Dissertation Matthias Junkers: "Künstliche Rezeptoren zur Erkennung der RGD-Sequenz"

Künstliche Rezeptoren zur Erkennung der RGD‐Sequenz

Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades

der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

dem

Fachbereich Chemie

der Philipps‐Universität Marburg

vorgelegt von

Matthias Junkers

aus Leverkusen

Marburg an der Lahn 2006

Vom Fachbereich Chemie der Philipps‐Universität Marburg als Dissertation

angenommen.

Erstgutachter: Prof. Dr. T. Schrader

Zweitgutachter: Prof. Dr. A. Geyer

Tag der mündlichen Prüfung: 2. März 2006

Meiner Familie

Aus dem Codex Buranus, ca. 1230, Bayerische Staatsbibliothek (Signatur: clm 4660/4660a)

O Fortuna velut luna statu variabilis, semper crescis aut decrescis; vita detestabilis nunc obdurat et tunc curat ludo mentis aciem, egestatem, potestatem dissolvit ut glaciem.

Sors immanis et inanis, rota tu volubilis, status malus, vana salus semper dissolubilis, obumbrata et velata michi quoque niteris; nunc per ludum dorsum nudum fero tui sceleris.

Sors salutis et virtutis michi nunc contraria, est affectus et defectus semper in angaria. Hac in hora sine mora corde pulsum tangite; quod per sortem sternit fortem, mecum omnes plangite!

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

2 Problemstellung 3

3 Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten

3.1 Integrine 6

3.1.1 Das Integrin αvβ3 im Komplex mit einem RGD‐Liganden 8

3.1.2 Liganden der Integrine 10

3.1.3 Ansätze zur Entwicklung von Therapeutika 13

3.2 Anionenrezeptoren auf Basis von Guanidinen 15

3.3 Rezeptoren für die Guanidiniumfunktion und Arginin

3.3.1 Biologische Systeme 18

3.3.2 Künstliche Rezeptoren 21

4 Durchführung und Ergebnisse

4.1 Beiträge zu einem neuen, künstlichen RGD‐Rezeptor analog RENSING 26

4.2 Ein neues Trisphosphonat zur Argininerkennung

4.2.1 Synthese 30

4.2.2 Bindungsstudien 33

4.2.3 Verlängerung des Trisphosphonsäureesters 13 36

4.3 Eine Serie von künstlichen RGD‐Rezeptoren auf Basis von benzylischen

Bisphosphonaten

4.3.1 Synthese 37

4.3.2 Bindungsstudien 41

4.3.3 Kraftfeldrechnungen 44

4.4 Rezeptoren für die RGD‐Sequenz aus Bisphosphonat und

Guanidiniumcarbonylpyrrol

4.4.1 Synthese von BP2‐GlyGlyPyrGua+ 44 47

4.4.1.1 Untersuchung auf Selbstassoziation 48

4.4.1.2 Bindungsstudien 50

4.4.1.3 Untersuchung auf Sequenzselektivitäten 52

4.4.2 BP2‐GlyPyrGua+ 47 54

4.4.3 BP2‐ASER‐PyrGua+ 49 57

4.5 Molekulare Pinzetten

4.5.1 Das Grundgerüst 59

4.5.2 Entwicklung von Synthesemethoden zur einseitigen

Funktionalisierung der molekularen Pinzette 60

4.5.3 Synthese der ersten, asymmetrisch funktionalisierten

Phosphonatpinzetten 65

4.5.4 Bindungsuntersuchung an der Glycinpinzette 67 69

4.5.5 Bindungsuntersuchungen an der Pinzette 68 72

5 Zusammenfassung 75

6 Ausblick 80

7 Experimenteller Teil

7.1 Materialien und Methoden 86

7.2 Synthesen

7.2.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 89

7.2.2 Synthesen zu Kapitel 4.2 (Trisphosphonat) 92

7.2.3 Synthese von 4b 101

7.2.4 Synthesen zu Kapitel 4.3 (Modellrezeptoren) 102

7.2.5 Synthesen zu Kapitel 4.4 (Bisphosphonatrezeptoren) 121

7.2.6 Synthesen zu Kapitel 4.5 (Molekulare Pinzetten) 131

7.3 Titrationen

7.3.1 Theoretische Grundlagen zu NMR‐Titrationen 156

7.3.2 Praktische Durchführung und Tabellen 158

7.3.3 Mikrokalorimetrische Verdünnungstitrationen 175

8 Abkürzungsverzeichnis 176

9 Literaturverzeichnis 179

Danksagung

Einleitung

1

1 Einleitung

Die supramolekulare Chemie befaßt sich mit nichtkovalenten

Assoziaten von Molekülen zu übergeordneten Strukturen.

Natürliches Vorbild für solche supramolekularen Strukturen sind

die Wechselwirkungen von Enzymen mit ihren Substraten.

Bereits 1894 formulierte EMIL FISCHER in seiner Schrift zum

„Einfluss der Configuration auf die Wirkung der Enzyme“: „daß

nur bei ähnlichem geometrischem Bau diejenige Annäherung der

Moleküle stattfinden kann, welche zur Auslösung des

chemischen Vorganges erforderlich ist. Um ein Bild zu gebrauchen, will ich sagen,

dass Enzym und Glucosid wie Schloss und Schlüssel zu einander passen müssen, um

eine chemische Wirkung aufeinander ausüben zu können.“[1] Auch über einhundert

Jahre später behält dieses Bild von Schloß und Schlüssel noch weitestgehend

Gültigkeit, wurde höchstens durch etwas präzisere Metaphern ersetzt wie „Hand

und Handschuh“. Der Handschuh ist im Gegensatz zu einem Schloß flexibel und

anpassungsfähig und öffnet seine Tasche erst, wenn die Hand hineinschlüpft. Dies

entspricht vielen Enzymen besser, die durch „induced fit“ erst bei Annäherung des

Substrates ihre Konformation anpassen und einen exakt ausgebildeten Hohlraum

bilden.[2]

Vor allem für seine Beiträge zur chemischen Synthese von Purinen und Zuckern,

aber eben auch für die frühe Erkenntnis der Bedeutung von supramolekularen

Wechselwirkungen zwischen Molekülen, wurde EMIL FISCHER 1902 als zweiter

Träger mit dem Nobelpreis für Chemie geehrt.

Dennoch dauerte es noch bis in die sechziger Jahre des vergangenen Jahrhunderts,

bevor die ersten synthetischen Systeme entwickelt wurden, die das Schlüssel‐Schloß‐

Modell aufgreifen und auf rein künstliche Verbindungen anwenden. CHARLES J.

PEDERSEN veröffentlichte 1967 in einer einzelnen Zuschrift nicht weniger als 33

zyklische Polyether, die er Kronenether taufte. Die verschiedenen Kronenether sind

in der Lage, stabile Komplexe mit Alkalimetallkationen über elektrostatische

Emil Hermann Fischer

Einleitung

2

Anziehung auszubilden. Aufgrund ihres eigenen räumlichen Aufbaus können sie

zwischen verschieden großen Kationen differenzieren.[3]

Nur zwei Jahre später folgte JEAN‐MARIE LEHN mit der Entwicklung von

Kronenether‐ähnlichen, bizyklischen Strukturen.[4, 5] Diese, von ihm Kryptanden

genannte Rezeptoren, sind den Kronenethern in ihrer Selektivität gegenüber

Metallkationen überlegen. JEAN‐MARIE LEHN und DONALD J. CRAM übertrafen sich in

der folgenden Zeit immer wieder in der Präsentation neuer, künstlicher, organischer

Strukturen mit Hohlräumen und Spalten, die niedermolekulare Gäste anhand ihrer

spezifischen Geometrie erkennen und selektiv binden.[6] Darunter befindet sich z.B.

im Jahr 1984 auch ein frühes Beispiel von LEHN für einen künstlichen Rezeptor für

den biologisch hochrelevanten Botenstoff Acetylcholin.[7] Für ihre Pionierarbeiten

wurden PEDERSEN, LEHN und CRAM 1987 gemeinsam mit dem Nobelpreis für Chemie

geehrt. Sie ebneten den Weg für ein neues Arbeitsfeld der Chemie, für das Lehn den

Terminus „Supramolekulare Chemie“ prägte, während Cram den Begriff der „Wirt‐

Gast‐Chemie“ bevorzugte.

Die präparative organische Chemie besitzt nun Werkzeuge, um die Natur immer

besser nachzuahmen. Der Bogen kann hier wieder zurück zu EMIL FISCHER

geschlagen werden: In seiner Festrede zur Annahme des Nobelpreises 1902 forderte

er, die Chemie solle sich mehr den Problemen der Biologie zuwenden. Er „sah den

Tag voraus, an dem die Chemie nicht nur natürliche Enzyme intensiv als Agentien

nutzt, sondern auch künstliche Fermente für eigene Zwecke herstellen würde.“ Für

diese Prophezeiung gibt es heute unzählige Beispiele. Auch die vorliegende Arbeit

widmet sich, in dieser Tradition, der Synthese und Untersuchung von künstlichen

Rezeptoren für eine biologisch hochrelevante Zielstruktur.

Im Übrigen sei noch erwähnt, daß EMIL FISCHER in der selben Rede auch den

Zeitpunkt nahen sah, an dem Kaffeebohnen obsolet werden und Chemiker eine gute

Tasse Kaffee vollsynthetisch und kostengünstig herstellen können. Dieser Tag steht

wohl immer noch aus.[8]

Problemstellung

3

2 Problemstellung

Die membranständigen Integrine sind Schlüsselproteine bei der Zell‐Zell‐ und Zell‐

Matrix‐Adhäsion.[9] Sie induzieren Signaltransduktion durch die Zellmembran und

spielen eine entscheidende Rolle bei vielen biologischen Prozessen wie der

Regulation der Zellmigration, Zellproliferation, Angiogenese (Wachstum von

kapillaren Blutgefäßen), Apoptose (natürlicher Zelltod) und Hämostase

(Blutgerinnung).[10, 11] Entscheidend für die Funktion der Integrine ist die Interaktion

mit löslichen Proteinen der extrazellulären Matrix, die als Liganden die Aktivität der

Integrine regulieren.[12] Das bedeutendste Erkennungsmotiv, welches die Bindung

eines solchen Liganden an das jeweilige Integrin vermittelt, besteht in der

Aminosäuresequenz Arginin‐Glycin‐Aspartat (RGD), die der Ligand in einer dem

Lösemittel zugewandten Schleife trägt (s. Tabelle 1).[13]

RGD‐Protein Funktion

Fibrinogen Blutplättchenkoagulation

Fibronectin Zell‐Matrix‐Adhäsion

Osteopontin Knochenwachstum

Thrombospondin Blutplättchenkoagulation

Vitronectin Zell‐Matrix‐Adhäsion

Wachstumsfaktoren Zelldifferentiation und Angiogenese

Tabelle 1: Ausgewählte Proteine, die das RGD‐Bindungsmotiv enthalten, und die von ihnen hauptsächlich regulierte Funktion.

Fehlfunktionen in den natürlichen integrinabhängigen Steuerungsvorgängen führen

zu schwerwiegenden pathologischen Prozessen. Resultierende Krankheitsbilder sind

Thrombosen, Infarkte, Arthritis, chronische Entzündungen, Tumormetastasierungen

und Viruserkrankungen (Gelbfieber, Maul‐ und Klauenseuche, HIV).

Problemstellung

4

Kleine, rational entworfene synthetische Rezeptoren, die gezielt bestimmte

Integrin/RGD‐Protein ‐ Wechselwirkungen inhibieren, stellen daher einen Ansatz zur

Entwicklung neuartiger Therapeutika dar.

Dazu wurden in der Vergangenheit bereits zahlreiche peptidische und

nichtpeptidische RGD‐Mimetika hergestellt und getestet.[14] Viele sind bereits bis in

klinische Studien vorgedrungen und patentrechtlich geschützt. Die RGD‐Mimetika

ahmen möglichst spezifisch ein RGD‐Protein nach und binden mit hoher Affinität an

die Bindungsstelle des zugehörigen Integrins, um dessen Aktivität zu inhibieren. Der

umgekehrte, viel beschwerlicher scheinende Ansatz, das RGD‐Protein durch einen

künstlichen Rezeptor zu verkappen und so seine Bindung an sein Integrin zu

verhindern, ist dagegen in der Literatur kaum beschrieben. Dennoch kann dies in

bestimmten Fällen sogar der vielversprechendere Weg sein. Zwar inhibieren RGD‐

Mimetika passende Integrine erfolgreich, aktivieren gleichzeitig aber wie die

entsprechenden natürlichen Liganden deren Signaltransduktionswege. Ein Abfangen

des natürlichen Liganden umgeht dieses Problem.[15]

HNN

NNH

O

H O

H O

HNO

O

H2N NH2

R ---- G ---- D

Abb. 1: Tripeptidsequenz Arginin‐Glycin‐Aspartat (RGD) und schematischer Aufbau eines maßgeschneiderten Rezeptors Die RGD‐Sequenz bietet zwei Haftpunkte für einen möglichen Rezeptor an: die

kationische Guanidiniumfunktion der Argininseitenkette und das negativ geladene

Carboxylat des Aspartat. Ein modularer Aufbau des Rezeptors aus einem Baustein

zur Argininbindung und einem zur Carbonsäurebindung, die beide über einen

variablen Spacer verbunden sind, liegt daher nahe. Die gemeinsame Bindung der

beiden Module an das Zielmolekül sollte die Gesamtbindungsstärke gegenüber den

Bindungsstärken der einzelnen Bausteine wesentlich verstärken. Der Spacer hat

Problemstellung

5

dabei in erster Linie die Aufgabe, die beiden Module möglichst exakt

vorzuorientieren. Es ist auch denkbar, daß dieser zusätzliche Wasserstoffbrücken

zum Rückgrat des RGD‐Peptides ausbildet und somit die Bindung weiter verstärkt.

In der Arbeitsgruppe SCHRADER wurden bereits geeignete Bausteine zur

Komplexierung von basischen Aminosäuren wie Arginin oder auch Lysin auf Basis

von anionischen Bisphosphonaten entwickelt. Zur Carboxylaterkennung bieten sich

vor allem die in der Gruppe SCHMUCK entworfenen Guanidiniumcarbonylpyrrole an.

Die Vereinigung dieser beiden Konzepte und Anwendung auf die Entwicklung von

künstlichen Rezeptoren in polaren Lösungsmitteln für die RGD‐Sequenz war Ziel

der vorliegenden Arbeit.

In den folgenden Kapiteln dieser Arbeit wird nun zunächst der biologische

Hintergrund der Integrin‐RGD‐Wechselwirkung weitergehend ausgeführt, gefolgt

von einer näheren Betrachtung des möglichen Aufbaus der einzelnen

Rezeptormodule, einem Überblick über den aktuellen Wissensstand und bereits

erfolgte Vorarbeiten in den beteiligten Gruppen. Anschließend wird die tatsächliche

Synthese der Bausteine und Rezeptoren dargestellt und die Ergebnisse der

Bindungsstudien mit den hergestellten Rezeptoren diskutiert.

Theoretischer Hintergrund und Vorarbeiten

6

3.1 Integrine

Multizelluläre Organismen sind auf einen stabilen Verbund ihrer Zellen und der sie

umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) angewiesen. Die ECM besteht aus von

den Zellen sezernierten, immobilen Makromolekülen, im wesentlichen Proteinen

und Polysacchariden.[16] Adhäsive Kontakte von Zellen untereinander und Zellen mit

der ECM steuern das Zellverhalten und die Zellentwicklung. Sie spielen eine

entscheidende Rolle bei einer Vielzahl von Prozessen wie Zellmigration,

Zellproliferation, Angiogenese (Wachstum von kapillaren Blutgefäßen), Apoptose

(natürlicher Zelltod), Embryogenese, Hämostase (Blutgerinnung) und

Immunantwort. Aber auch für eine Reihe pathologischer Vorgänge sind sie

verantwortlich: tumorinduzierte Angiogenese, Tumormetastasierung, Thrombosen,

Infarkte, Osteoporose, Retinopathie, Arthritis und chronische Entzündungen.[17-19]

Vermittelt werden adhäsive Zellkontakte durch in der Zellmembran verankerte

Adhäsionsproteine. Neben den Cadherinen, der Immunglobulin‐Superfamilie und

den Selektinen ist die Proteinfamilie der Integrine hier von besonderem Interesse.[20‐23]

Dabei handelt es sich um eine hochkonservierte Klasse membranständiger Proteine,

die sowohl in primitiven Organismen wie Korallen und Schwämmen auftritt als auch

in Säugern.[24] Integrine regulieren nicht nur Zell‐Zell‐ und Zell‐Matrixadhäsion,

sondern ermöglichen auch bidirektionale Signaltransduktion durch die

Zellmembran.[17, 25‐27] Bislang sind 24 verschiedene Integrine gefunden worden, die

heterodimer durch den nichkovalenten Zusammenschluß einer etwa 180 kDa großen

α‐Einheit und einer etwa 95 kDa großen β‐Einheit gebildet werden.

Beide Untereinheiten sind membranständige Glycoproteine mit einer großen

extrazellulären Domäne, einer Transmembranhelix und einer kleinen intrazellulären

Domäne. Die Kopfgruppe der α‐Einheit besteht aus einem siebenblättrigen Propeller,

dessen Blätter jeweils aus einem viersträngigen, antiparallelen Faltblatt gebildet

werden. Der zentrale Rest zwischen den α‐ und β‐Untereinheiten scheint das Arg261

der β‐Untereinheit zu sein, das sich in den β ‐Propeller der α‐Untereinheit einschiebt

und den Komplex durch π‐Kation‐Wechselwirkung stabilisiert.[28] Die jeweilige


7

Kombination aus einer der 18 verschiedenen α‐Einheiten und einer der 8 β‐Einheiten

moduliert die Ligandenspezifität des gebildeten Integrins. Während einige Integrine

selektiv nur einen einzigen Liganden binden, erlauben andere ein verhältnismäßig

breites Ligandenspektrum.[29] Fast die Hälfte aller bekannten Integrine ist dabei in

der Lage, Proteine anhand der kurzen Aminosäuresequenz Arginin‐Glycin‐Aspartat

(RGD) zu erkennen.[30] Dieses Tripeptid wurde 1984 von PIERSCHBACHER und

RUOSLAHTI als die minimale essentielle Adhäsionssequenz in Fibronectin

identifiziert. Sie zeigten, daß immobilisierte RGD‐Peptide analog zu ECM‐Proteinen

integrinvermittelte Zelladhäsion induzieren, während lösliche RGD‐Peptide

antagonistisch dazu adhärierte Zellen ablösen.[13]

α10α11

β2α1

α2

α4

α6

α7

α8

α9

β3

β5

β6

β8

αIIb

β4 β7 αE

αd

αL

αM

αXα3α5

αv

β1

1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 20040

100

200

300

400

500

600

700

Anz

ahl

Jahr

Anzahl jährliche Publikation zu RGD

Abb. 2: Aus 18 verschiedenen α‐ und 8 verschiedenen β‐Einheiten werden die 24 bisher bekannten Integrine nichkovalent als Heterodimer verknüpft. Blau markierte Kombinationen geben Integrine an, die durch RGD‐Peptide inhibiert werden können (links).[31] Die Anzahl der jährlichen Publikationen über RGD‐haltige Strukturen (rechts; 2005 bis September).[32]

Daher ist diese Tripeptidsequenz eines der bedeutendsten natürlichen

Erkennungsmotive, das Schlüsselfunktionen in den oben genannten physiologischen

und pathologischen Prozessen ausübt. Das ubiquitäre Vorkommen der RGD‐

bindenden Integrine nutzen auch eine Reihe von Viren wie z.B. das Gelbfiebervirus,

HIV (human immunodeficiency virus) oder das MKS‐Virus (Maul‐ und

Klauenseuche) als Pforte zur Wirtszelle.[33‐35] Sie bieten selbst das RGD‐Motiv an und

assoziieren darüber an Integrine in der Wirtszellmembran. Bakterien wie E. Coli oder


8

Streptokokken bewegen sich mit Hilfe von RGD‐Proteinen im Wirtsorganismus.[36]

Auch in noch weiteren xenogenen Stoffen finden sich die RGD‐Sequenz tragende

Strukturen: In Schlangengift oder im Speichel von Blutegel und Zecke hemmen

sogenannte Disintegrine die Blutgerinnung.[12, 37] Aufgrund der enormen Bedeutung

dieses Erkennungsmotivs wird auf dem Gebiet der Integrin/RGD‐Wechselwirkung

seit rund 20 Jahren äußerst intensiv geforscht. Dies ist leicht ersichtlich anhand der

mittlerweile insgesamt weit über 7000 Publikationen mit einer kontinuierlich

steigenden Zahl pro Jahr.[32]

3.1.1 Das Integrin αvβ3 im Komplex mit einem RGD‐Liganden

2001 gelang der Gruppe ARNAOUT an der Harvard Medical School erstmals die

Aufnahme der Kristallstruktur eines Integrins, und zwar des extrazellulären

Segments von αvβ3.[38] Im Jahr darauf folgte in der selben Gruppe die zugehörige

Kristallstrukturaufklärung des αvβ3‐Segmentes im Komplex mit einem zyklischen,

künstlichen RGD‐Liganden.[28, 39] Zusammen mit früheren, elektronen‐

mikroskopischen Aufnahmen läßt sich nun genau analysieren, wie der natürliche

Rezeptor die Tripeptidsequenz bindet und welche Folgen die Ligandenbindung auf

Struktur und Funktion des Integrins hat.[40, 41]

Abb. 3: Die RGD‐Integrin‐Bindungsstelle im Komplex mit dem zyklischen Peptid cyclo(RGDf[NMe]V); αv‐Domäne in blau, β3‐Domäne in rot, Ligand in gelb, zusätzlich 3 Mn2+‐Kationen (violett, blau und grau); Oberflächendarstellung des Integrins (links), Stäbchenmodell von Integrin und Ligand (rechts). Wasserstoffbrücken und Salzbrücken zwischen dem Protein und dem Liganden bzw. den Metallkationen sind durch gepunktete Linien dargestellt.[39]


9

Die Bindungstasche für den RGD‐Liganden liegt in der Kopfgruppe des Integrins, in

einer Spalte zwischen dem β‐Propeller und der βA‐Domäne. Alle drei Aminosäuren

des Erkennungsmotivs haben intensiven Kontakt zum Rezeptor. Die

Argininseitenkette des Liganden steckt in einer aus Schleifen zwischen den

Propellerblättern gebildeten Furche. Sie wird von einer bidentaten Salzbrücke zu

einem Aspartat (Asp218) am Boden der Furche und einem Aspartat (Asp150) im

hinteren Teil an ihrem Platz gehalten. Die hydrophobe Alkylkette des Arginins wird

von einem Tyrosin (Tyr178) und einem Alanin (Ala215) an der Nahtstelle zwischen der

α‐ und β‐Einheit des Integrins flankiert. Der obere Teil des Arginins bleibt dem

Lösungsmittel zugänglich. Das in der Mitte des Liganden sitzende Glycin geht enge

hydrophobe Kontakte mit αV ein. Der kritischste Kontakt besteht hier zur

Carbonylgruppe von Arg216. Der enge, dem Glycin zustehende Raum macht hier

einen großen Teil der Ligandenspezifität der Integrine deutlich. Mutation des Glycin

gegen Alanin in natürlichen Liganden, bzw. Austausch in dem verwendeten

zyklischen Peptid, verhindert die Bindung des RGD‐Liganden weitestgehend. Die

zusätzliche Methylgruppe des Alanins besitzt bereits einen zu großen

Raumanspruch.[42]

Die Aspartatseitenkette des Liganden taucht im Gegensatz zu der des Arginins

vollständig in eine Spalte ein und koordiniert dort an ein Mn2+‐Kation, an der sog.

MIDAS (Metal Ion Dependent Association Site). Zusätzlich bildet die

Aspartatcarboxylgruppe noch Wasserstoffbrücken zum Rückgrat des Rezeptors aus,

den Amidprotonen von Tyr122 und Asn215. Die Zugänglichkeit von MIDAS moduliert

die Aktivität des Integrins. Durch konformationelle Änderungen der Tertiär‐ und

Quartärstruktur des Integrins kann dieses zwischen einem hochaffinen und

niedrigaffinen Zustand durch Signale aus der Zelle heraus geschaltet werden. Im

niedrigaffinen Zustand ist die MIDAS für Liganden nicht erreichbar.

Umgekehrt bewirkt aber auch die Bindung eines Liganden weitere konformationelle

Änderungen des Integrins, die nun wiederum Signaltransduktionswege von außen

in die Zelle hinein aktivieren.


10

Die übrigen beiden Aminosäuren des ligierten zyklischen Peptids haben abgesehen

von einer π‐Stapel‐Wechselwirkung des D‐Phe mit Tyr122 keinen Kontakt zum

Integrin. Dies zeigt, daß tatsächlich nur die Tripeptidsequenz RGD für die Bindung

notwendig ist. Der Ligand muß diese lediglich an seiner Oberfläche in einer Schleife

präsentieren.

3.1.2 Liganden der Integrine

In zahlreichen natürlichen Liganden der Integrine wurde die RGD‐Sequenz

nachgewiesen (z. B. Fibronectin, Vitronectin, Fibrinogen, von Willebrand Faktor,

Collagen, Laminin, Osteopontin, Tenascin und Thrombospondin). Teilweise ist sie

hier nicht direkt an der Bindung an den Rezeptor beteiligt, sondern andere

Aminosäuresequenzen im Liganden stellen die Hauptbindungsstellen dar. Aber

auch in den Fällen, in denen tatsächlich die RGD‐Sequenz das wesentliche

Bindungsmotiv ist, müssen noch andere Faktoren hinzugezogen werden, um die

Selektivität der Integrin‐Ligand‐Bindung zu verstehen. Selektivität kann zustande

kommen, wenn die RGD‐Sequenz bei einem Integrin‐Ligand‐Paar nicht die einzige

Bindungsstelle des Integrins ist, sondern gleichzeitig noch eine zweite Sequenz

erkannt wird. Die kooperative Bindung zweier Erkennungsmotive verstärkt in einer

Multipunktwechselwirkung die Ligandbindung wesentlich und steigert die

Selektivität gegenüber Liganden, die nur eines der Erkennungsmotive tragen,

deutlich. Mittlerweile wurden bereits zahlreiche andere Sequenzen in Liganden

identifiziert, die von bestimmten Integrinen unabhängig oder kooperativ zur RGD‐

Sequenz gebunden werden (s. Tabelle folgende Seite).

In einigen Fällen ist das Erkennungsmotiv auch um einige Aminosäuren verlängert.

So bindet das Integrin α5β1 hochspezifisch Fibronectin als Liganden, in dem die

längere RGDSP‐Sequenz erkannt wird. Auch mit Hilfe von kurzen, synthetischen

Peptiden konnte der Einfluß verlängerter Sequenzen gezeigt werden.[43, 44]


11

Integrin Ligand Bindungsmotive Funktion

β1 α1 Natives Collagen, Laminin GFOGER Zell‐Matrix‐Adhäsion α2 Natives Collagen, Laminin,

Fibronectin RGD, DGEA, GFOGER

Zell‐Matrix‐Adhäsion, Knochenbau

α3 Natives Collagen, Laminin, Fibronectin

RGD Zell‐Matrix‐Adhäsion

α4 Fibronectin (Spleißdomäne), Invasin

EILDV, REDV

α5 Fibronectin (RGD‐Domäne) RGD, RGDSP Zellmigration/‐wachstum, T‐Zellproliferation

α6 Laminin α7 Laminin α8 Fibronectin, Vitronectin, Tenascin RGD Zell‐Matrix‐Adhäsion α9 Tenascin, Collagen, Laminin AEIDGIEL α10 Collagen Zell‐Matrix‐Adhäsion α11 Collagen Zell‐Matrix‐Adhäsion αv Vitronectin, Fibronectin,

Osteopontin RGD Knochenbau

β2 αL ICAM‐1, ICAM‐2, ICAM‐3 Zell‐Zell‐Adhäsion αM C3b, Fibrinogen, Faktor X, ICAM‐

1, VCAM‐1 KRLDGS, KQAGDV

Blutgerinnung, Leukozytenfunktion

αX С3b GPRP Zell‐Zell‐Adhäsion αD ICAM‐3, VCAM‐1 Zell‐Zell‐Adhäsion β3 αIIb Fibrinogen, Fibronectin, von

Willebrand Faktor, Vitronectin, Thrombospondin

RGD, KGD, KQAGDV (Fibrinogen)

Blutgerinnung

αv Vitronectin, denaturiertes Collagen, von Willebrand Faktor, Fibrinogen, Thrombospondin, Fibulin, Osteopontin, Sialoprotein

RGD, SNS, KRLDGS

Zelldifferentiation, Angiogenese, Knochenbau

β4 α6 Laminin, Desmin β5 αv Vitronectin, Fibronectin,

Osteopontin, Fibrinogen, Knochen‐Sialoprotein

RGD, RKKRRQRRR

Zelldifferentiation, Angiogenese, Knochenbau

β6 αv Fibronectin RGD, DLXXL Zell‐Matrix‐Adhäsion β7 α4 Fibronectin (Spleißdomäne),

VCAM‐1, MAdCAM‐1 EILDV, REDV, GNEH, LDT

Zell‐Zell‐Adhäsion

αE E‐Cadherin NRDKETKV Zell‐Zell‐Adhäsion β8 αv Vitronectin RGD

Tabelle 2: Die Integrine mit natürlichen Liganden und einigen für die Ligation notwendigen minimalen Bindungsmotiven. Liganden, in denen die RGD‐Sequenz nachgewiesen wurde, sind grau unterlegt. Einige physiologische Funktionen der Ligand‐Rezeptor‐Paare sind angegeben. (Die abgekürzten Liganden sind ICAM: intercellular adhesion molecule, VCAM: vascular cell adhesion molecule, MAdCAM: mucosal adressing cell adhesion molecule, C3b: Komplementfaktor 3b).[30, 45]


12

Neben der Sequenz scheint nicht zuletzt die Konformation der RGD‐Sequenz im

jeweiligen Liganden eine entscheidende Rolle für die Selektivität der Integrine zu

spielen. Diese Abhängigkeit von Konformation und Integrinselektivität konnte von

KESSLER mit konformativ eingeschränkten zyklischen RGD‐Peptiden nachgewiesen

werden, die durch „spatial screening“ ermittelt wurden.[46‐49] Zyklische Pentapeptide

wie cyclo(RGDf[NMe]V) inhibieren selektiv die Bindung von Vitronectin an das

Integrin αvβ3. Dem gegenüber weisen zyklische Hexapeptide, die ein β‐turn‐

Mimetikum neben der RGD‐Sequenz enthalten, eine Selektivität für das Integrin

αIIbβ3 auf.[47] Konformationsanalysen solcher Peptide in wäßriger Lösung zeigen,

daß das Rückgrat der RGD‐Sequenz in den Pentapeptiden einen durch die relativ

bewegliche Peptidbindung des Glycins gebildeten Knick aufweist. Die Seitenketten

des Arginins und Aspartats rücken dadurch näher zueinander. Dagegen nehmen die

Hexapeptide eine weitgehend gestreckte Vorzugskonformation des RGD‐Rückgrats

ein. Die oben bereits beschriebene Kristallstruktur des Komplexes von

cyclo(RGDf[NMe]V) mit dem Integrin αvβ3 bestätigt die in freier Lösung ermittelte

Konformation des Liganden für die kondensierte Phase.

