dissertao_saccharomyces

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS

PS-GRADUAO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

CLARISSA BRITO CARVALHO DE S

CARACTERIZAO DE LINHAGENS DE

Saccharomyces cerevisiae E Zymomonas mobilis

PARA APLICAO NA PRODUO DE BIOETANOL

RECIFE

2012

ii





Dissertao apresentada ao Curso de Ps-

Graduao em Biotecnologia Industrial da

Universidade Federal de Pernambuco, como

requisito parcial obteno do ttulo de Mestre

em Biotecnologia Industrial.

Orientador:

Profa. Dra. Ana Maria Souto Maior

Co-orientador:

Prof. Dr. Irapuan Oliveira Pinheiro

RECIFE

2012

iii





Dissertao apresentada ao Curso de Ps-

Graduao em Biotecnologia Industrial da

Universidade Federal de Pernambuco, como

requisito parcial obteno do ttulo de Mestre

em Biotecnologia Industrial.

COMISSO EXAMINADORA

__________________________________________________

Profa. Dra. Elba Pinto da Silva Bon

Departamento de Bioqumica do Instituto de Qumica/UFRJ

_________________________________________________

Profa. Dra. Ester Ribeiro Gouveia

Departamento de Antibiticos /UFPE

_________________________________________________

Profa. Dra. Ana Maria Souto-Maior

Departamento de Antibiticos /UFPE

Recife, 01 de maro de 2012.

iii

Catalogao na fonte

Elaine Barroso CRB 1728

S, Clarissa Brito Carvalho de Caracterizao de linhagens de Saccharomyces cerevisae e Zymomonas mobilis para aplicao na produo de bioetanol/ Clarissa Brito Carvalho de S Recife: O Autor, 2012.

72 folhas : il., fig., tab. Orientadora: Ana Maria Souto Maior Coorientador: Irapuan Oliveira Pinheiro Dissertao (mestrado) Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Cincias Biolgicas, Biotecnologia Industrial, 2012. Inclui bibliografia

1. Etanol 2. Fermentao 3. Cana de acar- bagao I. Souto

Maior, Ana Maria (orientadora) II. Pinheiro, Irapuan Oliveira (coorientador) III. Ttulo

547.031 CDD (22.ed.) UFPE/CCB- 2013- 034

iv

Dedico aos meus pais Luiz (in memoriam) e

Tereza. Aos meus irmos Emanoela e Emmanuel.

Ao meu namorado Filipe Melo.

v

AGRADECIMENTOS

A Deus por me abenoar e guiar pelos caminhos tortuosos que percorri.

Ao meu pai Luiz, que foi responsvel pela criao do meu carter, e mesmo distante

acompanhou mais essa etapa de minha vida, estando sempre presente nos meus pensamento e

oraes, Te amo Pai, Saudades.

minha me Tereza, fonte de toda fora que precisei para concluir mais esse trabalho,

agradeo por todo afeto e amor dedicado a mim nas horas mais difceis. Te amo muito minha

mainha.

Aos meus irmos, Emanoela e Emmanuel, que apesar de vrias entrelinhas, esto sempre

presentes ajudando nas horas mais complicadas.

minha av Adalgisa pelo carinho e por todas as lies de vida passadas a mim atravs de

suaves palavras.

Aos meus tios, tias, primas e primos, em especial a Hallison por sempre me ajudar quando

precisei, pelo estmulo e incentivos em todos os momentos.

Ao meu namorado Filipe por est sempre ao meu lado, suportado a minha ausncia em vrios

momentos e por compreender todo esforo para terminar minha dissertao. Te amo.

minha amiga-irm Hamanda, por sempre me entender, escutar e mostrar os erros cometidos

sempre identificando os caminhos para no repeti-los.

s minhas amigas, Joseanna, Suelda e Tathiana, que mesmo com a distncia esto sempre

presentes na minha vida.

minha amiga Catharina, que sempre me apoiou, mesmo distante, nessa longa estrada do

inicio at a sua finalizao.

Aos meus amigos Ana, Amncio, Luanna, Ronaldo, Helena, Amanda e Andresa, pelos

incentivos nos momentos mais incertos da minha vida.

minha cunhada Izabella e a Goretti, sua me, pela fora e por sempre ajudar quando

necessrio.

minha amiga Ludhimilla Suellen, pela companhia durante todas as etapas desse desafio,

servindo pelas muitas vezes como psicloga, alm de todo incentivo e auxlio em todos os

momentos.

vi

Profa. Glcia Calazans, pela confiana a mim dedicada nos momentos inicias e tumultuados

do inicio da minha carreira e por auxiliar nos momentos tericos e estressantes da confeco

deste trabalho.

minha amiga Thas Mota, por ouvir minha lamurias e incertezas e por me incentivar a

nunca desistir.

Aos meus amigos do Laboratrio de Processos Fermentativos: Bruno, Rafael, Filipe, Wagner,

Fernando, Elza e Teresa por todo carinho.

Profa. Ana Maria Souto Maior, por orientar esta dissertao, por todo empenho, sabedoria,

compreenso e pacincia a mim dedicada nas horas mais complicadas do aprendizado

acadmico.

Ao Prof. Irapuan Oliveira Pinheiro, pela co-orientao e colaborao que foram necessrios

para a realizao deste trabalho.

Aos estagirios, Bruna, Juliana, Jessica, Vanessa e David, por ajudarem durante o

desenvolvimento deste trabalho.

s minhas amigas e companheiras de laboratrio, Solange, Mrcia e Carol, por estarem

sempre dispostas a ajudar e escutar meus dilemas.

Aos Doutorandos, Thiago e Cynthia, por repassarem conhecimentos que at um dado

momento eram desconhecidos para mim.

Aos meus coleguinhas do mestrado, Bruno, Dbora, Gabriel, Luana, Luciana e Ingrid, pelas

boas risadas e os momentos de descontrao, quando o trabalho permitia.

Ao Departamento de Antibiticos, excepcionalmente ao Laboratrio de Processos

Biotecnolgicos, pela infraestrutura fornecida para o desenvolvimento dessa dissertao.

Ao Programa de Ps-graduao em Biotecnologia Industrial e a todos que fizeram e/ou fazem

parte da coordenao deste programa.

CAPES e ao CNPq pelo suporte financeiro.

E a todas as pessoas que durante este tempo foram envolvidas, direta ou indiretamente, na

realizao deste projeto, portanto, recebam desde j a minha sincera gratido.

vii

Renda-se, como eu me rendi. Mergulhe no

que voc no conhece como eu mergulhei.

No se preocupe em entender, viver

ultrapassa qualquer entendimento.

Clarice Lispector, 1920 1977.

viii

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi selecionar e caracterizar microrganismos etanolognicos

eficientes e robustos para aplicao industrial. Inicialmente, foi comparada a produo de

etanol entre 10 linhagens industriais de S. cerevisiae e entre 10 linhagens de Z. mobilis,

pertencentes Coleo de Culturas de Microrganismos do Departamento de Antibiticos da

UFPE. Os experimentos foram realizados em tubos de ensaio (50 mL), em meios a base de

glicose, com e sem hidrolisado hemicelulsico de bagao de cana-de-acar. O hidrolisado foi

obtido por tratamento hidrotrmico (195 C, 16 min.) em reator descontnuo de 20 L (Regmed

AU/E-20). Por anlise estatstica, duas linhagens, uma de cada grupo (S. cerevisiae IA1238 e

Z. mobilis ZAP), foram selecionadas para caracterizao cintica em biorreator de bancada

(New Brunswick Scientific, Bioflo 110). Foram avaliados, tambm, os efeitos individuais e

sinrgicos de inibidores (furfural, HMF, cido actico, cido frmico e cido glico) sobre as

duas linhagens selecionadas. Na caracterizao cintica em biorreator, na ausncia de

hidrolisado, o rendimento de etanol de S. cerevisiae IA1238 (0,36 g g-1

) foi um pouco inferior

ao de Z. mobilis ZAP (0,42 g g

-1). No entanto, S. cerevisiae IA1238 foi capaz de fermentar na

presena do hidrolisado, embora com inibio do crescimento, enquanto Z. mobilis ZAP foi

totalmente inibida. Na anlise individual de inibidores, o cido actico e o cido frmico, em

concentraes presentes no hidrolisado, apresentaram maior poder de inibio, tanto sobre S.

cerevisiae IA1238 (53% e 26%, respectivamente) como sobre Z. mobilis ZAP (93% e 73% ,

respectivamente). Embora Z. mobilis apresente vantagem metablica em meio de glicose (i.e.

maior rendimento de etanol), S. cerevisiae se mostrou, em geral, mais robusta para aplicao

industrial. Em particular, a linhagem IA1238, utilizada atualmente em processos industriais de

primeira gerao, mostrou ser uma boa plataforma para modificaes genticas futuras, para

aplicao em processos de segunda gerao.

Palavras-chave: Fermentao; bagao de cana-de-acar; Saccharomyces cerevisiae;

Zymomonas mobilis; inibidores.

ix

ABSTRACT

The aim of this work was the selection of efficient and robust ethanologenic microorganisms

for industrial application. Ethanol production were initially compared among 10 industrial

strains of Saccharomyces cerevisiae and among 10 strains of Zymomonas mobilis, deposited

in the Microorganism Culture Collection of the Department of Antibiotics from UFPE. The

experiments were carried out in test tubes (50 mL) on glucose medium, without and with

hemicellulosic hydrolysate of sugarcane bagasse. The hydrolysate was obtained by

hydrothermal pretreatment (195 C, 16 min.) in a 20-L batch reactor (Regmed AU/E-20). By

statistical analysis, two strains, one of each group (S. cerevisiae IA1238 and Z. mobilis ZAP),

were selected for kinetic analysis in benchtop batch bioreactor (New Brunswick Scientific,

Bioflo 110). The individual and sinergic effects of inhibitors (furfural, HMF, acetic acid,

formic acid and galic acid) on the two selected strains were also evaluated. Kinetic

characterization in medium not containing hydrolysate showed a lower ethanol yield for S.

cerevisiae IA1238 (0.36 g g-1

) compared to Z. mobilis ZAP (0.42 g g

-1). However, S.

cerevisiae IA1238 was capable of fermenting in the presence of the hydrolysate, although

growth was inhibited, while Z. mobilis ZAP was totally inhibited. Individually, acetic acid and

formic acid (in concentrations found in the hydrolysate) showed higher inhibition power on

both S. cerevisiae IA1238 (53% and 26%, respectively) and Z. mobilis ZAP (93% and 73%,

respectively). Although Z. mobilis has metabolic advantage in fermenting glucose (i.e. higher

ethanol yield), S. cerevisiae showed, in general, to be more robust for industrial application.

