i

DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO SEBAGAI

PENDETEKSI DAERAH RRDR GEN rpoB

Mycobacterium tuberculosis UNTUK METODE REAL-

TIME POLYMERASE CHAIN REACTION

Skripsi

DEK PUETERI DEWI SURYANI

1208505085

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS UDAYANA

2016

ii

iii

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, Ida Sang

Hyang Widhi Wasa, karena berkat rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan

skripsi berjudul “DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO SEBAGAI

PENDETEKSI DAERAH RRDR GEN rpoB Mycobacterium tuberculosis

UNTUK METODE REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION” tepat

pada waktunya. Skripsi ini diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Farmasi (S.Farm) di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Udayana.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini tidak berhasil tanpa

dukungan, bantuan, serta bimbingan dari berbagai pihak, baik secara langsung

maupun tidak langsung. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan rasa terima

kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Tuhan Yang Maha Esa, yang selalu memberikan anugerah, tuntunan dan

kekuatan bagi penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

2. Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M. Si., selaku Dekan Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana

3. Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt., selaku Ketua Jurusan

Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas

Udayana.

4. Putu Sanna Yustiantara S.Farm., M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing I

yang telah membantu dalam membimbing serta tak hentinya memberikan

semangat dan dukungan hingga akhir penyusunan skripsi ini.

iv

5. Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si., selaku dosen pembimbing II

yang telah membantu dalam membimbing serta tak hentinya memberikan

semangat dan dukungan hingga akhir penyusunan skripsi ini.

6. Rasmaya Niruri, S.Si., M. Farm. Klin., Apt., L. P. Mirah Kusuma Dewi, S.

Farm., M.Sc., Apt. dan Ni Kadek Warditiani, S. Farm., M.Sc., Apt., selaku

dosen penguji yang telah banyak membantu dalam membimbing penulis

hingga akhir penyusunan skripsi ini.

7. Seluruh dosen pengajar beserta staf/pegawai di Jurusan Farmasi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana yang telah

banyak membantu penulis, terutama para staf yang telah banyak membantu

dalam hal pengurusan surat dan kelengkapan administratif lainnya.

8. Kedua orang tua penulis, Putu Eka Winarsa dan Wahyu Hariyani, kakak

sekaligus panutan bagi penulis, Gede Bagues Guna Harimbawan WB (Mas

Rian), serta adik tercinta Sri Wisnu Opi Wulandari (Opik) yang tak pernah

henti selalu mengingatkan, memberi dukungan, doa dan semangat hingga

akhir penyusunan skripsi ini.

9. Keluarga besar Nengah Bendesa dan Soehari tersayang yang selalu

mendukung dan memberikan semangat bagi penulis hingga akhir penyusunan

skripsi ini.

10. Nenek penulis, Widyawati Bendesa dan Mulyati tersayang yang selalu

mendukung, mendoakan dan memberikan semangat bagi penulis hingga akhir

penyusunan skripsi ini.

v

11. Bibi tersayang penulis, alm. Nyoman Yudi Deli Astini “Bik Tini” yang tidak

pernah lelah untuk selalu memotivasi penulis semasa hidupnya.

12. Sahabat seperjuangan penulis yaitu Masmitha, Dein, Pebri, Utik, Rika, Ayuk,

Tata, Wichy, Krisnawan, Dewa, Sugi dan Lanang yang telah berjuang

bersama sejak awal menginjakkan kaki di Jurusan Farmasi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.

13. Tim TB, Rai, Ratih, Linda, Ebi dan Widya yang telah menjadi teman diskusi

dan berbagai suka duka selama penyusunan skripsi.

14. Teman terdekat sekaligus panutan bagi penulis, Gede Agastya Aparigraha

yang selalu mengingatkan dan memberi motivasi untuk mengerjakan skripsi

ini sampai pada akhirnya dapat terselesaikan dengan baik.

15. Seluruh Mahasiswa Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana,

khususnya Dioscuri Hygeia yang telah berjuang bersama penulis.

16. Semua Pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu per satu.

Penulis sepenuhnya menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih sangat jauh

dari kesempurnaan. Untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang

bersifat membangun dari semua pihak demi karya yang lebih baik di masa yang

akan datang. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.

