Diagnóstico de Laboratorio de Malaria o

Paludismo Dra. Mercedes Subirats

S. Microbiología. H. Carlos III

Dra. Rocío Martínez S. Microbiología. H. U. Puerta de Hierro-Majadahonda

Paludismo

4+1 tipos de Plasmodium que preferentemente afectan al Humano

P. falciparum

P. vivax

P. ovale

P. malariae

+1: P. knowlesi (parásito del

mono que aparece en zonas boscosas

de Sudeste asiático)

Fiebre Paludismo = Malaria

Toda fiebre en un paciente procedente del Trópico es PALUDISMO

mientras no se demuestre lo contrario

La principal enfermedad del viajero y

del inmigrante procedente de países tropicales

“ Paciente procedente de Guinea. Fiebre y sospecha de pielonefritis. Enviamos orina para cultivo”

Nuestra respuesta:

1. “Vale, de acuerdo”

2. “Vale, pero enviadnos también una gota gruesa para descartar malaria”

La existencia de un proceso que

justifique la fiebre NO EXCLUYE EL

PALUDISMO

¡URGENCIA!

Diagnóstico parasitológico

Diagnóstico directo:

Muestra: sangre periférica

Tinción de Giemsa o Field de la gota gruesa y extensión o frotis fino

Visualización del parásito

Identificación de la especie

Cuantificación de la parasitemia

Monitorización del tratamiento

Técnicas de diagnóstico rápido: Inmunocromatografía

Técnicas de biología molecular: PCR

Diagnóstico indirecto: Serología

Recogida de la muestra

¿Cuándo?

Extracción durante el pico febril

¿Cómo?

Digitopunción

Venopunción, tubo con EDTA (= Hemograma).

Gota gruesa: > sensibilidad

Sangre con EDTA: Extenderla lo suficiente para poder ver a través de ella las manecillas del reloj.

Sangre capilar: Extenderla durante 1 minuto para eliminar la fibrina.

Dejar secar 30’ antes de teñir.

Extensión: diagnóstico de especie

Diagnóstico microscópico

El “gold standard” es la Gota Gruesa. Ventajas Sensibilidad: detección 5-50 parásitos/µl (gota gruesa) Especificidad: eficaz al dar la especie y fase del ciclo (extensión) Información útil clínicamente: cuantificación de parasitemia,

especie y fase del ciclo Control del tratamiento (ojo: gametocitos sólo) Barato

Inconvenientes Entrenamiento y experiencia Buen microscopio y tinciones

A B

Solución A

Solución B

(se diluye a 1/5

para la extensión)

AGUA pH 7’2

TINCIÓN DE FIELD

¿Cómo distinguimos las distintas especies?

Hematíe parasitado Tamaño

Presencia de granulaciones

Existencia de infecciones múltiples

Características del trofozoito Tamaño, forma y número de parásitos

Número de núcleos por anillo

Características del esquizonte Tamaño y forma

Número y disposición de los merozoitos

Forma y distribución del pigmento palúdico

Características de los gametocitos Tamaño y forma

Forma y distribución del pigmento palúdico

P. knowlesi Pv

P. falciparum

Aspecto de los hematíes:

Tamaño normal

Manchas de Maurer

Infecciones múltiples frecuentes

Infecta tanto los hematíes jóvenes como viejos.

Parasitemia puede ser >>2%

Trofozoitos:

Anillos jóvenes pequeños, delicados

1/6 del diámetro del hematíe

Frecuentemente con gránulos dobles de

cromatina

Algunos anillos en el borde del hematíe, forma

“accolé”

P. falciparum

Gametocitos:

Alargados o en forma de media luna o banana

Esquizontes: sólo en malaria cerebral

6-32 merozoitos (promedio 24)

Estadios encontrados en sangre periférica:

Anillos y/o gametocitos

Los pre-esquizontes y esquizontes se

desarrollan en los microcapilares

No se observan en sangre periférica

excepto en infecciones graves

Gota gruesa

Esquizontes de P falciparum secuestrados en

la microcirculación cerebral

Paludismo grave: P falciparum con esquizontes

P. malariae

Aspecto de los hematíes:

Tamaño normal o disminuido

Infecta a hematíes viejos.

Parasitemia normalmente < 1%

Raramente se observan puntos o manchas

de Ziemann

Trofozoitos:

Redondeados, compactos con citoplasma

denso, cromatina grande

Formas características:

Formas en “ojo de pájaro”

Trofozoitos en banda o acintados

P. malariae

Esquizontes:

6-12 merozoitos (promedio 8)

Esquizontes “en roseta” con el pigmento

palúdico en el centro

Gametocitos:

Redondo u ovalado, compacto. Casi ocupa

todo el hematíe

Estadios encontrados en sangre periférica:

Todos los estadios

Suelen observarse pocas formas “en anillo” o

gametocitos

P. malariae

P. vivax

Aspecto de los hematíes:

Tamaño aumentado o normal

Infecta hematíes jóvenes (reticulocitos).

Parasitemia normalmente <2%

Punteado de Schüffner: Punteado fino,

distribución uniforme en todo el hematíe

Presente en todos los estadios excepto formas

anulares iniciales

Trofozoitos:

Citoplasma irregular, anillo grueso ameboide,

aspecto difuso, irregular

Basofilia punctata

No hay parasito

No confundir

P. vivax

Esquizontes:

12-24 merozoitos (promedio 16).