In particular, the strain IA1238, used currently in first generation industrial processes, could

be a good platform for future genetic modifications for application in second generation

processes.

Key-words: Fermentation; sugarcane bagasse; Saccharomyces cerevisiae; Zymomonas

mobilis; inhibitors.

x

SUMRIO

RESUMO................................................................................................................................viii

ABSTRACT.............................................................................................................................ix

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................. xii

LISTA DE TABELAS ........................................................................................................... xvi

NOMENCLATURA ............................................................................................................ xviii

1 INTRODUO .................................................................................................................... 1

2 OBJETIVOS ......................................................................................................................... 3

2.1 Objetivo Geral ..................................................................................................................... 3

2.2 Objetivos Especficos .......................................................................................................... 3

3 REVISO BIBLIOGRFICA ........................................................................................... 4

3.1 Biocombustveis .................................................................................................................. 4

3.2 Etanol de Segunda Gerao ................................................................................................. 6

3.2.1 Inibidores da fermentao ............................................................................................... 9

3.3 Fermentao Alcolica ...................................................................................................... 10

3.3.1 Saccharomyces cerevisiae ............................................................................................ 11

3.3.2 Zymomonas mobilis ...................................................................................................... 14

4 MATERIAL E MTODOS .............................................................................................. 18

4.1 Microrganismos ................................................................................................................. 18

4.2 Meios de Cultura ............................................................................................................... 19

4.2.1 Meio de conservao .................................................................................................... 19

4.2.2 Meio de preparao de inculo ..................................................................................... 20

4.2.3 Meio de fermentao .................................................................................................... 21

4.2.4 Hidrolisado hemicelulsico .......................................................................................... 22

4.3 Procedimento Experimental ............................................................................................. 24

4.3.1 Caracterizao inicial e seleo de linhagens ............................................................... 24

4.3.2 Caracterizao cintica das linhagens selecionadas ..................................................... 26

4.3.3 Caracterizao do efeito de inibidores em meio sinttico ............................................ 26

4.4 Mtodos Analticos ............................................................................................................ 28

4.4.1 Determinao de concentrao celular ......................................................................... 28

4.4.2 Determinao das concentraes de substratos, produtos e inibidores. ....................... 29

4.5 Mtodos Matemticos ....................................................................................................... 30

4.5.1 Clculo de parmetros cinticos ................................................................................... 30

xi

4.5.2 Anlise estatstica ......................................................................................................... 32

5 RESULTADOS E DISCUSSO ....................................................................................... 33

5.1 Caracterizao e Seleo das Linhagens ....................................................................... 33

5.1.1 Linhagens de S. cerevisiae ............................................................................................ 33

5.1.2 Linhagens de Z. mobilis ................................................................................................... 41

5.2 Caracterizao Cintica das Linhagens Selecionadas ................................................. 46

5.2.1 S. cerevisiae IA 1238 .................................................................................................... 46

5.2.2 Z. mobilis ZAP .............................................................................................................. 50

5.3 Efeito de Inibidores sobre os Microrganismos Selecionados ....................................... 54

5.3.1 S. cerevisiae IA 1238 .................................................................................................... 54

5.3.2 Z. mobilis ZAP .............................................................................................................. 59

6 CONCLUSO .................................................................................................................... 64

7 REFERNCIAS ................................................................................................................. 65

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 3.1 Estrutura recalcitrante dos materiais lignocelulsicos, os quais so

constitudos de celulose, hemicelulose e lignina. Fonte: Adaptado de

CANILHA et al. (2010)..................................................................... 7

Figura 3.2 Alteraes estruturais na microfibrila celulsica determinadas pelo

pr-tratamento, seguidas pela hidrlise enzimtica e fermentao.

Fonte: Adaptado de CANILHA et al. (2010).................................... 8

Figura 3.3 Via metablica de formao de produtos da fermentao de

carboidratos por S. cerevisiae (via Embden-Meyerhof). Fonte:

Modificado de WALKER (1998)......................................................... 12

Figura 3.4 Via metablica de formao de produtos da fermentao de

carboidratos por Z. mobilis (via Entner-Doudoroff). Fonte:

ERNANDES; GARCIA-CRUZ (2009)................................................ 15

Figura 4.1 Reator (REGMED AU/E-20) utilizado para a obteno do hidrolisado

hemicelulsico...................................................................................... 22

Figura 4.2 Fluxograma do tratamento hidrotrmico utilizado para a obteno do

hidrolisado hemicelulsico.................................................................... 23

Figura 4.3 Mesa incubadora rotativa (New Brunswick Scientific, C25KC),

contendo frascos Erlenmeyer de 500 mL com

inculos.................................................................................................. 25

Figura 4.4 Tubos de 50 mL (Falcon) utilizados na seleo de

linhagens.............................................................................................. 25

Figura 4.5 Biorreator de bancada instrumentado (New Brunswick Scientific,

Bioflo 110) utilizado nos experimentos de caracterizao cintica das

linhagens................................................................................................ 27

Figura 4.6 Esquema da Cmara de Neubauer e da microscopia em objetiva de

40X. Fonte: Adaptado de ALVES (2006)............................................. 29

Figura 4.7 Equipamento de cromatografia lquida de alta eficincia (Agilent,

srie 1100) utilizado para a determinao de concentraes de

substrato, produtos e inibidores........................................................... 30

Figura 5.1 Concentrao de biomassa das 10 linhagens de S. cerevisiae, em 18

horas de fermentao, em meios com e sem hidrolisado

hemicelulsico de bagao de cana-de-acar....................................... 33

Figura 5.2 Concentrao de clulas viveis das 10 linhagens de S. cerevisiae, em

18 horas de fermentao, em meios com e sem hidrolisado


xiii

Figura 5.3 Consumo de glicose das 10 linhagens de S. cerevisiae, em 18 horas

de fermentao, em meios com e sem hidrolisado hemicelulsico de

bagao de cana-de-acar.................................................................... 36

Figura 5.4 Produo de etanol pelas 10 linhagens de S. cerevisiae, em 18 horas

de fermentao, em meios com e sem hidrolisado hemicelulsico de

bagao de cana-de-acar................................................................. 37

Figura 5.5 Produo de cido succnico, cido actico e glicerol pelas 10

linhagens de S. cerevisiae, em 18 horas de fermentao, em meio sem

hidrolisado hemicelulsico de bagao de cana-de-

acar.................................................................................................... 39

Figura 5.6 Produo de cido actico pelas 10 linhagens de S. cerevisiae, em 18

horas de fermentao, em meio com hidrolisado hemicelulsico de

bagao de cana-de-acar................................................................. 39

Figura 5.7 Concentrao de biomassa formada pelas 10 linhagens de Z. mobilis,

em 18 horas de fermentao, em meio sem hidrolisado


Figura 5.8 Consumo de glicose pelas 10 linhagens de Z. mobilis, em 18 horas de

fermentao, em meio sem hidrolisado hemicelulsico de bagao de

cana-de-acar............................................................................... 43

Figura 5.9 Produo de etanol pelas 10 linhagens de Z. mobilis, em 18 horas de

fermentao, em meio sem hidrolisado hemicelulsico de bagao de

cana-de-acar............................................................................... 43

Figura 5.10 Produo de cido actico pelas 10 linhagens de Z. mobilis, em 18

horas de fermentao, em meio sem hidrolisado hemicelulsico de

bagao de cana-de-acar................................................................ 45

Figura 5.11 Curvas de crescimento, consumo de substrato e produo de etanol

por S. cerevisiae IA1238, durante fermentao em alta concentrao

de glicose (200 g L-1

), em meio sem hidrolisado hemicelulsico de

bagao de cana-de-acar..................................................................... 47

Figura 5.12 Curvas de crescimento, consumo de substrato e produo de etanol e

glicerol por S. cerevisiae IA1238, durante fermentao em baixa

concentrao de glicose (50 g L-1

), em meio sem hidrolisado

hemicelulsico de bagao de cana-de-acar........................................ 47

Figura 5.13 Velocidade especfica mxima de crescimento de S. cerevisiae

IA1238, em meio de glicose (200 g L-1

) sem hidrolisado


Figura 5.14 Velocidade especfica mxima de crescimento de S. cerevisiae

IA1238, em meio de glicose (50 g L-1

) sem hidrolisado

hemicelulsico de bagao de cana-de-acar...................................... 48

xiv

Figura 5.15 Curvas de crescimento, consumo de substrato e produo de etanol e

glicerol por S. cerevisiae IA1238, durante fermentao em baixa

concentrao de glicose, em meio com hidrolisado hemicelulsico de

bagao de cana-de-acar...................................................................... 49

Figura 5.16 Variao das concentraes dos inibidores durante a fermentao de

S. cerevisiae IA1238 em baixa concentrao de glicose (50 g L-1

), em

meio com hidrolisado hemicelulsico de bagao de cana-de-

acar.................................................................................................... 50


por Z. mobilis ZAP, durante fermentao em alta concentrao de

glicose, em meio sem hidrolisado hemicelulsico de bagao de cana-

de-acar............................................................................................... 51


por Z. mobilis ZAP, durante fermentao em baixa concentrao de

glicose, em meio sem hidrolisado hemicelulsico de bagao de cana-

de-acar............................................................................................... 51

Figura 5.19 Velocidade especfica mxima de crescimento, calculada na fase

exponencial da curva de crescimento, durante fermentao de glicose

por Z. mobilis ZAP, em meio sem hidrolisado hemicelulsico, com

alta concentrao de glicose (150 g L-1

)................................................ 52

Figura 5.20 Velocidade especfica mxima de crescimento, calculada na fase

exponencial da curva de crescimento, durante fermentao de glicose

por Z. mobilis ZAP, em meio sem hidrolisado hemicelulsico, com

baixa concentrao de glicose (50 g L-1

)............................................... 52

Figura 5.21 Densidade ptica e concentrao de biomassa durante fermentao

de glicose por Z. mobilis ZAP, em meio com hidrolisado

hemicelulsico, com baixa concentrao de glicose (50 g L-1

)............ 53

Figura 5.22: Variao das concentraes dos inibidores durante a fermentao de

Z. mobilis ZAP em baixa concentrao de glicose (50 g L-1

), em meio

com hidrolisado hemicelulsico de bagao de cana-de-acar............. 53

Figura 5.23: Concentrao de biomassa formada pela linhagem S. cerevisiae

IA1238 e percentual de inibio do crescimento, aps 18 horas de

fermentao, em meio contendo cido glico e inibidores

identificados no hidrolisado hemicelulsico de bagao de cana-de-

acar................................................................................................ 54