Jimbaran, Mei 2016

Penulis

vi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ........................................................................................... i

LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................ ii

KATA PENGANTAR ........................................................................................ iii

DAFTAR ISI ....................................................................................................... vi

DAFTAR TABEL ............................................................................................... ix

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... x

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xi

DAFTAR SINGKATAN SECARA UMUM ...................................................... xii

DAFTAR SINGKATAN ASAM AMINO ......................................................... xiii

DAFTAR ISTILAH ........................................................................................... xiv

ABSTRAK.......................................................................................................... xvi

ABSTRACT ....................................................................................................... xvii

BAB I PENDAHULUAN ................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang .................................................................................. 1

1.2 Rumusan Masalah ............................................................................. 7

1.3 Tujuan Penelitian .............................................................................. 7

1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................ 7

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................... 9

2.1 Tuberkulosis (TB) ............................................................................ 9

2.2 Genomik M. Tuberculosis ................................................................ 10

2.3 Mekanisme Resistensi Rifampisin (RIF) ......................................... 11

vii

2.4 Strategi Terapi Pasien dengan Resistensi Rifampisin ...................... 14

2.5 Mutasi Gen ...................................................................................... 17

2.6 Polymerase Chain Reaction (PCR) ................................................. 18

2.7. Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real-Time PCR) ............ 21

2.8 DNA Probe ..................................................................................... 21

2.9 Label TaqMan probe ....................................................................... 26

BAB III METODE PENELITIAN..................................................................... 29

3.1 Rancangan Penelitian ...................................................................... 29

3.2 Batasan Operasional Penelitian ....................................................... 29

3.3 Lokasi dan Waktu Penelitian .......................................................... 30

3.4 Bahan Penelitian.............................................................................. 30

3.5 Alat Penelitian ................................................................................. 31

3.6 Prosedur Penelitian ......................................................................... 31

3.6.1 Pemilihan Sekuens Target Rancangan DNA Probe.................. 32

3.6.2 Perancangan DNA Probe .......................................................... 33

3.6.3 Analisis Hasil Rancangan DNA Probe ..................................... 33

3.7 Penyimpulan Hasil Penelitian ......................................................... 35

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................... 36

4.1 Pemilihan Sekuens Target Rancangan DNA Probe...................... 36

4.2 Hasil Perancangan DNA Probe Secara In Silico .......................... 37

4.3 Hasil Analisis Rancangan DNA Probe ......................................... 40

4.3.1 Hasil Analisis Urutan DNA Probe .......................................... 40

4.3.2 Pelabelan Urutan DNA TaqMan probe.................................... 51

viii

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................. 56

5.1 Kesimpulan .................................................................................... 56

5.2 Saran ............................................................................................... 56

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 57

LAMPIRAN ........................................................................................................ 63

ix

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Terapi Penggunaan OAT Pasien dengan MDR-TB ........................... 15

Tabel 2.2 Tipe label Reporter dan Quencher untuk TaqMan probe .................. 27

Tabel 3.1 Data Kriteria Primer yang Telah Didesain Secara In Silico

dengan Clone Manager Suite 6 .......................................................... 31

Tabel 3.2 Hasil Analisis Tahap Awal Desain DNA Probe Wild-type

Sensitif ............................................................................................... 34

Tabel 4.1 Hasil Rancangan DNA Probe Wild-type Sensitif Tahap Awal.......... 41

Tabel 4.2 Empat Sekuens DNA Probe Wild-Type Sensitif Terpilih dari

Analisis Tahap Awal ......................................................................... 49

Tabel 4.3 Sekuens TaqMan probe Terpilih untuk Tahap Pelabelan .................. 50

x

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Genom Lengkap M. tuberculosis H37Rv ................................... 11

Gambar 2.2 Diagram Skematik Prinsip Kerja Real-time PCR

Menggunakan TaqMan probe .................................................... 24

Gambar 3.1 Pemetaan Urutan Nukleotida Daerah RRDR Gen rpoB

M. tuberculosis yang Menjadi Target Perancangan DNA

Probe ........................................................................................... 33

Gambar 4.1 Contoh Analisis Run dan Repeats Pada Software

Clone Manager Suite 6................................................................ 43