Abb. 4: Fünf verschiedene Klassen von zyklischen Peptiden sind mit der darin vorliegenden RGD‐Konformation dargestellt und dem Integrin, das von dem Peptid inhibiert wird. Die Pfeile deuten die Blickrichtung auf die jeweilige Kante des Peptidringes an. Die Kohlenstoffatome des Peptidrückgrats sind durch eine Linie verbunden, um ihre Anordnung zu verdeutlichen. Die Arginin‐ und Aspartatseitenkette sind vollständig in ihrer anti‐Konformation dargestellt zur Verdeutlichung des Knicks im Rückgrat (links).[50] Vier Beispiele aus Kristallstrukturen für die Konformation der RGD‐Sequenz (rechts; im Uhrzeigersinn von l.o.: Fibronectin, Thrombospondin, cyclo(RGDf[NMe]V), Vitronectin). [51]


13

3.1.3 Ansätze zur Entwicklung von Therapeutika

Aufgrund der zahlreichen schwerwiegenden pathogenen Vorgänge, die durch

Fehlsteuerungen in Integrin‐Ligand‐Wechselwirkungen ausgelöst werden, wurde in

der Vergangenheit äußerst intensiv nach wirksamen Inhibitoren als Therapeutika

gesucht. Mittlerweile befinden sich eine ganze Reihe von Integrinantagonisten in

verschiedenen klinischen Phasen des Zulassungsverfahrens oder sind sogar bereits

zugelassen (s. Tabelle 3).

Therapeutikum Hersteller Indikation Integrin Status Integrilin (Eptifibatid, Cycloheptapeptid)

GlaxoSmithKline Myokardinfarkt, Herzoperationen

αIIbβ3 zugelassen

Reopro Abciximab (monoklonaler Antikörper)

Eli Lilly Ischämische kardio‐vaskuläre Erkrankungen

αIIbβ3 αvβ3

zugelassen

Lamifiban/Sibrafiban (nichtpeptidisch)

F. Hoffmann – La Roche

Myokardinfarkt, instabile Angina

αIIbβ3 Phase III

BIO1211 (LDV‐haltiger Ligand)

Biogen/ Merck & Co

Asthma, Lungenentzündung

α4β1 Phase I

Cilengitide, cyclo(RGDf[NMe]V)

E. Merck KGaA Krebs, Thrombose αvβ3 Phase II

Endostatin (Disintegrin)

Alchemgen Krebs αvβ3 Phase II

SB‐265123 (Peptidmimetikum)

SmithKline Beecham Pharmaceuticals

Osteoporose αvβ3, αvβ5

vorklinisch

Tabelle 3: Auswahl einiger Integrinantagonisten, die als Therapeutika eingesetzt oder getestet werden.

Interessanterweise beschränken sich dabei fast alle in der Literatur beschriebenen

Ansätze darauf, bestimmte Integrine durch peptidische und nichtpeptidische RGD‐

Analoga bzw. ‐Mimetika abzusättigen und ihre Adhäsion zu inhibieren.[52, 53] Der

umgekehrte Ansatz, spezifische, synthetische Rezeptoren für die RGD‐Sequenz

einzusetzen, um dem jeweiligen Integrin den natürlichen Liganden zu entziehen, ist

dagegen bisher praktisch nicht beschritten worden. Der nach wie vor einzige

synthetische Rezeptor für die RGD‐Sequenz wurde von SCHRADER beschrieben.[54]

Zugegebenermaßen scheint dieser Weg auch zunächst synthetisch und konzeptionell

anspruchsvoller zu sein. RGD‐Peptide sind im Vergleich deutlich leichter zugänglich

und selbst das einfache, lineare RGD‐Tripeptid zeigt als erste Leitstruktur bereits


14

eine inhibitorische Wirkung in vitro. Allerdings haben insbesondere Integrin

αIIbβ3 – Blocker teilweise nicht zufriedenstellende Ergebnisse in klinischen Studien

gezeigt. Der intrinsische aktivierende Effekt der Blocker wird als mögliche Ursache

hierfür vielfach diskutiert.[55‐57] Genauso wie die natürlichen Liganden induzieren

synthetische Blocker konformationelle Änderungen im Integrin und aktivieren so

Signaltransduktionswege der Integrine. Die direkte Adhäsion über das ligierte

Integrin wird zwar verhindert, aber sekundäre Stoffwechselwege, die wiederum zu

Aggregation führen, werden angeregt.[58] Auf diesem Hintergrund erscheint es

sinnvoller, künstliche RGD‐Rezeptoren einzusetzen, die ebenfalls die Integrin‐

Ligand‐Wechselwirkung inhibieren können und dabei das Integrin in seiner

Funktion nicht beeinflussen. Nach Identifizierung von Fibrinogenbindungsstellen im

Integrin αIIbβ3 konnte bereits gezeigt werden, daß aus dem Integrin abgeleitete

kleine Peptide wie EHIPA oder GAPL Fibrinogen binden und die

Thrombozytenaggregation inhibieren können.[59‐61] Daraufhin wurde vorgeschlagen,

in einer Komplementärmethode Peptidsequenzen zu bestimmen, die als künstliche

Rezeptoren für RGD‐Proteine eingesetzt werden können, was aber noch nicht zu

künstlichen RGD‐Rezeptoren geführt hat.[15, 62]

Für einen rationalen Ansatz zur Entwicklung von RGD‐Rezeptoren bietet die

Tripeptidsequenz im Wesentlichen zwei Angriffspunkte: die aliphatische Seitenkette

des Arginin mit der abschließenden, positiv geladenen Guanidiniumgruppe und das

negativ geladene Carboxylat in der Seitenkette des Aspartats. Ein künstlicher

Rezeptor sollte also aus einem Baustein zur Argininerkennung und einem weiteren

Baustein zur Carboxylaterkennung bestehen, die über einen geeigneten Spacer

miteinander verknüpft sind. Der Spacer kann gegebenenfalls weitere attraktive

Wechselwirkungen zum Rückgrat des Peptides ausbilden und sollte die beiden

Haftgruppen so vororientieren, daß möglichst bestimmte Konformationen der RGD‐

Sequenz bevorzugt gebunden werden.[54]


15

3.2 Anionenrezeptoren auf Basis von Guanidinen

Sowohl in der Natur als auch in künstlichen Systemen hat sich die

Guanidiniumgruppe als eine äußerst vorteilhafte funktionelle Gruppe zur Bindung

von Oxoanionen wie Carboxylaten, Phosphaten, Sulfaten und Nitraten in

kompetitiven, polaren Lösungsmitteln erwiesen. Sie bildet starke nichtkovalente

Wechselwirkungen aus über Coulomb‐Anziehung der gegensinnigen Ladungen und

Wasserstoffbrücken zu anionischen Partnern. Die Aminosäure Arginin mit ihrer

Guanidiniumgruppe in der Seitenkette spielt eine Schlüsselrolle in vielen

biologischen Peptiden und Proteinen (z. B. Neuropeptid Y, Carboxypeptidase A,

Nukleasen, Histone).[63‐66]

In den späten 70er Jahren entwickelte LEHN einfache Makrozyklen mit jeweils zwei

bis drei Guanidiniumgruppen als Phosphatrezeptoren.[67] Einige Jahre später

verwendete SCHMIDTCHEN bizyklische Guanidiniumkationen zur Komplexierung

von Anionen in Chloroform.[68, 69]

N

CO2Et

NH HNHN

NH+ +HN

HN

OO

NH HN

NH2

N+N+

NH2

H

H

H

H

HN

NH

HN

NH

NH2+

NH2+

NH+

N

NH

R1 R2

Lehn Schmidtchen Hamilton Anslyn Abb. 5: Synthetische Anionenrezeptoren auf Basis von Guanidiniumkationen

1992 berichtete HAMILTON über ein Isophthaloyl‐verbrücktes Bisguanidiniumkation

als Rezeptor für Phosphodiester, welcher als Katalysator die Esterspaltung des

gebundenen Gastes 700fach beschleunigt (Ka = 4.6 ∙ 10‐4 M‐1 in Acetonitril).[70] Ein

ähnlicher Rezeptor mit zwei Guanidiniumfunktionen von ANSLYN bindet

Phosphodiester mit bis 700 M‐1 in wäßrigem DMSO (33/67).[71, 72]

Diese Beispiele zeigen bereits, daß die einfache Wechselwirkung eines isolierten

Guanidiniumkations mit einem Anion für eine Bindung in kompetitiver polarer

Lösung nicht ausreicht. Hier sind zusätzliche attraktive Wechselwirkungen bzw. die


16

Verwendung multipler Guanidiniumfunktionen notwendig. SCHMUCK führte auf

dieser Grundlage eine Klasse von Guanidiniumcarbonylpyrrolen als

Carboxylatrezeptoren mit neuen Eigenschaften ein.

NO O

N N N

N+R1

H

H

O-

OR2

H HH H H

Abb. 6: Von Schmuck entwickeltes Guanidiniumcarbonylpyrrol als Carboxylatrezeptor. Wasserstoffbrücken sind als gestrichelte Linien dargestellt Guanidine weisen pKS‐Werte im Bereich von 12‐14 auf, während die von SCHMUCK

verwendeten Acylguanidine bei 6‐8 liegen.[73] Dies beschränkt ihre Einsatzfähigkeit

auf das Arbeiten in sauren pH‐Bereichen. Dafür erhöht ihre stärkere Acidität

deutlich ihre Fähigkeit, Wasserstoffbrücken auszubilden. Zusätzliche

Wasserstoffbrücken von den Pyrrol‐ und Amid‐NHs steigern die Carboxylatbindung

wesentlich. Durch eine Wasserstoffbrücke zwischen der Guanidiniumgruppe und

der daneben liegenden Carbonylgruppe liegt der Rezeptor in einer vollständig

planaren Vorzugskonformation vor und ist damit optimal präorganisiert für die

Bindung ebenfalls planarer Anionen wie Carboxylaten. Der sterische Anspruch des

verwendeten Restes kann schließlich Selektivität zwischen verschiedenen

Carbonsäuren bewirken.

NH

O O

NH HN N

NH2+

H

HH2NOC

R

NH

O O

NH HN N

NH2+

R

H

HNH

O

HN N

NH2+

H

H

O

HN N

NH2+

H

HH2N NH2

NH2+

Abb. 7: Systematische Reihe von SCHMUCK zur Ermittlung der einzelnen Bindungsbeiträge der Guanidiniumcarbonylpyrrole Die einzelnen Beiträge der beteiligten Funktionen an der Bindung wurden in einer

systematischen Reihe mit N‐Acetylalanin als Substrat in 40 % Wasser/DMSO

untersucht.[74] Das einfache Guanidiniumkation zeigt unter diesen Bedingungen

keinerlei Bindung (Ka < 10 M‐1). Ein acideres Acetylguanidiniumkation weist bereits

eine schwache Bindung von Ka = 50 M‐1 auf. Eine weitere, durch das Pyrrol‐NH


17

angebotene Wasserstoffbrücke, erhöht die Assoziationskonstante um etwa den

Faktor drei (Ka = 130 M‐1). Mit wiederum einer zusätzlichen Wasserstoffbrücke von

dem Amid‐NH erreicht man eine erneute fünffache Steigerung (Ka = 770 M‐1, R = Et).

Durch die Wahl einer geeigneten Seitengruppe am Pyrrol (Valin, R = iPr) kann die

Bindungskonstante bis zu Ka = 1630 M‐1 gesteigert werden.

Kürzlich wurde eine analoge Reihe getestet, in der der zentrale Pyrrolbaustein gegen

ein Pyridin substituiert wurde. Wegen der elektrostatischen Abstoßung des freien

Elektronenpaars des Pyridinstickstoffs und dem gebundenen Carboxylat sind die

Assoziationskonstanten jedoch signifikant niedriger (20‐460 M‐1).[75]

MeO O

NHZHN

ONH

HN

O

BocHN

HNn

n = 1-4

OH

ONH

HN

O

BocHN

HN

Abb. 8: Auf der Guanidiniumpyrrolcarbonsäure (links) basierende Argininanaloga (rechts)

Wird das Rezeptormotiv von SCHMUCK in die Seitenkette einer Aminosäure

inkorporiert, so erhält man argininanaloge synthetische Aminosäuren, die

kompatibel zu üblichen Peptidkupplungsmethoden sind und auch in

festphasengestützen Synthesen verwendet werden können.[76]

NH

O

O

NH

HNNH2

NH2+

Et Et

Et

NH

O

O

HN

NHH2N

NH2+

HN

O

O

HN

HN

NH2

+H2N

N

O

ON

NH2+

N

N

OH+N

N

NH

O R2N

O R1

O-

OH

H H HH

HH

Abb. 9: Ausbau des obigen Rezeptormotivs zum Dipeptidrezeptor (links) und Citratrezeptor (rechts) von SCHMUCK.


18

Wird dagegen das Rezeptormotiv um zusätzliche Bindungsstellen erweitert, so kann

die Bindungsstärke weiter erhöht und ein spezifischeres Substratspektrum erzielt

werden. Ein mit zwei weiteren Wasserstoffbrückendonoren in geeignetem Abstand

versehenes, dikationisches Guanidiniumcarbonylpyrrol komplexiert Dipeptide mit

freiem C‐Terminus mit Ka > 106 M‐1 in 40 % Wasser/DMSO und immer noch mit

Ka > 104 M‐1 in 90 % Wasser/DMSO (s. Abb.).[77] In einem weiteren Beispiel führt die

dreifache Verwendung des Rezeptormotivs in einem einzigen Molekül zu einem

effizienten Tricarboxylatrezeptor (s. Abb.), der Tricarbonsäuren wie Citrat in

wäßriger, gepufferter Lösung mit Ka = 8.6 ∙ 104 M‐1 bindet. Damit stellt er den

stärksten bis dato bekannten Citratrezeptor mit ausgezeichneter Selektivität dar, da

andere Anionen, vor allem auch Dianionen mit physiologischer Bedeutung wie

Malat oder Tartrat deutlich schwächer gebunden werden.[78, 79]

Mit diesen hervorragenden Ergebnissen sind Guanidiniumcarbonylpyrrole

prädestiniert als Bausteine zur Aspartaterkennung im größeren Kontext eines

künstlichen RGD‐Rezeptors.

3.3 Rezeptoren für die Guanidiniumfunktion und Arginin

3.3.1 Biologische Systeme

In der bereits beschriebenen Kristallstruktur des cyclo(RGDf[NMe]V) im Komplex

mit dem Integrin αvβ3 wird die Guanidiniumfunktion des Arginins im Liganden

von zwei Carboxylaten (von Asp150 und Asp218) im Protein chelatisiert und so durch

das kooperative Spiel von Wasserstoffbrücken und der elektrostatischen Anziehung

der gegensinnigen Ladungen gebunden (s. Abb. links).

An der Nahtstelle zwischen α‐ und β‐Untereinheit des Integrins findet sich ein

weiteres Beispiel für Argininbindung in der Natur, jedoch mit gänzlich anderem

Muster. Die beiden Untereinheiten berühren sich großflächig, durchdringen sich aber

praktisch nicht. Nur das Arginin261 der β‐Untereinheit taucht tief in einen von dem β‐

Propeller der α‐Untereinheit gebildeten Kanal ein. Dort wird es von zwei

konzentrischen Ringen aromatischer Aminosäuren des Propellers durch π‐Kation‐


19

Wechselwirkungen an seinem Platz gehalten (s. Abb. rechts). Somit erwächst dem

Arginin261 offensichtlich eine besondere Bedeutung bei dem nichtkovalenten

Zusammenhalt der beiden Untereinheiten des Integrins.

Abb. 10: 2 Beispiele für Argininbindung aus der Kristallstruktur des Integrins αvβ3 im Komplex mit dem zyklischen Peptid cyclo(RGDf[NMe]V) (PDB‐Code: 1L5G). Das Arginin des Liganden wird von zwei Aspartaten gebunden (links); das Arginin261 der β-Untereinheit schiebt sich in einen aus aroma-tischen Aminosäuren der α‐Untereinheit gebildeten Kanal (rechts). (Farben: α‐Einheit blau, β rot)

Vor allem von DOUGHERTY wurde die π‐Kation‐Wechselwirkung studiert, die für die

biologische Argininerkennung von immenser Bedeutung ist.[80] Die

Guanidiniumgruppe des Arginins wechselwirkt hierbei deutlich stärker mit

aromatischen Flächen als das einfachere Ammoniumkation des Lysins.

Proteindatenbankanalysen haben gezeigt, daß etwa 25 % aller Tryptophane in π‐

Kation‐Wechselwirkungen involviert sind.[80, 81]

Abb. 11: Kalottenmodell der π‐Kation‐Wechselwirkung zwischen Arginin77A und Tryptophan211A im Oligopeptidbindungsprotein. (links; ΔE = ‐8.4 kcal/mol)[80]. Alternierende kationische (Arg, Lys) und aromatische (Tyr, Phe, Trp) Aminosäurereste in der Kristallstruktur des humanen Wachstums‐hormons (hGHR, PDB‐Code: 3HHR, mittig).[82] Farblich hervorgehoben sind die elektrostatischen Potentialflächen der Seitenketten (blau: positiv, rot: negativ).[83] Parallele Stapelwechselwirkung zwischen dem Tyr970A und dem H‐Brücken‐Netz zwischen Arg918 und Asp969A in Xylanase 10B (rechts, PDB‐Code: 1GKK).[84]


20

Mit den obigen Beispielen verwandte Bindungsmuster für Arginin wurden auch in

anderen Proteinen gefunden. Arginyl‐tRNA‐Synthetase z.B. benötigt für seine

katalytische Aktivität einen argininhaltigen Liganden, bindet aber auch bereits

monomeres L‐Arginin. Zwei in der Ebene des Guanidiniumkations liegende

Carboxylate, die hier von einem Aspartat und einem Glutamat bereitgestellt werden,

bilden Salz‐ und Wasserstoffbrücken zum Arginin aus. Zusätzlich kann ein Tyrosin

eine Wasserstoffbrücke akzeptieren, so daß alle fünf Guanidinium‐NHs an

Wasserstoffbrücken teilnehmen.[85]

Abb. 12: Argininbindungsmotiv in Arginyl‐tRNA‐Synthetase (links), schematische Darstellung für die Erkennung von Arginin (schwarze Linienstruktur) in Tar‐RNA durch Guanin26 und zwei Phosphate (mittig) und die von FRANKEL postulierte „Arginingabel“ (rechts).

FRANKEL fand Anfang der 90er Jahre ein weiteres natürliches Bindungsmotiv für

Arginin in Tar‐RNA, einem Teil der mRNA des HI‐Virus 1. Das

Transkriptionsaktivatorprotein Tat erkennt eine RNA‐Konformation, in der ein

einzelnes Arginin simultan von zwei Phosphaten gebunden wird. Diese Anordnung

wurde auch „Arginingabel“ genannt.[86] In späteren NMR‐Studien zeigte sich, daß

neben dieser Phosphatgabel auch Wasserstoffbrücken zu Basen (Guanin26) für die

Bindung bedeutsam sind.[87‐89]

In einer in vitro Selektionsreihe mit randomisierten RNA‐pools konnten von

FAMULOK Aptamere evolviert werden, die L‐Arginin enantioselektiv mit enormer

Bindungsstärke (Ka = 3∙106 M‐1) erkennen.[90] Allerdings ist das genaue Bindungsmotiv

für das Arginin hier noch unbekannt. Es kann aber angenommen werden, daß

NN

NH

H

H

R

HHO

O

O

O

P PO OO O


21

ebenfalls Phosphate und Wasserstoffbrückenakzeptorstellen in den Basen eine

entscheidende Rolle spielen.

3.3.2 Künstliche Rezeptoren

Künstliche Systeme zur selektiven Bindung von substituierten Guanidinen wie

Arginin in möglichst polaren Medien sind nach wie vor kaum vorhanden. Hier sind

zunächst lediglich drei herausragende Beispiele zu nennen.[91] DOUGHERTY stellte eine

Reihe von wasserlöslichen Cyclophanen vor, die vorwiegend durch π‐Kation‐

Wechselwirkungen positiv geladene Gäste zu binden vermögen. Ein in der

Peripherie mit acht Carboxylaten versehenes Cyclophan zeigte dabei eine hohe

Bindungsstärke und deutliche Selektivität für Argininamid (ΔG = ‐5.0 kcal/mol)

gegenüber Lysinamid (ΔG = ‐4.0 kcal/mol). Dipeptide aus Arginin und einer

weiteren basischen Aminosäure wiesen eine weiter gesteigerte Affinität auf

(ΔG = ‐5.8 kcal/mol).[92]

N NN N

O O- O- ON N+

NH R

H

H

H

H

Dougherty Bells ʺArgininkorkenʺ Eliseev

O

O-

O-

ON N+

NH R

H

H

H

H

Cs+-O2CCO2

-Cs+

OO

O

CO2-Cs+

Cs+-O2C

CO2-Cs+

+Cs-O2C+Cs-O2C

CO2-Cs+

O

Abb. 13: Drei herausragende Beispiele für künstliche Argininrezeptoren in polaren Medien. Mit einer perfekt vororientierten, starren Anordnung von Wasserstoffbrücken‐

bildenden Gruppen in annellierten sechsgliedrigen Ringen konnte BELL

Kationenrezeptoren mit optimaler Wirt‐Gast‐Komplementarität aufbauen. Die

Einführung zweier Carboxylate in das Rezeptorgerüst bewirkt auch hier

Wasserlöslichkeit und Bindungssteigerung durch die Bildung von Salzbrücken.

Arginin als Monokation wird selektiv gegenüber anderen Monokationen von dem


22

als „Arginin‐Korken“ bezeichneten Rezeptor mit Ka = 900 M‐1 erkannt. Eine zweite

positive Ladung in Diarginin potenziert die Bindung bis auf Ka = 2∙105 M‐1.[93]

Schließlich sei noch auf durch Licht schaltbare Argininrezeptoren von ELISEEV

hingewiesen und deren Anwendung in einem genetischen Algorithmus zur

Anreicherung des Photoisomers mit der höchsten Affinität zu Arginin, einem der

ersten Beispiele für eine evolutive Selektion in einem einfachen, rein chemischen

Prozeß.[94, 95] Später präsentierte HUNTER ein ähnliches photoisomerisierbares

Rezeptormodell für Arginin.[96]

SCHRADER stellte in einem biomimetischen Ansatz einfache, leicht zugängliche

Bisphosphonate als selektive Argininrezeptoren in polaren Lösungsmitteln vor, die

in ihrem Bindungsmuster ähnlich wie FRANKELS Arginingabel das

Guanidiniumkation pinzettenartig umgreifen und dabei noch ausreichend Raum für

Substituenten am Guanidin lassen.[97, 98] Weiterentwicklung dieses Grundmotivs

führte zu einem benzylischen Trisphosphonat, welches Arginin in Methanol mit

Ka = 3500 M‐1 durch ein Netzwerk von sechs Wasserstoffbrücken, π‐Kation‐

Wechselwirkung und die elektrostatische Anziehung der Ladungen bindet. Andere

natürliche, basische Aminosäuren zeigen in Methanol dagegen keine Affinität zu

diesem künstlichen Rezeptor.[99]

Me

P OO

O

N

N

H

POO

HO

HN

H H

Me

OCH2

CH3

HP

O

O

N

O

H

H NE H

O Abb. 14: Ein benzylisches Trisphosphonat von SCHRADER zur verbesserten Bindung von Arginin (links: Lewis‐Struktur; rechts: berechnete Struktur, bei der nur die Guanidiniumgruppe des Arginins zur besseren Veranschaulichung abgebildet ist))[99]

Das Trisphosphonat konnte, um eine m‐Aminobenzyleinheit verlängert, als erster

künstlicher Rezeptor erfolgreich Arginin im Kontext der RGD‐Sequenz erkennen.

Die Aniliniumfunktion mit ihrer positiven Ladung fungiert dabei als Einrastpunkt

für das Aspartat.[54]


23

N

OHN

HH

HN

HN H

N

N N

N

N

H

OO

H O H

O

H

O

OO

OO

O

OP

H

HNH

OP

O

OO

Abb. 15: Der erste künstliche Rezeptor für die RGD‐Sequenz im Komplex mit KESSLERS Fibronectin‐Modell cyclo(RGDfV) als Lewis‐Struktur (links; Rezeptor in rot, das Peptid in blau) und als mit MacroModel 7.0 energieminimierte Struktur (rechts).[54] Der Rezeptor bindet das lineare RGD‐Tripeptid mit einer Bindungskonstante von

Ka = 1300 M‐1 und KESSLERS Fibronectin‐Modell cyclo(RGDfV) etwas schwächer mit

Ka = 700 M‐1. Da im Vergleich zu dem einfachen Trisphosphonat, welches gegen

cyclo(RGDfV) keinerlei Affinität in Wasser zeigt, die Bindung deutlich stärker ist,

kann man hier eine kooperative Bindung des Arginins und des Aspartats annehmen.

Allerdings fanden diese Bindungsexperimente in ungepufferter Lösung ohne

Fremdsalzzugabe statt, so daß zum einen noch keine Bindung unter physiologischen

Bedingungen erzielt wurde und zum anderen die Frage offen bleibt, inwiefern Säure‐

Base‐Gleichgewichte eine Rolle für die beobachteten Bindungen und Selektivitäten

spielen.

Phosphonate konnten von SCHRADER aber auch noch in anderen Systemen

erfolgreich zur Erkennung von Arginin eingesetzt werden. Ein am oberen Rand mit

vier Phosphonatgruppen versehenes Calix[4]aren bindet selektiv Arginin und konnte

in einem Membranmodell eingesetzt werden, um die Oberfläche basischer Proteine

zu erkennen.[100]

Multiplikation des einfachen benzylischen Bisphosphonatmotivs zu einem

wasserlöslichen Polymer verwandelt in einem weiteren Beispiel das in Wasser

praktisch nicht Arginin bindende, monomere Bisphosphonat durch multivalente

Wechselwirkungen in einen starken Proteinbinder. Sowohl in Lösung als auch

immobilisiert auf Glasoberflächen werden basische Proteine mit einer deutlichen

Selektivität für argininreiche Oberflächen fest gebunden.[101]


24

In weiteren Arbeiten von SCHRADER in Zusammenarbeit mit KLÄRNER wurde eine

wasserlösliche molekulare Pinzette mit zwei Phosphonatgruppen am zentralen

Hydrochinonbaustein hergestellt.[102] Als Gastprofil scheinen sich schlanke

Alkylkationen am besten zu eignen. Die N/C‐geschützten, basischen Aminosäuren

Arginin und Lysin werden selbst in gepufferter, wäßriger Lösung stark gebunden,

Lysin noch stärker als Arginin (s. Tab. folgende Seite). Abgesehen von Histidin,

welches ebenfalls eine schwache Affinität zeigt, binden andere Aminosäuren jedoch

nicht.

O

P

O

H3CO

P O

CH3

OLi+

Li+

Abb. 16: Molekulare Bisphosphonatpinzette von KLÄRNER und SCHRADER als Lewis‐Struktur (links), mit PM3 berechnete Struktur (mittig) und mit PM3 ermitteltes elektrostatisches Oberflächenpotential (rechts) Die rote Färbung indiziert die hohe Elektronendichte im Inneren der Pinzette.[102] Die Pinzette besitzt eine torusförmige, elektronenreiche Kavität. Die Seitenketten von

Lysin und Arginin schieben sich in diese Öffnung ein. Der resultierende Komplex

besitzt eine Pseudorotaxanstruktur. Dabei rasten die geladene Ammonium‐ bzw. die

Guanidiniumgruppe der Aminosäure durch Bildung einer Salzbrücke zu einem

Phosphonat an der Pinzette auf der einen Seite ein. Auf der gegenüberliegenden

Seite fungieren die Schutzgruppen der Aminosäuren als Stopper.