Figura 5.24:

Concentrao de clulas viveis e a viabilidade de S. cerevisiae

IA1238, aps 18 horas de fermentao em meio contendo cido

glico e inibidores identificados no hidrolisado hemicelulsico de

bagao de cana-de-acar................................................................... 55

xv

Figura 5.25:

Consumo de glicose pela linhagem S. cerevisiae IA1238, aps 18

horas de fermentao, em meio contendo cido glico e inibidores


acar.............................................................................................. 56

Figura 5.26:

Produo de etanol pela linhagem S. cerevisiae IA1238, aps 18

horas de fermentao em meio contendo cido glico e inibidores


acar................................................................................................. 57

Figura 5.27:

Produo de glicerol pela linhagem S. cerevisiae IA1238 aps 18

horas de fermentao, em meio contendo cido glico e inibidores


acar................................................................................................ 58

Figura 5.28:

Variao das concentraes dos inibidores, aps 18 horas de



acar................................................................................................ 59

Figura 5.29:

Concentrao de biomassa formada pela linhagem Z. mobilis ZAP e

percentual de inibio do crescimento, aps 18 horas de fermentao

em meio contendo cido glico e inibidores identificados no

hidrolisado hemicelulsico de bagao de cana-de-

acar................................................................................................ 60

Figura 5.30:

Consumo de glicose pela linhagem Z. mobilis ZAP, aps 18 horas de



acar............................................................................................... 61

Figura 5.31: Produo de etanol pela linhagem Z. mobilis ZAP, aps 18 horas de



acar.................................................................................................. 62

Figura 5.32: Variao das concentraes dos inibidores, aps 18 horas de



acar.................................................................................................. 62

xvi

LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1 Balano de energia na produo de etanol, com diversas matrias-

primas. Fonte: MACEDO (2007)......................................................... 5

Tabela 4.1 Linhagens de S. cerevisiae investigadas neste trabalho.......................... 18

Tabela 4.2 Linhagens de Z. mobilis investigadas neste trabalho.............................. 19

Tabela 4.3 Composio dos meios de cultura utilizados nas etapas de ativao,

conservao e reativao das linhagens de S. cerevisiae e Z. mobilis... 20

Tabela 4.4 Composio do meio de cultura utilizado na preparao do inculo

nas linhagens de S. cerevisiae e Z. mobilis............................................ 21

Tabela 4.5 Composio do meio de fermentao (por litro de gua ou hidrolisado

hemicelulsico)....................................................................................... 21

Tabela 4.6 Composio do hidrolisado obtido e utilizado nas fermentaes.......... 23

Tabela 4.7 Concentraes dos inibidores utilizadas (isoladamente e em conjunto)

nos experimentos.................................................................................... 24

Tabela 5.1 Viabilidade celular das 10 linhagens de S. cerevisiae, em 18 horas de

fermentao, em meios sem e com hidrolisado hemicelulsico de

bagao de cana-de-acar.................................................................. 35

Tabela 5.2 Produtividade e rendimento de biomassa para as 10 linhagens de S.

cerevisiae, em 18 horas de fermentao, em meios sem e com

hidrolisado hemicelulsico de bagao de cana-de-acar..................... 36

Tabela 5.3 Produtividade e rendimento de etanol das 10 linhagens de S.

cerevisiae, em 18 horas de fermentao, em meios sem e com

hidrolisado hemicelulsico.................................................................... 38

Tabela 5.4 Rendimento de co-produtos das 10 linhagens de S. cerevisiae, em 18

horas de fermentao, em meios sem e com hidrolisado

hemicelulsico....................................................................................... 40

Tabela 5.5 Produtividade e rendimento de biomassa para as 10 linhagens de Z.

mobilis, em 18 horas de fermentao, em meio sem hidrolisado


Tabela 5.6 Produtividade e rendimento de etanol para as 10 linhagens de Z.

mobilis, em 18 horas de fermentao, em meio sem hidrolisado


Tabela 5.7 Rendimento de cido actico das 10 linhagens de Z. mobilis, em 18

horas de fermentao, em meio sem hidrolisado

hemicelulsico........................................................................................ 45

xvii

Tabela 5.8 Produtividade e rendimento de biomassa para a linhagem S.

cerevisiae IA1238, em meio contendo inibidores, ao final de 18 horas

de fermentao........................................................................................ 56

Tabela 5.9 Produtividade e rendimento de etanol para a linhagem S. cerevisiae

IA1238, em meio contendo inibidores, ao final de 18 horas de

fermentao........................................................................................ 57

Tabela 5.10 Produtividade e rendimento de biomassa para a linhagem Z. mobilis

ZAP, em meio contendo inibidores, ao final de 18 horas de

fermentao........................................................................................ 61

Tabela 5.11 Produtividade e rendimento de etanol para a linhagens Z. mobilis

ZAP, em meio contendo inibidores, ao final de 18 horas de

fermentao......................................................................................... 63

xviii

NOMENCLATURA

X Concentrao de biomassa (g L-1

)

S Concentrao de substrato (g L-1

)

P Concentrao de produto (g L-1

)

CP Concentrao de co-produto (g L-1

)

rX Velocidade de crescimento celular (g L-1

h-1

)

rS Velocidade de consumo de substrato (g L-1

h-1

)

rP Velocidade de formao de produto (g L-1

h-1

)

rCp Velocidade de formao de co-produto (g L-1

h-1

)

Velocidade especfica de crescimento (h-1

)

qS Velocidade especfica de consumo de substrato (g g-1

h-1

)

qP Velocidade especfica de formao de produto (g g-1

h-1

)

qCP Velocidade especfica de formao de co-produto (g g-1

h-1

)

YX/S Rendimento de biomassa em substrato (g g-1

)

YP/S Rendimento de produto em substrato (g g-1

)

YCP/S Rendimento de co-produto em substrato (g g-1

)

QX Produtividade volumtrica de biomassa (g L-1

h-1

)

QP Produtividade volumtrica de produto (g L-1

h-1

)

QCP Produtividade volumtrica de co-produto (g L-1

h-1

)

xix

Subscritos

F Final

MX Mxima

Siglas

ANOVA Analysis of variance

CONAB Companhia Nacional de Abastecimento

Furfural 2-furaldedo

HMF 5-Hidroximetil- 2-furaldedo

Prolcool Programa Nacional do lcool

SSF Simultaneous Saccharification and Fermentation

SHF Separate Hydrolysis and Fermentation

IA Instituto de Antibiticos

UFPE Universidade Federal de Pernambuco.

UFPEDA Coleo de Culturas de Microorganismos do Departamento de Antibiticos

da Universidade Federal de Pernambuco.

1

1 INTRODUO

Para reduzir o consumo de combustveis fsseis e a emisso de gases que provocam o

efeito estufa, rumando para uma matriz energtica mais sustentvel, faz-se necessrio a busca

por fontes de energia alternativas e renovveis. Entre as vrias possibilidades existentes,

pode-se citar a utilizao de etanol, um combustvel produzido principalmente a partir de

fontes renovveis, por meio da converso de acares presentes em diversas culturas, como,

por exemplo, cana-de-acar, beterraba e milho.

No Brasil, o etanol produzido oriundo de processo fermentativo do caldo da cana-de-

acar ou melao, sendo denominado de etanol de primeira gerao. Apesar de estar bem

estabelecido, o aumento da eficincia deste processo permanece como um aprendizado

constante, e novos desafios se apresentam para a utilizao do bagao como matria-prima em

processo de segunda gerao (etanol celulsico). Em particular, ainda deve-se dedicar ateno

seleo e ao melhoramento dos microrganismos responsveis pela fermentao, no que diz

respeito tolerncia s condies de estresse industrial.

A fermentao alcolica um processo que pode ser realizado por leveduras e bactrias.

A levedura da espcie Saccharomyces cerevisiae o microrganismo mais utilizado na

produo de etanol de primeira gerao, por ser bem adaptado s condies industriais e

produzir etanol com alto rendimento. Este microrganismo pode fermentar algumas fontes de

carbono como, por exemplo, glicose, frutose, maltose e sacarose. A principal desvantagem da

utilizao de S. cerevisiae para processos de segunda gerao a sua incapacidade de

metabolizar as pentoses presentes na hemicelulose (WALKER, 1998). A bactria Gram-

negativa Zymomonas mobilis uma alternativa considerada promissora para a produo de

etanol a partir de glicose, no entanto, como S. cerevisiae, este microrganismo possui limitao

para utilizao em processo de segunda gerao, pois metabolizam apenas glicose, frutose e

sacarose (SWINGS, DE LEY, 1977; VIIKARI, 1986).

A primeira etapa para a produo do etanol de segunda gerao o pr-tratamento, cuja

funo remover barreiras estruturais e composicionais dos materiais lignocelulsicos,

promovendo uma melhora na percentagem de hidrlise e aumento dos rendimentos de

acares fermentescveis a partir da celulose e hemicelulose (MOSIER et al., 2005). Porm,

durante esse processo h a formao de compostos inibitrios, que podem tornar-se um

entrave ao processo fermentativo. Na tentativa de evitar este obstculo, faz-se necessrio o

desenvolvimento de processos para reduzir a produo desses compostos inibitrios, atravs

2

de pr-tratamento adequado da matria-prima, e a seleo de linhagens de microrganismos

tolerantes aos inibidores presentes nos hidrolisados.

A Coleo de Cultura de Microrganismo do Departamento de Antibiticos da UFPE

(UFPEDA) possui um grande acervo de linhagens industriais de S. cerevisiae, obtidas, em sua

maioria, de destilarias da Regio Nordeste do Brasil. A seleo de uma linhagem, com

tolerncia ao estresse industrial tradicional e a inibidores presentes em hidrolisados de

biomassa de cana-de-acar, poder ter aplicao nas destilarias de lcool j implantadas no

pas, onde hidrolisados sejam utilizados em misturas com melao, dentro da tecnologia atual

de fermentao de hexoses, ou servir como plataforma para futuras modificaes genticas.