Gambar 4.2 Analisis Struktur Hairpin (A) dan Gambar Hairpin yang

Terbentuk Pada ∆G Berbeda dengan Suhu yang Berbeda

(B dan C) ...................................................................................... 44

Gambar 4.3 Analisis Struktur Hairpin yang Sesuai dengan Kriteria

Berdasarkan Suhu Annealing Secara Eksperimental (A)

dan Hairpin Tidak Terbentuk Pada Suhu Annealing

60ºC (B) ....................................................................................... 46

Gambar 4.4 Contoh Analisis Dimer Pada Salah Satu Sekuens DNA

Probe .......................................................................................... 47

Gambar 4.5 Daerah Penempelan 4 sekuens DNA Probe yang Telah

Memenuhi Kriteria nilai TmºC untuk TaqMan probe ................ 49

Gambar 4.6 Daerah Penempelan dan Pelabelan TaqMan probe WT

RRDR-24 ................................................................................... 51

xi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Peta Urutan Nukleotida Gen rpoB Mycobacterium

tuberculosis H37Rv RNA-Polymerase Beta Subunit ................... 63

Lampiran 2. Skema Kerja Prosedur Penelitian Desain DNA

Probe dan Analisis Hasil Rancangan ........................................... 65

Lampiran 3. Rincian Data Rancangan DNA TaqMan probe

WT RRDR-24 Pada Software Clone Manager Suite 6 ................ 67

xii

DAFTAR SINGKATAN SECARA UMUM

∆G : Energi Bebas

bp : Base Pairs

DNA : Deoxyribonucleic Acid

dNTPs : Deoxynucleotide Triphosphates

HEX : 6-carboxy-2’,4,4’,5’,7,7’-hexachlorofluorescein

JOE : 6-carboxy-4’,5’-dichloro-2’,7’-dimethoxyfluorescein

MDR : Multi-Drug Resistant

mRNA : Messenger Ribonucleic Acid

OAT : Obat Anti Tuberkulosis

pb : Pasang Basa

PCR : Polymerase Chain Reaction

PNA : Peptida Nucleic Acid

Q : Quencher

R : Reporter

RNA : Ribonucleic acid

RRDR : Rifampicin Resistant – Determining Region

TB : Tuberkulosis

TET : 6-carboxy-2’,4’,7,7’-tetrachlorofluorescein

TmºC : Temperature Melting

WHO : World Health Organization

WT : Wild-type

xiii

DAFTAR SINGKATAN ASAM AMINO

A : Alanin

C : Sitosin

D : Asam Aspartat

F : Fenilalanin

G : Guanin

H : Histidin

I : Isoleusin

L : Leusin

M : Metionin

N : Asparagin

P : Prolina

S : Serin

Q : Glutamin

R : Arginin

T : Treonina

V : Valin

W : Triptofan

Y : Tirosin

xiv

DAFTAR ISTILAH

Amplifikasi DNA : Perbanyakan DNA

Amplikon : Produk amplifikasi DNA

Asam Amino : Unit monomer penyusun protein yang dihubungkan

melalui ikatan peptide

DNA Template : DNA untai ganda yang membawa urutan basa

fragmen atau gen yang akan digandakan

Gen : Urutan DNA yang menyandi suatu protein

Kodon : Deret nukleotida pada mRNA yang terdiri atas

kombinasi tiga nukleotida berurutan yang menyandi

suatu asam amino tertentu

Mutasi : Terjadinya perubahan basa dari urutan nukleotida

yang lazim dari suatu sekuens DNA organisme yang

dapat menyebabkan perubahan sifat fenotip

Nukleotida : Unit monomer pembentuk DNA

PCR : Teknik amplifikasi sekuens DNA dengan

menggunakan reaksi enzimatis

Primer : Oligonukleotida Oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan

