Determinaciónde colesterol por GC-FID - gobierno chileno

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR COLESTEROL EN ALIMENTOS.

MÉTODO POR CROMATOGRAFÍA GASEOSA AOAC 994.10 MODIFICADO

Fecha Emisión: 14-03-2012 Revisión: 0

Fecha de revisión: 14-03-2012

Sección Química de Alimentos y Nutrición

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1. OBJETIVO

Determinar el contenido de colesterol presente en alimentos, cuya formulación deriva de productos o subproductos de origen animal.

2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

El método es aplicable a alimentos sólidos y líquidos que contengan en su composición materia de origen animal.

3. FUNDAMENTO El método consiste en una saponificación directa a la muestra seguido de una extracción del colesterol contenido en la fracción insaponificable. El extracto es analizado por GC-FID para determinar el contenido de colesterol, utilizando un estándar interno. 4. REFERENCIAS 4.1 AOAC Official Method 994.10. Cholesterol in Foods. Direct Saponificactión-Gas

Chromatographic Method. Cáp. 45, pág. 100. AOAC Official Methods Of Analysis 18º Ed., 2005.

5. TERMINOLOGÍA

5.1 GC-FID: Cromatografía Gaseosa con detección de Ionización de Llama.

5.2 ISTD: Estándar interno. 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1 Materiales

6.1.1 Tubos de centrifuga con tapa de 50 mL.

6.1.2 Micropipetas de 200, 1000 y 5000 µL.

6.1.3 Propipetas de volumen variable.

6.1.4 Pipetas totales de 20 mL.

6.1.5 Espátulas, gradillas y material básico de laboratorio.






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6.1.6 Matraz Erlenmeyer de 100 mL.

6.1.7 Piseta.

6.1.8 Elementos de seguridad como guantes, antiparras, mascarilla u otro que se considere pertinente.

6.1.9 Columna capilar Agilent Technologies™ HP-5 (5% de fenil-metilsilicona) 30m x 0,32mm con film de 0,5µm. Puede utilizarse una columna capilar de resolución similar.

6.1.10 Recipientes para desecho.

6.1.11 Viales para automuestreador ámbar de 1,5 a 2 mL con septa de teflón.

6.2 Equipos

6.2.1 Estación de cromatografía gaseosa con al menos detector FID e idealmente un automuestreador.

6.2.2 Balanza analítica con precisión de 0,0001 g.

6.2.3 Balanza semianalítica con precisión de 0,001 g.

6.2.4 Centrifuga con rotor para tubos de 50 mL (idealmente criocentrífuga).

6.2.5 Baño termorregulado con capacidad de mantener temperaturas de 80ºC.

6.2.6 Sistema de concentración por gas Nitrógeno.

6.2.7 Agitador orbital.

6.2.8 Rotatubos (Multivortex).

6.2.9 Baño de ultrasonido con temperatura regulable.

6.2.10 Termómetro de inmersión.

6.2.11 Temporizador.

6.3 Reactivos

6.3.1 Agua redestilada o desionizada conductividad < 0,055 µS/cm (resistividad 18 MΩ*cm).

6.3.2 Gas Hidrógeno, Aire y Helio ultra puro.

6.3.3 Gas Nitrógeno ultrapuro.






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6.3.4 n-Hexano p.a.

6.3.5 Etanol p.a.

6.3.6 KOH al 50%: para 100 mL pesar 50 g de KOH en granallas p.a. al 85% y disolver con agua desionizada hasta su total disolución.

6.3.7 NaCl al 3%: para 100 mL pesar 3 g de NaCl p.a. y disolver con agua desionizada hasta el aforo, agitando hasta total disolución.

6.3.8 Solución estándar de colesterol (solución madre de 2 mg/mL): pesar 200 mg de colesterol (99,9% de pureza) en pesa substancias y transferir el contenido a un matraz Erlenmeyer de 100mL, lavando con n-Hexano y llenando hasta el aforo. Mezclar bien. Mantenga idealmente a 4ºC. La duración estimada de la solución es de un mes.

6.3.9 Solución estándar (ISTD) de 5α-colestano (solución madre de 2 mg/mL): pesar 200 mg de 5α-colestano (≥ 97,0% de pureza) en pesa substancias y transferir el contenido a un matraz Erlenmeyer de 100mL, lavando con n-Hexano y llenando hasta el aforo. Mezclar bien. Mantenga idealmente a 4ºC. La duración estimada de la solución es de un mes.