Por outro lado, um grande nmero de linhagens de Z. mobilis, muitas isoladas e modificadas

geneticamente por pesquisadores do Departamento, esto tambm conservadas nesta coleo.

Embora este microrganismo etanolognico ainda no esteja vinculado indstria, , tambm,

importante a investigao sobre a sua potencialidade para aplicao em processos de segunda

gerao.

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2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Investigar o potencial de linhagens de Saccharomyces cerevisiae e Zymomonas mobilis,

pertencentes Coleo UFPEDA, para aplicao na produo de etanol de segunda gerao.

2.2 Objetivos Especficos

Selecionar a linhagem mais eficiente e robusta, entre linhagens de S. cerevisiae e entre

linhagens de Z. mobilis, em meio a base de glicose, com e sem hidrolisado

hemicelulsico de bagao de cana-de-acar.

Determinar e comparar os parmetros cinticos das linhagens selecionadas, de S.

cerevisiae e de Z. mobilis, em biorreator instrumentado.

Investigar os efeitos individuais e sinrgico de compostos inibitrios, identificados no

hidrolisado, sobre as linhagens selecionadas.

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3 REVISO BIBLIOGRFICA

3.1 Biocombustveis

Renovveis, os biocombustveis so fontes alternativas de energia que competem

diretamente com os combustveis derivados do petrleo, sendo considerados ambientalmente

corretos, pois durante o desenvolvimento da planta h a utilizao o dixido de carbono

produzido durante sua combusto, neutralizando emisses de CO2 para a atmosfera

(BRANCO; MURGEL, 2000).

At os anos 70, o consumo dos combustveis fsseis, considerados inesgotveis para

essa poca, atingiu altos nveis, porm a sociedade desconhecia os impactos ambientais

causados pelo uso desordenado. No entanto, no incio dos anos 80, com o surgimento de

alguns estudos, a sociedade ficou ciente das limitaes quanto ao consumo de combustveis

fsseis e dos impactos ambientais derivado do seu uso, gerando, assim, uma tendncia a

reduo do consumo e uma possvel diminuio da contaminao ambiental (ROSEN, 2002;

CABRERA et al., 2000).

A emisso de gases txicos, provenientes da reao de combusto, considerada um

dos principais responsveis pelo aquecimento global e pela intensificao do efeito estufa

(ROSEN, 2002). Harder et al. (2011) e Szwarc (2011) relatam a importncia da utilizao de

biocombustveis em substituio aos combustveis fsseis, obtendo-se, assim, efeitos

positivos na diminuio da emisso desses gases. A participao dos biocombustveis na

matriz energtica global torna-se cada vez mais relevante, alm da sua facilidade de obteno,

muitas vezes provenientes de conjunto de produtos e resduos da agricultura, das florestas e de

indstrias relacionadas, tendo como exemplos a madeira, o carvo de madeira, o lcool

combustvel e o biodiesel (HAHN-HGERDAL et al., 2006; BNDES/CGEE, 2008). No

Brasil, atualmente, dois combustveis, o etanol e o biodiesel, vm sendo alvo de polticas para

o setor energtico, sendo que o etanol apresenta um melhor balano energtico, que significa

uma alta relao entre a energia renovvel produzida em comparao energia fssil utilizada

na sua produo (URQUIAGA; ALVES; BOODEY, 2005).

O investimento em novos estudos para utilizao da cana-de-acar para a produo do

etanol deu-se aps a crise do petrleo em 1973, iniciando-se, assim, na dcada de 1970, o

Programa Nacional do lcool (PROLCOOL). O PROLCOOL permitiu a implementao

no Brasil de bioenergia em larga escala, atravs do investimento em tecnologia capaz de gerar

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motores que se adequassem ao novo combustvel. Esse programa caracterizou-se por

desenvolver um combustvel que colabora com a reduo da poluio ambiental

(ERNANDES; GARCIA-CRUZ, 2009). Apesar dos gargalos e do declnio do PROLCOOL

no final da dcada de 80, o incentivo de sua produo, durante o auge do programa, geraram

muitos estudos e avanos na rea da produo do etanol, tanto no sentido de aumentar a

quantidade como melhorar a qualidade do lcool produzido no pas. Mesmo com o grande

desenvolvimento cientfico alcanado na produo de etanol no Brasil, ainda existem

possibilidades de melhoramentos no processo para garantir a competitividade em relao ao

combustvel de origem fssil (GOLDENBERG, 2007; AMORIM et al., 2011).

O recente retorno aos aumentos no preo do petrleo, as perspectivas de esgotamento

das reservas e os compromissos firmados com a questo ambiental, provenientes do Protocolo

de Kyoto, fizeram renascer a ateno mundial s novas pesquisas para gerao de fontes

alternativas de energia, como o etanol, que passou a constar de forma definitiva nos mercados,

graas aos novos veculos bicombustveis (BASTOS, 2007; KIM et al., 2010). O etanol hoje

uma fonte de energia alternativa de uso corrente, podendo ser obtido mediante a fermentao

de mostos aucarados e de hidrolisados de amido (ANDRIETTA; STECKELBERG;

ANDRIETTA, 2007).

No Brasil, o etanol produzido a partir de caldo de cana-de-acar, que, dentre as vrias

matrias-primas utilizadas para a sua produo, possui o maior balano energtico

(MACEDO, 2007) (Tabela 3.1).

Tabela 3.1: Balano de energia na produo de etanol, com diversas matrias-primas.

Fonte: MACEDO (2007).

Matria-prima Energia renovvel/Energia fssil usada

Etanol de milho (USA) 1,3

Etanol de cana-de-acar (Brasil) 8,9

Etanol de beterraba 2,0

Etanol de sorgo sacarino (frica) 4,0

Etanol de trigo (Europa) 2,0

Etanol de mandioca 1,0

A cana-de-acar (Saccharum spp.) um dos principais produtos agrcolas do Brasil,

cultivada desde a poca da colonizao. uma gramnea semiperene com parte area da

planta composta pelos colmos, nos quais se concentra a sacarose, e pelas pontas e folhas, que

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constituem a palha da cana. Absorvem o dixido de carbono em molculas de 4 carbonos, que

ficam armazenadas em vacolos para serem utilizadas durante o dia (ciclo fotossinttico do

tipo C4). Todos esses componentes somados totalizam cerca de 35 toneladas de matria seca

por hectare. A cana-de-acar constitui um potencial reservatrio de energia e a grande

vantagem disso que ela completamente renovvel (ANDREOLI, 2008)

O grande impasse na utilizao da cana-de-acar para a produo de etanol seria a

concorrncia com os alimentos, porm esse argumento no se sustenta atualmente, pois 50%

do caldo extrado da cana de acar revertido para a produo de acar. Outro ponto que

instabiliza esse argumento que a produo de etanol no mundo, cerca de 50 bilhes de litros

por ano, utiliza 15 milhes de hectares de rea, ou seja, 1% da rea em uso pela agricultura no

mundo, equivalendo a 1,5 bilhes de hectares. No Brasil, 6 milhes de hectares so utilizados

para a produo da cana-de-acar, sendo cerca de 90% do total na principal regio produtora

do Pas, a Centro-Sul, e 10% no Nordeste, produzindo 569 milhes de toneladas e obtendo

uma produtividade de 72 (toneladas por hectare), dados da safra 2008/2009 (BASTOS, 2007;

BNDES/CGEE, 2008; KIM et al., 2010; CARDONA; QUINTERO; PAZ, 2010; UNICA,

2011).

3.2 Etanol de Segunda Gerao

Atualmente, o Brasil produz 25 bilhes de litros de etanol por ano a partir da cana-de-

acar. O plantio dessa matria-prima, realizado em terras arveis de boa qualidade, dever

ser expandido devido crescente demanda nacional e internacional de lcool (CONAB,

2012). Uma alternativa para evitar a expanso desmedida de reas de cultivo, devido

necessidade de um aumento significativo na produo de etanol, o desenvolvimento de

processos de segunda gerao, que permitam a utilizao de biomassas residuais de

composio lignocelulsica. Estas biomassas esto disponveis nos resduos de colheita, ou do

processamento das principais culturas, como a cana-de-acar, milho e trigo. Dentre estas

biomassas, os resduos celulsicos provenientes da produo de etanol uma das fontes mais

promissoras de carboidratos para a produo de etanol de segunda gerao (PEREIRA Jr.;

COUTO; SANTA ANNA, 2008; BENEDETTI et al., 2009).

O Brasil, nos ltimos anos, vem investindo em projeto de aproveitamento de resduos

provenientes da produo de lcool da cana-de-acar, na expectativa de que, futuramente, o

lcool lignocelulsico possa ser produzido em escala comercial e a custos competitivos ao do

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etanol de primeira gerao, possibilitando, assim, um aumento substancial na produtividade

(PEREIRA Jr. COUTO; SANTA ANNA, 2008; HARDER et al., 2011).

A CONAB (2012) estima para a safra de 2010/2011 uma produo de 625 milhes de

toneladas de cana-de-acar e 168,8 milhes de toneladas de bagao, sendo que, para cada

tonelada de cana, obtm-se em torno de 140 kg de bagao seco, composto basicamente por

celulose, hemicelulose e lignina, na proporo aproximada de 40 a 50%, 20 a 30% e 25 a

30%, respectivamente, alm de outros componentes em menores quantidades (APTA, 2011).

Os compostos presentes na parede celular das clulas vegetais so responsveis pela

sustentao e proteo da planta. Essa matriz altamente ordenada e dinmica, podendo

tornar-se mais rgida ou mais frouxa conforme as necessidades ontognicas e

comportamentais da clula ou da planta. A estrutura da parede celular formada por fibras de

celulose que so cobertas pela hemicelulose, formando, assim, o chamado domnio celulose-

hemicelulose, sendo este unido por outro componente da parede celular, a lignina (Figura 3.1)

(BUCKERIDGE, 2010).

Figura 3.1: Estrutura recalcitrante dos materiais lignocelulsicos, os quais so constitudos

de celulose, hemicelulose e lignina. Fonte: Adaptado de CANILHA et al. (2010).