Mikrokalorimetrische Messungen zeigen, daß die Komplexbildung vorwiegend

enthalpisch getrieben ist.


25

Abb. 17: Energieminimierte Strukturen für die molekulare Bisphosphonatpinzette im Komplex mit Ac‐Lys‐OMe (links) und Tos‐Arg‐OEt (rechts). Die Aminosäuren sind jeweils als Kalottenmodell dargestellt. Als Puffer wurde ein Phosphatpuffer verwendet.[103] Auch in gepufferter wäßriger Lösung bleibt eine starke Bindung bestehen und selbst

in peptidischem Kontext werden die Seitenketten von Arginin und Lysin weiterhin

stark gebunden. Unter den getesteten Signalpeptiden befindet sich auch das lineare

RGD‐Peptid, welches eine starke Affinität in Wasser zu der Pinzette aufweist (s.

Tab.).

Ac-Lys-OMe Ka = 23000 M-1

Ac-Lys-OMe (25 mM Puffer pH 7)

Ka = 4339 M-1

Tos-Arg-OMe Ka = 7843 M-1

Tos-Arg-OMe (25 mM Puffer pH 7)

Ka = 1802 M-1

RGD (25 mM Puffer pH 7)

Ka = 1000 M-1

Durchführung und Ergebnisse

26

4 Durchführung und Ergebnisse

4.1 Beiträge zu einem neuen, künstlichen RGD‐Rezeptor analog RENSING

Ausgehend von dem ersten künstlichen Rezeptor für die RGD‐Sequenz von

SCHRADER und RENSING wurde zunächst versucht, eine Variante des bereits

vorgestellten Trisphosphonatrezeptors herzustellen, sowie Ausgangsmaterial für

eine Kupplung mit einem effektiveren Aspartatrezeptormodul zu gewinnen.[104]

O2, Co(II), ∆

25 %COOH COOMe

NBS, CCl4, ∆

30 %

HCl/MeOH

quant.COOMe

Br Br

COOMe

P PMeO

MeO

O O

OMeOMe

P(OMe3), ∆

quant.

COOH

P PMeO

MeO

O O

OMeOMeLiOH,

MeOH/H2O80 %

1

Schema 1: Reaktionsweg zum benzylischen Benzoesäurebisphosphonat 1.

Dazu wird Mesitylen mit Co(II)stearat als Katalysator mit Sauerstoff oxidiert. Die

entstehende Säure wird zur leichteren Aufarbeitung in einer späteren Stufe zunächst

mit HCl/MeOH verestert und anschließend die beiden übrigen benzylischen

Stellungen mit NBS in CCl4 einfach bromiert. Substitution der Bromide gegen

Phosphonsäuremethylester in einer Michaelis‐Arbuzov‐Reaktion und folgende

selektive Verseifung des Carbonsäuremethylesters mit Lithiumhydroxid führen zum

benzylischen Benzoesäurebisphosphonat 1, welches als Ausgangsprodukt in

Peptidkupplungsreaktionen eingesetzt werden kann.[105‐107]

Zum Beispiel läßt sich Aminomethylphosphonsäurediethylester (AMPE) in sehr

guten Ausbeuten mit 1 und T3P als Hilfsreagenz zum von RENSING entwickelten

Trisphosphonsäureester 2 verknüpfen (s. Schema folgende Seite).[99]


27

COOH

P PMeO

MeO

O O

OMeOMe

1

+ H2N PO

OEtOEt P P

MeOMeO

O O

OMeOMe

90 %

O NH

PO

OEtOEt

2

T3P

Schema 2: Peptidkupplung zum Trisphosphonsäureester 2.

Von RENSING konnten für die vorliegende Arbeit größere Mengen der beiden Spacer‐

Module 3a und 3b zur Verfügung gestellt werden, wobei lediglich das

metasubstituierte Aminobenzylbromid 3a von RENSING auch selbst erfolgreich zum

direkten Vorläufer 4a des künstlichen RGD‐Rezeptors umgesetzt werden konnte.

N

O

O

N

O

O

P PMeO

MeO

O O

OMeOMe

O N

PO

EtOEtO

3a 3b 4a

Br

Br N

O

O

Schema 3: Die zwei Aminobenzylbromid‐Spacer 3a und 3b und der Rezeptorvorläufer 4a.

Die Schlüsselreaktion, nämlich die Deprotonierung des Amid‐NHs des

Trisphosphonsäureesters 2 und die nukleophile Substitution des Bromids im

Spacermolekül mit diesem in situ generierten Anion, erwies sich zunächst bei 3b als

problematisch. Die von RENSING ausgearbeitete Vorgehensweise erzielte hier

praktisch keinen Umsatz. Erst ein fünffacher Überschuß führte zum neuen

Rezeptorvorläufer 4b.

P PMeO

MeO

O O

OMeOMe

O N

PO

EtOEtO

N

P PMeO

MeO

O O

OMeOMe

O NH

PO

OEtOEt

2

40 %NaH, 5 Äq. 3b, DMF

O

O4b Schema 4: Optimierte Reaktion zum neuen Rezeptorvorläufer 4b mit para‐Aminobenzyl‐Spacer.


28

Der neue Trisphosphonsäureester 4b kann anschließend mit LiBr quantitativ zum

Trilithiumphosphonat 5b verseift werden. Für die Funktion des Moleküls als RGD‐

Rezeptor ist zuletzt die Abspaltung der Phthalimidschutzgruppe notwendig, um

eine Aniliniumfunktion zu generieren, die sich als Ankerpunkt für die

Aspartatseitenkette des RGD‐Peptids eignet.

P PMeO

MeO

O O

OMeOMe

O N

PO

EtOEtO

N

90 %

LiBr, CH3CN, ∆

O

O4b

P PMeO

+Li-O

O O

O-Li+OMe

O N

PO

+Li-OEtO

N

O

O5b

P PMeO

+Li-O

O O

O-Li+OMe

O N

PO

+Li-OEtO

NH2

6bH2NNH2, EtOH

3d

Schema 5: Syntheseroute zur neuen RGD‐Rezeptorvariante 6b.

Leider ergab jedoch in mehreren Ansätzen die Entschützung mit Hydrazin ein

komplexes Produktgemisch, so daß diese neue Variante aufgrund der gravierenden

Verunreinigungen nicht auf ihre Eigenschaft als künstlicher Rezeptor für die RGD‐

Sequenz getestet werden konnte. Eine Aufreinigung des Rohproduktes mit

Extraktionsmethoden gelang nicht. Chromatographische Trennmethoden mit

Kieselgel oder Aluminiumoxid sind wegen des Salzcharakters des Zielprodukts

ausgeschlossen. Als Alternative schien es lohnenswert, die Phthalimidschutzgruppe

bereits auf der Stufe der noch vollständig veresterten Trisphosphonate 4a und 4b zu

entfernen, um so an die freie Aminofunktion einen geeigneteren Aspartatrezeptor als

die bereits vorhandene Aniliniumfunktion ankuppeln zu können.

Von der Arbeitsgruppe SCHMUCK wurde hierfür in einem Kooperationsprojekt die in

der Einleitung bereits besprochene Guanidiniumcarbonylpyrrolcarbonsäure 42 mit


29

Boc‐geschützter Guanidiniumfunktion zur Verfügung gestellt, die sich in einem

Peptidkupplungsprotokoll mit PyBOP mit Aminen verknüpfen läßt.[74]

NH

O O

HNHN

NH

HOO

O

42

Abb. 18: Guanidiniumcarbonylpyrrolcarbonsäure 42 von SCHMUCK als Aspartat‐erkennungsmodul. Doch auch ausgehend von 4a und 4b konnte die Phthalimidabspaltung nicht zu

einem definierten Produkt durchgeführt werden. Zwar läßt sich die neutrale

Verbindung säulenchromatographisch reinigen, aber 7a und 7b sind offensichtlich

sehr empfindliche Verbindungen. Das zuvor farblose Rohprodukt der Entschützung

färbt sich noch auf der Trennsäule rosa. RENSING hatte bereits die leichte Spaltbarkeit

der Benzylamidbindung beobachtet.[104] Ein weiteres Problem scheint die Präsenz der

Anilinfunktion neben den nukleophil spaltbaren Phosphonsäureestern im selben

Molekül zu sein. Vor allem spielt aber sicherlich die Oxidationsempfindlichkeit des

Moleküls eine große Rolle.

P PMeO

MeO

O O

OMeOMe

O N

PO

EtOEtO N

O

O4a,b 7a,b

H2NNH2, EtOH

3d

P PMeO

MeO

O O

OMeOMe

O N

PO

EtOEtO NH2

Schema 6: Abspaltung der Phthalimidschutzgruppe in 4a und 4b ist unpraktikabel.

Die Herstellung geeigneter Mengen von 7a und 7b erwies sich als extrem schwierig.

Zudem bietet das so verfolgte Konzept nur wenig weitere Variationsmöglichkeiten

im Hinblick auf eine spätere Optimierung der synthetisierten Rezeptoren. Die

Spacer‐Einheiten 3a und 3b sind selbst nur in mehrstufigen Synthesen zugänglich

und nur sehr aufwändig weiter anpaßbar. Der von RENSING eingeschlagene Weg zu

künstlichen RGD‐Rezeptoren wurde daher vollständig verlassen.


30

4.2 Ein neues Trisphosphonat zur Argininerkennung

4.2.1 Synthese

Es sollte nun eine geradlinige Syntheseroute zu einem leichter zugänglichen

Trisphosphonat für die Argininerkennung gesucht werden, das gleichzeitig eine

Aminogruppe als Anknüpfungspunkt für die Aspartatrezeptormodule der Gruppe

SCHMUCK besitzt.[108] Dabei sollte der Spacer zwischen den beiden Rezeptormodulen

idealerweise durch käufliche Substanzen leicht variiert werden können.

NH2

P

O

OMe

O-O

NH

P

P

O-

OMeO

O-

OMeO

HN

POOMe

OMeO

NH2

P

P

OMe

OMeO

OMe

OMeO

HO SG+

8 9 10

Schema 7: Retrosynthetische Analyse des neuen Trisphosphonats 8.

Die einfache Umkehr der Amidbindung in dem Trisphosphonat 2 von RENSING zu

dem neuen Trisphosphonat 8 stellt unter Beibehaltung der vollständigen Geometrie

des bekannten Rezeptormotivs eine solche Vereinfachung dar. Die retrosynthetische

Analyse des neuen Rezeptors führt zu dem anilinischen Bisphosphonsäureester 9,

welcher in der Gruppe SCHRADER von ARENDT zuvor bereits hergestellt worden war,

und dem Phosphonoglycinester 10.[109]

NO2

P PMeOMeO

OOMe

OMe

O

NO2

1) NBS, CCl4, ∆2) POMe3, ∆

30 %

NH2

P PMeOMeO

OOMe

OMe

OH2/Pd-C, MeOHquant.

11 9

Schema 8: Dreistufige Reaktionssequenz zum anilinischen Bisphosphonsäureester 9 ausgehend von Nitroxylol.

Ausgehend von 5‐m‐Nitroxylol kann in einer, im Rahmen dieser Arbeit optimierten,

dreistufigen Reaktionssequenz der Aminobisphosphonsäureester 9 aufgebaut

werden.[109] Zunächst werden die beiden benzylischen Stellungen des 5‐m‐Nitroxylol


31

radikalisch mit NBS in CCl4 bromiert. Auf eine mühsame und verlustreiche

Aufarbeitung kann an dieser Stelle verzichtet werden. Statt dessen folgt direkt die

Substitution der eingeführten Bromatome in einer Michaelis‐Arbuzov‐Reaktion mit

Trimethylphosphit. Nach der vergleichsweise einfachen säulenchromatographischen

Reinigung erhält man den Nitrobisphosphonsäureester 11 mit etwa 30 % Ausbeute

über die beiden ersten Stufen. Die folgende hydrogenolytische Reduktion der

Nitrogruppe zum Amin verläuft quantitativ mit Wasserstoff und Pd‐C als

heterogenem Katalysator. Die einzige problematische Stufe dieser Reaktionssequenz

liegt direkt am Anfang: Die radikalische Bromierung liefert zwar vorwiegend das

gewünschte Produkt, daneben aber auch alle anderen denkbaren, in Benzylstellung

bromierten Varianten, deren Auftrennung nicht ohne weiteren Ausbeuteverlust

möglich ist. Wesentlich günstiger ist der Verzicht auf die Aufreinigung, da die

Michaelis‐Arbuzov‐Reaktion nur an den einfach bromierten Spezies erfolgt, so daß

sich das Trennproblem hier auf nur noch zwei Moleküle reduziert, nämlich dem

gewünschten Produkt und dem monophosphorylierten, wesentlich unpolareren

Derivat.

Der N‐geschützte Phosphonoglycinester 10 läßt sich leicht aus dem käuflichen,

vollständig veresterten Derivat 12 herstellen. Unter Eiskühlung kann mit LiOH

selektiv der Carbonsäuremethylester in Anwesenheit der Phosphonsäuremethylester

verseift werden. Das gewünschte Produkt entsteht zu etwa 60 %. Zu 10 % wird

unproduktiv ein Phosphonsäureester verseift. Im übrigen Anteil verbleibt das Edukt

unverändert und kann wiedergewonnen werden. Die drei Derivate lassen sich

einfach und vollständig durch Extraktion voneinander trennen.

HN

PO OMeOMe

O

HOO

OHN

PO OMeOMe

O

MeOO

O LiOH, MeOH/H2O0 °C, 14 h60 %

12 10

Schema 9: Selektive Verseifung des käuflichen Phosphonoglycintrimethylesters 12.


32

Zur Zusammenführung der beiden Komponenten 9 und 10 wurden mehrere

Peptidkupplungsreagenzien (T3P, TBTU, HBTU, PyBOP) getestet. Lediglich das

Mukaiyama‐Reagenz ist in der Lage, die Amidknüpfung effektiv zu dem noch

vollständig geschützten Rezeptor 13 zu katalysieren.

NHZ

PO OMeOMe

O

HONH2

P PMeOMeO

OOMe

OMe

OMukaiyama

80 %+

HN

P PMeOMeO

OOMe

OMe

O

ZHN P

O

OMeOMe

O

LiBr, CH3CN, ∆

90 %

9 10 13

HN

P P+Li-OMeO

OO-Li+

OMe

O

ZHN P

O

OMeO-Li+

OHN

P P+Li-OMeO

OO-Li+

OMe

O

H2N P

O

OMeO-Li+

O

H2/Pd-C, MeOHquant.

14 15

Schema 10: Amidknüpfung zum Trisphosphonsäureester 13 und nachfolgende Entfernung der Schutzgruppen. Auch bei dem Rezeptorvorläufer 13 zeigt sich wieder die schon zuvor beobachtete

Tendenz, daß freie Aminogruppen in Gegenwart von Phosphonsäuredimethylestern

zur Zersetzung der Substanz führen. Hier konnte deutlich die nukleophile

Verseifung der Ester nach Freisetzung der Aminogruppe beobachtet werden. Auf

dem Weg zum Trisphosphonat 15 müssen daher zuerst die

Phosphonsäuredimethylester zu dem N‐geschützten Trisphosphonat 14 mit

Lithiumbromid einfach gespalten werden. Am Phosphonatsalz 14 kann dann

anschließend problemlos die Z‐Schutzgruppe hydrogenolytisch abgespalten werden.

Die bereits einfach anionischen Phosphonsäureester können von Aminen nicht mehr

weiter angegriffen werden.


33

4.2.2 Bindungsstudien

Mit dem Trisphosphonat 14 steht nun ein neues Rezeptormotiv für

Alkylguanidiniumgruppen bzw. die Aminosäure Arginin zur Verfügung. In NMR‐

Titrationsexperimenten in Methanol zeigt 14 eine Affinität von Ka = 1500 M‐1

gegenüber dem kleinen, einfach positiv geladenen Methylguanidiniumhydrochlorid

und Ka = 7.6 ∙ 105 M‐1 gegenüber dem zweifach positiv geladenen Argininmethylester.

Auftragungen der aus den Titrationen gewonnen Daten nach JOB ergeben in beiden

Fällen einen klaren Hinweis auf 1:1‐Komplexe.[110, 111]

Wie computergestützte Modelingrechnungen belegen, wird die Guanidiniumgruppe

von dem neuen Trisphosphonat in ganz ähnlicher Weise gebunden wie von dem

bereits beschriebenen Motiv von RENSING. Das positiv geladene, planare Kation

ordnet sich parallel zu dem Aromaten des Rezeptors an und wird von diesem durch

π‐Kation‐Wechselwirkungen stabilisiert. Die drei Phosphonatarme befinden sich

dann im optimalen Abstand, um durch drei Salzbrücken und ein Netzwerk von

Wasserstoffbrücken das Guanidiniumkation zu umklammern.


34

Titration von Methylguanidiniumhydrochlorid gegen Trisphosphonat 14

Äq. MeGUA0 1 2 3 4 5 6

∆δ

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14Job-Plot

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

0,1 0,3 0,5 0,7 0,9

Molenbruch χ

∆δ

∗ χ

OHN

O P

O

MeO OLiO

NH

P

P

LiOMeO

O

OLiMeO

O

vs.NH2Cl

HN

NH2

H

Titration von Argininmethylester gegen Trisphosphonat 14

Äq. Arginin

0 1 2 3 4 5 6

∆δ

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16Job-Plot

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,1 0,3 0,5 0,7 0,9

Molenbruch χ

∆δ

∗ χ

OHN

O P

O

MeO OLiO

NH

P

P

LiOMeO

O

OLiH3C

O

vs.

NH

NH2

NH2ClCOOMe

ClH3N

H

Abb. 18: NMR‐Titrationskurven in Methanol für Wirt 14 gegen Methylguanidiniumhydrochlorid und Argininmethylester, aus den Titrationsdaten gewonnene Auftragungen nach JOB und energieminimierte Darstellungen der Komplexe (MacroModel 7.2, MC 10K Schritte, Amber*, H2O).


35

Die enorme Steigerung der Bindungsstärke vom einfachen Guanidiniumkation zum

größeren Argininester läßt sich nur über die zweite positiv geladene Gruppe des

verwendeten Argininmethylesters erklären. Hier kann offensichtlich auch die

Aminogruppe der Aminosäure von einem der Phosphonatarme zusätzlich gegriffen

werden. Diese zusätzliche Bindungsstelle bewirkt hier eine dramatische Steigerung

um den Faktor 500 und macht das Trisphosphonat 14 zu einem ausgezeichneten,

neuen Rezeptormotiv für N‐terminale Arinine.

Damit ist der Komplex von 14 und Arginin stabil genug, um auch im wesentlich

kompetitiveren und polareren Wasser als Lösungsmittel zu bestehen.

Wiederholungen der NMR‐Titrationen in Wasser zeigen für den schwächeren

Methylguanidiniumkomplex erwartungsgemäß keine komplexinduzierten

Signallagenverschiebungen. Argininmethylester wird hingegen auch in Wasser mit

immerhin noch Ka = 140 M‐1 gebunden. Die starke Abnahme der Affinität in Wasser

deutet auf einen großen Beitrag elektrostatischer Wechselwirkungen zur Bindung

hin.

LM Ka [M‐1] ΔG [kJ/mol] Δδmax [ppm] 14 + MeGua MeOH 1500 M‐1 ± 24 % 18.1 0.142 ± 3 % 14 + MeGua H2O Keine Shifts Keine Shifts 14 + ArgOMe MeOH 7.6 ∙ 105 M‐1 ± 30 % 33.6 0.144 ± 1 % 14 + ArgOMe H2O 140 M‐1 ± 45 % 12.3 0.036 ± 22 % 15 + H‐RGD‐OH MeOH/H2O 3:1 95 M‐1 ± 18 % 11.3 0.334 ± 7 %

Tabelle 4: Ermittelte Bindungskonstanten für die Trisphosphonate 14 und 15. Die Ka‐Werte sind gemittelt über alle verfolgten Signale, Δδmax bezieht sich auf das jeweils am stärksten verschobene Signal.

Daraufhin wurde getestet, inwiefern das Trisphosphonat 15, bei dem im Vergleich zu

14 lediglich die Z‐Schutzgruppe zusätzlich entfernt wurde, Arginin auch im RGD‐

Peptid erkennen kann. 15 wurde verwendet, weil die darin frei liegende

Ammoniumgruppe (durch Zugabe von einem Äquivalent HCl zu 15 generiert)

gegebenenfalls eine zusätzliche Bindung zum Aspartat des Tripeptids aufbauen

kann. Die NMR‐Titration in einem Methanol‐Wasser‐Gemisch von 3:1 ergab eine

Bindung von Ka = 95 M‐1. Obwohl auch im linearen RGD‐Peptid die Aminogruppe


36

des Arginins frei liegt, ist die Bindung hier deutlich schwächer. Bei gesteigertem

Wassergehalt von 80 % des Lösungsmittelgemisches ist bereits keine Bindung mehr

durch NMR‐Titration detektierbar. Vermutlich stören die beiden negativen

Ladungen im Aspartat des RGD‐Peptides durch Abstoßung mit den ebenfalls

anionischen Phosphonaten die Bindung.

4.2.3 Verlängerung des Trisphosphonsäureesters 13

Wie im vorangehenden Kapitel bereits beschrieben, ist das aus dem vollständig

geschützten Trisphosphonsäureester 13 gebildete Z‐entschützte Produkt 16 in

Lösung nicht sehr stabil und daher ein Anknüpfen zusätzlicher Rezeptormodule

schwierig. Es konnte aber gezeigt werden, daß solche zusätzlichen Module alternativ

zuerst mit dem stabilen Phosphonoglycinamin 17 umgesetzt werden können. Nach

Verseifung des Carbonsäuremethylesters steht mit der Verbindung 19 nun ein neues,

verlängertes Phosphonat zur Verfügung, das mit dem Bisphosphonsäureester 9 zu

einem modifizierten Trisphosphonat umgesetzt werden kann.

NH3+TFA-

PO OMeOMe

O

MeOHN

PO OMeOMe

O

MeOO

O H2,Pd-C, MeOH1 Äq. TFAquant.

12 17 18

Z-Gly-OH, HCTU,Cl-HOBt, DIEA, DMF32 %

HNO

PO

OMeOMeO

COOMe

O

NHO

LiOH, MeOH/H2O0 °C50 %

HN

O P

O

MeO OMeO

O-Li+O NH

O

19

Schema 11: Z‐Entschützung des käuflichen Phosphonoglycintrimethylesters 12, folgende Verlängerung des Bausteins um ein Glycin und selektive Verseifung des Carbonsäureesters zum Diglycinbaustein 19.


37

4.3 Eine Serie von künstlichen RGD‐Rezeptoren auf Basis von

benzylischen Bisphosphonaten

4.3.1 Synthese

Wie zuvor bereits ausführlich diskutiert sind die Trisphosphonsäureester 7a und 7b

gar nicht, und der neue Trisphosphonsäureester 16 nur sehr eingeschränkt tauglich,

um über ihre freie Aminofunktion weitere Rezeptor‐ oder Spacer‐Module

anzuknüpfen. Daher wurde im Folgenden wieder ein um einen Phosphonatarm

reduziertes Argininrezeptormotiv verwendet.

P POMeO

OO

OMe

O

20

Tabelle 5: Bindungsstärke des einfachen benzylischen Bisphosphonats 20 gegenüber Methylguanidiniumhydrochlorid in Methanol im Vergleich zu Trisphosphonaten.[98, 99]

Das einfache benzylische Bisphosphonat 20 bindet Methylguanidiniumhydrochlorid

in Methanol bereits mit Ka = 800 M‐1.[98] Der dritte Phosphonatarm verdoppelt die

Bindungsstärke im Falle des Trisphosphonats 14 und vervierfacht sie im

Trisphosphonat 5a. Dennoch liegen alle diese Bindungsstärken insgesamt in

derselben Größenordnung.

Modulare Studien zum Aufbau von künstlichen Rezeptoren für die RGD‐Sequenz,

bestehend aus einem Argininrezeptormodul, einer variablen Spacer‐Gruppe und

einem Aspartatrezeptormodul, sollten daher auch ohne weiteres mit einem einfachen

benzylischen Bisphosphonat als Argininrezeptor möglich sein. Dieses weist bereits

eine ausreichende Bindungsstärke gegenüber Arginin auf, um die Auswirkungen

von Veränderungen in den übrigen beiden Rezeptormodulen zu untersuchen. Nach

Optimierung eines kompletten künstlichen RGD‐Rezeptors kann gegebenenfalls

wieder auf einen dritten Phosphonatarm zurückgegriffen werden, um die Affinität

des Rezeptors nochmals zu erhöhen.

Ka [M‐1] ΔG [kJ/mol]Bisphosphonat 20@MeGua 800 M‐1 16.6 kJ/molTrisphosphonat 14@MeGua 1500 M‐1 18.1 kJ/molTrisphosphonat 5a@MeGua 3500 M‐1 20.2 kJ/mol


38

Als Startpunkt für die Synthese wurde der Aminobisphosphonsäureester 9 gewählt,

der eine hinreichende Stabilität besitzt und an den sich beliebige Aminosäuren und

kurze Peptide in einer einfachen Peptidkupplungsreaktion anknüpfen lassen sollten.

NH2

P PMeOMeO

OOMe

OMe

O

9

HOOC-(AS)n-NH-SG

HN

P PMeOMeO

OOMe

OMe

O

(AS)n-NH-Z

O

HN

P PMeOMeO

OOMe

OMe

O

(AS)n-NH2

O

HN

P POMeO

OO

OMe

O

(AS)n-NH3+

O1) LiBr, CH3CN2) H2, Pd-C, MeOH3) H+

H 2, Pd-C, MeOH

Schema 12: Das Bisphosphonat 9 kann variabel mit Aminosäuren (AS) oder kurzen Peptiden als Spacer‐Modulen verknüpft werden. Entfernung der N‐terminalen Schutzgruppe ermöglicht die Anbindung weiterer Module, z.B. potenter Aspartatrezeptoren. Die Ammoniumfunktion kann aber auch bereits selbst als einfache Aspartaterkennungsgruppe in den so erhaltenen RGD‐Rezeptoren fungieren.

Die große Bandbreite an käuflichen Aminosäuren und auch Peptiden ermöglicht hier

eine leichte, auch kombinatorische Variation des Spacer‐Moduls. Gleichzeitig

ermöglichen Aminosäuren durch ihre Kopf‐Schwanz‐Verknüpfbarkeit jederzeit die

Verlängerung bereits erstellter Rezeptoren. Zuletzt kann die terminale

Aminofunktion des verwendeten Spacers in protonierter, kationischer Form als

einfache Rezeptoreinheit für die anionische Aspartatseitenkette fungieren. Alternativ

ist die Anbindung des bereits vorgestellten Aspartatrezeptors mit freier

Carbonsäurefunktion 42 von SCHMUCK in einer letzten Amidknüpfung möglich.[112]

Diesem Konzept folgend wurde eine systematische Reihe von Aminosäuren,

Dipeptiden und Tripeptiden an das Anilin 9 gekuppelt, wie der folgenden Tabelle 6

zu entnehmen ist.


39

# Aminosäure Ausb. # Dipeptid Ausb. # Tripeptid Ausb.21 Z‐Gly‐OH 75 % 22 Z‐GlyGly‐OH 82 % 23 Z‐GlyGlyGly‐OH 48 %24 Z‐Ala‐OH 39 % 25 Z‐Ala‐Ala‐OH 58 % 26 Z‐Gly‐Gly‐Ala‐OH 36 %‐ Z‐Val‐OH 0 % ‐ Z‐Val‐Val‐OH 0 % 27 Boc‐3ABz‐OH 60 % 28 Boc‐4ABz‐OH 79 % 29 Z‐Phe‐OH 24 % 30 Z‐Ser(tBu)‐OH 21 % 13 Z‐PGly‐OH 66 %

Tabelle 6: Mit dem Aminobisphosphonsäureester 9 durchgeführte Kupplungen mit Aminosäuren, Dipeptiden und Tripeptiden und die erzielten Ausbeuten (Abz: Aminobenzoesäure, PGly: Phosphonoglycinsäure). Für die Kupplungsreaktionen wurden zahlreiche Peptidkupplungsreagenzien

getestet, darunter T3P, TBTU, TCTU, HCTU, HATU, PyBOP, das Mukaiyama‐

Reagenz und ein Chlorenamin. Ein universell wirksames und effektives Hilfsreagenz

konnte dabei nicht identifiziert werden. Im Prinzip muß jede neue

Kupplungsreaktion trotz des stets gleich bleibenden Nukleophils 9 als neues System

betrachtet und neu optimiert werden. Einige der verwendeten Kupplungsreagenzien

erzielen für bestimmte Systeme außerordentlich gute Ausbeuten (insbesondere das

Mukaiyama‐Reagenz, T3P und das Chlorenamin), katalysieren andere Kupplungen

jedoch nur mäßig. Dagegen kuppeln die Reagenzien TBTU, TCTU und PyBOP in

Kombination mit 9 fast immer erfolgreich, allerdings nicht mit maximalen

Ausbeuten. Die hauptsächlichen Faktoren, die den Erfolg der vorliegenden

Amidkupplungen beeinflussen, sind die Polarität bzw. Löslichkeit und der sterische

Anspruch der zu kuppelnden Carbonsäuren. Die einzelnen Kupplungsprotokolle

sind dem experimentellen Teil dieser Arbeit zu entnehmen.