Ocupa casi todo el hematíe

Gametocitos:

Redondo u ovalado. Casi ocupa todo el hematíe

Estadios encontrados en sangre periférica:

Todos los estadios

Amplia gama de fases visibles en un frotis

P. vivax

P. ovale

Aspecto de los hematíes:

Tamaño aumentado

Algunos hematíes infectados son ovales y/o

desflecados

Infecta hematíes jóvenes (reticulocitos).

Parasitemia normalmente < 2%

Punteado de Schüffner

Trofozoitos:

Redondeados, compactos, a veces ligeramente

ameboides

Los trofozoitos en desarrollo tienen una gran

masa cromatínica

P. ovale

Esquizontes:

6-14 merozoitos (promedio 8) rodeando al

pigmento malárico

Gametocitos:

Redondo u ovalado. Casi ocupa todo el

hematíe

Estadios encontrados en sangre

periférica:

Todos los estadios se pueden ver.

SINCRONIZACIÓN DE FASES: Todos son

trofozoítos o son esquizontes o son

gametocitos.

Se desincronizan cuando 2% parasitemia

Pre-esquizonte de P ovale

P. knowlesi

Aspecto de los hematíes:

Tamaño normal o disminuido

No son raras los eritrocitos

poliparasitados

Trofozoito:

Anillos jóvenes pequeños, delicados

1 o 2 puntos grandes de cromatina

Ocasionalmente, anillos en el borde del

hematíe, forma “accolé”

Trofozoito maduro:

Redondeados, compactos con

citoplasma denso y cromatina grande

Ocasionalmente trofozoitos en banda o

acintados

Esquizontes

P. knowlesi

Esquizontes:

Hasta 16 merozoitos

Esquizontes “en roseta” con el pigmento

palúdico en el centro

Gametocitos:

Redondo u ovalado, compacto. Casi ocupa

todo el hematíe

Estadios encontrados en sangre

periférica:

Todos los estadios

P. knowlesi

Trofozoito joven o anillo semejante al de P. falciparum

P. knowlesi P. falciparum

P. knowlesi Trofozoito maduro, esquizonte y gametocitos

semejantes a P. malariae

P. knowlesi

P. malariae

Trofozoitos

P. vivax

P. falciparum P. malariae

P. ovale

Esquizontes

P. vivax

P. falciparum P. malariae

P. ovale

Gametocitos

P. vivax

P. falciparum P. malariae

P. ovale

Cálculo de la parasitemia

Calcular el porcentaje de hematíes parasitados (en extensión fina):

1. Con el objetivo de inmersión, seleccionar un área de la extensión fina con una densidad aproximada de 100 hematíes/campo.

2. Contar 10 campos.

3. Dividir por 10 para calcular el porcentaje (%) de hematíes parasitados.

Inmunocromatografía Principio

Contiene anticuerpos monoclonales frente a antígenos especificos del Plasmodium

Diferencian P falciparum del resto de las especies, algunas diferencian P. vivax, pero no pueden diferenciar entre las demás

Antígenos de Paludismo detectados:

Enzimas metabólicas que se encuentran en todas las especies:

1. pLactato deshidrogenasa (pLDH)

2. Aldolasa

Proteína Rica en Histidina 2 (HRP 2) se encuentra sólo

en P falciparum

p-ALDOLASA y p-LDH

Enzimas metabólicas parasitarias que intervienen en la glucolisis

p-Aldolasa Dihidroxiacetona-P

Fructosa-1,6-diP +

Gliceraldehido-3-P

p-LDH

Lactato Piruvato

Inmunocromatografía Ventajas:

Fáciles de realizar

Rápidas

No precisan microscopio

No precisan personal entrenado

Útiles en el diagnóstico en gestantes debido al secuestro placentario de los parásitos (HRP-2)

Desventajas:

Falso N si parasitemia baja No miden la parasitemia Bien para P. falciparum. OJO:

Cuidado con P.ovale y con los P. malariae que no los detecta bien.

No distinguen todas especies Persisten(+) tras infección

aguda y tras tratamiento Falso P con factor reumatoide Precio alto Evitar humedad (Tª 2-30ºC)

Negativo Pl. no falciparum Pl. falciparum o

infección mixta

RESULTADOS

pLDH

o

Aldolasa

HRP 2

Inmunocromatografía RDT (rapid test diagnosis)

PCR

Ventajas:

5 parásitos / µl (0,0001%)

Identificación de especie

Mutaciones de resistencia

S y E ~ 100%

Inconvenientes:

Precio

Laboriosa

Resultado en horas

No distingue entre parásitos viables y no viables

Infecciones mixtas, monitorizar respuesta al tratamiento

y diagnóstico temprano de fallo terapéutico

Sensibilidad métodos diagnóstico malaria

• Gota gruesa: 5-100 parásitos/μL

• Extensión fina: 50-100 parásitos/μL

• Pruebas rápidas: 100 parásitos/μL

• PCR: 0,04-20 parásitos/μL

Resumiendo…

Gracias