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Toda essa barreira dificulta a disponibilidade da glicose presente na celulose da parede

celular, sendo necessrias quatro etapas para produo de etanol lignocelulsico: pr-

tratamento da biomassa, hidrlise enzimtica da celulose; fermentao dos acares liberados

e recuperao do etanol (HAHN-HGERDAL et al., 2006).

O pr-tratamento pode ser fsico, qumico, biolgico ou a combinao desses (SUN;

CHENG, 2002). As tcnicas de pr-tratamento dos materiais lignocelulsicos, consideradas

mais promissoras no processo de obteno de etanol a partir da biomassa, so a de exploso a

vapor, a hidrotrmica e de utilizao de cido diludo. No entanto, a escolha das condies de

pr-tratamento depender de uma avaliao global do processo, rendimento e manuteno da

integridade dos insumos de interesse (GALBE; ZACHI, 2002; MOSIER et al., 2005;

SNCHEZ; CARDONA, 2008).

As prximas etapas para a obteno de etanol, aps o pr-tratamento, so a hidrlise

enzimtica e a fermentao, que podem ocorrer em separado (SHF - Separate Hydrolysis and

Fermentation) ou simultaneamente (SSF - Simultaneous Saccharification and Fermentation)

(Figura 3.2).

Figura 3.2: Alteraes estruturais na microfibrila celulsica determinadas pelo pr-

tratamento, seguidas pela hidrlise enzimtica e fermentao. Fonte: Adaptado de CANILHA

et al. (2010).

A hidrlise enzimtica consiste no uso de enzimas capazes de converter o polmero de

celulose, presente na frao celulsica, em unidades fermentveis de glicose. Esse processo

realizado por celulases (endoglucanase e exoglucanase), que quebram a celulose em

celobiose, que, por fim, so convertidas em duas molculas de glicose pela -glucosidase.

Esse processo apresenta especificidade da reao, ausncia de reaes secundrias, ausncia

de formao de produtos secundrios (inibidores da fermentao alcolica) e reao em

condies que no requerem altas presses e temperaturas, ou ambientes corrosivos para os

equipamentos (BASTOS, 2007).

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No processo SHF, o xarope obtido, aps a hidrlise da celulose, usado para a

fermentao etanlica, utilizando-se culturas de microrganismos que convertem hexoses em

etanol (RABELO et al., 2011). No processo SSF, a hidrlise enzimtica e a fermentao,

ocorrem em uma mesma etapa, para se evitar, assim, a inibio da celulase pela glicose

resultante da hidrlise (PALMQVIST; HAHN-HGERDAL, 2000).

3.2.1 Inibidores da fermentao

Uma consequncia da utilizao de altas temperaturas, empregadas em muitos pr-

tratamentos, a formao de inibidores originados dos acares, principalmente da

hemicelulose: furfural, formado a partir da degradao das pentoses (xilose e arabinose); 5-

hidroximetilfurfural (HMF), formado como conseqncia da degradao das hexoses (glicose,

manose e galactose); cido frmico, proveniente da degradao do HMF; compostos

fenlicos, gerados a partir da degradao da lignina; e cido actico, formado pela

desacetilao da hemicelulose. Esses compostos, quando presentes entre os componentes do

meio de cultura, podem danificar a parede dos microrganismos, reduzir a absoro de

aminocidos aromticos do meio, inibir enzimas (lcool desidrogenase, piruvato

desidrogenase e aldedo desidrogenase), bem como prolongar a fase lag de crescimento

(MUSSATO; SANTOS; ROBERTO, 2004; ALMEIDA et al., 2007; CHENG et al., 2008;

ALPER; STEPHANOPOULOS, 2009; YANG et al., 2010).

Os compostos produzidos no pr-tratamento da biomassa podem ser divididos nas

classes dos cidos carboxilicos, furanos e dos fenis (MCMILLAN, 1994). Os inibidores

formados nesse processo, que apresentam baixo peso molecular, so capazes de penetrar na

membrana celular, enquanto que os de elevado peso molecular no penetram na clula, porm

influenciam na atividade de molculas transportadoras na membrana da clula. Os

mecanismos de cidos fracos, furanos e fenis na inibio do crescimento e produo de

etanol foram avaliadores por Palmqvist e Hahn-Hgerdal (2000).

Linhagens de S. cerevisiae reagem inibio do furfural, em condies de anaerobiose,

reduzindo este composto a lcool fufurlico, sendo essa reao catalisada pela lcool

desidrogenase, enzima dependente de NADH. A produo desse co-fator nessa reao faz

com que haja uma menor produo de glicerol, j que a produo desse composto tambm

libera um NADH que ser utilizado na via metabolica desse microrganismo (PALMQVIST E

HAHN-HGERDAL, 2000 ; PALMQVIST et al., 1999).

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Estudos tecnolgicos, na rea de fermentao, buscam o desenvolvimento de

microrganismos robustos, alm dos j conhecidos atualmente, que consigam produzir etanol a

partir dessa biomassa residual com maior eficincia, sendo tambm resistentes aos inibidores

industriais mais relevantes (ALMEIDA et al., 2007; ALMEIDA et al., 2009 PURWADI;

BRANDBERG; TAHERZADEH, 2007).

Na pesquisa de desenvolvimento de novos microrganismos para utilizao em processo

de segunda gerao, so utilizadas tcnicas de mutao e seleo, engenharia metablica e

engenharia evolutiva para introduo de vias de assimilao de substratos, como a xilose e a

arabinose; vias eficientes de produo de etanol e mecanismos de resistncia a inibidores

originados do pr-tratamento do bagao (ALMEIDA et al., 2009).

S. cerevisiae e Z. mobilis so microrganismos etanolognicos e, portanto, candidatos

naturais para desenvolvimento e utilizao na produo de etanol. (DELGENES; MOLETTA

NAVARRO, 1996; LAU et al., 2010).

3.3 Fermentao Alcolica

Os microrganismos utilizados na fermentao so responsveis pelas caractersticas do

processo de obteno do etanol. Nesse processo, h algumas caractersticas particulares

importantes: alta converso por unidade de substrato assimilado, alta capacidade de

fermentao, termotolerncia, estabilidade e tolerncia a altas concentraes de etanol e de

substrato e a baixos valores de pH. Algumas leveduras e bactrias so capazes de produzir

etanol, entre as quais se destacam as leveduras Saccharomyces cerevisiae, S. uvarum

(carlsbergenis), Schizosaccharomyces pombe e Kluyveromyces e as bactrias Zymomonas

mobilis, Clostridium sporogenes e Thermoanaerobacter athanolicus (JONES; PAMMENT;

GREENFIELD, 1981; KOSARIC; VARDAR-SUKAN, 2001).

Dentre as diversas opes citadas, S. cerevisiae o microrganismo utilizado em nvel

industrial, pelas elevadas produtividade, eficincia de fermentao e resistncia ao estresse

industrial. Nas ltimas trs dcadas, pesquisadores tm discutido a possibilidade da

substituio da clssica levedura S. cerevisiae pela bactria Z. mobilis, por apresentar um

maior direcionamento de carbono para a produo de etanol, podendo fermentar glicose duas

vezes mais rpido do que a levedura (BAI; ANDERSON; MOO-YOUNG, 2008).

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3.3.1 Saccharomyces cerevisiae

S. cerevisiae um fungo predominantemente unicelular de rpido crescimento e de fcil

manipulao gentica. Suas clulas podem ser esfricas, ovais ou elpticas, podendo ainda

apresentar-se bastante alargadas. Suas dimenses variam consideravelmente em funo da

linhagem, nutrio, tempo de brotamento, entre outros fatores. Reproduzem-se sexuada e

assexuadamente por brotamento, fisso ou cissiparidade, ou combinao desses dois

mecanismos (BARNETT, 1992; TORTORA; FUNKE; CASE, 2002).

S. cerevisiae capaz de crescer at uma temperatura mxima que se encontra na faixa

de 35-43C (WALKER, 1998). No que diz respeito ao pH, o melhor valor encontra-se entre

4,5-6,5. Quanto concentrao de etanol, as clulas simplesmente se adaptam s mudanas de

concentrao deste composto no sistema, sendo tambm instigadas a desenvolver uma

termotolerncia gradativa ao aumento da temperatura (PLESSET; PALM; McLAUGHLIN,

1982). Na indstria, as clulas de leveduras so expostas a estresses diversos, tais como alta

temperatura, alto teor de etanol, baixo pH e compostos inibidores presente no caldo de cana

ou melao, como os cidos orgnicos e os compostos fenlicos (TOSETTO, 2003). Na

produo de etanol a partir de biomassa lignocelulsica, a formao de substncias inibidoras,

durante a etapa de pr-tratamento da biomassa, uma fonte adicional de estresse (LIN;

TANAKA, 2006).

Os acares assimilados por este microrganismo incluem a glicose, frutose, sacarose,

manose, galactose e maltose. O processo catablico da glicose em S. cerevisiae ocorre pela

via Embden-Meyerhof, que tem a funo de decompor a molcula de glicose at cido

pirvico, atravs de uma srie de reaes catalisadas por enzimas especficas, situadas na

parede celular e no interior da clula (Figura 3.3).

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Figura 3.3: Via metablica de formao de produtos da fermentao de carboidratos por S.

cerevisiae (via Embden-Meyerhof). Fonte: Modificado de WALKER (1998).

Na presena de oxignio, o cido pirvico destinado, principalmente, ao Ciclo de

Krebs, onde oxidado a dixido de carbono e gua. Porm, na ausncia de oxignio, S.

cerevisiae destina a fonte de carbono para produzir etanol e dixido de carbono, sendo estes

compostos equivalentes a 95% dos produtos formados a partir da degradao dos acares. Os

outros 5% so desviados para a formao de glicerol, cidos orgnicos (como cido succnico,

actico e pirvico), alcois superiores e acetaldedo, entre outros (WALKER, 1998; LIMA et

al., 2001;TOSSETO, 2002).

As linhagens de S. cerevisiae utilizadas em processos industriais possuem, como

principais caractersticas, a elevada produtividade e a eficincia de fermentao, a tolerncia

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ao etanol e temperatura, a resistncia s altas concentraes de acares. A nova

preocupao tem sido o desenvolvimento de linhagens capazes de assimilar, alm das hexoses

(glicose, manose e galactose), as pentoses (xilose e arabinose) presentes em hidrolisados

lignocelulsicos, na presena de compostos inibitrios, como furfural, HMF, cido actico,

cido frmico e derivados fenlicos (ALMEIDA et al., 2007; HAHN-HGERDAL et al.,

2007a,b).