Die mit dem Bisphosphonat 9 verknüpften Aminosäuren und Peptide bilden die

Grundlage zur Synthese einer ersten Generation von kleinen, künstlichen RGD‐

Rezeptoren unter Variation des Spacer‐Moduls zwischen dem Arginin‐ und

Aspartatrezeptorbaustein. Dabei wurde durch die Anzahl der gekuppelten

Aminosäuren gezielt die Länge des angeknüpften Moduls variiert. Der Einbau von

Glycin oder alternativ Alanin ändert den sterischen Anspruch des Spacers. Die


40

Einführung noch raumfüllenderer Reste mit Valin bzw. Divalin gelang nicht; der

Unterschied im Raumanspruch zwischen Glycin und Alanin sollte aber bereits

ausreichend sein. Wie in den einführenden Kapiteln geschildert, können natürliche

Rezeptoren wie z.B. das Integrin α5β3 sehr gut zwischen diesen beiden Aminosäuren

unterscheiden.[42]

Die aromatischen Aminosäuren meta‐ und para‐Aminobenzoesäure stellen relativ

starre, rigide Module dar, während die ansonsten verwendeten Glycin‐ und Alanin‐

haltigen Spacer weitgehend flexibel und beweglich sind.

Mit Phenylalanin ließe sich der Einfluß aromatischer Gruppen in der

Rezeptorperipherie untersuchen. Serin wäre eventuell in der Lage, über die

zusätzliche Hydroxylgruppe Wasserstoffbrücken zum Rückgrat des RGD‐Peptids

auszubilden.

Zuletzt läßt sich durch das im vorhergehenden Kapitel bereits beschriebene

Kupplungsprodukt von 9 mit Phosphonoglycin der Einfluß eines dritten

Phosphonatarms auf die Bindung des RGD‐Tripeptids untersuchen.

Die in ausreichender Menge vorliegenden Kupplungsprodukte wurden nun zu neun

verschiedenen, einfachen Rezeptoren für die RGD‐Sequenz weiter umgesetzt. Dazu

erfolgte zuerst die einfache Verseifung der Phosphonsäureester mit LiBr in

Acetonitril und anschließend die hydrogenolytische bzw. saure Entfernung der

Schutzgruppen für die Aminofunktion. Falls notwendig wurde die Aminogruppe

zuletzt durch Zugabe von einem Äquivalent Salzsäure zur Ammoniumfunktion

protoniert.

Die Reihenfolge der Abspaltung der Schutzgruppen ist auch hier wieder von

essentieller Bedeutung. Nur wenn die Lithiumbromid‐Spaltung zuerst durchgeführt

wird, erhält man saubere Produkte in quantitativer Ausbeute.


41

4.3.2 Bindungsstudien mit den einfachen künstlichen RGD‐Rezeptoren auf Basis

des benzylischen Bisphosphonats 9

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

O HN

ONH

ONH3

+

Li+

Li+

Cl-NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

O HN

ONH3

+

Li+

Li+Cl-N

HP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

ONH3

+

Li+

Li+

Cl-

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

O HN

ONH

ONH3

+

Li+

Li+

Cl-NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

O HN

ONH3

+

Li+

Li+Cl-N

HP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

ONH3

+

Li+

Li+

Cl-

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

ONH3

+

Li+

Li+

Cl-

32: BP2--Gly-NH3+ 33: BP2--Gly-Gly-NH3

+ 34: BP2--Gly-Gly-Gly-NH3+

35: BP2--Ala-NH3+ 36: BP2--Ala-Ala-NH3

+ 37: BP2--Ala-Gly-Gly-NH3+

15: BP2--PGly--NH3+ 38: BP2--Gaba-NH3

+

PO OMe

O-Li+

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

ONH3

+

Li+

Li+

Cl-

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

O

Li+

Li+

Cl-NH3+

39: BP2--3ABz--NH3+

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

O

Li+

Li+ Cl-

40: BP2--4ABz--NH3+

NH3+

Abb. 19: Schematische Darstellung für das Konzept zum Aufbau künstlicher RGD‐Rezeptoren (r.u.) und 10 synthetisierte Varianten mit Kurzbezeichnungen. Dem Kreis‐Modul im Schema entspricht dabei das benzylische Bisphosphonat und dem Dreieck‐Modul die Ammoniumgruppe der hergestellten Rezeptoren. Dazwischen liegen variable, peptidische Spacer‐Module. (BP2‐Gaba‐NH3+ 38 wurde freundlicherweise von M. MAUE zur Verfügung gestellt.)

HNN

NNH

O

H O

H O

HNO

O

H2N NH2

R ---- G ---- D


42

Die zehn künstlichen RGD‐Rezeptoren in obiger Abbildung wurden mittels NMR‐

Titration gegen das lineare RGD‐Tripeptid auf ihre Bindungsstärke hin vermessen.

Alle Titrationen wurden in einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol‐d4 und

Wasser im Verhältnis 3:1 durchgeführt. In reinem Wasser zeigte keiner der zehn

Rezeptoren eine Bindung bei NMR‐gestützten Untersuchungen. Ein Vergleich der

Rezeptoren wäre in den unpolareren Lösungsmitteln Methanol oder DMSO wegen

der zu erwartenden höheren Bindungskonstanten leichter. In diesen Lösungsmitteln

löst sich das Gast‐Peptid jedoch nicht. Nur in Methanol‐Wasser‐Gemischen sind alle

Komponenten dagegen gut löslich und die besten Binder konnten bestimmt werden.

Die Ergebnisse der Titrationen sind in folgender Tabelle 7 zusammengefaßt:

AS‐Spacer Ka [M‐1] Dipeptid‐Spacer Ka [M‐1] Tripeptid‐Spacer Ka [M‐1] BP2‐Gly‐NH3+ 32

45 M‐1 ± 40 %

BP2‐GlyGly‐NH3+ 33

780 M‐1 ± 28 %

BP2‐GlyGlyGly‐NH3+

34 keine

SättigungBP2‐Ala‐NH3+

35 keine Shifts

BP2‐AlaAla‐NH3+

36 156 M‐1 ± 55 %

BP2‐AlaGlyGly‐NH3+

37 keine

SättigungBP2‐PGly‐‐NH3+

15 95 M‐1 ± 18 %

BP2‐Gaba‐NH3+

38 keine

Sättigung

BP2‐3Abz‐NH3+

39 keine Shifts

BP2‐4Abz‐NH3+

40 keine Shifts

Tabelle 7: Aus NMR‐Titrationen gewonnene Ergebnisse der Bindungsexperimente der Wirte 15 und 32‐40 gegen H‐RGD‐OH in Methanol/Wasser 3:1. Die Wirte sind spaltenweise nach der Länge der eingebauten Spacer sortiert (links eine, mittig zwei und rechts drei Aminosäuren). Die angegebene Bindungskonstante Ka ist das arithmetische Mittel, falls mehrere Protonen verfolgt werden konnten. Unter den getesteten Verbindungen zeigt die Verbindung 33 mit einem Diglycin‐

Spacer die stärkste Affinität zu H‐RGD‐OH. Deutlich dahinter folgt die Verbindung

36 mit einem Dialanin. Kurze Linker mit nur einer Aminosäure zeigen im Falle des

Glycins 32 und Phosphonoglycins 15 eine schwache Bindung. Andere gleichermaßen

kurze Linker wie das Alaninderivat 35 oder die beiden Aminobenzoesäurederivate

39 und 40 zeigen keinerlei Affinität zum RGD‐Peptid. Bei diesen letzten beiden

Verbindungen kommt als Problem der sehr niedrige pKs‐Wert (etwa 5) von Anilinen

hinzu.[113] In neutraler, ungepufferter wäßriger Lösung liegen Aniline praktisch


43

vollständig unprotoniert vor. Eine kooperative Bindung der Aspartatseitenkette ist

mit der neutralen Form der Aniline aber kaum möglich.

Linker mit drei Aminosäuren wie 34 und 37 weisen zwar minimale

komplexinduzierte Signallagenverschiebungen auf; diese ergeben jedoch keine

Sättigungskurve.

. RGD0 1 2 3 4 5 6 7

∆δ

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

BP2-GlyGly-NH3+ vs H-RGD-OH

H-RGD-OH vs BP2-Gaba-NH3+

. BP2-Gaba-NH3+0 1 2 3 4

∆δ

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

Abb. 19: Exemplarisch zwei NMR-Titrationskurven aus obiger Meßreihe. Links der beste Binder 33 mit Diglycin-Linker, rechts 38 mit γ‐Aminobuttersäure‐Linker, bei dem die Signale keine Sättigung aufweisen und daher nur eine extrem schwache Bindung vorliegt. Verbindung 38 mit einem γ‐Aminobuttersäure‐Spacer nimmt eine Sonderstellung

ein. Zwar besteht dieser Spacer nur aus einer Aminosäure, die Kettenlänge ist aber

eher mit den Dipeptid‐Linkern zu vergleichen. Zusätzlich besitzt die Alkylkette aber

maximale Flexibilität, während die Dipeptid‐Linker durch die zusätzliche

Amidbindung konformationell eingeschränkter sind. Auch hier tritt jedoch wieder

keine Sättigung auf.

Zusammenfassend lassen sich die Titrationsergebnisse dahingehend interpretieren,

daß die besten Modellrezeptoren einen Linker aus zwei Aminosäuren besitzen. Eine

einzelne Aminosäure führt zu schwacher Bindung. Bei Linkern mit drei

Aminosäuren bricht die Affinität dagegen fast vollständig ein. Auch die

Verwendung sehr flexibler Spacer wie in 38 führt trotz geeigneter Länge zum Verlust

der Bindung.


44

Abb. 20: Graphische Darstellung der Abhängigkeit der Bindungsstärke von der Spacer‐Länge. Sterisch anspruchsvollere Seitenketten stören die Bindung. Schon eine zusätzliche

Methylgruppe, wie sie beim Wechsel von Glycin nach Alanin vorliegt, verhindert bei

dem kurzen Ein‐Aminosäure‐Linker die Bindung vollständig. Beim Zwei‐

Aminosäure‐Spacer liegt dieselbe Tendenz vor: die Bindungsaffinität von 33 und 36

unterscheidet sich um den Faktor 7.

Wie erwartet bewirkt dagegen ein zusätzlicher Phosphonatarm beim Wechsel vom

Glycin zum Phosphonoglycin‐Linker eine Bindungsverstärkung, die mit einem

Faktor zwei allerdings moderat ausfällt. Der Einfluß der Spacer‐Länge ist deutlich

entscheidender für die Komplexstärke.

4.3.3 Kraftfeldrechnungen

Computergestützte Kraftfeldrechnungen veranschaulichen die in NMR‐Titrationen

gewonnen Ergebnisse. Dazu wurden die Komplexe zunächst durch

Energieminimierung vororientiert und anschließend mit Hilfe einer MonteCarlo‐

Rechnung die günstigste, absolute Konformation des Komplexes gesucht

(MacroModel 7.2, Amber*‐Kraftfeld, GB/SA Solvatationsmodell für Wasser).

Der berechnete Komplex aus dem RGD‐Tripeptid und dem besten Rezeptor BP2‐

GlyGly‐NH3+ 33 aus obiger Serie zeigt eine gute Komplementarität der beiden

Komplexpartner. Die Guanidiniumgruppe des Arginins weist schräg auf die beiden

0

200

400

600

800

1000

1200 Ka [M-1]

1 AS 2 AS 3 AS

32 (Gly)

15 (PGly)

36(AlaAla)

33(GlyGly)

34(GlyGlyGly)

37 (AlaGlyGly)


45

Phosphonatgruppen des Rezeptors und bildet zu diesen vier Wasserstoffbrücken

aus. Sowohl das Peptidrückgrat als auch der Rezeptor liegen in einer entspannten,

gestreckten Konformation vor, in der am anderen Ende ein Kontakt des Aspartat‐

Seitenkettencarboxylats mit der Ammoniumgruppe des Rezeptors besteht. Diese

Ammoniumgruppe bildet gleichzeitig Wasserstoffbrücken zu dem Carboxylat und

dem Arginin‐Carbonylsauerstoffatom aus. Eine weitere Wasserstoffbrücke kann von

einem Carbonylsauerstoffatom des Rezeptors zum N‐Terminus des Peptids

geschlagen werden. An der Bindung sind also nicht nur die beiden expliziten

Arginin‐ bzw. Aspartaterkennungsmotive des Rezeptors beteiligt, sondern auch das

Rückgrat des Peptids und die Spacer‐Gruppe des Rezeptors tragen positiv zur

Bindung bei.

Abb. 21: Der berechnete Komplex aus dem RGD‐Tripeptid und dem besten künstlichen Rezeptor BP2‐GlyGly‐NH3+ 33 (MonteCarlo, MacroModel 7.2, Amber*, H2O, 10000 Schritte).

Im direkten Vergleich dazu zeigt die computergenerierte Struktur von BP2‐AlaAla‐

NH3+ 36 (s. Abb. folgende Seite) im Komplex mit dem RGD‐Peptid eine Störung der

Bindung durch die zusätzlichen Methylgruppen im Rezeptor. Eine dieser beiden

Methylgruppen zeigt in Richtung des Liganden und verhindert so attraktive

Kontakte des Peptidrückgrats zum Rezeptor. Das Peptid muß sich um diese

Methylgruppe herum falten, um dem Rezeptor die beiden Seitenketten anzubieten.

Folglich ist bei gleicher Länge des Rezeptors im Vergleich zu 33 die Bindungsaffinität

dennoch deutlich schwächer.


46

Experimentell haben die Rezeptoren mit einer einzelnen Aminosäure als Linker nur

schwache Affinität gegenüber dem RGD‐Tripeptid gezeigt. Die berechneten

Komplexstrukturen weisen darauf hin, daß diese kurzen Rezeptoren die RGD‐

Sequenz nur in einer Konformation binden, in der die beiden Seitenketten von

Arginin und Aspartat eng benachbart stehen.

Abb. 22: Die Rezeptoren BP2‐AlaAla‐NH3+ 36 (links; zur Verdeutlichung des sterischen Anspruchs der Methylgruppen wurde ihr Oberflächenpotential transparent eingezeichnet) und BP2‐Gly‐NH3+ 32 (rechts) im Komplex mit dem RGD‐Peptid (MonteCarlo, MacroModel 7.2, Amber*, H2O, 5000 Schritte).

Abb. 23: Die Rezeptoren mit aromatischem Spacer BP2‐3ABz‐NH3+ 39 (links) und BP2‐4Abz‐NH3+ 40 (rechts) im Komplex mit dem RGD‐Peptid (MonteCarlo, MacroModel 7.2, Amber*, H2O, 10000 Schritte, Wasserstoffatome wurden zur Verbesserung der Übersicht teilweise entfernt).


47

4.4 Rezeptoren für die RGD‐Sequenz aus Bisphosphonat und

Guanidiniumcarbonylpyrrol

4.4.1 Synthese von BP2‐GlyGlyPyrGua+ 44

Da sich das Bisphosphonat mit einem Diglycin‐Linker 33 in der Testreihe der kurzen

Modellrezeptoren als bester Binder erwiesen hatte, wurde es ausgewählt, um mit

einem effektiveren Aspartatrezeptormodul verknüpft zu werden. Als

Aspartatrezeptor sollte das Guanidiniumcarbonylpyrrol 42 fungieren, das von

SCHMUCK und RUPPRECHT bereitgestellt wurde.

NH

O O

HNHN

NH

HOO

O

NH

PP OMeOMe

OMeO

MeO

O

O

HN

ONH

O

O

H2/Pd-C, MeOH HN

P PMeOMeO

OOMe

OMe

O

O

NH

ONH2

NH

P

P

OMeOMeO

OMeOMeO

O HNO

NH NH

O

O

HN NH

HN

PyBOP, NMM, DMF, 24 h

1) DCM/TFA2) HCl3) LiBr, CH3CN, ∆

HN

P P-OMeO

OO-

OMe

O

O

NH

OHN

HN

O

O

HN

NH2

+H2N

Li+

O

Oquant.

42

4344

22 41quant.

30 %

Schema 13: Synthese des neuen, künstlichen RGD‐Rezeptors 44.


48

Von BP2‐GlyGly‐Z 22 wurde dazu zunächst hydrogenolytisch die Z‐Schutzgruppe

abgespalten. Das Produkt 41 mit freier Aminogruppe weist im Gegensatz zu

ähnlichen Verbindungen mit Aminogruppen in Gegenwart von

Phosphonsäuredimethylestern eine hinreichende Stabilität auf, um weiter umgesetzt

zu werden. Frisch hergestelltes BP2‐GlyGly‐NH2 41 konnte so mit PyBOP an das

Guanidiniumcarbonylpyrrol 42 von SCHMUCK gekuppelt werden. Nach Entfernen

der Boc‐Schutzgruppe von der Guanidiniumfunktion mit Trifluoressigsäure,

anschließendem Umsalzen des Trifluoracetatsalzes mit Salzsäure und einfacher

Verseifung der Phosphonsäuredimethylester mit Lithiumbromid wurde der neue

künstliche RGD‐Rezeptor 44 erhalten. 44 ist bis in den millimolaren Bereich hinein in

Wasser gut löslich. In anderen Lösungsmitteln, auch polaren wie Methanol,

Acetonitril oder Dimethylsulfoxid löst es sich dagegen praktisch nicht.

4.4.1.1 Untersuchung von BP2‐GlyGlyPyrGua+ 44 auf Selbstassoziation

Der grundsätzliche Aufbau des Rezeptors 44 aus einem benzylischen Bisphosphonat

und dem Guanidiniumcarbonylpyrrol macht eine Untersuchung auf

Selbstassoziation notwendig, da sowohl der Bisphosphonatbaustein als Rezeptor für

die Acylguanidiniumfunktion agieren kann, als auch das

Guanidiniumcarbonylpyrrol für eine Phosphonatgruppe. Um diese Wechselwirkung

modellhaft zu untersuchen, wurde das Lithiumsalz des einfachsten Bisphosphonats

20 in einer Mischung von Wasser und DMSO (40/60) gegen das

Guanidiniumcarbonylpyrrol 45 getestet.

P POMeO

OO

OMe

O

20

NH

O O

NH HN NH2

NH2+ Cl-45

Abb 24: Das einfachste benzylische Bisphosphonat 20 und das Guanidiniumcarbonylpyrrol 45.

Die NMR‐Titration ergab eine Bindungskonstante Ka = 744 M‐1 ± 17 % und liegt damit

exakt bei der von SCHMUCK ermittelten Bindungsstärke von 45 gegenüber N‐

Acetylalanin im selben Lösungsmittelgemisch (Ka = 770 M‐1).[74] Carboxylate und


49

Bisphosphonate verhalten sich demnach gegenüber dem

Guanidiniumcarbonylpyrrol 45 ähnlich. Die zweite Phosphonatfunktion in 20

bewirkt interessanterweise keine Bindungsverstärkung. Beim Wechsel von

wäßrigem Dimethylsulfoxid als Lösungsmittel zu reinem Wasser sollte die Affinität

aber drastisch sinken und die potentiellen Wechselwirkungen der Rezeptormodule

einzeln miteinander vernachlässigbar sein. Bei ausreichend selbstkomplementärem

Aufbau könnten aber durch gleichzeitige, gegenseitige Erkennung der jeweiligen

Rezeptormodule in einer multivalenten Wechselwirkung dennoch stabile, dimere

Komplexe gebildet werden, die die Bindung eines RGD‐Liganden erschweren oder

sogar ganz verhindern.

Kraftfeldrechnungen zeigen, daß durchaus ein stabiler, dimerer Komplex aus zwei

Molekülen 44 denkbar ist. Allerdings liegt kein komplett zwitterartiger Komplex vor,

sondern das eine der beiden beteiligten Moleküle fungiert eher als

Oxoanionrezeptor, während das andere als Guanidiniumrezeptor wirkt (s. Abb.).

Jeweils eines der beiden Rezeptormodule ist also im Komplex weitgehend inaktiv.

Auch liegen im berechnete Komplex nicht die üblich angenommenen idealen

Bindungsmuster für die beiden Rezeptorbausteine vor. Die Muster sind leicht

verzerrt.

Abb. 25: Kraftfeldrechnung zur möglichen Selbstassoziation des RGD‐Rezeptors 44 (MacroModel 7.2, MonteCarlo, Wasser, Amber*, 5000 Schritte): der dimere Komplex in einer Seitenansicht (links) und mit Blick auf eine der Kopfgruppen (rechts). Wasserstoffatome wurden zur Verbesserung der Übersicht teilweise entfernt. Eines der beiden Moleküle ist violett eingefärbt.


50

Letztendlich lassen die Kraftfeldrechnungen die Fragen nach der möglichen

Selbstassoziation von 44 offen. Daher wurde mit verschiedenen experimentellen

Methoden dieser Frage nachgegangen:

Eine Verdünnungsreihe des Rezeptors 44 in Wasser zeigt mit UV/Vis‐

Spektroskopie ineares Absorptionsverhalten nach Lambert‐Beer.

Eine Verdünnungsreihe in Wasser im Bereich von 1∙10‐3 M‐1 bis 5∙10‐5 zeigt

keine Veränderung in den beobachteten chemischen Verschiebungen im 1H‐

NMR‐Spektrum.

1H‐NMR‐Spektren einer Probe bei variabler Temperatur von 5 °C bis 80 °C

zeigen ebenfalls keine Veränderung in den beobachteten chemischen

Verschiebungen.

Ein NOESY‐NMR‐Spektrum zeigt lediglich Kreuzpeaks für die erwarteten

intramolekularen Kontakte. Intermolekulare Kontakte der außen liegenden

Rezeptorteile sind nicht zu beobachten.

Die mikrokalorimetrische Messung der Verdünnung des Rezeptors 44 zeigt

eine normale, endotherme, lineare Abhängigkeit der Wärmetönung von der

Konzentration. Bei Selbstassoziation sollte diese asymptotisch verlaufen.

Zusammenfassend läßt sich daher sagen, daß mit verschiedenen spektroskopischen

und einem mikrokalorimetrischen Verfahren keinerlei Selbstassoziation des

Rezeptors 44 festgestellt werden konnte.

4.4.1.2 Bindungsstudien mit dem Rezeptor BP2‐GlyGlyPyrGua+ 44

Nachdem eine Selbstassoziation des Rezeptors 44 ausgeschlossen werden konnte,

wurde nun die Bindung des RGD‐Liganden untersucht. Dabei ist der niedrige pKS‐

Wert der Acetylguanidiniumfunktion von ca. 7.0‐7.5 zu berücksichtigen, der bewirkt,

daß der Rezeptor in Wasser bei neutralem pH‐Wert teilweise dissoziiert und

deprotoniert vorliegt. Zutitrieren peptidischer, meist leicht saurer Gäste führt dann

zu einem Protonentransfer vom Gast zum Rezeptor, der die spektroskopischen

Observablen der Titration stärker beeinflussen kann als die eigentliche Bindung. In


51

ungepufferter, wäßriger Lösung wurden sowohl in NMR‐ als auch in UV‐Titrationen

sowie in mikrokalorimetrischen Messungen zunächst Bindungskurven gefunden, die

allein auf diesen Protonentransfer zurückzuführen sind und fälschlicherweise eine

hohe Assoziationskonstante vorspiegeln. Um dieses Problem zu vermeiden, sollte

der Rezeptor 44 möglichst ausschließlich in gepufferter Lösung bei einem leicht

sauren pH‐Wert von 6.0‐6.5 auf Ligandenaffinitäten untersucht werden. Da Puffer

und Fremdsalze die Bindungsaffinität jedoch drastisch absenken können, wurden

zusätzlich auch Experimente in ungepufferter Lösung durchgeführt, bei denen die

Stammlösungen zuvor jeweils mit Hilfe einer pH‐Elektrode und Salzsäure auf den

selben leicht sauren pH‐Wert (ca. 6) eingestellt wurden. Dadurch ist während der

Titration bei minimaler Fremdsalzkonzentration ein Protonentransfer

ausgeschlossen.

In wäßriger Lösung mit einem niedrig konzentrierten Phosphatpuffer (3 mM) weist

der Rezeptor 44 eine Affinität von Ka ~ 200 M‐1 für das RGD‐Tripeptid auf. Erhöht

man die Pufferkonzentration auf 80 mmol/L, so ist keine Bindung NMR‐

spektroskopisch mehr nachzuweisen. Die Phosphatanionen des Puffers konkurrieren

offensichtlich mit der Carboxylatfunktion des Aspartats um das

Guanidiniumcarbonylpyrrol des Rezeptors und verhindern bei ausreichendem

Überschuß dessen Bindung.

NHP

P

O OMeO

OOMe

O

O HN

ONH HN

O

OHN

NH2H2N

44

H3NO

NH O

HN COO

COONH

H2N

NH2

H-RGD-OH

Abb. 26: Der berechnete Komplex von 44 mit dem violett hervorgehobenen H‐RGD‐OH (links: MonteCarlo, MacroModel 7.2, Amber*, H2O, 7000 Schritte, Wasserstoffatome sind für bessere Übersichtlichkeit teilweise nicht dargestellt) und die Lewis‐Formeln der beiden Moleküle (rechts).


52

Bei Verwendung eines anderen Puffersystems ohne Oxoanionen kann auch bei

höheren Pufferkonzentrationen noch eine ähnlich starke Bindung nachgewiesen

werden. So ergibt die NMR‐Titration desselben Systems in 40 mmol/L BisTris‐Puffer

die Bindungskonstante Ka = 230 M‐1 (BisTris = 2,2‐Bis(hydroxymethyl)‐2,2’,2’’‐

nitrilotriethanol).

In Kraftfeldrechnungen ergibt sich für die Komplexstruktur von 44 mit dem RGD‐

Peptid eine gute Komplementarität der beiden Partner. Die beiden Molekülketten

sind ineinander verschlungen; das Rückgrat des Peptids und der Wirtspacer haben

dabei intensiven Kontakt und werden durch intermolekulare Wasserstoffbrücken

zusätzlich stabilisiert. Das Bisphosphonat bindet die Arginin‐Guanidiniumgruppe

und simultan die terminale Ammoniumgruppe des RGD‐Peptids. Gleichzeitig

erkennt das Pyrrol‐Modul eines der beiden Carboxylate des Peptids.

4.4.1.3 Untersuchung auf Sequenzselektivitäten

Um die Sequenzselektivität des Rezeptors 44 überprüfen zu können, wurde in

automatisierter Festphasensynthese mit Standard‐Fmoc‐Protokoll an Wang‐ und Cl‐

Trt‐modifizierten Polystyrolharzen eine Serie von kleinen Peptiden aus je 3‐6

Aminosäuren hergestellt, die Arginin und Aspartat in unterschiedlichem Abstand,

Kontext und Reihenfolge enthalten.[114] Teilweise wurde auch eine der zu

erkennenden Aminosäuren ausgelassen.

Tripeptid Tetrapeptide Pentapeptide Hexapeptide+ H‐DGR‐OH H‐GRGG‐OH H‐GRGDG‐OH H‐GRGGDG‐OH H‐GRDG‐OH H‐GDGRG‐OH H‐RGGGDG‐OH H‐DGGR‐OH H‐GRADG‐OH H‐ARGDSG‐OH H‐GDGR‐OH H‐RGGDG‐OH H‐GARGDAG‐OH H‐GRGAG‐OH H‐GKGDG‐OH H‐DfVRG‐OH H‐GRGDS‐OH

Tabelle 8: In automatisierter Festphasensynthese an Wang‐ und Cl‐Trt‐modifizierten Polystyrolharzen mit Standard‐Fmoc‐Strategie hergestellte Peptide als Modellsubstanzen für künstliche RGD‐Rezeptoren.


53

Einige ausgewählte Peptide wurden in NMR‐Titrationen gegen den künstlichen

RGD‐Rezeptor 44 getestet. Die Ka‐Werte und die verwendeten Puffersysteme finden

sich zusammen mit den Titrationsergebnissen für das einfache RGD‐Peptid

vergleichend in nachfolgender Tabelle dargestellt. Bei Messungen ohne Puffer wurde

der pH‐Wert der Lösungen vorher genau auf 6.5 eingestellt.

Komplex Puffersystem pH‐Wert Ka [M‐1] 44 + RGD NaH2PO4/Na2HPO4 3 mM 6.5 190 M‐1 ± 24 % 44 + RGD NaH2PO4/Na2HPO4 80 mM 6.5 Keine Shifts 44 + RGD BisTris 40 mM 6.1 230 M‐1 ± 46 % 44 + GDGRG NaH2PO4/Na2HPO4 5 mM 6.5 180 M‐1 ± 23 % 44 + GRGDG NaH2PO4/Na2HPO4 6 mM 6.5 210 M‐1 ± 16 % 44 + DfVRG ‐ 6.5 350 M‐1 ± 15 % 44 + RGGDG ‐ 6.5 200 M‐1 ± 10 % 44 + GRGG ‐ 6.5 360 M‐1 ± 28 % 44 + GKGDG ‐ 6.5 Keine Shifts

Tabelle 9: In NMR‐Titrationen mit dem Rezeptor 44 ermittelte Bindungskonstanten für verschiedene lineare, peptidische Liganden in Wasser. Konnten mehrere Signale verfolgt und ausgewertet werden, so ist das angegebene Ka das arithmetische Mittel. Die angegebenen Fehler ergeben sich aus der Standardabweichung der Regressionsanalyse. Es zeigt sich, daß die Bindungsaffinitäten unabhängig von der exakten

Aminosäuresequenz alle im Bereich von 200 bis etwa 400 M‐1 liegen. Dabei sind

allerdings die in Puffer ermittelten Bindungskonstanten etwas höher zu bewerten, da

in gepufferter Lösung die Ionenstärken geringer sind. Der Rezeptor ist noch nicht in

der Lage, sehr ähnliche Sequenzen zu differenzieren. Zwischen Arginin und

Aspartat können ohne Affinitätsverlust auch zwei andere Aminosäuren liegen.