7. DESARROLLO

7.1.1 Saponificación directa de la muestra.

7.1.2 Pesar con precisión de 0,1 mg 2 ± 0.3 g de muestra en un tubo de centrifuga de 50 mL con tapa rosca.

7.1.3 Adicionar 500 µL de la solución de ISTD 2 mg/mL.

7.1.4 Adicionar 3 mL de la solución de KOH al 50%.

7.1.5 Adicionar 15 mL de Etanol p.a.

7.1.6 Tapar bien y colocar sus viales en una gradilla. Llevar la gradilla a sonicar por 15 minutos o hasta notar total disgregación de la materia. Luego llevar a un baño termorregulado de agua a 80ºC por 15 minutos (no tome los tubos, siempre tome solo la gradilla). Alternativamente, si cuenta con un baño de sonicación termorregulado, puede colocar los tubos en el baño de sonicación por 30 minutos a 80 ºC. Igualmente, solo manipule la gradilla con los tubos, y no cada tubo individualmente.

7.1.7 Retirar del baño la gradilla con los tubos y dejar enfriar a temperatura ambiente. Nota: no lo enfrié por corriente de aire, sino el tubo se deformara y corre el riesgo de perder.

7.1.8 Una vez frío centrifugar a 1500 rpm por 5 minutos, idealmente a 4ºC.

7.1.9 Abrir cuidadosamente la tapa y adicionar 10 mL de la solución de NaCl al 3%.






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7.1.10 Adicionar 20 mL de n-Hexano.

7.1.11 Sonicar por 10 minutos.

7.1.12 Agitar en rotatubos por 10 minutos con una intensidad de al menos 1500 r.p.m. Alternativamente agitar 1 hora en agitador orbital de 200 rpm.

7.1.13 Centrifugar a 5000 rpm por 5 minutos, idealmente a 4ºC.

7.1.14 Tomar una alícuota de 1 a 2 mL de la fase orgánica (fase superior) y dispensar a un vial con tapa de teflón cerrando herméticamente (NOTA: el vial debe mantenerse refrigerado a -20ºC hasta realizar el análisis cromatográfico). Si considera que es necesario guardar sus muestras por un tiempo más prolongado, lleve la alícuota de fase orgánica a sequedad en un concentrador de nitrógeno, y resuspenda a igual volumen de la alícuota con n-hexano, sonicando de ser necesario por periodos breves, hasta obtener una disolución homogénea para su determinación instrumental.

7.2 Determinación de colesterol por GC-FID.

7.2.1 Los parámetros cromatográficos para la determinación son los siguientes: - T° detector: 300 °C - T° inyector: 250 °C - Gas carrier: Helio - Flujo gas carrier: 2 mL - Split mode: Splitless - Volumen de inyección: 1 µL. - Lavado de jeringa con acetona y n-Hexano, al menos 3 veces cada solvente, antes

y después de la inyección. - Programa de temperatura del horno:

*Inicialmente a 190 °C, mantener por 2 minutos. *Aumentar la temperatura a razón de 20 °C por minuto hasta 230 °C y mantener por 3 minutos. *Aumentar la temperatura a razón de 40 °C por minuto hasta 255 °C y mantener por 25 minutos. *Tiempo de post corrida de 0 minutos. *Tiempo total de corrida: 33 minutos.

7.2.2 El ISTD debe ubicarse (idealmente) en su cromatograma a los 15,9 minutos, en tanto que el colesterol debe ubicarse a los 24,9 minutos. Debe verificarse siempre los tiempos de retención con una dilución del estándar antes de cualquier análisis de muestra problema.






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7.3 Aseguramiento de la calidad del ensayo

7.3.1 Realizar las muestras al menos en duplicado.

7.3.2 Realizar prueba de testigo de reactivo por cada batch de muestras.

7.3.3 Realizar al menos un análisis de una dilución de estándar para verificar y/o ajustar tiempos de retención.

7.3.4 Realizar controles periódicos con material de referencia (carta control).

7.3.5 Realizar curvas de calibrado para verificar linealidad (control de pendiente).

7.4 Expresión de los Resultados.

7.4.1 Realizar los cálculos de acuerdo a la siguiente fórmula: Ci x d x c x m0 mg/100g de Colesterol =

mn Donde: C = concentración en mg/mL entregada por el instrumento.. m0 = masa de muestra analizada. mn = 2 g = masa nominal de muestra utilizada para la metodología. d = 20 = factor de dilución. c = 50 = factor de conversión a mg/100g Promediar los valores obtenidos y expresar el resultado con un decimal.

7.4.2 Informar en mg/100g de colesterol en matriz. 8. REGISTROS

8.1 Registro de Análisis Proximal en Alimentos 9. ANEXOS

No Aplica

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