O furanos e fenis so compostos aromticos que podem inibir o crescimento e reduzir

a produtividade de etanol, porm no alteram os rendimentos de etanol em linhagens de S.

cerevisiae e Z. mobilis (KLINKE; THOMSEN; AHRING, 2004). O desempenho das

linhagens, em presena destes compostos, depende da composio do hidrolisado, uma vez

que as concentraes dos inibidores iro variar de acordo com a matria-prima e condies de

pr-tratamento utilizados (ALMEIDA et al, 2007; GALBE; ZACCHI, 2007; HEER; SAUER,

2008).

Modig, Liden e Taherzadeh (2002) avaliaram a tolerncia de linhagem de S. cerevisiae

a inibidores, relatando que a inibio por furfural e por HFM , na concentrao de 1,0 g L-1

,

acarretou em uma disfuno no crescimento de 90%, no caso do furfural, e 50% pelo HMF.

Ainda neste trabalho, foi discutido que, durante o crescimento aerbio e anaerbio, a

capacidade de S. cerevisiae em tolerar furfural parece estar diretamente acoplada capacidade

de converter furfural para compostos menos inibitrios como o lcool furfurlico. Misturas

artificiais de inibidores tambm foram testadas para analisar o poder inibitrio de cada

composto (MARTIN; JONSSON, 2003). Ding et al. (2011) investigaram os efeitos,

individual e sinrgico, do furfural, fenol e do cido actico em S. cerevisiae, nas

concentraes 1,3 g L-1

, 0,5 g L-1

e 5,3 g L-1

, respectivamente. Observou-se, nesse trabalho,

que os trs inibidores exibem efeito sinrgico significante sobre o crescimento, fermentao e

alguns metablitos da levedura. Na anlise individual, o cido actico apresentou efeitos mais

graves sobre a levedura.

Almeida et al. (2009) realizou uma seleo entre 12 linhagens de S. cerevisiae, em

diferentes hidrolisados (pinheiro Scrupe, palha do trigo e da cevada), observando uma

inibio de crescimentos em todos os casos, sendo o hidrolisado do pinheiro o que apresentou

as maiores concentraes dos inibidores (cido actico 6,2 g L-1

; HMF 3,6 g L-1

; furfural 2,1 g

L-1

) e a maior inibio no crescimento das linhagens.

Tofighi (2010) testou a tolerncia de S. cerevisiae Lalvin EC1118, uma linhagem

industrial, em meios com altas concentraes de furfural, e demonstrou que, na menor

14

concentrao utilizada (4,0 g L-1

), o microrganismo j apresentou uma reduo significativa

no crescimento e na produo de etanol.

3.3.2 Zymomonas mobilis

Z. mobilis uma bactria Gram-negativa, que apresenta-se em forma de bastonete com

terminaes arredondas, ocasionalmente elipsoidais, formando pares ou no, com

comprimento de 2 a 6 m e dimetro de 1 a 1,4 m (SWINGS; DE LEY, 1977). No so

esporulantes e se reproduzem, na maioria dos casos, por diviso binria simples. A posio

taxonmica de Zymomonas no foi totalmente estabelecida, devido a incertezas sobre o

metabolismo aerbio ou anaerbio destas bactrias. Porm, Swing e De Ley (1977), ao

estudarem caractersticas fenotpicas de 38 linhagens de Z. mobilis, observou que no havia

diferena significativa entre elas, sendo estas geneticamente estveis (DOELLE et al, 1993;

ALTERTHUM, 2001).

Segundo Swings e De Ley (1977), a faixa de pH que as linhagens de Z. mobilis so

capazes de crescer entre 3,85 a 7,55. Gunasekarn, Karunakaran e Kasthuriban (1986),

realizaram anlises em diferentes linhagens de Z. mobilis, provenientes de colees de

culturas mundiais, e confirmaram que rendimento da fermentao foi mxima em pH 7,0, mas

baixa em pH 4,0. A melhor temperatura para Z. mobilis encontra-se entre 25C e 35C; em

temperaturas mais altas, acima de 38, o crescimento do microrganismo diminui cerca de

26%, e, em temperaturas prximas de 40C, o crescimento mnino, dificultando ou inibindo

a produo de etanol.

Esta bactria tolera concentraes de etanol na faixa de 7,7 a 10% e de glicose entre 15

a 25% (v/v) (GONALVES DE LIMA et al., 1972; SWINGS; DE LEY, 1977; MICHEL;

STARKA, 1986). Calazans, Rios e Falco de Morais (1990) estudaram a produo de etanol

de uma linhagem de Z. mobilis (ZAP), utilizando diferentes concentraes de glicose,

relatando o aumento da durao da fase lag e a diminuio do rendimento em etanol com a

utilizao de concentraes acima de 15,6% de glicose.

Em aerobiose, esse microrganismo reduz seu crescimento entre 25 a 40%, alm de

produzirem quantidade considerveis de acetaldedo e cido actico. Em sistemas onde h a

adio de nitrognio para efetivar a anaerobiose, ocorre uma reduo das taxas de crescimento

e rendimento. Quando h a adio direta de CO2, h uma inibio das taxas metablicas.

(BRINGER; FINN; SAHM, 1984; VORE; TALBURT, 1993).

15

Z. mobilis uma bactria obrigatoriamente fermentativa, que produz etanol a partir de

uma fonte de carbono pela via Entner-Doudoroff, comumente utilizada por organismos

estritamente aerbios (Figura 3.4) (SWINGS; DE LEY, 1977).

Figura 3.4: Via metablica de formao de produtos da fermentao de carboidratos por Z.

mobilis (via Entner-Doudoroff). Fonte: ERNANDES; GARCIA-CRUZ (2009).

Os acares utilizados para a obteno de energia so a sacarose, a frutose e a glicose.

Na metabolizao de 1 mol de glicose, gera aproximadamente 1,8 moles de etanol, 1,2 moles

de CO2, 0,15 moles de cido actico e pequenas quantidades de outros subprodutos, como

16

lactato e acetaldedo. A metabolizao da sacarose produz, como principais subprodutos, a

levana (CALAZANS et al., 1989; KANG et al., 2006) e o sorbitol (SHENE; BRAVO, 2001;

CAZETTA et al., 2005; BARROS; CELLIGOI, 2006; VIGNOLI et al., 2006), reduzindo

assim, significativamente, a produo de etanol. Outros subprodutos so frutooligossacardeos

(BEKERS et al., 1993), glutamato, cido actico, acetaldedo (COTON et al., 2005) e cido

glicnico (SILVEIRA et al., 1999). Linhagens recombinantes foram desenvolvidas para

ampliar o alcance de degradao de substratos, permitindo assim a fermentao de pentoses,

como a xilose e arabinose (ZHANG et al., 1995; DEANDA et al., 1996; MOHAGHEGHI et

al.,, 2002; SEO et al., 2005; YANG et al., 2009).

No Brasil, a pesquisa com Z. mobilis foi iniciada pelo cientista Gonalves de Lima em

1952, quando trouxe do Mxico a linhagem Ag11 e a depositou na Coleo UFPEDA.

Posteriormente, em 1970, o pesquisador isolou linhagens de amostras de caldo de cana-de-

acar ligeiramente degradado, nomeando-as de CP1, CP2, CP3 e CP4. Essas culturas foram

consideradas distintas at 1982, quando Dally e colaboradores analisaram o perfil plasmidial

destas linhagens e observaram a analogia entre elas. Por isso, todas as linhagens so hoje

igualmente denominadas por CP4. Atualmente, esto catalogadas na Coleo UFPEDA 24

linhagens de Z. mobilis, sendo 19 destas consideradas distintas, por estudos do perfil

plasmidial e anlises cromossmica. (FALCO DE MORAIS et al., 1993).

A linhagem CP4 (UFPEDA -202) possui muitas variantes, dentre elas a ZM4 (ATCC

31821), cuja diferena de um plasmdio, em relao linhagem de origem. A ZM4 foi a

primeira linhagem desta espcie a ter seu genoma sequenciado (ROGERS et al., 1982;

JOACHIMSTHAL et al., 2000; LAWFORD et al., 2001; SEO et al., 2005).

Z. mobilis considerada uma alternativa para a produo de etanol em larga escala, com

algumas vantagens em relao a S. cerevisiae, que inclui um melhor rendimento na converso

de acares a etanol, devido utilizao da via Entner-Doudoroff (BEAVEN et al., 1989).

Segundo Ernandes e Garcia-Cruz (2009), vrios pases realizam estudos com o intuito de

substituir a utilizao de leveduras por bactrias para reduzir o tempo de fermentao

alcolica. Porm, Z. mobilis possui entraves quanto ao substrato utilizado, pois esses

microrganismos, em presena de sacarose, sintetizam outros produtos secundrios como

levana e sorbitol, diminuindo, assim, o rendimento fermentativo. Programas de melhoramento

vm sendo desenvolvidos para a obteno de linhagens mais tolerantes ao etanol e capazes de

fermentar carboidratos lignocelulsicos (JOACHIMSTHAL et al., 1998).

A viabilidade de utilizao de Z. mobilis para a produo de etanol a partir de fontes

ricas em material lignocelulsicos, como resduos agrcolas, vem sendo muito pesquisada e

17

relatada (ROGERS; JOACHIMSTHAL; HAGGETT, 1997; RUANGLEK;

MANEEWATTHANA; TRIPETCHKUL, 2006; MOHAGHEGHI; SCHELL, 2009;

ROGERS et al., 2007). O problema em utilizar este tipo de substrato encontra-se no fato da

toxicidade natural dos hidrolisados de lignocelulose resultar em altos custos de processo de

desintoxicao do meio reacional (ADEN; FOUST, 2009).

Gutierrez-Padilla e Karim (2005) investigaram o furfural, em concentraes baixas e

elevadas, como inibidor do crescimento e produo de etanol em linhagem recombinante de

Z. mobilis CP4 (pZB5), tendo como resultado uma diminuio de 30 e 60% (w/v) na

produo de biomassa e de 19 e 76% (v/v) na produo de etanol, respectivamente. Yang et

al. (2010) avaliaram a ao de inibidores (acetato, vanilina, furfural e HMF) em Z. mobilis

ZM4. Os resultados mostraram que todos os inibidores testados tm efeito negativo na

linhagem, sendo a vanilina o maior efeito inibitrio, seguido do furfural e HMF.