Aspartat darf sogar gegen ein C‐terminales Glycin substituiert werden. Wie auch

schon in der computergenerierten Komplexstruktur für 44 mit H‐RGD‐OH zu sehen

ist, kann der Rezeptor nicht zwischen dem Aspartat‐Seitenkettencarboxylat und

einem C‐terminalen Carboxylat in ähnlicher Entfernung unterscheiden.

Erfreulicherweise deutet die vollständig fehlende Bindung von H‐GKGDG‐OH an 44

allerdings darauf hin, daß ein Arginin essentiell notwendig ist und der Austausch

gegen das ebenfalls basische Lysin zum vollständigen Verlust der Bindung führt.

Dies ist ein Hinweis darauf, daß tatsächlich beide Erkennungsmodule des Rezeptors


54

kooperativ an der Bindung beteiligt sind und nicht nur ein Carboxylat vom

Guanidiniumcarbonylpyrrol gebunden wird.

4.4.2 Synthese und Bindungseigenschaften von BP2‐GlyPyrGua+ 47

Ganz analog zur Synthese des künstlichen RGD‐Rezeptors 44 wurde das um ein

Glycin kürzere Derivat 47 ausgehend von dem benzylischen Bisphosphonsäureester

21 hergestellt.

NH

PP OMeOMe

OMeO

MeO

O 1) H2/Pd-C, MeOH2) 42, PyBOP, NMM, DMF, 24 h

NH

P

P

MeO OMe

O

OMe

OMe

O

OHN

NH

O

HN

NH1) DCM/TFA2) HCl3) LiBr, CH3CNquant.

4621

28 %O

ZHNNHBocO

NHP

P

-O OMeO

OMeO-

O

O HN N

H

O

HNNH2

+

NH2

O

Li+

47

Schema 14: Die Synthese des kürzeren RGD‐Rezeptors 47 mit einem Glycin als Spacer gelingt analog zu der Synthese von 44 mit Diglycin‐Linker.

In NMR‐Titrationen ließ sich keine Affinität des Derivats 47 gegenüber dem RGD‐

Tripeptid feststellen. Im Computermodeling zeigt sich für 47 noch deutlicher

dieselbe Tendenz, die sich schon bei der Reihe von Bisphosphonatrezeptoren mit

Ammoniumgruppe als Aspartatrezeptor abzeichnete: ein einzelnes Glycin ist als

Spacer zu kurz. In der berechneten Struktur kommt eine Bindung nur dadurch

zustande, daß sich die Arginin‐Seitenkette eng an das Peptidrückgrat heran faltet (s.

Abb. folgende Seite).


55

HN

P

P

OOMe

O

O OMeO

NH HN

O

OHN

NH2H2N

47

H3NO

NH O

HN COO

COO

NH2H2N

H-RGD-OH

ONH

Abb. 27: Der berechnete Komplex von 47 mit dem RGD‐Peptid (links: MonteCarlo, MacroModel 7.2, Amber*, H2O, 5000 Schritte) und die Lewis‐Formeln der beiden Komplexpartner (rechts). Neben der ungünstigeren sterischen Architektur von BP+2‐GlyPyrGua+ 47 im

Vergleich zum längeren BP2‐GlyGlyPyrGua+ 44 kommt bei 47 noch als zusätzlicher

Faktor eine meßbare Selbstassoziation hinzu. Dies wird bereits in

Kraftfeldrechnungen sehr anschaulich.

Abb. 28: Der berechnete Komplexe eines Dimers aus zwei Molekülen 47 aus zwei verschiedenen Blickwinkeln betrachtet (links: MonteCarlo, MacroModel 7.2, Amber*, H2O, 8000 Schritte) und die Lewis‐Formel des Komplexes (rechts). Der Rezeptor 47 kann sich wegen seiner vielen sp2‐Zentren in einer fast vollständig

planaren, gestreckten Konformation anordnen, bei der nur die beiden Phosphonate

aus der Ebene herausragen, jeweils eines nach oben, eines nach unten. Zwei

Moleküle 47 können sich dann genau parallel zueinander ausrichten und ein stabiles

Dimer ausbilden. Die Guanidiniumgruppen werden im Komplex wechselseitig

HN

P

P

OHOMe

O

O OMeO

NHO

O HN

NH

O

NH

NH2

HN

P

P

HOMeO

O

OMeOO

NH O

OHN

NH

O

HN

H2N

47@47


56

durch ein benzylisches Phosphonat des Partners gebunden. Prinzipiell sind in dieser

Stapelung auch noch höhere Aggregate denkbar.

Im Experiment sind bei Verdünnung einer in Wasser gelösten Probe von 47 im 1H‐

NMR‐Spektrum Signalverschiebungen zu beobachten. Trägt man den Logarithmus

der Konzentration gegen die Änderung der beobachteten Signale auf, so läßt sich aus

dieser Kurve eine Assoziationskonstante berechnen. Im konkreten Fall ergeben die

Meßwerte für 47 eine Selbstassoziationskonstante zwischen 200 und 700 M‐1, je nach

verfolgtem Signal, mit allerdings recht hohen statistischen Fehlern von etwa 65 %.

log c-4 -3 -2

∆δ

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

Abb. 29: NMR‐Verdünnungsreihe des Rezeptors BP2‐GlyPyrGua+ 47 in D2O zur Ermittlung der Selbstassoziationskonstante Kass ~ 330 M‐1 ± 65 % (arithmetisches Mittel). Der große statistische Fehler wird zum einen durch die sehr kleinen

Signalverschiebungen verursacht, zum andern können höhere Aggregate nicht

ausgeschlossen werden. Die Selbstassoziation liegt in der selben Größenordnung wie

die Bindungsaffinität des RGD‐Peptids zum verwandten Rezeptor 44. Da diese

zunächst aufgebrochen werden muß, bevor ein anderer Ligand gebunden werden

kann, erklärt dies zusammen mit der ungünstigen Rezeptorgeometrie die fehlende

Affinität des Rezeptors 47 gegenüber dem RGD‐Peptid.


57

4.4.3 Synthese und Bindungseigenschaften von BP2‐ASER‐PyrGua+ 49

Aus dem von der Arbeitsgruppe SCHMUCK zur Verfügung gestellten

Argininanalogon 48 und dem Benzoesäurebisphosphonsäureester 1 konnte in 51 %

Gesamtausbeute ein drittes Derivat mit Bisphosphonat‐Modul, Aminosäure‐Linker

und Guanidiniumcarbonylpyrrol‐Gruppe synthetisiert werden. Zwar besteht auch

hier der Spacer zwischen den beiden Erkennungsgruppen nur aus einer einzelnen

Aminosäure (einem nicht proteinogenen Azaserin), doch verändert der C‐2 Linker

mit Chiralitätszentrum deutlich die Gesamtgeometrie des Rezeptors. Er

unterscheidet sich daher wesentlich vom gleich langen Rezeptor 47 mit Glycin‐

Linker. Das stereogene Zentrum und die sperrige Methylestergruppe induzieren

einen Knick im Molekül, so daß Selbstassoziation wie in 47 nicht mehr möglich ist

(vgl. Kraftfeldrechnung folgende Seite). Folglich finden sich auch in einer

Verdünnungsreihe des Rezeptors 49 im NMR‐Spektrum keine

verdünnungsabhängigen Signalverschiebungen.

1) PyBOP, NMM, DMF, 15 h2) DCM/TFA3) LiBr, CH3CN, ∆, 12 h4) HCl

COOH

P PMeO

MeO

O O

OMeOMeMeO

O

NH2HN

ONH

HN

O

BocHN

NH

+

51%

MeO O

NH

P

P

O-O

MeO

-O

MeO

O

OHN

ONH

HN

O

+H3N

HNLi+

48 1

49

Schema 15: Die Synthese des RGD‐Rezeptors 49 mit einem Azaserin als Spacer verläuft ähnlich wie die Synthesen von 44 und 47.


58

Nachdem eine Selbstassoziation für diesen Rezeptor 49 nicht nachgewiesen werden

konnte, wurde in einer NMR‐Titration seine Affinität gegenüber dem RGD‐Peptid

untersucht. In wäßriger, gepufferter Lösung (11 mmol/L BisTris‐Puffer, pH 6.3)

ergibt sich eine Bindungskonstante Ka = 280 M‐1.

vs.

HN

NH2+H2N

+H3NO

NH O

HN COO-

COO-

OMeO

HN

P

P

-O OOMe

O-

OMe

O

ONH

OHN

HN

O

NH3+

NH

49

H-RGD-OH

Abb. 30: Die NMR‐Titration des RGD‐Rezeptors 49 gegen H‐RGD‐OH in D2O (BisTris‐Puffer 11 mM, pH 6.3) ergibt eine Bindungskonstante Ka = 276 ± 23 % (Verfolgt wurden die C‐H Protonen des Pyrrol). Damit bindet 49 das RGD‐Peptid in etwa gleicher Stärke wie der Rezeptor 44.

Abb. 31: Der mit Kraftfeldrechnungen modellierte Komplex von 49 mit dem violett hervorgehobenen Tripeptid H‐RGD‐OH (MonteCarlo, MacroModel 7.2, Amber*, H2O, 10000 Schritte, Wasserstoffatome sind zur besseren Übersicht teilweise nicht dargestellt). Der verwendete Azaserinlinker bewirkt einen Knick im Rezeptor, so daß die beiden verknüpften Rezeptormodule direkt übereinanderliegen.

. RGD0 2 4 6 8

∆δ

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035


59

4.5 Molekulare Pinzetten

4.5.1 Das Grundgerüst

Da die bisher geschilderten Ansätze zur Entwicklung von künstlichen Rezeptoren

für die RGD‐Sequenz keine überzeugenden Bindungsaffinitäten erzielt haben, wurde

ein neues Konzept gesucht. 2004 wurde von FOKKENS eine wasserlösliche

Bisphosphonatpinzette hergestellt, die auf einem Grundgerüst von KLÄRNER

basiert.[115] Diese bindet Arginin in wäßriger, gepufferter Lösung im submillimolaren

KD‐Bereich und damit wesentlich stärker als die in dieser Arbeit bisher verwendeten

Bis‐ und Trisphosphonate. In der Gruppe von KLÄRNER wurde wenig später auch

noch eine analoge Bisphosphatpinzette synthetisiert. Es liegt daher nahe, einen

modularen RGD‐Rezeptor mit einer solchen Pinzette als Argininerkennungsmodul

zu konstruieren.

O

O

PMe

-O

O

Li+

PO

R1 RR1 = Me, OMe, O-

R+ = O-Linker-NH3+, O-Linker-PyrGua+

Abb. 31: Erstes Konzept für ein RGD‐Rezeptor‐Design, das eine Bisphosph(on)at‐Pinzette als Argininerkennungsmodul und eine Ammoniumgruppe oder das Guanidiniumcarbonylpyrrol von SCHMUCK als Aspartaterkennungsmodul besitzt. Das in dieser Arbeit bisher verwendete grundlegende Rezeptordesign, bestehend aus

zwei Modulen zur Arginin‐ und Aspartaterkennung sowie einem verknüpfenden

Linker soll beibehalten werden. Der Linker mit dem Aspartaterkennungsmodul

könnte als Alkohole über eines der Phosphonate bzw. Phosphate mit der Pinzette

esterartig verknüpft werden. Im Falle der Bisphosphonatpinzette würde dies für das

Rezeptormolekül allerdings den Verlust einer negativen Ladung bedeuten. Nur

Bisphosphatpinzetten könnten auf diesem Weg weiterhin als Dianion vorliegen. Die

Notwendigkeit zweier negativer Ladungen ergibt sich aus den Arbeiten von

FOKKENS allerdings nicht. Komplexstrukturuntersuchungen deuten lediglich darauf


60

hin, daß mindestens ein Phosphonatanion als Einrastpunkt für die positiv geladenen

Seitenketten von Liganden wie Arginin oder Lysin gebraucht wird.

Um eine bessere Löslichkeit in Wasser zu erzielen, wären mehrere negative

Ladungen im Pinzetten‐Modul jedoch äußerst förderlich, zumal eine negative

Ladung durch ein vorgesehenes Kation im Aspartaterkennungsmodul wieder

ausgeglichen wird. Zwitterionische Strukturen vermindern generell die Löslichkeit

in Wasser.

Synthesen zur Phosphorylierung der molekularen Pinzetten gehen von dem

Hydrochinonsystem 50 aus. In der von FOKKENS etablierten Synthese der

Bisphosphonatpinzette wird 50 mit Methylphosphonsäuredichlorid umgesetzt und

anschließend mit einem großen Überschuß Methanol vollständig verestert. Die

Phosphonsäuremethylester können anschließend mit Lithiumbromid selektiv wieder

gespalten werden, um die Bisphosphonatpinzette quantitativ in ihr Dilithiumsalz zu

überführen.[102, 103] Die Bisphosphatpinzette wird ähnlich hergestellt, nämlich über die

Umsetzung von 50 mit Phosphorylchlorid und anschließendem Abfangen des

Intermediats mit einem großen Überschuß Wasser.

4.5.2 Entwicklung von Synthesemethoden zur einseitigen Funktionalisierung der

molekularen Pinzette

Zur Erprobung und Optimierung von neuen Syntheserouten zu substituierten

Bisphosphat‐ und Bisphosphonatpinzetten wurde zunächst das verkürzte

Hydrochinongerüst 51 als Modell verwendet (s. Abb. folgende Seite). Dieses ist

synthetisch deutlich leichter und in größeren Mengen zugänglich als das

vollständige Pinzettengrundgerüst 50, besitzt aber dieselben funktionellen Gruppen.


61

OH

OH

OH

OH

1. NEt3, POCl32. 1-2 Äq. R-OH

1. NEt3, MePOCl22. 1-2 Äq. R-OH

1. NEt3, MeOPOCl22. 1-2 Äq. R-OH

1. NEt3, MePOCl22. großer Überschuß MeOH

O

OP

PMe

MeO

O

Me OMe

O

R-OH = H2O, MeOH, PrOH, Boc-N-Et-OH, Z-N-Pr-OHLM: THF, DCM, Benzol; 0 °C < T < Reflux

50

51

Abb. 32: Ungeeignete Syntheserouten mit dem verkürzten Pinzettengerüst 51. Sämtliche Syntheseversuche, das Hydrochinonsystem 51 zunächst mit

Säurechloriden der Phosphorsäure oder Methylphosphonsäure zu phosphorylieren

und anschließend mit äquimolaren Mengen aliphatischer Alkohole vollständig zu

verestern, schlugen fehl. Die verwendeten Alkohole bestanden aus kurzen

Alkylketten (C2‐ und C3‐Bausteine) mit einer Boc‐ oder Z‐geschützten

Aminofunktion an dem der Hydroxylgruppe gegenüberliegenden Molekülende.

Aber auch kleine, einfache Alkohole wie Propanol oder Methanol und sogar Wasser

führten bei äquimolarer Zugabe oder leichtem Überschuß bis zehn Äquivalenten

nicht zu den gewünschten Phosphor‐ und Phosphonsäureestern, sondern zu nicht

trennbaren, komplexen Gemischen. Um eine praktikable Synthesemethode zu

entwickeln, wurden verschiedene absolutierte Lösungsmittel (THF, DCM, Benzol)

mit den genannten Bedingungen getestet. Auch die Reaktionstemperatur wurde

systematisch zwischen Eiskühlung und Reflux‐Temperatur des jeweiligen

Lösungsmittels variiert. Dennoch wurden nie einheitliche Produkte erhalten.

Die Problematik dieser Reaktionen wurde schließlich mit einem einfachen

Testsystem untersucht: Selbst wenn man Phosphorsäuretrichlorid oder

Methylphosphonsäuredichlorid in absolutem THF bei Raumtemperatur mit jeweils


62

zwei Äquivalenten Methanol unter Zugabe einer Base für 24 Stunden rührt, erhält

man nicht die erwarteten Ester.

R-OH +

PCl

Cl Cl

O

PCl

MeO Cl

O

PCl

Me Cl

O

NEt3

PCl

RO OR

O

PCl

MeO OR

O

PCl

Me OR

O

1 Äq. R-OH

Schema. 16: Die bei der Reaktion von Alkoholen mit Säurechloriden der Phosphor‐ und Methylphosphonsäure entstehenden Intermediate sind zu stabil, um in stöchiometrisch geführten Reaktionen weiter umgesetzt werden zu können. Die intermediär entstehenden Säurechloride sind offensichtlich verhältnismäßig

stabil und können nicht mehr ohne weiteres substituiert werden. Erst wenn man sehr

reaktive Partner wie Methanol oder Wasser in äußerst großem Überschuß (100 –

1000fach) hinzugibt, wird auch das letzte Chlorid am Phosphor(V) substituiert.

Daraufhin mußte das Pinzettendesign angepaßt werden. Unter Verzicht auf die

zweite Phosphonatgruppe am Rezeptor konnten am Modellsystem 51 eine Reihe

wichtiger Reaktionen durchgeführt werden, die das Hydrochinonsystem auf der

einen Seite mit geeigneten aminosubstituierten Linkern verlängern und auf der

anderen Seite immer noch die Phosphorylierung erlauben.

Eine grundlegende Umsetzung ist die einfache Phosphorylierung des

Hydrochinonsystems 51 zum Methylphosphonsäureester 52 mit exakt einem

Äquivalent Methylphosphonsäuredichlorid. Diese Reaktion verläuft mit 60 %

Ausbeute zufriedenstellend, ermöglicht aber vor allem im Folgenden, die zweite

Hydroxylgruppe zielgerichtet zu funktionalisieren. Auch am kompletten

Pinzettengerüst 50 konnte diese einfache Phosphorylierung mit gleicher Ausbeute

erfolgreich durchgeführt werden.


63

OH

OH

OH

O

NH

OO

O

OH

PMe

MeO

O

OH

O O

NH

OO

R1

R1 = H, Me, iPr

OH

O

OHNR2

R2 = Ala, Ser

Boc-AS-OHDCM, DIEA, DIC90 %

DCM, KI, K2CO3Boc-NH-Et-Br, 70 %

Aceton, KI, K2CO390 %

1) MePOCl2, NEt32) MeOH60 %

BrO

NHR2

51

52

53

54a,b

55a,b

Schema 17: An dem verkürzten Pinzettengerüst 51 neu etablierte Synthesen. Eine weitere mögliche Reaktion ist eine Veretherung nach WILLIAMSON an einer der

beiden Hydroxylgruppen von 51.[116] Diese gelingt mit einem Boc‐geschützten 2‐

Bromethylamin und man erhält mit 70 %iger Ausbeute den Ether 53. Allerdings

konnte diese Reaktion bisher nicht auf die Dihydroxypinzette 50 übertragen werden.

Besser verlaufen ähnliche Synthesevarianten unter FINKELSTEIN‐Bedingungen mit

aktiveren Bromessigsäurederivaten.[117] In der Gruppe KLÄRNER wurden solche

Reaktionen bereits sehr erfolgreich zur symmetrischen Umsetzung von Pinzetten

und Klammern an beiden Hydroxylgruppen des Hydrochinonsystems verwendet.[118]

Am Testsystem 51 konnte nun gezeigt werden, daß auch Bromessigsäureamide

verwendbar sind. Die einseitige Umsetzung ist ebenfalls gut möglich. Mit 90 %

Ausbeute konnten auf diese Weise die Ether 54a aus Bromacetylalanin 56 und 54b

aus tert‐Butylether‐geschütztem Bromacetylserin 57 dargestellt werden. Diese


64

Reaktionen sind vollständig auf die komplette Pinzette 50 übertragbar. Als

problematischer hat sich hier die Synthese der benötigten Bromessigsäureamide

erwiesen. Bromacetylalanin 56 kann leicht mit Bromacetylchlorid hergestellt werden.

O‐tBu‐Serinmethylester reagierte dagegen nicht mit dem Säurechlorid. Statt dessen

war hier jedoch eine Peptidkupplung mit Bromessigsäure und dem Chlorenamin ‐

Kupplungsreagenz in fast quantitativer Ausbeute erfolgreich. Mit mäßiger Ausbeute

reagierte auch das interessantere Argininanalogon 48 von SCHMUCK mit

Bromessigsäure und dem Chlorenamin als Hilfsreagenz zum Bromessigsäureamid

58. In einem ersten Versuch konnte 58 bisher leider nicht an das Pinzettengerüst 50

kovalent angefügt werden.

NH

O

OONH2

O

OO

BrBr

Cl+

NH

O

OMeONH2

O

OMeO

BrBr

OH+

Chlorenamin, Py

OtBuOtBu

56

57

NEt3, DMAP

90 %

OBr

OH

+ Chlorenamin, Py 58OMeO

H2N HN

ONH

HN

O

NHBoc

NH

OMeO

HN HN

ONH

HN

O

NHBoc

NHOBr48

27 %

33 %

Schema 18: Synthese der Bromessigsäureamide 56, 57 und 58 als Edukte für WILLIAMSON‐Ethersynthesen. Einige andere Amine konnten dagegen gar nicht zum Bromessigsäureamid

umgesetzt werden. Bromessigsäure reagiert z.B. nicht mit dem

Aminobisphosphonsäureester 9, auch nicht mit zahlreichen, anderen gängigen

Kupplungsmethoden.


65

4.5.3 Synthese der ersten, asymmetrisch funktionalisierten Phosphonatpinzetten

Als letzte neu etablierte Synthesemethode zur einseitigen Funktionalisierung der

Hydrochinonsysteme 50 und 51 soll nun auf Veresterungen eingegangen werden.

Zuerst gelangen diese mit Boc‐geschütztem Glycin und Valin, welche mit Hilfe des

Kupplungsreagenzes DIC in ausgezeichneten Ausbeuten (ca. 90 %) zu den Estern 55a

und 55b reagierten. DIC erwies sich aber als vollkommen ungeeignet, um dieselben

Veresterungen am vollständigen Pinzettengerüst 50 durchzuführen.

OH

O O

NH

OO

55a 55b

OH

O O

NH

OO

Abb. 33: Die einseitig mit Aminosäuren veresterten Pinzetten‐Brückenköpfe 55a und 55b. Spätestens hier wird deutlich, daß das verkürzte Hydrochinongerüst 51 nur sehr

bedingt als synthetisches Modell für das vollständige Pinzettengerüst 50 dienen

kann. Es wurden mehrere Synthesemethoden entwickelt, die zwar am Brückenkopf

51 problemlos eingesetzt werden können, mit der Pinzette 50 aber trotz derselben

funktionellen Gruppen und derselben chemischen Umgebung gar nicht oder nur

sehr eingeschränkt durchführbar sind. Allen diesen Reaktionen ist gemein, daß eine

Hydroxylgruppe bzw. ein daraus gebildetes Phenolatanion als Nukleophil fungiert.

Die Pinzettenseitenwände in der Pinzette 50 schirmen die beiden Hydroxylgruppen

sterisch offenbar so stark ab, so daß ein nukleophiler Angriff an sperrige Substrate

wesentlich erschwert wird.

Der Durchbruch gelang schließlich mit dem Kupplungsreagenz PyBOP bei erhöhten

Reaktionstemperaturen und ‐zeiten, die bei Peptidknüpfungen mit diesem

Hilfsreagenz unüblich sind. Bei 40 °C und langen Reaktionszeiten von 3‐4 Tagen

konnten so Glycin, die SCHMUCKsche Guanidiniumcarbonylpyrrolcarbonsäure 42


66

und eine um ein Glycin verlängerte Variante von 42 mit der Hydroxylpinzette 50 als

Ester verknüpft werden.

O

O O

NHBoc

O

BocHN

O

O O

NH3+

O

+H3N

TFA/DCMquant.63 64

TFA-

TFA-

OH

OH

DCM, PyBOP, NMM, 40 °C, 3-4 d,20-69 %

OH

O O

NH

ONH

NHBocHN

ONH

O

NH

HN

BocHN

OH

ONH

O

NH

HN

BocHN

HN OH

O1) H2N-Gly-OMe, PyBOP, NMM, DCM, RT2) LiOH, MeOH/H2O

42 59

50

Boc-Gly-OH, 42 oder 59

OH

O O

NHBoc

OH

O O

NH

OHN HN

ONH

NHBoc

60 61

62

a)

b)

c)

40 %

Schema 19: a) Synthese des um ein Glycin verlängerten Guanidiniumcarbonylpyrrols 59, b) Drei erfolgreich an einer Seite gezielt veresterte molekulare Pinzetten 60 bis 62 und c) Die Diglycinpinzette 63 fällt als Nebenprodukt bei der Herstellung von 60 an, kann aber auch gezielt hergestellt werden. Anschließend lassen sich die Schutzgruppen sauer abspalten.


67

Für die letzte dieser drei Reaktionen mußte zunächst der

Guanidiniumcarbonylpyrrol‐Baustein 42 mit Glycin verknüpft werden (s. Reaktion

a). Diese Peptidkupplung konnte mit PyBOP realisiert werden. Die folgende basische

Verseifung des Methylesters zur Carbonsäure 59 führte teilweise auch zur störenden

Abspaltung der Guanidiniumgruppe.[119]

Die anschließende Synthese des Esters 62 aus 50 und 59 konnte zwar durchgeführt

werden, insgesamt ist dieser Reaktionsweg jedoch noch nicht optimiert und führt zu

geringen Gesamtausbeuten. Als problematisch könnte sich später auch noch

erweisen, daß Kraftfeldrechnungen auf einen Einschluß der Guanidiniumgruppe

von 62 in der Kavität der Pinzette hindeuten (berechnet für Molekül 62 ohne Boc‐

Schutzgruppe mit MacroModel 7.2, MonteCarlo, Wasser, OPLS‐AA). Der Glycin‐

Linker könnte die dafür notwendige Faltung des Moleküls ermöglichen.

Wesentlich besser verlief die Veresterung von 50 mit Glycin allein. Tatsächlich ist

Glycin dabei ausreichend reaktionsfreudig, so daß als unerwünschte Nebenreaktion

zu etwa 25 % die beidseitig des Hydrochinonsystems symmetrisch veresterte

Diglycinpinzette 63 gebildet wird. Das eigentliche Hauptprodukt 60 wird daher nur

zu etwa 50 % erhalten. Die Diglycinpinzette 63 kann durch Verwendung von zwei

Äquivalenten Glycin in der Synthese auch gezielt hergestellt werden. Durch saure

Abspaltung der beiden Boc‐Schutzgruppen erhält man die dikationische, in

Methanol lösliche, C2‐symmetrische Pinzette 64.

Die mit 69 % beste Ausbeute für eine einseitige Veresterung der Dihydroxyl‐

pinzette 50 konnte mit der Guanidiniumcarbonylpyrrolcarbonsäure 42 erzielt

werden. Diese führt in vier Tagen Reaktionszeit bei 40 °C mit PyBOP zur Pinzette 61.

Mit der durch PyBOP vermittelten Veresterung steht nun also ein weitgehend

universelles Syntheseprotokoll zur Verfügung, um das Pinzettengerüst 50 gezielt auf

einer Seite des Hydrochinonsystems weiter zu funktionalisieren. Lediglich sterisch

anspruchsvolle Carbonsäuren wie z.B. der Benzoesäurebisphosphonsäure‐ester 1

konnten nicht an die ebenfalls sterisch gehinderte Pinzette 50 angeknüpft werden.


68

Die beiden einseitig veresterten Pinzetten 60 und 61 wurden an der verbliebenen

phenolischen Hydroxylgruppe über die von FOKKENS etablierte Methode mit

Methylphosphonsäuredichlorid phosphoryliert und in situ durch einen großen

Überschuß Methanol zu den Phosphonsäuremethylestern 65 und 66 umgesetzt (s.

Schema unten). Die Methylester wurden anschließend mit Lithiumbromid in

Acetonitril selektiv zum Lithiumphosphonatsalz gespalten. Zuletzt konnte mit

Trifluoressigsäure in Dichlormethan die Boc‐Schutzgruppe quantitativ sauer entfernt

werden. Die so vollständig protonierten Verbindungen wurden mit

Lithiumhydroxid bis zu einem neutralen pH titriert (67: pH = 7.0, 68: pH = 6.3). Auf

diese Weise wurden die beiden ersten asymmetrisch funktionalisierten,

zwitterionischen molekularen Pinzetten 67 und 68 erhalten.

OH

O

R

O

O

O

R

O

1) THF, NEt3, MePOCl2

2) Ü. MeOH

PMeO

OMe

1) CH3CN, LiBr

2) DCM, TFAO

O O

PMe

-O

O

NH

ONH

NH2+

H2N

O

O O

NH3+

PMe

-O

O

R = GlyBoc, PyrGuaBoc

60, 61 65, 66

67

68

42% 6569% 66

98% 6778% 68

Schema 20: Phosphorylierung der bereits einseitig veresterten Pinzetten 60 und 61 und die folgende Abspaltung der Schutzgruppen zu den beiden ersten asymmetrisch funktionalisierten, zwitterionischen molekularen Pinzetten 67 und 68. Hinsichtlich der zuletzt durchgeführten Schutzgruppenoperationen sind zwei

Beobachtungen wichtig: Zum einen ist auch hier die Reihenfolge der Entfernung der

Schutzgruppen von Bedeutung. Wird zuerst die Boc‐Entschützung vorgenommen,


69

kommt es zur teilweisen Zersetzung des Produktes. Diese Erfahrung wurde in der

vorliegenden Arbeit bereits bei der neutralen Hydrogenolyse von Z‐Schutzgruppen

in Gegenwart von Phosphonsäuremethylestern beschrieben. Hier trifft sie auch für

das Arbeiten in saurem Milieu zu. Da aus diesem Grund zuerst die

Phosphonsäureester gespalten werden müssen, ist zum anderen zu beachten, daß die

entstehenden Lithiumphosphonatsalze, vor allem im Falle der Pinzette mit

Guanidiniumcabonylpyrrolgruppe, partiell in Acetonitril löslich sind und nicht wie

gewöhnlich quantitativ ausfallen. Das Lösungsmittel wird daher abweichend vom

sonst üblichen Arbeitsprotokoll nach vollständiger Reaktion durch Destillation

entfernt. Waschen mit Wasser, in dem sich die Produkte nicht lösen, bietet im

Anschluß eine gute Möglichkeit zur Aufreinigung.