nukleotida yang komplementer dengan urutan

nukleotida DNA template

Probe : Molekul asam nukleat yang memiliki afinitas kuat

dan dapat berikatan dengan target spesifik DNA atau

xv

RNA sekuens

Resistensi : Hilangnya kepekaan bakteri terhadap obat yang

sebelumnya dapat membunuh bakteri

RNA Polimerase : Enzim yang diperlukan dalam proses sintesis RNA

dari DNA

Sekuens Nukleotida : Urutan nukleotida

Transkripsi : Proses pembentukan RNA dengan menggunakan

DNA sebagai templat

Wild-type : Bakteri yang tidak mengalami mutasi dan digunakan

sebagai sekuens pembanding terjadinya mutasi

xvi

ABSTRAK

Mutasi pada rifampisin ditemukan sebanyak 96,1% pada daerah RRDR

(kodon 507-533). Deteksi secara molekuler adanya mutasi dapat dilakukan

dengan metode real-time PCR menggunakan DNA probe spesifik. Penelitian ini

bertujuan untuk mendesain DNA probe yang mampu mendeteksi urutan wild-type

yang dapat didesain secara in silico dan dilabel dengan metode TaqMan. Desain

DNA probe dilakukan dalam dua tahap analisis. Pertama, analisis DNA probe

berdasarkan kriteria DNA probe secara umum. Kedua, analisis DNA probe

berdasarkan kriteria TaqMan probe.

Hasil dari penelitian ini, diperoleh 27 sekuens yang memenuhi kriteria DNA

probe secara umum. Dari 27 sekuens tersebut diperoleh 4 sekuens berdasarkan

seleksi kriteria nilai TmºC yang dipersyaratkan TaqMan probe. Empat sekuens

tersebut yaitu WT RRDR-18 (5'-AG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC

A-3'), WT RRDR-19 (5'-G CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AA-3'),

WT RRDR-23 (5'-G CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC-3') dan

WT RRDR-24 (5'-CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC C-3'). Dari

keempat sekuens tersebut, diperoleh satu sekuens terpilih yaitu WT RRDR-24.

Sekuens yang terpilih memiliki posisi basa G yang berada pada urutan basa ke-3

dari ujung 5’ serta memiliki jumlah basa C lebih banyak dibandingkan basa G.

Hal tersebut akan memudahkan proses pelabelan, karena memberi kesempatan

bagi reporter (FAM) dapat ditempelkan pada ujung 5’ dan quencher (TAMRA)

pada ujung 3’.

Kesimpulan dari penelitian ini, telah diperoleh 4 sekuens DNA probe yang

memenuhi kriteria nilai TmºC untuk TaqMan probe. Dari keempat sekuens

tersebut diperoleh satu sekuens terbaik yang telah sesuai dengan kriteria TaqMan

probe, yaitu desain probe WT RRDR-24 yang dapat digunakan untuk mendeteksi

adanya mutasi pada daerah RRDR gen rpoB M. tuberculosis untuk metode real-

time PCR.

Kata kunci : Tuberkulosis, gen rpoB, In Silico, TaqMan probe, Real-time PCR

xvii

ABSTRACT

Mutations in rifampicin was found 96.1% in the area of RRDR (codons 507-

533). Molecular detection of mutation can be performed by real-time PCR using

specific DNA probe. The purpose of this research was design a DNA probe by in

silico based on TaqMan probe labeling that can detect wild-type sequence. Design

of DNA probe was performed in two step of analysis. The first, analysis of DNA

probe based on general criteria of DNA probe. The second, analysis of DNA

probe based on TaqMan probe criteria.

The results of this study, were 27 sequences of DNA probe obtained. All of

sequences were meet to general criteria of DNA probe. There were 4 sequences of

27 sequences which were based on TmºC value meet the TaqMan probe criteria.

The probe were WT RRDR-18 (5'-AG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG

AAC A-3'), WT RRDR-19 (5'-G CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC

AA-3'), WT RRDR-23 (5'-G CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC-

3') and WT RRDR-24 (5'-CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC C-

3'). Within 4 sequences, one selected sequences was WT RRDR-24. It had G

bases position at 3rd

base and the number of C bases more than the G base. It will

be easier for labeling process, therefore it allowed reporter (FAM) to be attached

to the 5 'end and quencher (Tamra) at the 3' end.

The conclusion of this study, there were 4 sequences of DNA probe which

were meet to TmºC value of TaqMan probe criteria. Within 4 sequences, one of

the best sequences that meet to criteria of TaqMan probe has been selected. It was

WT RRDR-24, that can be used to detect mutation in the area RRDR of M.

tuberculosis rpoB gene for real-time PCR method.

Key words: Tuberculosis, rpoB gene, In Silico, TaqMan probe, Real-time PCR