18

4 MATERIAL E MTODOS

4.1 Microrganismos

Foram utilizadas linhagens de leveduras industriais da espcie Saccharomyces

cerevisiae e linhagens de bactrias da espcie Zymomonas mobilis, pertencentes Coleo de

Microrganismos do Departamento de Antibiticos da Universidade Federal de Pernambuco -

UFPEDA (Tabelas 4.1-4.2).

Todas as linhagens de S. cerevisiae utilizadas foram isoladas de destilarias da regio

Nordeste do Brasil, sendo estas registradas na coleo da UFPEDA pelo nome da destilaria de

onde foram isoladas. A origem das linhagens de Z. mobilis encontram-se descritas na tabela

4.2.

Tabela 4.1: Linhagens de S. cerevisiae investigadas neste

trabalho.

N UFPEDA Nome Registrado

1238 IA

1255 IA

1325 MONTE ALEGRE

1326 AGRISA (R)

1327 FERMENTO INEXPORT (R)

1329 OTA-PEMEL

1331 FERMENTO INEXPORT (S)

1333 AGRISA (S)

1337 JP-1

- MARITUBA

19

Tabela 4.2: Linhagens de Z. mobilis investigadas neste trabalho.

N UFPEDA Nome Registrado Origem

202 CP4 Caldo de cana fermentado (Recife/PE)

203 Z1-80 Caldo de cana e melao da Usina

Massauassu (Escada/PE)

205 ZAP gua residual aucarada (Refinaria de

acar/PE)

238 ZAG4 Recombinante (AG11+ZAP)


354 Z1-86 B Caldo de cana e melao da Usina

Maravilhas (Goiana/PE)

356 Z1-88 Caldo de cana e melao da Usina

Laranjeira (Vicncia/PE)

362 Z1-97 Caldo de cana da Destilaria PEMEL

(Marataca/PE)


633 ZM4 ATCC 31821

4.2 Meios de Cultura

4.2.1 Meio de conservao

Os microrganismos cedidos pela Coleo, liofilizados, foram reativados utilizando-se os

meios descritos na Tabela 4.3, em estufa microbiolgica a 30 C, por 24-48 h. Aps a

incubao, as culturas de Z. mobilis permaneceram em meio lquido e as de S. cerevisiae

foram repicadas para tubos com meio slido inclinado para a conservao (Tabela 4.3). O pH

inicial de ambos os meios foi 7,0. As linhagens foram conservadas em geladeira a 4 C, sendo

repicadas a cada trs meses para o meio de conservao (Tabela 4.3).

20

Tabela 4.3: Composio dos meios de cultura utilizados nas etapas de ativao,

conservao e reativao das linhagens de S. cerevisiae e de Z. mobilis.

Etapa Microrganismo Componente Concentrao

(g L-1)

Ativao

S. cerevisiae

Glicose 20,0

Extrato de Levedura 5,00

Peptona 3,00

Z. mobilis Glicose 20,0


Conservao

S. cerevisiae

Glicose 20,0


Peptona 3,00

Agar 12,0

Z. mobilis Glicose 20,0


Reativao S. cerevisiae

Z. mobilis

Glicose 20,0


Peptona 3,00

4.2.2 Meio de preparao de inculo

Os microrganismos conservados foram reativados no meio descrito na Tabela 4.3. A

composio dos meios de inculo (Tabela 4.4), utilizados para todos os testes realizados, foi

formulada a partir da composio elementar mdia, em base seca, de cada microrganismo

(STANBURY et al., 1995). Aps o crescimento, as culturas foram transferidas para frascos

Erlenmeyer contendo o meio da preparao de inculo (Tabela 4.4). O pH inicial deste meio

foi 6,0.

21

Tabela 4.4: Composio do meio de cultura

utilizado na preparao do inculo nas linhagens

de S. cerevisiae e de Z. mobilis.

Componente Concentrao (g L-1)

Glicose 100

MgSO4.7H2O 0,6

KH2PO4 1,2

Extrato de levedura 6,6

(NH4)2SO4 6,3

4.2.3 Meio de fermentao

O meio de fermentao, utilizado para a caracterizao inicial das linhagens e para a

caracterizao cintica das duas linhagens selecionadas, est descrito na Tabela 4.5.

A composio dos meios de fermentao (Tabela 4.5), utilizados na seleo das

linhagens e na caracterizao cintica das duas linhagens selecionadas, foi formulada a partir

da composio elementar, em base seca, de cada microrganismo (STANBURY et al., 1995),

de forma que a glicose fosse o substrato limitante. Utilizaram-se diferentes concentraes de

glicose, sendo os demais compostos proporcionalmente reduzidos, e, para a investigao do

efeito dos inibidores, os componentes foram dissolvidos em hidrolisado hemicelulsico. O

valor do pH inicial para todos os meios de fermentao foi 5,0.

Tabela 4.5: Composio do meio de fermentao

(por litro de gua ou hidrolisado hemicelulsico).

Componente Concentrao (g)

Glicose 150/ 200* ou 50

**

Mg2SO4.7H2O 0,81

KH2PO4 2,46


(NH4)2SO4 18,0

* Meio sem inibidores: Z. mobilis (150 g L-1

); S.

cerevisiae (200 g L-1

).

** Meio contendo hidrolisado: 50 g L-1

para ambas os

microrganismos.

22

4.2.4 Hidrolisado hemicelulsico

O bagao de cana-de-acar utilizado foi originado do resduo da moagem e extrao do

caldo da cana-de-acar da Usina Central Olho Dgua, localizada no municpio de

Camutanga no Estado de Pernambuco. O bagao foi tratado hidrotermicamente, temperatura

de 195 C, por 16 minutos, em reator descontnuo com capacidade de 20 L (REGMED AU/E-

20), com sistema de mistura por rotao completa (Figura 4.1). Foram utilizados 500 g de

bagao (massa seca) e 10 litros de gua. Aps o tratamento, duas fraes foram formadas:

uma slida (celulignina) e uma lquida (hidrolisado hemicelulsico) (Figura 4.2). O

hidrolisado foi separado dos resduos slidos, com auxilio de filtro de pano, e armazenado em

garrafas em cmara fria at a sua utilizao. A composio do hidrolisado hemicelulsico

encontra-se descrita na Tabela 4.6.

Figura 4.1: Reator (REGMED AU/E-20) utilizado para

a obteno do hidrolisado hemicelulsico.

23

Figura 4.2: Fluxograma do tratamento hidrotrmico utilizado para a

obteno do hidrolisado hemicelulsico.

Tabela 4.6: Concentrao de acares e

inibidores identificados por HPLC no

hidrolisado hemicelulsico obtido e utilizado

nas fermentaes.

Composto Concentrao (g L-1

)

Arabinose 0,61

Celobiose 0,93

Glicose 0,35

Xilose 8,69

cido Frmico 0,59

cido Actico 3,22

Furfural 0,67

HMF 0,64

Fenis 0,32

Para a avaliao dos efeitos individuais e sinrgico dos inibidores presentes no

hidrolisado (cido frmico, cido actico, furfural, hidroximetilfurfural e compostos

fenlicos), foram realizados experimentos no meio de fermentao (Tabela 4.5), adicionando-

Tratamento

hidrotrmico

195 C, 16 min.

Hidrolisado

hemicelulsico

(frao lquida)

Celulignina

(frao slida)

Bagao

de

Cana-de-acar

24

se apenas um dos inibidores ou todos os inibidores. O composto fenlico utilizado para esse

experimento foi o cido glico. As concentraes utilizadas, descritas na Tabela 4.7, foram

baseadas nos valores encontrados no hidrolisado hemicelulsico.

Tabela 4.7: Concentraes dos inibidores

utilizadas (isoladamente e em conjunto) nos

experimentos.

Inibidores Concentrao (g L-1

)

cido Frmico 0,6

cido Actico 3,2

Furfural 0,7

HMF 0,6

cido Glico 0,3

4.3 Procedimento Experimental

4.3.1 Caracterizao inicial e seleo de linhagens

A caracterizao inicial das leveduras e bactrias ocorreu atravs de fermentaes em

tubos de 50 mL (Falcon). Os experimentos foram realizados em duplicatas, em meios base

de glicose (Tabela 4.5).

Cada linhagem de S. cerevisiae foi repicada, com uma ala de platina, do meio de

conservao para um tubo de 15 mL (Falcon) contendo 5 mL do meio de reativao (Tabela

4.3). O repique das linhagens de Z. mobilis foi realizado pela transferncia, com pipeta

automtica, de 1 mL do meio de conservao para um tubo de 15 mL (Falcon) contendo 4 mL

de meio de reativao. Todos os tubos, contendo ambas as linhagens, foram mantidas a 30C

em estufa microbiolgica, durante 24 horas.

Aps o crescimento, todo o volume do tubo, contendo o microrganismo crescido, foi

transferido para frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 45 mL de meio da preparao de

inculo (Tabela 4.4). Cada frasco foi posto em mesa incubadora rotativa (New Brunswick

Scientific, C25KC Figura 4.3), por 18 horas, a 35C, com agitao de 250 rpm, para a

levedura, e de 150 rpm para a bactria.

25

Figura 4.3: Mesa incubadora rotativa (New Brunswick Scientific, C25KC), contendo

frascos Erlenmeyer de 500 mL com inculos.

Depois do inculo preparado, um volume de 4 mL foi transferido para tubos de 50 mL

(Figura 4.4), contendo 36 mL do meio de fermentao (Tabela 4.5). As fermentaes

ocorreram a 35C, pH inicial 5, por 18 horas, em meio de fermentao, com e sem

hidrolisado, descrito na Tabela 4.5. Foram retiradas amostras no incio e aps 18 horas de

fermentao, para anlises de concentrao celular, concentrao de substrato e concentrao

de produto e co-produtos. O pH final de cada tubo tambm foi aferido.

Figura 4.4: Tubos de 50 mL (Falcon) utilizados na

seleo de linhagens.

26

4.3.2 Caracterizao cintica das linhagens selecionadas

As linhagens de S. cerevisiae e de Z. mobilis, que demonstraram, estatisticamente,

melhores caractersticas para a produo industrial de etanol, foram selecionadas para

comparao, atravs de uma caracterizao cintica mais detalhada, em biorreator

instrumentado, em meio de fermentao (Tabela 4.5), sem e com hidrolisado hemicelulsico

de bagao da cana-de-acar.