4.5.4 Bindungsuntersuchungen an der Glycinpinzette 67.

Im Gegensatz zur Bisphosphonatpinzette von FOKKENS ist die zwitterionische

Glycinpinzette 67 in Wasser absolut unlöslich. Ein geeignetes Lösungsmittel ist

Methanol, dem auch einige Anteile (bis etwa 30‐40 %) Wasser zugefügt werden

können, ohne daß die Pinzette wieder ausfällt.

In Methanol wurde die Pinzette 67 nun zunächst auf Selbstassoziation und

Selbstinklusion hin untersucht. Ein NOESY‐NMR‐Spektrum zeigt hier nur die zu

erwartenden intramolekularen Kreuzsignale, aber keine Anzeichen für eine

Dimerisierung oder Inklusion einer Glycinylgruppe in der Kavität der Pinzette.

Sowohl bei Verdünnung einer Probe des Rezeptors in Methanol als auch bei

Variation der Temperatur zwischen 0 °C und 45 °C verschieben sich einige Signale

leicht im 1H‐NMR‐Spektrum (< 0.3 ppm).

Die Temperaturabhängigkeit deutet auf Selbstassoziation mehrerer

Pinzettenmoleküle oder eine eingeschränkte konformationelle Freiheit der

Glycinylgruppe bei niedriger Temperatur hin. Bei vollständigem Einschluß dieser

Gruppe in der Kavität wäre allerdings ein wesentlich größerer Hochfeldshift zu

erwarten. Auch trägt die computermodellierte Struktur der Pinzette den Glycinylrest


70

klar außerhalb der Kavität. Allerdings ist eine Konformation denkbar, bei der die

Ammoniumgruppe des Glycinylrestes in den Eingangsbereich der Kavität gebracht

wird.

Abb. 34: Die Glycinpinzette 67 in einer Ansicht von der Seite (links) und von vorne, mit Blick in die Kavität hinein (rechts). Die Struktur wurde mit MacroModel 7.2 berechnet (MonteCarlo, 7000 Schritte, H2O, OPLS‐AA). Weiteren Kraftfeldrechnungen zufolge sollte die Glycinpinzette 67 gut als Rezeptor

für das RGD‐Peptid präorganisiert sein. Die Argininseitenkette kann in die Kavität

der Pinzette eingeschoben werden und die positiv geladene Guanidiniumgruppe am

gegensinnig geladenen Phosphonat einrasten. Das Rückgrat des Peptids kann seitlich

entspannt an der Pinzette entlang geführt werden, so daß die Carboxylatfunktion der

Aspartatseitenkette eine Salzbrücke zu der im richtigen Abstand befindlichen

Ammoniumgruppe des Glycins ausbildet.

Abb. 35: Energieminimierter Komplex der Glycinpinzette 67 mit dem RGD‐Peptid (MacroModel 7.2, MonteCarlo, 10000 Schritte, H2O, OPLS‐AA).


71

Im Experiment mittels NMR‐Titration konnte eine solche Bindung jedoch leider nicht

nachgewiesen werden. Als Lösungsmittelgemisch für die Untersuchung wurde wie

bereits in zuvor beschriebenen Versuchen Methanol/Wasser im Verhältnis 3:1

gewählt, in dem sich beide Komponenten ausreichend lösen lassen. Eine erste

Messung mit zusätzlich 25 millimolarem BisTris‐Puffer ergab keinerlei

komplexinduzierte Verschiebungen von NMR‐Signalen. Um auch in ungepufferten

Medien eine definierte ionische Struktur des Rezeptors gewährleisten zu können,

wurde dieser in Lösung mit Hilfe einer pH‐Elektrode und Lithiumhydroxid auf

einen pH‐Wert von 7.0 eingestellt und das Lösungsmittel erneut abdestilliert. Der

nach Trocknen auf diese Weise erhaltene, zwitterionische Rezeptor wurde für die

folgenden Untersuchungen in ungepufferter Lösung verwendet.

Die Wiederholung der Titration von 67 gegen das RGD‐Peptid, nun in ungepufferter

Lösung, wies einige schwache Shifts < 0.1 ppm auf. Bei Inklusion des Gastes in der

Kavität muß bei den NMR‐Signalen der eingeschlossenen Gruppen ein drastischer

Hochfeldshift > 1 ppm zu sehen sein. Da dies nicht der Fall ist, muß davon

ausgegangen werden, daß die Argininseitenkette des RGD‐Peptids nicht in die

Kavität der Pinzette 67 hineingezogen wird, anders als in der Bisphosphonatpinzette

von FOKKENS, bei der dies zweifelsfrei nachgewiesen werden konnte.

Daraufhin wurden einige alternative Gäste in methanolischer Lösung gegen die

Pinzette 67 titriert: Acetyllysinmethylester, das Tetrapeptid H‐GRGG‐OH und γ‐

Aminobuttersäure. Lysin wurde gewählt, um zu testen, ob gegebenenfalls die

anionischen Teile des RGD‐Peptids die Bindung an den Rezeptor stören. Zudem

bestünde hier wiederum ein guter Vergleich zu den Arbeiten von FOKKENS, dessen

Bisphosphonatpinzette Acetyllysinmethylester mit hoher Affinität erkennt. Das

Tetrapeptid bietet ein Arginin in peptidischem Kontext an und ist im Gegensatz zum

RGD‐Tripeptid auch in reinem Methanol ausreichend löslich. Zuletzt wurde mit γ‐

Aminobuttersäure noch ein wichtiger Neurotransmitter als Gast untersucht. Dieser

ist ebenfalls zwitterionisch. Die beiden geladenen Kopfgruppen sitzen an den Enden

einer kurzen aliphatischen Kette, die in die Pinzette hineingezogen werden könnte,


72

wobei die beiden geladenen Kopfgruppen von den entgegengesetzt geladenen

Seitengruppen an der Pinzette gebunden werden sollen. Die NMR‐Titrationen

ergaben jedoch für keinen der drei genannten Gäste in Methanol Änderungen der

Signallagen bei Zugabe der Glycinpinzette 67.

Daraus muß man schließen, daß die Kavität in der Glycinpinzette 67 für Gäste nicht

zugänglich ist. Eine mögliche Erklärung dafür könnte die Bildung von nichtkovalent

Kopf‐Schwanz‐verknüpften Pinzetten zu Oligomeren sein. Alternierende

Anordnung der ionischen Kopfgruppen der Pinzetten führt eventuell zu Stapeln, in

denen die Pinzetten gegenseitig ihre Hohräume versperren.

4.5.5 Bindungsuntersuchungen an der Guanidiniumcarbonylpyrrolpinzette 68.

Bei der Guanidiniumcarbonylpyrrolpinzette 68 werden bereits in

Kraftfeldrechnungen einige potentielle Probleme offensichtlich. Die

Guanidiniumcarbonylpyrrolgruppe ist im Vergleich zu dem in der Pinzette 67

verwendeten Glycin deutlich größer. Zwar scheint ein direkter Einschluß dieses

Carboxylaterkennungsmoduls aus sterischen Gründen nicht möglich, jedoch

versperrt das Modul in der energetisch günstigsten, berechneten Struktur den

Eingang zur Kavität fast vollständig. Auch in einer Moleküdynamikrechnung bei

Raumtemperatur verbleibt die Pyrrolgruppe vor dem Eingang der Kavität.

Abb. 36: Die Guanidiniumcarbonylpyrrolpinzette 68 in einer Ansicht mit Blick auf die Kavität durch die Guanidiniumgruppe hindurch (links) und schräg von vorne (rechts). Die Struktur wurde mit MacroModel 7.2 berechnet (MonteCarlo, 7000 Schritte, H2O, OPLS‐AA).


73

Im computergestützt berechneten Komplex der Pinzette 68 mit dem RGD‐Tripeptid

zeigt sich demzufolge auch, daß für eine Bindung und Inklusion der

Argininseitenkette in der Kavität zum einen die Guanidiniumgruppe im Rezeptor

aus der optimalen, zur Acylfunktion koplanaren Position herausgedreht werden

muß, und zum anderen das Peptid nur wenig Raum findet, um sich aus der Pinzette

„herauszuwinden“.

Abb. 37: Energieminimierter Komplex der Guanidiniumcarbonylpyrrolpinzette 68 mit dem violett hervorgehobenen RGD‐Peptid (MacroModel 7.2, MonteCarlo, 10000 Schritte, H2O, OPLS‐AA) in zwei verschiedenen Ansichten von der Seite (links) und von unten (rechts).

Was die berechneten Strukturen im Detail zu bedeuten haben, muß jedoch das

Experiment zeigen. Die Guanidiniumcarbonylpyrrolpinzette 68 ist ebenfalls in

Wasser unlöslich. Auch in Methanol ist sie leider nur schwer löslich und ergibt dabei

stark verbreiterte NMR‐Signale. Dies könnte auf Aggregation in polaren Medien

hindeuten.

Für Bindungsuntersuchungen wurde als geeignetes Lösungsmittelgemisch

Chloroform/Methanol im Verhältnis 1:1 gewählt. Der Rezeptor löst sich in diesem

Gemisch bis zu einer Höchstkonzentration von etwa 1 mM. Ähnlich wie bei der

Glycinpinzette 67 wurde vor den folgenden Untersuchungen die Pinzette 68 mit

Hilfe einer pH‐Glaselektrode und Lithiumhydroxid auf einen pH‐Wert von 6.0

eingestellt, um einen zwitterionischen Zustand der Pinzette zu sichern.

Ein 1H‐NMR‐VT‐Experiment zeigt schwache Shifts der NMR‐Signale der beiden

Pyrrol‐Protonen. Vermutlich zeigt dies die mit steigender Temperatur aufbrechende


74

Bindung einer Phosphonatgruppe an die Guanidiniumcarbonylpyrrolgruppe eines

anderen Pinzettenmoleküls an. Die gleichartige intramolekulare Bindung zwischen

Phosphonat und Guanidiniumcarbonylpyrrol kann aufgrund von

Kraftfeldrechnungen ausgeschlossen werden. Die intramolekulare Annäherung der

beiden Rezeptorgruppen ist nämlich sowohl innerhalb der Kavität, als auch oberhalb

der Pinzette sterisch nicht möglich.

Da das RGD‐Peptid in der oben genannten Chloroform/Methanol‐Mischung nicht

löslich ist, konnte seine Affinität gegenüber der Pinzette 68 nicht bestimmt werden.

Statt dessen wurde zunächst freies L‐Lysin gegen 68 in Chloroform/Methanol 1:1

titriert und NMR‐spektroskopisch verfolgt. Es zeigten sich mäßige

komplexinduzierte Shifts kleiner 0.2 ppm im α‐Proton der Aminosäure. Die

nichtlineare Regression ergab eine Affinität Ka = 2500 M‐1 (± 50 %). Diese

verhältnismäßig schwache Bindung, die nur moderaten Shifts und vor allem das

vollständige Fehlen von Shifts in der Lysinseitenkette lassen schließen, daß die

Lysinseitenkette in diesem Fall nicht in die Kavität der Pinzette 68 eingeschlossen

wird. Die Bindung beruht vermutlich lediglich auf der Wechselwirkung des

Guanidiniumcarbonylpyrrols mit dem freien Carboxylat des Lysins.

Diese These wurde durch die Titration der Pinzette mit Acetyllysinmethylester

untermauert, welcher keine freie Carboxylatfunktion enthält,. Tatsächlich ist in der

NMR‐Titration mit 68 und diesem Gast keine komplexinduzierte Verschiebung des

α‐Protonensignals und somit keinerlei Bindung mehr feststellbar.

Wie bei der Glycinpinzette 67 wurden auch die alternativen Gäste H‐GRGG‐OH und

γ‐Aminobuttersäure gegen die Pinzette 68 titriert. Doch auch hier wurden keinerlei

Affinitäten festgestellt.

Es muß also leider tatsächlich angenommen werden, daß in der Pinzette 68 die

Kavität nicht zugänglich ist. Wahrscheinlich wird sie von der sterisch

anspruchsvollen Guanidiniumcarbonylpyrrolgruppe blockiert, die so die

Einlagerung von Gästen verhindert.

Zusammenfassung und Ausblick

75

5 Zusammenfassung

Ein neues Trisphosphonat als Argininrezeptor

Im Rahmen dieser Dissertation ist zunächst die Synthese des neuen Trisphosphonat‐

Bausteins 14 gelungen, der Alkylguanidiniumgruppen in vergleichbarer Stärke

bindet wie das ähnliche Trisphosphonat von RENSING. Gegenüber

Argininmethylester wurde in Methanol sogar eine Affinität von 7.6 ∙ 105 M‐1 ermittelt.

In reinem Wasser wird Argininmethylester immer noch mit 140 M‐1 komplexiert. Die

starke Bindung kann auf eine kooperative Komplexierung der Guanidinium‐ und

Aminofunktion des Arginins zurückgeführt werden. Das neue Trisphosphonat 14 ist

daher ein guter, künstlicher Rezeptor für N‐terminales Arginin.

OHN

O P

O

MeO OLiO

NH

P

P

LiOMeO

O

OLiH3C

O

vs.

NH

NH2

NH2ClCOOMe

ClH3N

H

14

Abb. 38: Das neue Trisphosphonat 14 als Rezeptor für Arginin als Lewis‐Struktur (links) und der mit Kraftfeldrechnungen energieminimierte Komplex (rechts; Wasserstoffatome wurden für bessere Übersichtlichkeit teilweise nicht abgebildet). Eine systematische Reihe von kleinen, künstlichen Modellrezeptoren für die

RGD‐Sequenz.

Ausgehend von dem einfachen Aminobisphosphonat 9 wurde eine Serie von

insgesamt zehn kleinen Rezeptoren für die RGD‐Sequenz hergestellt. Dabei dient das

benzylische Bisphosphonat‐Modul als Argininrezeptor und eine terminale

Ammoniumgruppe als einfacher Aspartatrezeptor. Dazwischen wurde ein

systematisch variierter, peptidischer Spacer eingebaut, mit dessen Hilfe die

grundsätzlichen sterischen Anforderungen an künstliche RGD‐Rezeptoren studiert

wurden.


76

Es zeigte sich, daß der günstigste Abstand zwischen den beiden Rezeptormodulen

durch einen Dipeptidspacer eingestellt werden konnte. Einzelne Aminosäuren oder

Tripeptidspacer führten zu deutlich geringeren Bindungskonstanten. Sterisch

anspruchsvolle Seitenketten im peptidischen Linker führten ebenso zu niedrigeren

Affinitäten gegenüber dem RGD‐Peptid. Die durch die Peptidbindungen

eingeschränkte konformationelle Freiheit wirkte sich dabei günstig auf die

Bindungskonstanten aus. So zeigte ein den Dipeptidspacern in der Länge

entsprechender, jedoch flexiblerer γ‐Aminobuttersäure‐Linker keine Bindung des

RGD‐Peptids. Noch starrere Spacer wie meta‐ und para‐Aminobenzoesäure erzielten

allerdings ebenfalls keine Bindung. Aus Kraftfeldrechnungen geht hervor, daß hier

die Ammoniumgruppe nicht optimal zum Aspartat des RGD‐Peptides vororientiert

zu sein scheint Vor allem ist aber aufgrund des sehr niedrigen pKa ‐ Wertes von

Anilinen in wäßriger Lösung nicht von einer vollständigen Protonierung der

Aminofunktion auszugehen.

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

O HN

ONH3

+

Li+

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

O

NH3+

Li+

= peptischer Spacer 33 Abb. 39: Schematische Darstellung des Aufbaus einer Serie von zehn künstlichen RGD‐Rezeptoren mit variablem peptidischem Spacer (links) und der beste Binder 33 aus dieser Serie (rechts). Der beste RGD‐Binder aus dieser Serie ist demzufolge der Rezeptor 33 mit einem

Diglycinspacer, der das RGD‐Peptid in wäßrigem Methanol (1:3) mit einer Affinität

von 780 M‐1 im Sinne eines 1:1‐Adduktes komplexiert.

Künstliche RGD‐Rezeptoren auf Basis von benzylischen Bisphosphonaten und

Guanidiniumcarbonylpyrrolen in Kooperation mit der Gruppe SCHMUCK.

Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden im Anschluß drei neue, künstliche RGD‐

Rezeptoren hergestellt, in denen die zuvor noch als Aspartatrezeptormodul


77

verwendete Ammoniumgruppe gegen den wesentlich potenteren

Guanidiniumcarbonylpyrrol‐Baustein der Gruppe SCHMUCK ausgetauscht wurde. In

nur je acht linearen Stufen wurden der Rezeptor 44 mit Diglycinspacer, der Rezeptor

47 mit Glycinspacer und der Rezeptor 49 mit einem Azaserinspacer hergestellt. Die

dafür jeweils benötigten Guanidiniumcarbonylpyrrolbausteine wurden von der

Gruppe SCHMUCK zur Verfügung gestellt.

NHP

P

MeO O-

O

O-

OMeO

O HN

ONH

OHN HN

ONH2

+

NH244Li+

HNP

P

-O OMe

O

O-

OMe

O

O

NH

O

HN

HN

O

NH2

+H2N47

Li+

OMeO

HN

P

P

-OO

OMe

O-

OMeO

O

NH

O NH

HN

O

NH3+

HN

49

Li+

Abb. 40: Die drei Rezeptoren 44, 47 und 49, bestehend aus einem benzylischen Bisphosphonatmodul, einem peptidischen Linker und einem Guanidiniumcarbonylpyrrol. Abgebildet sind die Lewis‐Strukturen der drei Rezeptoren (links) und die berechneten Komplexe von 44 und 49 mit dem RGD‐Peptid (in violett), bzw. das durch Selbstassoziation gebildete Dimer von 47 (rechts). Alle drei Rezeptoren dieser Serie sind dank einer negativen Überschußladung

wasserlöslich. Das einfache Glycin als Spacer in Rezeptor 47 führt zu einem

weitgehend selbstkomplementärem Bau dieses Moleküls mit einer Selbstassoziation

in Höhe von 330 M‐1. Eine Affinität gegenüber dem RGD‐Peptid konnte für 47 nicht

nachgewiesen werden.

Ebenfalls nur eine einzelne Aminosäure als Spacer trägt Rezeptor 49. Durch das hier

vorliegende Chiralitätszentrum und die unterschiedliche Anknüpfung des


78

Pyrrolbausteins an die Seitenkette der Aminosäure weist 49 jedoch keine meßbare

Selbstassoziation in Wasser auf. Statt dessen kann sogar in gepufferter, wäßriger

Lösung mit Hilfe von NMR‐Titrationen eine Affinität gegenüber dem RGD‐Peptid in

Höhe von 280 M‐1 ermittelt werden.

Am intensivsten studiert wurden die Bindungseigenschaften des Rezeptors 44. Der

darin vorliegende Diglycinspacer hatte sich in der zuvor diskutierten Reihe kleiner

RGD‐Rezeptoren als der Günstigste erwiesen. Auch für 44 scheint der Spacer

geeignet zu sein. Es konnte mit verschiedensten Methoden keine Selbstassoziation

des Rezeptors in Wasser festgestellt werden. Die Affinität von 44 gegenüber dem

RGD‐Tripeptid beträgt in gepufferter, wäßriger Lösung rund 200 M‐1. Dies bedeutet

eine deutliche Steigerung gegenüber dem vergleichbaren Rezeptor 33 mit

Diglycinspacer aus der Vorserie, zumal dieser nur in wesentlich unpolarerer, wäßrig‐

methanolischer Lösung eine Bindung aufweist.

Anhand von NMR‐Titrationen mit verschiedenen über Festphasenmethoden

hergestellten, kleinen Peptiden konnte ein präzises Gastprofil für den Rezeptor 44

definiert werden. Für die moderate Bindung notwendig scheint ein Arginin und eine

in der Nähe befindliche Carboxylatfunktion zu sein. Diese muß nicht zwingend von

einem Aspartat zur Verfügung gestellt werden. Auch ein frei liegender C‐Terminus

des Gast‐Peptides reicht aus. Die Carboxylatfunktion kann von der Aminosäure

direkt neben dem Arginin oder in einem deutlichen Abstand erst von der dritten

Aminosäure nach dem Arginin angeboten werden. Die Affinitäten bewegen sich

dabei jeweils in einem Bereich von etwa 200 bis 400 M‐1.

Molekulare Pinzetten

In einem abschließendem Projekt wurde versucht, die noch niedrigen Affinitäten der

bisher hergestellten Rezeptoren durch ein wesentlich stärkeres Arginin‐

erkennungsmodul zu steigern. Statt des verhältnismäßig schwachen benzylischen

Bisphosphonats sollte das Gerüst der Bisphosphonatpinzette von FOKKENS in einen

neuen RGD‐Rezeptor eingebaut werden.


79

Nach umfangreichen synthetischen Studien an dem Pinzettengerüst und einem

diesem zugrunde liegendem Modell konnten schließlich die beiden ersten

asymmetrisch substituierten Phosphonatpinzetten 67 und 68 hergestellt werden. Die

in dieser Arbeit entwickelten Methoden stellen nun erstmals einen generellen

Zugang dar, um das ausgezeichnete supramolekulare Rezeptorsystem der

molekularen Pinzetten von KLÄRNER mit zwei unterschiedlichen, variablen Gruppen

am oberen Rand zu funktionalisieren. Auf diese Weise können in Zukunft ganz neue

Gastprofile für die Pinzetten erschlossen werden.

O

O O

PMe

-O

O

NH

ONH

NH2+

H2N

O

O O

NH3+

PMe

-O

O

67 68

Abb. 41: Die beiden ersten asymmetrisch substituierten Phosphonatpinzetten 67 (links) und 68 (rechts, oben jeweils als Lewis‐Struktur, darunter als energieminimierte Struktur (MacroModel 7.2, MonteCarlo, 8000 Schritte, OPLS‐AA, H2O). Um als künstliche Rezeptoren für die RGD‐Sequenz dienen zu können, wurde das

Pinzettengerüst in 67 auf der einen Seite des Hydrochinons mit einem Glycin

verestert. Die terminale Ammoniumgruppe des Glycins stellt wie in den zuvor

beschriebenen Rezeptorsystemen ein einfaches Aspartaterkennungsmodul dar. Auf


80

der anderen Seite wurde ein Methylphosphonat angefügt, das der Argininseitenkette

einen Einrastpunkt bietet, wenn diese sich in die Kavität der Pinzette einschiebt.

In gleicher Weise wurde auch in der Pinzette 68 ein Methylphosphonat verwendet.

Auf der gegenüberliegenden Seite der Pinzette wurde jedoch statt des Glycins

wieder ein Guanidiniumcarbonylpyrrol der Gruppe SCHMUCK als

Aspartatrezeptorbaustein verwendet.

In Bindungsstudien zeigte sich leider für beide Rezeptoren, daß die Kavität der

Pinzette für die Seitenketten von Arginin oder Lysin nicht zugänglich ist. Lediglich

68 wies eine Affinität gegenüber einfachem Lysin in Höhe von 2500 M‐1 in einer

Chloroform/Methanol‐Mischung auf. Diese kann aber vollständig auf die

Wechselwirkung des Guanidiniumcarbonylpyrrolmoduls mit dem Carboxylat des

Lysins zurückgeführt werden. Um die Pinzette als aktiven Baustein in einem

künstlichen RGD‐Rezeptor einsetzen zu können, sind noch weitere Optimierungen

der angefügten Module notwendig. Insbesondere wirkt sich die zwitterionische

Struktur von 67 und 68 negativ auf die Löslichkeit der Rezeptoren in polaren

Lösungsmitteln oder Wasser aus.

6 Ausblick

Nach wie vor stellt die Entwicklung eines wirksamen künstlichen Rezeptors für die

RGD‐Sequenz, der in seiner Bindungsstärke und Selektivität mit biologischen

Rezeptoren konkurrieren kann, eine große Herausforderung an die supramolekulare

Chemie dar. Der modulare Aufbau solcher Rezeptoren aus einem benzylischen

Bisphosphonat und einem Guanidiniumcarbonylpyrrol mit variablem Linker

besticht durch seine hohe Flexibilität. Die Bindung von RGD‐Peptiden in wäßriger,

gepufferter Lösung konnte zwar nachgewiesen werden. Die bisher auf diesem Weg

erzielten Bindungsaffinitäten (~ 102 M‐1) sind jedoch noch um 4‐6 Größenordnungen

von denen der Natur entfernt.

Steigerungen könnten hier durch weitere Optimierung des Linkers erreicht werden.

Die bisher verwendeten peptidischen Linker weisen immer noch eine relativ große


81

Flexibilität auf. Sterisch genau passende, starre Spacer, z.B. aromatische

Aminosäuren wie Aminobenzoesäure, lassen höhere Bindungskonstanten erwarten.

Dies wird gegenwärtig in der Gruppe SCHMUCK verfolgt.

Auch die Einführung eines dritten Phosphonatarmes im Argininerkennungsmodul

sollte mindestens eine Verdopplung der bisher erzielten Bindungskonstanten

bewirken. Synthetische Ansätze, das Trisphosphonat 14 mit einem

Guanidiniumcarbonylpyrrol zu verknüpfen, wurden in dieser Arbeit bereits

beschrieben.

RHN

ONHNH

OHN

NH

Abb. 42: Mögliches verbessertes Design des Guanidiniumcarbonylpyrrolbausteins. Eine Modifizierung des Guanidiniumcarbonylpyrrolbausteins läßt ebenfalls eine

Bindungsverstärkung erwarten. Die Einführung sterisch anspruchsvoller Gruppen

anstelle der Guanidiniumfunktion sollte die Eigenschaften der NH‐Donoren des

Bausteins als Carboxylatrezeptor in keiner Weise beeinträchtigen. Die zusätzlichen

Gruppen würden jedoch effektiv die Selbsterkennung der Guanidiniumfunktion

durch die im Rezeptor vorhanden Bis‐ bzw. Trisphosphonate und damit die störende

Selbstassoziation verhindern.

Nichtsdestotrotz werden durch diese Änderungen verbesserte Rezeptoren nicht mit

den natürlichen Integrinen konkurrieren können. Wesentlich vielversprechender

scheint der zuletzt verfolgte Ansatz zu sein, statt der benzylischen Bis‐ und

Trisphosphonate eine molekulare Pinzette als Argininerkennungsmodul zu

verwenden. Die für die einfache Bisphosphonatpinzette beschriebenen Affinitäten

gegenüber Lysin und Arginin prädestinieren diese für einen Einsatz in komplexeren

Rezeptorsystemen.[102]

Alternativ zu den Pinzetten 67 und 68 wurde in dieser Arbeit ein weiterer

synthetischer Zugang zu asymmetrisch substituierten Pinzetten entwickelt.

Bromacetylester und ‐amide lassen sich leicht etherartig an das Hydrochinonsystem


82

der Pinzette kovalent anknüpfen. Mit dem bereits hergestellten Baustein 58 sind so

Varianten der vorliegenden Pinzetten darstellbar. Der zusätzliche Spacer in 58 sollte

sich günstig auf die RGD‐Bindung auswirken.

OMeO

HN HN

ONH

HN

O

NHBoc

NHOBr

O OP

Me O-O

58

OH

OH

OMeO

HNNH

O NH

HN

O

NH2+

HN

O

+

1) Aceton, KI, K2CO3, ∆2) THF, MePOCl2, NEt33) CH3CN, LiBr4) TFA/DCM

50

Abb. 43: Syntheseroute zu einer asymmetrisch substituierten Phosphonatpinzette über die in dieser Arbeit etablierte, einseitige WILLIAMSON‐Veretherung des Hydrochinonsystems der Pinzette 50 mit Bromacetylamiden.. Größtes Problem der beiden in dieser Arbeit hergestellten Phosphonatpinzetten

scheint jedoch deren zwitterionische Struktur zu sein, die ihre Löslichkeit zu sehr

herabsetzt. Um wieder Wasserlöslichkeit zu ermöglichen, ist eine zweite, anionische

Phosphonatgruppe notwendig. Unter Beibehalt des in dieser Arbeit etablierten

Syntheseweges könnte ein solches weiteres Phosphonat mit Hilfe der hier schon

verwendeten Phosphonoglycinsäure 10 eingeführt werden. Im einfachsten Fall

entstünde so eine direkt zum Rezeptor 67 analoge Bisphosphonatpinzette. Aber auch

die Anknüpfung eines Guanidiniumcarbonylpyrrols sollte möglich sein, wenn die

Phosphonoglycinsäure 10 zuvor mit der Guanidiniumcarbonylpyrrolcarbonsäure 42

verknüpft wird.


