GGTCTGGACG CAGTAACTCA CGCCATGGAA
GCTTATGTTT CTGTACTGGC ATCTGAGTTC TCTGATGGTC AGGCTCTGCA GGCACTGAAA
CTGCTGAAAG AATATCTGCC AGCGTCCTAC CACGAAGGGT CTAAAAATCC GGTAGCGCGT
GAACGTGTTC ACAGTGCAGC GACTATCGCG GGTATCGCGT TTGCGAACGC CTTCCTGGGT
GTATGTCACT CAATGGCGCA CAAACTGGGT TCCCAGTTCC ATATTCCGCA CGGTCTGGCA
AACGCCCTGC TGATTTGTAA CGTTATTCGC TACAATGCGA ACGACAACCC GACCAAGCAG
ACTGCATTCA GCCAGTATGA CCGTCCGCAG GCTCGCCGTC GTTATGCTGA AATTGCCGAC
CACTTGGGTC TGAGCGCACC GGGCGACCGT ACTGCTGCTA AGATCGAGAA ACTGCTGGCA
TGGCTGGAAA CGCTGAAAGC TGAACTGGGT ATTCCGAAAT CTATCCGTGA AGCTGGCGTT
CAGGAAGCAG ACTTCCTGGC GAACGTGGAT AAACTGTCTG AAGATGCATT CGATGACCAG
TGCACCGGCG CTAACCCGCG TTACCCGCTG ATCTCCGAGC TGAAACAGAT TCTGCTGGAT
ACCTACTACG GTCGTGATTA TGTAGAAGGT GAAACTGCAG CGAAGAAAGA AGCTGCTCCG
GCTAAAGCTG AGAAAAAAGC GAAAAAATCC GCTtaa
3. Curva de calibración para la concentración de glicerol
Gráfica tomada de:
https://biblioteca.uniandes.edu.co/visor_de_tesis/web/?SessionID=L1Rlc2lzXzEyMDEyMj
IwMS81My5wZGY%3D