O inculo obtido para a caracterizao cintica das linhagens selecionadas seguiu o

mesmo procedimento da caracterizao inicial, sendo obtido a partir da repicagem do

microrganismo para quatro tubos de ensaio contendo meio de reativao (Tabela 4.3), que foi

mantido a 30C em estufa, durante 24 horas. Em seguida, toda a biomassa crescida nos tubos

foi transferida para frasco Erlenmeyer de 500 mL, contendo 45 mL de meio de preparao do

inculo (Tabela 4.4). O crescimento do inculo foi realizado em mesa agitadora a 35C, por

18 horas, a 250 rpm para S. cerevisiae e 150 rpm para Z. mobilis. O volume total de 200 mL

do inculo foi ento transferido ao biorreator, o qual continha 1800 mL do meio de

fermentao (Tabela 4.5).

Foi utilizado um biorreator de bancada instrumentado, com capacidade para 2 litros

(New Brunswick Scientific, Bioflo 110 Figura 4.5). As variveis controladas foram pH 5,0,

temperatura de 35C e agitao de 500 rpm. O controle de pH foi realizado por sistema

automtico, com a adio de soluo de NaOH 3 M ou H2SO4 3 M. Nitrognio foi adicionado

ao reator para remoo de oxignio, e a anaerobiose foi verificada por meio de eletrodo

detector de oxignio dissolvido.

Durante todo o processo, foram retiradas amostras para anlises de concentrao

celular, concentrao de substrato e concentrao de produto e co-produtos

4.3.3 Caracterizao do efeito de inibidores

Foram realizados experimentos adicionais para se investigar os efeitos individuais e

interativo de cinco inibidores presentes no hidrolisado (cido frmico, cido actico, furfural,

hidroximetilfurfural e cido glico) sobre as linhagens de S. cerevisiae e Z. mobilis

selecionadas. Os efeitos foram investigados individualmente, ou seja, adicionando-se apenas

um inibidor ao meio de fermentao, e em conjunto, adicionando-se todos os inibidores.

27

Figura 4.5: Biorreator de bancada instrumentado

(New Brunswick Scientific, Bioflo 110) utilizado nos

experimentos de caracterizao cintica das linhagens.

Inicialmente as linhagem foram repicadas para um tubo de 15 mL (Falcon) contendo 5

mL de reativao (Tabela 4.3), sendo mantidos em estufa a 30C por 24 horas. Aps

crescimento, todo o volume do tubo, contendo o microrganismo crescido, foi transferido para

frasco Erlenmeyer de 500 mL, contendo 45 mL de meio da preparao de inculo (Tabela

4.4). Cada frasco foi posto em mesa incubadora rotativa, por 18 horas, a 35 C, com agitao

de 250 rpm, para a levedura, e de 150 rpm para a bactria.

Um volume de 4 mL do inculo foi transferido para tubos de 50 mL, contendo 36 mL

do meio de fermentao (Tabela 4.5), contendo cada inibidor (ou todos) na concentrao

descrita na Tabela 4.6, com exceo do controle que possua apenas o meio de fermentao.

As fermentaes ocorreram em estufa a 35C, com pH inicial de 5, por um perodo 18

horas. Para anlises de concentrao celular, concentrao de glicose e concentrao de etanol

e co-produtos foram retiradas amostras no incio e aps 18 horas de fermentao. O pH final

de cada tambm tubo foi determinado.

28

4.4 Mtodos Analticos

4.4.1 Determinao de concentrao celular

Densidade tica

A densidade ptica das amostras foi determinada em espectrofotmetro a 600 nm, para

S. cerevisiae, e em 660 nm para Z. mobilis.

Peso seco

Para a determinao da concentrao celular por peso seco, uma amostra de 5 mL foi

filtrada em membrana microporosa de 0,45 m, para as leveduras, e de 0,2 m, para as

bactrias, em um sistema de filtrao a vcuo (Millipore). Todas as membranas foram

previamente pesadas (pm) e, aps filtrao, foram secas em estufa a 80C por 24 horas. Aps a

secagem, as membranas foram postas em dessecador at atingirem a temperatura ambiente,

sendo, em seguida, pesadas (pt). O valor da biomassa seca foi calculado pela diferena entre o

peso da membrana com a biomassa seca e o peso apenas da membrana (pl = pt pm). A

concentrao celular foi obtida dividindo-se o peso das membranas filtradas secas, em

gramas, pelo volume filtrado, em litros (X = pl/0,005).

Contagem por microscopia

O nmero de clulas viveis e no-viveis de S. cerevisiae foi determinado por

contagem em cmara de Neubauer, utilizando-se um microscpio ptico (Zeiss, modelo

Axiolab Hbo). As clulas foram coradas com soluo de azul de metileno, preparada com

0,025 g do corante, adicionado a 2 g de citrato de sdio, em 100 mL de gua. A mistura da

amostra com a soluo de azul de metileno foi na proporo de 1:1. Em seguida, foi

transferida uma alquota da mistura para a cmara de Neubauer, procedendo-se a observao

das clulas em objetiva de 40x. Foram contados o nmero de clulas totais e de clulas

coradas em 5 campos quadrados distintos de 0,2 mm de largura (Figura 4.6). Nos casos em

que o nmero de clulas era excessivo para ser contado (mais que 300 clulas por campo), as

amostras foram diludas nas propores adequadas.

Como a cmara tem profundidade de 0,1 mm, o volume total dos campos contados foi

de 210-5

mL. A concentrao de clulas totais foi dada pela razo entre o nmero total de

clulas e o volume total dos campos contados. Como apenas as clulas no-viveis so

coradas pela soluo corante, a concentrao de clulas viveis foi calculada pela diferena

29

entre as clulas totais e corada, dividindo-as pelo volume total. A viabilidade celular foi

determinada como o percentual de clulas no coradas presente na amostra.

A contagem de clulas de Z. mobilis no pode ser realizada devido mobilidade das

clulas na cmara de Neubauer.

Figura 4.6: Esquema da Cmara de Neubauer e da microscopia em objetiva de

40X. Fonte: Adaptado de ALVES (2006).

4.4.2 Determinao das concentraes de substratos, produtos e inibidores.

A quantificao do substrato (glicose), do produto (etanol), co-produtos (cido actico,

glicerol, cido succnico) e inibidores (HMF, furfural, cido frmico) foi realizada atravs de

cromatografia lquida de alta eficincia (Agilent, Srie 1100 Figura 4.8). Foi utilizada uma

coluna Aminex HPX-87HX (Bio-Rad) de 300 x 7,8 mm, com cido sulfrico 5 molar como

fase mvel, a um fluxo de 0,6 mL min-1

, a 50C; o detector utilizado foi o de ndice de

refrao. A fase mvel foi preparada com gua ultrapura e, posteriormente, filtrada em

membrana microporosa de 0,2 m. O mtodo do padro externo foi utilizado para quantificar

a concentrao dos compostos. Todas as amostras e os padres foram diludos em fase mvel,

filtrados em membrana 0,2 m e injetados automaticamente em um volume de 5 L.

30

Figura 4.7: Equipamento de cromatografia lquida

de alta eficincia (Agilent, srie 1100) utilizado para

a determinao de concentraes de substrato,

produtos e inibidores.

Os fenis totais foram determinados pelo mtodo colorimtrico de Folin-Ciocalteau

(SINGLETON et al., 1999). Adicionaram-se 2,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteau (10%

v/v) e 2,0 mL de carbonato de sdio (7,5% p/v), a 0,5 mL do hidrolisado diludo, incubando-

se em banho termostatizado a 50 C, durante 5 minutos. Para a preparao do branco, o

mesmo procedimento foi utilizado, sendo que no lugar da amostra foi utilizado 0,5 ml de gua

destilada. Foi construda uma curva de calibrao com diferentes concentraes de cido

glico, nas mesmas condies do mtodo colorimtrico de Folin-Ciocalteau.

4.5 Mtodos Matemticos

4.5.1 Clculo de parmetros cinticos

Considerou-se o biorreator perfeitamente agitado, de forma que, para o sistema

descontnuo, o balano material foi expresso como:

31

[Taxa de variao] = [Velocidade de reao]

onde:

X = concentrao de biomassa (g L-1

)

S = concentrao de substrato (g L-1

)

P = concentrao de produto (g L-1

)

CP = concentrao de co-produto (g L-1

)

rX = velocidade de crescimento celular (g L-1

h-1

)

rS = velocidade de consumo de substrato (g L-1

h-1

)

rP = velocidade de formao de etanol (g L-1

h-1

)

rCP = velocidade de formao de co-produto (g L-1

h-1

)

= velocidade especfica de crescimento (h-1

)

qS = velocidade especfica de consumo de substrato (g g-1

h-1

)

qP = velocidade especfica de formao de produto (g g-1

h-1

)

qCP = velocidade especfica de formao de co-produto (g g-1

h-1

)

Fatores de converso, Y, foram obtidos atravs das relaes, considerada constantes,

entre as velocidades especficas definidas acima (Eq. 1-4):

32

onde:

YX/S = rendimento de biomassa em substrato (g g-1

)

YP/S = rendimento de produto em substrato (g g-1

)

YCP/S = rendimento de co-produto em substrato (g g-1

)

A eficincia das fermentaes foi calculada pela relao entre YP/S e o rendimento

mximo terico (0,511 g g-1

):

A produtividade de biomassa, QX, e as produtividades de produto, QP,e co-produto, QCP,

foram calculadas como:

4.5.2 Anlise estatstica

Os resultados experimentais obtidos na caracterizao inicial, em duplicatas, foram

analisados pelo mtodo ANOVA seguido pelo teste de comparao mltipla de mdias de

Tukey a 5% de significncia. Na caracterizao do efeito de inibidores individuais, os

resultados obtidos, em duplicatas, foram analisados pelo mtodo ANOVA seguido pelo teste

de Dunnett a 5% de significncia. Os clculos foram realizados no programa computacional

EXCEL 2007 da Microsoft Corporation.

33

5 RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Caracterizao e Seleo das Linhagens

A caracterizao inicial foi realizada com o objetivo de selecionar linhagem de S.

cerevisiae e linhagem de Z. mobilis que apresentassem resultados mais si

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