83

O

O O

NH3

PMe

O

O

PO

MeO

OH

OH

+ MePOCl2 +COOHZHN

POMeO

MeO

50 10

O

O O

NH

PMe

O

O

PO

MeO

OHN

O

HNNH2

NH2

OH

OH

+ MePOCl2 +

COOH

HNP O

MeO OMe

50

ONH2

HN

OBocHN

HN

Abb. 44: Retrosynthetische Analyse von zwei neuen Rezeptordesigns. In analoger Weise zur in dieser Arbeit ausgearbeiteten Synthese der Pinzetten 67 und 68 soll das Pinzettengrundgerüst 50 zunächst mit einer Aminosäure, die hier bereits eine zusätzliche Phosphonsäureestergruppe trägt, verestert werden. Anschließend kann mit Methylphosphonsäuredichlorid die übrige Hydroxylgruppe des Grundgerüsts phosphoryliert werden. Die Abspaltung der Schutzgruppen führt schließlich zu den zwei neuen Rezeptoren. In den beiden in dieser Arbeit hergestellten Rezeptoren 67 und 68 scheint die Kavität

der Pinzette jeweils für Gäste unzugänglich zu sein. Es ist nicht auszuschließen, daß

die gewählten Veresterungen zu einer räumlichen Anordnung der Rezeptoren

führen, in der die eingeführten Gruppen den Eingang zur Kavität versperren. Unter

Umständen ist daher ein Pinzettendesign notwendig, daß sich noch deutlich näher

an der Bisphosphonatpinzette von FOKKENS orientiert. Direkt an das Pinzettengerüst

sollten wie bei FOKKENS beidseitig je ein anionisches Phosphonat angeknüpft sein.

An eines (oder auch beide) der Phosphonate könnte wiederum ein

Aspartatrezeptormodul gebunden sein, das die Spezifität einer solchen, neuen

Pinzette für das RGD‐Peptid moduliert.


84

O

OP

O

PMeO

O

ORn

R = NH3+, Carbonylpyrrolbaustein

OH

OH

50

+

+MePOCl2

PO

NSGnCl

Cl

PO

NSGnHO

HO + PCl5

PO

NSGnMeO

MeO+ KOH

BrNSGn

+ P(OMe)3

SG = Phtalimid, Carbonylpyrrolbaustein

Abb. 45: Ein neues Bisphosphonatrezeptordesign mit einem kovalent an eines der Phosphoratome gebundenen Aspartatrezeptormodul. Die Synthese geht von dem Phosphonsäuredichlorid des Aspartatrezeptormoduls aus, welches durch MICHAELIS‐ARBUZOV‐Reaktion aus dem entsprechenden Halogenalkan mit folgender Esterspaltung und Chlorierung hergestellt werden kann. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß kein praktikabler Weg existiert, ein

solches zusätzliches Rezeptormodul als Phosphor‐ oder Phosphonsäureester

einzuführen. Ein noch nicht beschrittener Weg besteht dagegen in der Herstellung

eines Phosphonsäuredichlorids, welches das gewünschte Aspartatrezeptormodul

kovalent an den Phosphor gebunden bereits enthält. Das benötigte Säurechlorid

könnte ausgehend von einem halogenierten Derivat des Aspartatrezeptormoduls in

einer Michaelis‐Arbuzov‐Reaktion mit Trimethylphosphit hergestellt werden.

Folgende basische Verseifung des Phosphonsäuredimethylesters und Chlorierung

der Säure mit PCl5 führt schließlich zu dem Phosphonsäuredichlorid. Dieses kann je

nach zugegebener Menge ein‐ oder beidseitig mit dem Pinzettengerüst 50 reagieren

und wie bei dem Methylphosphonsäuredichlorid gewohnt mit Wasser oder

Methanol abgefangen werden. Als Aspartatrezeptormodul ist im einfachsten Fall

wieder eine Ammoniumgruppe vorzuschlagen, die während der Reaktionsfolge

sinnvollerweise phthalimidgeschützt vorliegt. Alternativ könnte auch ein


85

entsprechender Guanidiniumcarbonylpyrrolbaustein hergestellt werden. Ein

vielversprechendes Modell wurde in einer Kraftfeldrechnung energieminimiert (s.

Abb. 46).

Abb. 46: Kraftfeldrechnung (MacroModel 7.2, MonteCarlo, 10000 Schritte, OPLS‐AA, H2O) für ein neues RGD‐Rezeptordesign aus einer Bisphosphonatpinzette mit einem an ein Phosphonat angeknüpften Guanidiniumcarbonylpyrrol. Das RGD‐Peptid ist violett dargestellt. (Vgl. Abb. 45)

Experimenteller Teil

86

7 Experimenteller Teil

7.1 Materialien und Methoden

Dünnschichtchromatogramme wurden auf Aluminium‐Fertigplatten Kieselgel 60 F254

der Firma Merck ausgeführt. Die Substanzen wurden durch Betrachtung unter einer

UV Lampe (254 nm bzw. 366 nm) oder durch Anfärben mit CAM‐Tauchreagenz (2 g

Cersulfat, 50 mL konz. Schwefelsäure, 50 g Ammoniummolybdat und 400 mL

Wasser, Platte auf 100 °C erwärmen), bzw. mit Ninhydrin‐Tauchreagenz (0.3 %ige

Lösung in n‐Butanol, Essigsäure, Platte auf 100 °C erwärmen) sichtbar gemacht.

Für die Säulenchromatographie nach der Flash‐Methode wurde Kieselgel 60

(Korngröße 0.040‐0.063 mm) der Firma Merck verwendet. Die Elution erfolgte bei

Raumtemperatur unter Verwendung eines Preßluft‐Überdrucks.

HPLC‐Chromatographie wurde mit Merck‐Hitachi‐Anlagen (analytisch: L‐7150

Pumpe, L‐7400 UV Detektor, L‐7000 Interface Modul, Jasco Säulenofen, L‐7614

Lösungsmittel Entgaser; präparativ: K‐1800 Pumpe, K‐2501 UV‐Detektor, Advantec

SF‐3120 Probensammler) durchgeführt.

Schmelzpunkte wurden in offenen Glaskapillaren mit einer Kofler‐Apparatur

Thermophan von Reichert gemessen und sind nicht korrigiert.

UV/Vis‐Spektren wurden auf einem U‐3410 Spektrophotometer der Firma Hitachi

mit Temperiereinheit der Firma Haake gemessen. Die Basislinie wurde vor jeder

Messung mit reinem Puffer bestimmt. Für die Messungen wurden Küvetten der

Firma Helma verwendet mit einem Innendurchmesser von 2 mm und einem

Strahlengang von 10 mm (Meßvolumen 500 µL).


87

Massenspektren (MS) wurden durch den MS‐Service des FB‐Chemie, Philipps‐

Universität Marburg, aufgenommen. ESI‐Massenspektren wurden auf einem

Finnigan TSQ 7000, Finnigan MAT 95 oder S“Qstar Pulsar i” ESI‐TOF

Massenspektrometer (Applied Biosystems, Darmstadt) gemesssen. FD‐Massenspektren

wurden mit einer Finnigan MAT 95 S aufgenommen. MALDI‐TOF‐Massenspektren

wurden auf einem Bruker Flex III gemessen. Es werden die wichtigsten Signal in m/z‐

Einheiten angegeben, wobei wenn möglich eine Zuordnung in Klammern angemerkt

ist.

ITC

Mikrokalorimetrische Messungen wurden an einem VP‐ITC‐Gerät der Firma

MicroCal (Modell aus dem Jahr 2003) durchgeführt.

Lösungsmittel und Chemikalien wurden falls nicht anders erwähnt, in den

kommerziell erhältlichen Qualitäten puriss. p.a. oder purum. eingesetzt und wurden

von den Firmen Fluka, Aldrich, Acros, und Merck bezogen. Aminosäuren, Peptide und

Kupplungsreagenzien wurden von den Firmen Novabiochem, Bachem, Advanced

Chemtech, Applied Biosystems und Iris Biotech bezogen. THF wurde über Natrium,

Dichlormethan über Calciumhydrid, Methanol über Magnesium und Ethanol über

Natrium / Phthalsäure‐diethylester getrocknet. DMF und NMP wurden speziell für

die Peptidsynthese von Fluka bezogen. Lösungsmittel für Extraktionen und

Säulenchromatographie waren von technischer Qualität und wurden vor der

Verwendung destilliert.

Schutzgasbedingungen

Reaktionen wurden grundsätzlich in einer inerten Argon‐Atmosphäre durchgeführt

und die verwendeten Glasgeräte zuvor im HV durch Erhitzen mit einem

Heißluftgebläse von Wasserspuren befreit.


88

Molecular Modeling Untersuchungen

Kraftfeldrechnungen wurden mit dem Programm MacroModel V 7.2 der Firma

Schroedinger INC. durchgeführt.[120] Verwendet wurden die Kraftfelder AMBER*

sowie OPLS‐AA und das GB/SA Solvatationsmodell für Wasser.[121, 122] Monte‐Carlo

Simulationen wurden mit 5000‐10000 Schritten gerechnet. Anschließende

Moleküldynamik‐Rechnungen wurden 100 ps bei 300 K durchgeführt und durch

Überlagerung der alle 10 ps gespeicherten Strukturen abgebildet.

Weitere Darstellungen von Proteinen und ihren Liganden wurden mit dem

Programm Sybyl 6.0 angefertigt und durch einfache Minimierung mit MMFF95*

strukturell optimiert.

Die Visualisierung der berechneten Strukturen erfolgte mit den frei erhältlichen

Programmen ISI WebLab Viewer Lite und PyMol.[123, 124]

Kernresonanzspektren (NMR) wurden falls nicht anders angegeben bei 300 K auf

den Geräten Bruker DRX 200, Bruker AMX 300, Bruker AMV 300, Bruker AMX 400 und

Bruker AMX 500 aufgenommen. In Klammern sind jeweils die Meßfrequenz in MHz

sowie das Lösungsmittel vermerkt. Die chemische Verschiebung δ ist in ppm und die

Kopplungskonstante J in Hz angegeben. Kalibriert wurde jeweils auf das

Restprotonensignal des Lösungsmittels.[125] Die Signalmultiplizitäten wurden mit den

Symbolen s (Singulett), br s (breites Singulett), d (Dublett), t (Triplett), q (Quartett), m

(Multiplett) gekennzeichnet.


89

7.2 Synthesen

7.2.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften

Allgemeine Arbeitsvorschrift AAV I zur Abspaltung von Z‐Schutzgruppen:

Die zu entschützende Substanz wird zusammen mit etwa fünf Gewichtsprozent

Hydrierkatalysator Pd/C (10 %) in einen Schlenckkolben gegeben und mit Methanol

überschichtet. Die resultierende Suspension wird 24 h unter einer

Wasserstoffatmosphäre bei RT gerührt. Anschließend wird die flüssige Phase durch

zwei doppelt gelegte Faltenfilter abfiltriert und der Rückstand mit reichlich

Methanol gewaschen. Die vereinigten methanolischen Phasen werden unter

vermindertem Druck so weit wie möglich eingeengt und der Rückstand im

Hochvakuum getrocknet, um in quantitativer Ausbeute das gewünschte Amin zu

erhalten.

Allgemeine Arbeitsvorschrift AAV II zur Abspaltung von Boc‐Schutzgruppen:

Die zu entschützende Substanz wird in einer Mischung von fünf Teilen

Dichlormethan und einem Teil Trifluoressigsäure gelöst und 3 h bei RT gerührt.

Anschließend wird das Lösungsmittel nach Zugabe von reichlich Toluol unter

vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird noch weitere zwei Male in

Toluol aufgenommen und unter vermindertem Druck wieder eingeengt. Nach

Trocknen im Hochvakuum erhält man in quantitativer Ausbeute das gewünschte

Amin als Trifluoressigsäuresalz.

Zum Umsalzen kann das erhaltene Trifluoressigsäuresalz in 1 N Salzsäure gelöst

werden und unter vermindertem Druck wieder eingeengt, sowie im Hochvakuum

getrocknet werden. Bei empfindlichen Substanzen kann statt der Destillation die

wäßrige Phase auch schonender durch Lyophilisation entfernt werden.


90

Allgemeine Arbeitsvorschrift AAV III zur LiBr‐Spaltung von benzylischen

Bis(phosphonsäuredimethylestern):

Der zu verseifende benzylische Bis(phosphonsäuredimethylester) wird in absolutem

Acetonitril gelöst und 2.4 Äquivalente sorgfältig getrocknetes LiBr (1.2 Äquivalente

pro Phosphonsäureestergruppe) zugegeben. Die Lösung wird mindestens 16 h unter

Rückfluß erhitzt. Das entstehende benzylische Bisphosphonatsalz fällt als weißer

Feststoff aus. Nach Abkühlen der Lösung kann der Feststoff durch Zentrifugation

(4000 Upm, 5 min) abgetrennt werden. Zur Entfernung von überschüssigem LiBr

und etwaigen Verunreinigungen wird der Feststoff noch dreimal in Diethylether

aufgenommen und erneut zentrifugiert. Nach Trocknen im HV erhält man das

benzylische Bisphosphonat als weißes Lithiumsalz in quantitativer Ausbeute.

Bei reaktionsträgen Phosphonsäuredimethylestern kann die Reaktionszeit verlängert

werden und ein größerer Überschuß LiBr eingesetzt werden bis zum vollständigen

Umsatz. Die Reaktionskontrolle erfolgt am Einfachsten mittels 31P‐NMR.

In der Regel kann diese Vorschrift auch analog auf andere Substrate mit

unterschiedlicher Zahl von Phosphonsäuredimethylestergruppen angewendet

werden.

Allgemeine Arbeitsvorschrift AAV IV zur Peptidknüpfung mit auf Hydroxybenz‐

triazol basierenden Kupplungsreagenzien (HBTU, TBTU, HCTU, TCTU) in Lösung:

Ein Äquivalent der Carbonsäure wird in absolutem Dichlormethan oder DMF (je

nachdem, worin sich die zu kuppelnde Carbonsäure und Amin vollständig lösen.

DCM ist vorzuziehen. Auch Mischungen aus DCM und DMF sind möglich.) gelöst

und auf 0 °C gekühlt. Dazu werden 2.5 Äquivalente HOBt, 1.0 Äquivalente des

Kupplunsreagenzes und 3.0 Äquivalente DIEA (wird das zu kuppelnde Amin als

Hydrochlorid eingesetzt, so wird die Menge an DIEA entsprechend erhöht)

zugegeben und 15 Minuten bei 0 °C gerührt. Anschließend werden 1.0 Äquivalente

des zu kuppelnden Amins zugefügt und die Lösung 1‐3 h bei RT gerührt. Der

Fortschritt der Reaktion kann per DC kontrolliert werden (Wird DMF als


91

Lösungsmittel verwendet, so wird hierfür ein Aliquot entnommen, dieses in etwa

1 mL DCM aufgenommen und mit 1 mL Wasser gewaschen. Die organische Phase

kann nun auf eine DC‐Karte aufgetragen werden.). Die Reaktion wird schließlich

durch Zugabe von Wasser beendet. Wurde DMF als Lösungsmittel verwendet, so

wird nun Dichlormethan zugegeben. Die organische Phase wird je dreimal mit 1 M

NaHSO4‐Lösung, 1 M Natriumhydrogencarbonatpuffer pH 10 und gesättigter

Natriumchloridlösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet, unter vermindertem

Druck eingeengt und am HV getrocknet. Eine weitere Aufreinigung kann

säulenchromatographisch erfolgen.

Bei der Kupplung von Phosphonsäurebausteinen ist zu beachten, dass diese häufig

partiell wasserlöslich sind. Daher kann zur Verbesserung der Ausbeute in diesem

Fall das Waschen der organischen Phase unterbleiben und direkt

säulenchromatographisch aufgereinigt werden.


92

7.2.2 Synthesen zu Kapitel 4.2

Rac‐2‐(benzyloxycarbonylamino)‐2‐(dimethoxyphosphoryl)essigsäure

(Z‐PGly‐OH) 10

OHN

O POH

O

MeO OMeO

C12H16NO7P, MG: 317.23 g/mol

Darstellung:

392 mg (1.183 mmol) rac‐Z‐Phosphonoglycinsäuretrimethylester werden in 15 mL

Methanol gelöst und auf ‐18 °C gekühlt. Dazu gibt man in 5 mL Wasser gelöste

32 mg (1.336 mmol; 1.1 Äq.) Lithiumhydroxid. Die Mischung wird zunächst 4 h bei ‐

18 °C und danach noch weitere 20 h bei ‐4 °C gerührt. Nach Zugabe von etwa

weiteren 30 mL Wasser schüttelt man die Lösung mit 40 mL Dichlormethan aus. Aus

der organischen Phase kann übriges Edukt wiedergewonnen werden. Die wässrige

Phase wird mit 0.2 N angesäuert und wiederum mit Dichlormethan ausgeschüttelt.

Nach Trocknen der organischen Phase mit Natriumsulfat und Entfernen des

Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhält man 262 mg (0.826 mmol; 69 %)

Rac‐2‐(benzyloxycarbonylamino)‐2‐(dimethoxyphosphoryl)essigsäure als farblosen,

leicht öligen Feststoff.

Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 3.76 (d, 3JHP = 11.0 Hz, 3 H, ‐O‐CH3), 3.85 (d, 3JHP =

11.3 Hz, 3 H, ‐O‐CH3), 4.97 (dd, 2JHP = 22.3 Hz, 3JHH = 9.1 Hz, 2 H, P‐CH), 5.11 (s, 2 H,

Z‐CH2‐), 5.81 (d, 3JHH = 8.8 Hz, 1 H, NH), 7.31‐7.35 (m, 5 H, Ar‐H), 10.02 (br s, 1 H,

COOH).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 20.4.

ESI‐MS (MeOH): m/z = 340 [M+Na+].


93

3,5‐Bis(brommethyl)nitrobenzen 11a

NO2

Br Br

C8H7Br2NO2, MG: 308.95 g/mol

Darstellung:

20.0 g (132 mmol) 5‐m‐Nitroxylol werden in 300 mL Tetrachlorkohlenstoff gelöst und

54.2 g (304 mmol; 2.3 Äq.) N‐Bromsuccinimid sowie wenig AIBN zugefügt. Die

Suspension wird langsam erhitzt. Nach Anspringen der Reaktion, erkennbar an dem

sich bildenden und an der Oberfläche schwimmenden Succinimid, wird die

Suspension 3 h refluxiert. Nach dem Abkühlen wird das feste Succinimid abfiltriert

und der Filterkuchen mit etwas Tetrachlorkohlenstoff gewaschen. Die vereinigten

organischen Phasen werden am Rotationsverdampfer abdestilliert und das

verbleibende Rohprodukt im HV getrocknet. Dabei handelt es sich um ein Gemisch

unterschiedlich häufig bromierter Derivate, wobei das gewünschte Produkt zu einem

Anteil von etwa 30 % enthalten sein sollte. Das Gemisch kann jedoch ohne weitere

Aufreinigung in der nächsten Reaktionsstufe eingesetzt werden und dort leicht

getrennt werden.

Ist dennoch eine Aufreinigung gewünscht, so können die Reaktionsprodukte in

möglichst wenig Essigsäureethylester gelöst werden. Daraufhin wird so lange n‐

Hexan zugegeben, bis eine leichte Trübung auftritt. 6.1 g 3,5‐

Bis(brommethyl)nitrobenzen (20 mmol, 15 %) fallen nach etwa 12 h Stehen bei 4 °C

als weißer Feststoff aus.

Analytik:

1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 4.52 (s, 4 H, ‐CH2), 7.75 (s, 1 H, Ar‐H), 8.19 (d, 4JHH =

1.5 Hz, 2 H, Ar‐H).


94

3,5‐Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)nitrobenzen (BP‐NO2) 11

NO2

P PMeOMeO

OOMe

OMe

O

C12H19NO8P2 ; MG: 367.23 g/mol

Darstellung:

4.5 g 3,5‐Bis(brommethyl)nitrobenzen 11a (14.6 mmol) werden in ca. 30 mL

Trimethylphosphit gelöst und 5 h unter Reflux erhitzt. Nach Abkühlen der nun in

der Regel dunkelbraunen Lösung wird überschüssiges Trimethylphosphit

abkondensiert. Der Rückstand wird säulenchromatographisch (DCM/MeOH 15:1

v/v) aufgereinigt. Man erhält nach Trocknung im HV 4.2 g 3,5‐

Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)nitrobenzen (11.6 mmol, 80 %) als weißen Feststoff.

Analytik:

DC: RF (EE/MeOH 2:1 v/v) = 0.45, RF (DCM/MeOH 10:1 v/v) = 0.59.

1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 3.25 (d, 2JHP = 22.3 Hz, 4 H, ‐PCH2), 3.73 (d, 3JHP = 10.7

Hz, 12 H, POCH3), 7.59(s, 1 H, Ar‐H), 8.04‐8.07 (m, 2 H, Ar‐H).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 27.3.


95

3,5‐Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin (BP‐NH2) 9

NH2

P PMeOMeO

OOMe

OMe

O

C12H21NO6P2 , MG: 337.08 g/mol

Darstellung:

Etwa 50 mg Pd/C – Hydrierkatalysator (10 %) werden in einer Lösung von 1.0 g 3,5‐

Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)nitrobenzen 11 (2.72 mmol) in 15 mL Methanol

suspendiert. Diese Suspension wird in einer Wasserstoffatmosphäre 15 h bei

Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird der Katalysator über zwei doppelt

gelegte Faltenfilter abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Das Lösungsmittel wird

unter vermindertem Druck abdestilliert und der verbleibende ölige, farblose

Rückstand im HV getrocknet, wobei er häufig auskristallisiert. Das Rohprodukt kann

ohne weitere Aufreinigung für nachfolgende Kupplungsreaktionen eingesetzt

werden.

Analytik:

DC (DCM/MeOH 10:1 v/v): RF = 0.20

1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 3.04 (d, 2JHP = 21.8 Hz, 4 H, ‐P‐CH2), 3.65 (d, 3JHP = 10.8

Hz, 12 H, ‐PO‐CH3), 6.64 (s, 1 H, Ar‐H), 7.98 (s, 3 H, Ar‐H).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.4.


96

Rac‐Benzyloxycarbonyl‐2‐(dimethoxyphosphoryl)glycinyl‐3,5‐

bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin (BP‐PGly‐Z) 13

OHN

O P

O

MeO OMeO

NH

P

P

MeOMeO

O

OMeMeO

O

C24H35N2O12P3 MG: 636.46 g/mol

Darstellung:

75 mg (0.236 mmol) Rac‐2‐(benzyloxycarbonylamino)‐2‐dimethoxyphosphoryl)essig‐

säure und 88 mg (0.260 mmol; 1.1 Äq.) 3,5‐Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin

werden in 30 mL trockenem Dichlormethan gelöst. Dazu werden 67 mg (0.260 mmol;

1.1 Äq.) Mukaiyama‐Reagenz und 100 μL (0.709 mmol; 3 Äq.) Triethylamin gegeben.

Die Lösung wird für 15 h gerührt und anschließend je dreimal mit 1 M NaHSO4, 1 M

Na2CO3/NaHCO3 und Brine ausgeschüttelt. Nach Trocknen der organischen Phase

über Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels unter vermindertem

Druck werden 100 mg BP‐PGly‐Z 13 (0.157 mmol; 66 %) erhalten.

Analytik:

DC (Essigsäureethylester/Ethanol 1:1 v/v): RF = 0.37.


Hz, 12 H, Bz‐POCH3), 3.78 (d, 3JHP = 11.0 Hz, 3 H, Gly‐POCH3), 3.89 (d, 3JHP = 11.0 Hz,

3 H, Gly‐POCH3), 5.00 (dd, 2JHP = 20.0 Hz, 3JHH = 8.0 Hz, 1 H, ‐PCHNH‐), 5.16 (s, 2 H,

Z‐CH2), 5.80 (d, 3JHH = 7.0 Hz, 1 H, Gly‐NH), 7.02 (s, 1 H, Ar‐H), 7.33‐7.37 (m, 7 H, Ar‐

H), 8.86 (s, 1 H, Ar‐NH).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 21.2, 28.9.

FD‐MS (MeOH): m/z = 636 [M+].

ESI‐MS (MeOH): m/z = 637 [M+H+], 659 [M+Na+], 675 [M+K+].

HRMS (ESI, MeOH), ber. für C24H35NaN2O12P3+: 659.1301, gef.: 659.1313.


97

Rac‐2‐(dimethoxyphosphoryl)glycinyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin

(BP‐PGly‐NH2) 16

H2N

P

O

MeO OMeO

NH

P

P

MeOMeO

O

OMeMeO

O

C16H29N2O10P3, MG: 502.33 g/mol

Darstellung: AAV I

Analytik:


Hz, 12 H, Bz‐POCH3), 3.85 (d, 3JHP = 10.8 Hz, 3 H, Gly‐POCH3), 3.89 (d, 3JHP = 10.8 Hz,

3 H, Gly‐POCH3), 4.03‐4.11 (m, 1 H, Gly‐NH), 7.01 (s, 1 H, Ar‐H), 7.47 (s, 2 H, Ar‐H),

9.32 (s, 1 H, Ar‐NH).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 24.6, 28.9.


98

Rac‐N‐[Benzyloxycarbonyl‐2‐(methoxyphosphinato)glycinyl]‐3,5‐

bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin Trilithiumsalz (BP2‐‐PGly‐‐Z) 14

OHN

O P

O

MeO OLiO

NH

P

P

LiOMeO

O

OLiMeO

O

C21H26Li3N2O12P3, MG: 612.18 g/mol

Darstellung:

30 mg BP‐PGly‐Z 13 (47 mmol, 1.0 Äq.) werden in absolutem Acetonitril gelöst und

5.0 Äq. sorgfältig getrocknetes Lithiumbromid zugegeben. Die Lösung wird 16 h

unter Rückfluß erhitzt. Das entstehende Trisphosphonatsalz fällt als weißer Feststoff

aus. Nach Abkühlen der Lösung kann der Feststoff durch Zentrifugation (4000 Upm,

5 min) abgetrennt werden. Er wird noch dreimal in Diethylether wieder

aufgenommen und erneut zentrifugiert. Nach Trocknen im HV erhält man 28 mg

BP3‐‐PGly‐Z 14 (28 mg, 98 %) als weißen Feststoff.

Analytik:

1H‐NMR (400 MHz, D2O): δ = 3.06 (d, 2JHP = 20.3 Hz, 4 H, ‐PCH2), 3.55 (d, 3JHP = 9.4 Hz,

6 H, Bz‐POCH3), 3.65 (d, 3JHP = 10.5 Hz, 3 H, Gly‐POCH3), 4.62 (d, 2JHP = 20.7 Hz, 1 H,

PCHNH‐), 5.20 (s, 2 H, Z‐CH2), 7.05‐7.47 (m, 8 H, Ar‐H).

13C‐NMR (100 MHz, D2O): δ = 23.2, 32.7, 34.0, 51.8, 51.9, 52.8, 52.9, 54.2, 55.5, 67.3,

67.5, 67.8, 120.7, 127.7, 127.8, 128.4, 128.7, 135.7, 136.5, 157.9, 158.4, 168.8.

31P‐NMR (81 MHz, D2O): δ = 15.7, 26.7.

ESI‐MS (MeOH, ESI‐negativ): m/z = 197 [M3‐], 299 [M3‐+Li+]2‐.


99

Rac‐N‐[2‐(methoxyphosphinato)glycinyl]‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin

Trilithiumsalz (BP2‐‐PGly‐‐NH2) 15

H2N

P

O

MeO OLiO

NH

P

P

LiOMeO

O

OLiMeO

O

C13H20Li3N2O10P3 , MG: 478.05 g/mol

Darstellung: AAV I

Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 2.90 (d, 2JHP = 21.0 Hz, 4 H, PCH2), 3.46 (d, 3JHP =

10.8 Hz, 6 H, Bz‐POCH3), 3.53 (d, 3JHP = 10.7 Hz, 3 H, Gly‐POCH3), 4.04 (d, 2JHP = 17.0

Hz, 1 H, PCHNH‐), 6.92 (s, 1 H, Ar‐H), 7.30 (d, 4JHP = 1.5 Hz, 2 H, Ar‐H).

31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 20.4, 25.9.

ESI‐MS (H2O, ESI‐negativ): m/z = 230 [M3‐+H+]2‐.


100

Rac‐ 2‐(dimethoxyphosphoryl)glycinmethylester 17

H2N

P

O

MeO OMeO

COOMe

C6H12NO6P , MG: 225.14 g/mol

Darstellung: ΑAV I

Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 2.82 (s, 3 H, ‐COCH3), 3.80 (d, 3JHP = 11.1Hz, 6 H, ‐

POCH3), 5.23 (d, 2JHP = 22.1Hz, 1 H, ‐PCHNH2).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 15.1.

(Benzyloxycarbonylglycinyl)‐(2‐phosphono)glycintrimethylester

(Z‐Gly‐PGly‐OMe) 18

HN

O P

O

MeO OMeO

COOMeO NH

O

C16H21N2O9P , MG: 416.32 g/mol

Darstellung:

Eine Lösung von 1.56 g Rac‐ 2‐(dimethoxyphosphoryl)glycinmethylester 17

(6.91 mmol, 1.0 Äq.) in DMF wird auf 0 °C gekühlt und 1.44 g Z‐Gly‐OH (6.91 mmol,

1.0 Äq.), 2.93 g Cl‐HOBt (6.91 mmol, 1.0 Äq.), 2.86 g HCTU (6.91 mmol, 1.0 Äq.) und

4.70 mL DIEA (27.7 mmol, 4.0 Äq.) zugegeben. Die Mischung wird auf RT allmählich

erwärmt und 2 h gerührt. Anschließend wird Wasser zugegeben und dreimal mit

DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden wiederum je dreimal

mit 1M NaHSO4‐Lösung, 1 M Natriumhydrogencarbonatpuffer pH 10 und

gesättigter NaCl‐Lösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet, unter vermindertem

Druck eingeengt und am HV getrocknet. Das so erhaltene Produkt kann

säulenchromatographisch (MeOH/EE 1:10 v/v) weiter aufgereinigt werden. Es

werden 920 mg Z‐Gly‐Pgly‐OMe 18 (2.21 mmol, 32 %)erhalten.


101

Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 2.83 (s, 3 H, ‐COCH3), 3.79 (d, 3JHP = 11.0 Hz, 3 H, ‐

POCH3), 3.82 (d, 3JHP = 11.2 Hz, 3 H, ‐POCH3), 3.98 (d, 3JHH = 5.3 Hz, 2 H, Gly‐CH2),

5.14 (s, 2 H, Z‐CH2), 5.25 (d, 2JHP = 22.0 Hz, 1 H, ‐PCHNH‐), 7.35‐7.36 (m, 5 H, Ar‐H),

8.02 (s, 1 H, NH).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 18.5.

ESI‐MS (MeOH): m/z = 439 [M+Na+]+.

N‐[4‐(1,3‐dioxoisoindolin‐2‐yl)benzyl]‐N‐[(diethoxyphosphoryl)methyl]‐3,5‐

bis(dimethoxyphosphorylmethyl)benzamid 4b

P PMeOMeO

OOMe

OMe

O

NO

P N

O

O

EtOEtO O

C33H39N2O12P3, MG: 750.19 g/mol

Darstellung:

100 mg (0.194 mmol) 3,5‐Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)‐N‐(diethoxyphosphoryl‐

methyl) benzamid werden in 10 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und mit 1.3

Äq. Natriumhydrid versetzt. Die Suspension wird zwei Stunden bei RT gerührt,

bevor portionsweise 306 mg 2‐(4‐(Brommethyl)phenyl)isoindolin‐1,3‐dion

(0.97 mmol, 5.0 Äq.) zugegeben werden. Nach vier weiteren Stunden bei 60 °C wird

das Dimethylformamid im Vakuum abdestilliert und das Produkt

säulenchromatographisch (Essigsäureethylester/Ethanol 2:1 v/v) gereinigt.


102

Analytik:


1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.37 (t, 3JHH = 7.0 Hz, 6 H, CH3CH2‐), 3.17 (d, 2JHP =

22.0 Hz, 4 H, Ar‐CH2P), 3.65 (d, 3JHP = 10.8 H, 12 H, POCH3), 3.95 (d, 2JHP = 11.5 Hz, 2

H, NCH2P), 4.15‐428 (m, 4 H, PCH2CH3), 4.54 und 4.81 (s, 2 H, NCH2, Peptidbindung

cis‐ bzw. transständig), 7.31‐7.52 (m, 7 H, Ar‐H), 7.79‐7.83 (m, 2 H, Ar‐H), 7.95‐8.00

(m, 2 H, Ar‐H).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 22.6, 28.3.

ESI‐MS (CHCl3/MeOH): m/z = 751 [M+H+], 773 [M+Na+].

FD‐MS (CHCl3/MeOH): m/z = 750 [M+].

(Benzyloxycarbonylglycinyl)‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin (BP‐Gly‐Z)

21

HN

P PMeOMeO

OOMe

OMe

O

O

NH

OO

C22H30N2O9P2, MG: 528.43 g/mol

Darstellung:

142 mg Z‐Gly‐OH (0.68 mmol, 1.0 Äq.), 283 mg Cl‐HOBt (1.67 mmol, 2.5 Äq.) und

0.35 mL Diisopropylethylamin (2.04 mmol, 3.0 Äq.) werden in 10 mL absolutem

Dimethylformamid gelöst. Nach Zugabe von 240 mg TCTU (0.68 mmol, 1.0Äq.) wird

die Lösung zehn Minuten gerührt, bevor schließlich 270 mg 3,5‐

Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin 9 (0.80 mmol, 1.2 Äq.) hinzugefügt werden

und weitere zwei Stunden bei RT gerührt wird. Die Reaktion wird durch Zugabe von


103

30 mL Wasser beendet und die wäßrige Phase vier Male mit je 40 mL Chloroform

extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter

Natriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach

Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck und

säulenchromatographischer Aufreinigung des Rückstandes (EE/Ethanol 2:1 v/v)

verbleiben 268 mg (0.51 mmol, 75 %) BP‐Gly‐Z als weißer Feststoff.

Analytik:


1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 3.10 (d, 2JHP = 22.2 Hz, 4 H, P‐CH2‐), 3.66 (d, 3JHP = 10.5

Hz, 12 H, ‐OCH3), 3.99 (s, 2 H, Gly‐α‐CH2), 5.12 (s, 2 H, Ar‐CH2‐O‐), 6.94 (s, 1 H, Ar‐

H), 7.32 (m, 5 H, Ar‐H), 7.42 (s, 2 H, Ar‐H), 8.85 (s, 1 H, NH).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.1.


HRMS (ESI, MeOH), ber. für C22H30N2NaO9P2+: 551.1319, gef.: 551.1289.

N‐Glycinyl‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin Dilithiumsalz (BP2‐Gly‐NH2)

32

HN

P P-O

MeO

OO-

OMe

O

O

NH2

Li+ Li+

C12H18Li2N2O7P2, MG: 378.11 g/mol

Darstellung: AAV I


104

Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 2.64 (d, 2JHP = 20.5 Hz, 4 H, PCH2), 3.09 (s, 2 H, α‐

CH2), 3.22 (d, 3JHP = 10.5 Hz, 6 H, POCH3), 6.72 (s, 1 H, Ar‐H), 7.08 (s, 2 H, Ar‐H).

31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 25.9.

ESI‐MS (MeOH, ESI‐negativ): m/z = 182 [M2‐], 365[M2‐+H+]‐.

(Benzyloxycarbonylglycinyl)glycinyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin

(BP‐Gly‐Gly‐Z) 22

NHP

P

MeO OMe

O

OMeOMe

O

O HN

ONH

O

O

C24H33N3O10P2, MG: 585,48 g/mol

Darstellung: AAV IV

Kupplungsreagentien: HCTU, Cl‐HOBt

Edukte: 3,5‐Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin 9 und Z‐GlyGly‐OH

Ausbeute: 82 %

Analytik:

DC (EE/MeOH 2:1 v/v): RF = 0.33, (EE/MeOH 5:1 v/v): RF = 0.09.

Smp.: 135 °C.


Hz, 12 H, ‐OCH3), 3.94 (d, 3JHH = 3.0 Hz, 2 H, Gly‐α‐CH2), 4.08 (d, 3JHH = 4.0 Hz, 2 H,

Gly‐α‐CH2), 5.11 (s, 2 H, Ar‐CH2‐O‐), 6.71 (br s, 1 H, NH), 6.87 (s, 1 H, Ar‐H), 7.29‐

7.34 (m, 5 H, Ar‐H), 7.47 (s, 2 H, Ar‐H), 9.37 (s, 1 H, NH).


105

13C‐NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 32.1 (d, 1JCP = 91.0 Hz), 43.5, 44.3, 53.0, 67.0, 119.7,

126.4, 128.1, 128.2, 131.8‐132.0 (m, 1 C), 136.2, 138.7, 157.2, 167.6, 170.6, 174.9.

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.4.

ESI‐MS (CHCl3/MeOH): m/z = 608 [M+Na+], 624 [M+K+].

FD‐MS (CHCl3/MeOH): m/z = 585 [M]+, 608 [M+Na+].

N‐Glycinylglycinyl‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin Dilithiumsalz

(BP2‐‐Gly‐Gly‐NH2) 33

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

O HN

ONH2

Li+

Li+

C24H33N3O10P2, MG: 585,48 g/mol

Darstellung: AAV III

Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 2.91 (d, 2JHP = 20.5 Hz, 4 H, P‐CH2‐), 3.32 (s, 2 H,

Gly‐α‐CH2NH2), 3.48 (d, 3JHP = 10.3 Hz, 6 H, ‐OCH3), 4.00 (s, 2 H, Gly‐α‐CH2), 7.01 (s,

1 H, Ar‐H), 7.31 (s, 2 H, Ar‐H).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 26.0.

ESI‐MS (MeOH): m/z = 424 [M+3H+]+, 436 [M+H++2Li+]+, 468 [M+H++2Na+]+, 500

[M+H++2K+]+.


106

(Benzyloxycarbonylglycinyl)glycinylglycinyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)‐

anilin (BP‐Gly‐Gly‐Gly‐Z) 23

NHP

P

MeO OMe

O

OMeOMe

O

O HN

ONH

O HN O

O

C26H36N4O11P2, MG: 642.53 g/mol

Darstellung: AAV IV

Kupplungsreagentien: HCTU, Cl‐HOBt

Edukte: 3,5‐Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin 9 und Z‐GlyGlyGly‐OH

Ausbeute: 48 %

Analytik:

DC (Essigsäureethylester/Methanol 10:1 v/v): RF = 0.03.


Hz, 12 H, ‐OCH3), 3.79 (d, 3JHH = 6.0 Hz, 2 H, Gly‐α‐CH2), 3.98 (d, 3JHH = 6.0 Hz, 2 H,

Gly‐α‐CH2), 4.14 (d, 3JHH = 6.6 Hz, 2 H, Gly‐α‐CH2), 5.30 (s, 2 H, Ar‐CH2‐O‐), 6.70 (br s,

1 H, NH), 6.85 (s, 1 H, Ar‐H), 7.17‐7.25 (m, 5 H, Ar‐H), 7.68 (s, 2 H, Ar‐H), 7.77‐7.84

(m, 2 H, NH), 9.11 (s, 1 H, NH).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 30.0.



107

N‐(Benzyloxycarbonylglycinyl)glycinylglycinyl‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)‐

methyl]anilin Dilithiumsalz (BP2‐‐Gly‐Gly‐Gly‐Z) 23a

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

O HN

ONH

O HN O

OLi+

Li+

C24H30Li2N4O11P2, MG: 626.34 g/mol


Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 2.99 (d, 2JCP = 20.2 Hz, 4 H, CH2P), 3.50 (d, 3JCP =

10.5 Hz, 6 H, POCH3), 3.90 (s, 2 H, Gly‐CH2), 4.00 (s, 2 H, Gly‐CH2), 4.04 (s, 2 H, Gly‐

CH2), 5.11 (s, 2 H, Z‐CH2), 7.00 (s, 1 H, Ar‐H), 7.19 (s, 2 H, Ar‐H), 7.38 (s, 5 H, Ar‐H).

13C‐NMR (75 MHz, d4‐MeOD): δ = 33.9 (d, 1JCP = 128.6 Hz), 43.1, 43.4, 44.3, 52.4, 67.9,

121.1, 128.3, 128.4,129.0, 129.3, 136.2, 136.7, 173.8.

31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 26.8.

N‐Glycinylglycinylglycinyl‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin Dilithiumsalz

(BP2‐‐Gly‐Gly‐Gly‐NH2) 34

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

O HN

ONH

ONH2

Li+

Li+

C16H24Li2N4O9P2, MG: 492.21 g/mol


108

Darstellung: AAV I

Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, D2O): δ = 2.96 (d, 2JCP = 20.2 Hz, 4 H, CH2P), 3.47 (d, 3JCP = 10.2 Hz,

6 H, POCH3), 3.96 (s, 2 H, Gly‐CH2), 4.00 (s, 2 H, Gly‐CH2), 4.03 (s, 2 H, Gly‐CH2), 6.96

(s, 1 H, Ar‐H), 7.14 (s, 2 H, Ar‐H).

31P‐NMR (81 MHz, D2O): δ = 26.7.

ESI‐MS (MeOH): m/z = 486 [M2‐+ Li++H+], 537 [M2‐+ Na++HCl].

S‐(Benzyloxycarbonylglycinyl)glycinylalaninyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphoryl‐

methyl)anilin (BP‐Ala‐Gly‐Gly‐Z) 26

NHP

P

MeO OMe

O

OMeOMe

O

O HN

ONH

O HN O

O

C27H38N4O11P2, MG: 656.56 g/mol

Darstellung:

193 mg Z‐Gly‐Gly‐Ala‐OH (0.572 mmol, 1Äq.) werden in 20 mL absolutem DMF

gelöst und 292 μL DIEA (1.72 mmol, 3.0 Äq.), 242 mg Cl‐HOBt (1.43 mmol, 2.5 Äq.)

und 214 mg TCTU zugegeben. Die Mischung wird 15 Minuten bei RT gerührt, bevor

183 mg in wenigen mL absolutem DCM gelöstes 3,5‐

Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin 9 (0.574 mmol, 1.0 Äq.) zugefügt werden und

weitere zwei Stunden gerührt wird. Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe

von 3 mL H2O beendet und die flüssige Phase durch Abkondensieren entfernt. Der

Rückstand wird säulenchromatographisch gereinigt (Essigsäureethylester/Methanol

2:1 v/v), um 136 mg Produkt (0.207 mmol, 36 %) als gelbliches Öl zu isolieren.


109

Analytik:

DC (Essigsäureethylester/Methanol 2:1): RF = 0.06.

1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.51 (d, 3JHH = 7.0 Hz, 3 H, Ala‐CH3), 3.09 (d, 2JCP =

20.1 Hz, 4 H, CH2P), 3.45‐3.50 (m, 4 H, Gly‐CH2), 3.65 (d, 3JCP = 10.8 Hz, 12 H, POCH3),

4.12 (q, 3JHH = 7.0 Hz, 1 H, Ala‐α‐CH), 4.70 (d, 2JHH = 11.7 Hz, 1 H, Z‐CH2), 5.00 (d, 2JHH

= 12.0 Hz, 1 H, Z‐CH2), 6.89 (s, 1 H, Ar‐H), 7.13‐7.26 (m, 5 H, Ar‐H), 7.48 (br s, 1 H,

NH), 7.56‐7.69 (m, 2 H, NH), 7.76 (s, 2 H, Ar‐H), 8.97 (s, 1 H, NH).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.4.


(S)‐N‐[(Benzyloxycarbonylglycinyl)glycinylalaninyl]‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)‐

methyl]anilin Dilithiumsalz (BP2‐‐Ala‐Gly‐Gly‐Z) 26a

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

O HN

ONH

O HN O

O

Li+

Li+

C25H32Li2N4O11P2, MG: 640.37 g/mol


Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, D2O): δ = 1.43 (d, 3JHH = 7.0 Hz, 3 H, Ala‐CH3), 2.97 (d, 2JCP = 20.5

Hz, 4 H, CH2P), 3.49 (d, 3JCP = 10.8 Hz, 6 H, POCH3), 3.86 (s, 2 H, Gly‐CH2), 3.95 (s, 2

H, Gly‐CH2), 4.41 (q, 3JHH = 7.0 Hz, 1 H, Ala‐α‐CH), 5.08 (s, 2 H, Z‐CH2), 6.99 (s, 1 H,

Ar‐H), 7.16 (s, 2 H, Ar‐H), 7.35‐7.37 (m, 5 H, Ar‐H).

31P‐NMR (81 MHz, D2O ): δ = 26.7.

ESI‐MS (MeOH, ESI‐negativ): m/z = 313 [M2‐].


110

N‐Glycinylglycinylalaninyl‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin Dilithiumsalz

(BP2‐‐Ala‐Gly‐Gly‐NH2) 37

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

O HN

ONH

ONH2

Li+

Li+

C25H32Li2N4O11P2, MG: 640.37 g/mol

Darstellung: AAV I

Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, D2O): δ = 1.44 (d, 3JHH = 7.2 Hz, 3 H, Ala‐CH3), 2.99 (d, 2JCP = 20.5

Hz, 4 H, CH2P), 3.49 (d, 3JCP = 10.4 Hz, 6 H, POCH3), 3.54 (s, 2 H, Gly‐CH2), 3.99 (s, 2

H, Gly‐CH2), 4.42 (q, 3JHH = 7.2 Hz, 1 H, Ala‐α‐CH), 7.00 (s, 1 H, Ar‐H), 7.17 (s, 2 H,

Ar‐H).

31P‐NMR (81 MHz, D2O ): δ = 26.7.

ESI‐MS (MeOH): m/z = 246 [M2‐], 493 [MH‐], 499 [M2‐+Li+]‐.


111

(S)‐(Benzyloxycarbonylalaninyl)‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin

(BP‐Ala‐Z) 24

HN

P PMeOMeO

OOMe

OMe

O

O

NH

OO

C23H32N2O9P2, MG: 542.46 g/mol

Darstellung: AAV IV

Kupplungsreagentien: TBTU, HOBt

Edukte: 3,5‐Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin 9 und Z‐Ala‐OH

Ausbeute: 39 %

Analytik:

DC (EE/EtOH 2:1 v/v): RF = 0.30.

1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.40 (d, 3JHH = 7.0 Hz, 3 H, CHCH3), 3.07 (d, 2JHP = 21.8

Hz, 4 H, P‐CH2‐), 3.66 (d, 3JHP = 10.7 Hz, 12 H, ‐OCH3), 4.30‐4.49 (m, 1 H, Ala‐α‐CH),

5.12 (d, 4JHH = 2.0 Hz, 2 H, Ar‐CH2‐O‐), 5.84 (d, 3JHH = 7.7 Hz, 1 H, Z‐NH), 6.92 (s, 1 H,

Ar‐H), 7.27‐7.38 (m, 7 H, Ar‐H), 9.04 (s, 1 H, Ar‐NH).

13C‐NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 18.6, 32.5 (1JCP = 91.4 Hz), 51.2, 53.0 (2JCP = 3.7 Hz), 67.1,

119.8, 126.7, 128.1, 128.2, 128.5, 132.2 (2JCP = 4.1 Hz), 136.2, 138.6, 156.2, 170.9.

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.1.



112

(S)‐N‐[(Benzyloxycarbonylalaninyl)]‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin

Dilithiumsalz (BP2‐‐Ala‐Z) 24a

HN

P P-O

MeO

OO-

OMe

O

O

NH

OO

Li+ Li+

C21H26Li2N2O9P2, MG: 526.27/mol


Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 1.35 (d, 3JHH = 7.2 Hz, 3 H, CHCH3), 2.88 (d, 2JHP =

20.8 Hz, 4 H, P‐CH2‐), 3.44 (d, 3JHP = 10.5 Hz, 6 H, ‐OCH3), 4.22 (q, 3JHH = 7.0 Hz, 1 H,

Ala‐α‐CH), 5.04 (d, 4JHH = 1.5 Hz, 2 H, Ar‐CH2‐O‐), 6.99 (s, 1 H, Ar‐H), 7.22‐7.30 (m, 7

H, Ar‐H).

31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 25.9.

(S)‐N‐Alaninyl‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin Dilithiumsalz

(BP2‐‐Ala‐NH2) 35

HN

P P-O

MeO

OO-

OMe

O

O

NH2

Li+ Li+

C13H20Li2N2O7P2, MG: 392.14 g/mol


113

Darstellung: AAV I

Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 1.35 (d, 3JHH = 7.0 Hz, 3 H, Ala‐CH3), 2.96 (d, 2JHP =

20.5 Hz, 4 H, PCH2), 3.46 (d, 3JHP = 10.2 Hz, 6 H, POCH3), 3.68 (q, 3JHH = 7.0 Hz, 1 H,

Ala‐α‐CH), 6.97 (s, 1 H, Ar‐H), 7.16 (s, 2 H, Ar‐H).

31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 29.1.

ESI‐MS (MeOH, ESI‐negativ): m/z = 189 [M2‐], 379 [M2‐+H+]‐.

(S),(S)‐N‐[(Benzyloxycarbonylalaninyl)alaninyl]‐3,5‐

bis(dimethoxyphosphorylmethyl)‐anilin (BP‐Ala‐Ala‐Z) 25

NHP

P

MeO OMe

O

OMeOMe

O

O HN

ONH

O

O

C26H37N3O10P2, MG: 613.53 g/mol

Darstellung: AAV IV

Eingesetzt: 95 mg Z‐Ala‐Ala‐OH (0.32 mmol).

Kupplungsreagenz: TBTU, Lösungsmittel: DCM.

Ausbeute: 115 mg (0.19 mmol, 58 %).

Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.16‐1.36 (m, 6 H, CHCH3), 2.85‐3.10 (m, 4 H, CH2P),

3.55‐3.66 (m, 12 H, POCH3), 4.10‐4.33 (m, 1 H, α‐CH), 4.67‐4.82 (m, 1 H, α‐CH), 4.90‐

5.24 (m, 2 H, Z‐CH2), 6.77‐7.50 (m, 10 H, NH und Ar‐H), 9.51 (s, 1 H, NH)9.87 (s, 1 H,

NH).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.2, 29.8.

ESI‐MS (CHCl3/MeOH): m/z = 636 [M+Na+].


114

(S),(S)‐N‐[(Benzyloxycarbonylalaninyl)alaninyl]‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)‐

methyl]anilin Dilithiumsalz (BP2‐‐Ala‐Ala‐Z) 25a

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

O HN

ONH

O

O

Li+

Li+

C24H31Li2N3O10P2, MG: 597.35 g/mol


Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 1.25‐1.36 (m, 6 H, CHCH3), 2.84 (d, 2JHP = 20.5 Hz,

4 H, CH2P), 3.40 (d, 3JHP = 10.2 Hz, 6 H, POCH3), 4.02‐4.12 (m, 1 H, α‐CH), 4.26‐4.45

(m, 1 H, α‐CH), 5.03 (s, 2 H, Z‐CH2), 6.98 (s, 1 H, Ar‐H), 7.19‐7.33 (m, 7 H, Ar‐H).

13C‐NMR (50 MHz, d4‐MeOD): δ = 18.2, 18.7, 36.0 (d, 1JCP = 86.9 Hz), 50.3, 51.4, 52.6 (d,

2JCP = 4.5 Hz), 68.2, 120.7‐121.00 (m, 2 C), 129.1‐129.9 (m, 8 C), 137.7‐137.8 (m, 1 C),

139.2, 173.2, 175.8, 175.9.

31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 25.9.

ESI‐MS (MeOH, ESI‐negativ): m/z = 584 [M2‐+H+]‐.


115

(S),(S)‐N‐Alaninylalaninyl‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin Dilithiumsalz

(BP2‐‐Ala‐Ala‐Z) 36

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

O HN

ONH2

Li+

Li+

C16H25Li2N3O8P2, MG: 463.21 g/mol

Darstellung: AAV I

Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 1.22‐1.27 (m, 3 H, CHCH3), 1.38‐1.41 (m, 3 H,

CHCH3). 2.90 (d, 2JHP = 21.0 Hz, 4 H, CH2P), 3.45 (d, 3JHP = 10.5 Hz, 6 H, POCH3), 3.52‐

3.68 (m, 1 H, α‐CH), 4.40‐4.51 (m, 1 H, α‐CH), 7.00 (s, 1 H, Ar‐H), 7.31 (s, 2 H, Ar‐H).

31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 25.8.

ESI‐MS (MeOH, ESI‐negativ): m/z = 225 [M2‐], 479 [M2‐+Li++Na+], 493 [M2‐+Li++HCl].

(S)‐(Benzyloxycarbonylphenylalaninyl)‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin

(BP‐Phe‐Z) 29

HN

P PMeOMeO

OOMe

OMe

O

O

NH

OO

C29H36N2O9P2, MG: 618.55 g/mol


116

Darstellung: AAV IV

Eingesetzt: 90 mg Z‐Phe‐OH (0.30 mmol).



Analytik:


1H‐NMR (200 MHz, d4‐MeOD): δ = 3.10 (d, 2JHP = 22.1 Hz, 4 H, P‐CH2‐), 3.58 (d, 3JHP =

10.5 Hz, 12 H, ‐OCH3), 4.41 (m, 1 H, Phe‐α‐CH), 4.79 (s, 2 H, Phe‐CH2), 4.91 (s, 2 H,

Ar‐CH2‐O‐), 6.89 (s, 1 H, Ar‐H), 7.15 (m, 10 H, Ar‐H), 7.31 (s, 2 H, Ar‐H).

31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 34.1.


(S)‐(Benzyloxycarbonyl‐O‐tert‐butyl‐serinyl)‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)‐

anilin (BP‐Ser‐Z) 30

HN

P PMeOMeO

OOMe

OMe

O

O

NH

OO

O

C27H40N2O10P2, MG: 614.56 g/mol

Darstellung: AAV IV

Eingesetzt: 89 mg Z‐Ser(OtBu)‐OH (0.30 mmol).




117

Analytik:


1H‐NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.22 (s, 9 H, C(CH3)3), 3.12 (d, 2JHP = 22.1 Hz, 4 H, P‐

CH2‐), 3.45‐3.62 (m, 2 H, Ser‐OCH2), 3.67 (d, 3JHP = 13.5 Hz, 12 H, ‐OCH3), 3.89 (br s, 1

H, Ser‐α‐CH), 4.35 (s, 1 H, NH), 5.14 (s, 2 H, Ar‐CH2‐O‐), 6.98 (s, 1 H, Ar‐H), 7.33‐7.37

(m, 7 H, Ar‐H), 8.70 (s, 1 H, NH).

13C‐NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 27.4, 32.6 (d, 1JCP = 137.8 Hz), 52.9 (m), 55.1, 67.7, 67.2,

74.6, 119.6 (m), 127.1 (d), 128.2 (m), 132.5 (m), 132.6 (m), 136.0, 138.0, 156.1, 168.5.

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.1.



3‐tert‐Butyloxycarbonylaminobenzoyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin

(BP‐3ABz‐Boc) 27

NH

P

P

OMe

OMeO

OMe

O O

HNO

O

MeO

C24H34N2O9P2, MG: 556.48 g/mol

Darstellung: AAV IV

Eingesetzt: 100 mg Boc‐3ABz‐OH (0.422 mmol).

Kupplungsreagenz: TBTU, Lösungsmittel: DMF/DCM (1:1).

Ausbeute: 140 mg (0.253 mmol, 60 %).


118

Analytik:

1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.53 (s, 9 H, Boc‐CH3), 3.15 (d, 2JHP = 22.0 Hz, 4 H,

PCH2), 3.69 (d, 3JHP = 10.7 Hz, 12 H, OCH3), 6.80 (s, 1 H, Ar‐H), 7.00 (s, 1 H, Ar‐H),

7.34‐7.57 (m, 5 H, Ar‐H), 7.93 (s, 1 H, NH), 8.26 (s, 1 H, NH).

13C‐NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 28.4, 32.7 (1JCP = 91.7 Hz), 53.1 (2JCP = 3.7 Hz), 81.2,

117.0, 120.4, 121.7, 127.1, 129.5, 131.5, 132.5, 137.0, 139.0, 153.0, 159.1.

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.0


4‐tert‐Butyloxycarbonylaminobenzoyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin

(BP‐4ABz‐Boc) 28

NH

P

P

OMe

OMeO

OMe

O O

MeO

NHO

O

C24H34N2O9P2, MG: 556.48 g/mol

Darstellung:

121 mg p‐t‐Butyloxycarbonylaminobenzoesäure (0.89 mmol, 1.0 Äq.) und 496 mg

PyBOP (0.89 mmol 1.0 Äq.) werden in 10 mL absolutem DMF gelöst und 0.29 mL N‐

Methylmorpholin (2.63 mmol, 2.9 Äq.) sowie 380 mg 3,5‐Bis(dimethoxyphosphoryl‐

methyl)anilin 9 (1.13 mmol, 1.4 Äq.) zugegeben. Die Mischung wird 17 h lang bei RT

gerührt und an die Reaktion anschließend durch Zugabe von 40 mL gesättigter

Natriumchloridlösung beendet. Die wäßrige Phase wird zweimal mit je 80 mL

Chloroform extrahiert. Nach Vereinigung der organischen Phasen werden diese

wiederum dreimal mit je 30 mL gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Nach


119

Trocknen über Natriumsulfat, Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem

Druck und säulenchromatographischer Aufreinigung des Rückstandes

(Dichlormethan/Ethanol 15:1 v/v) werden 391 mg BP‐4ABz‐Boc (0.70 mmol, 79 %)

erhalten.

Analytik:

DC (Dichlormethan/Methanol 15:1 v/v): RF = 0.48.

1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.52 (s, 9 H, tBu‐CH3), 3.14 (d, 2JHP = 21.8 Hz, 4 H, P‐

CH2), 3.68 (d, 3JHP = 10.8 Hz, 12 H, POCH3), 6.82 (s, 1 H, NH), 6.99 (s, 1 H, Ar‐H), 7.46

(d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, ABz‐H), 7.55 (s, 2 H, Ar‐H), 7.78 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, ABz‐H),

7.95 (s, 1 H, NH).

13C‐NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 28.7, 33.0 (d, 1JCP = 91.5 Hz), 53.3 (d, 2JCP = 4.6 Hz), 81.2,

117.9, 120.4, 126.9, 128.5, 128.7, 132.5, 139.2, 142.3, 152.7, 165.5.

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.0.

ESI‐MS (CHCl3/MeOH): m/z = 523 [M+Na+‐C4H8], 579 [M+Na+].

HRMS (ESI, CHCl3/MeOH), ber. für C24H34N2NaO9P2+: 579.1632, gef.: 579.1690.

4‐Ammoniumbenzoyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)aniliniumtrifluoracetat

(BP‐4ABz+) 28a

NH

P

P

OMe

OMeO

OMe

O O

MeO

NH3+ F3C

O-

O

C21H27F3N2O9P2, MG: 570.39 g/mol

Darstellung: AAV II


120

Analytik:

DC (EE/Ethanol 2:1 v/v): RF = 0.27.

1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 3.10 (d, 2JHP = 21.8 Hz, 4 H, P‐CH2), 3.64 (d, 3JHP = 10.8

Hz, POCH3), 4.75 (br s, 3 H, ‐NH3+), 6.60 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, ABz‐H), 6.91 (s, 1 H, Ar‐

H), 7.57 (s, 2 H, Ar‐H), 7.69 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, ABz‐H), 8.38 (br s, 1 H, NH).

13C‐NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 32.7 (d, 1JCP = 91.7 Hz), 53.2 (d, 2JCP = 4.5 Hz), 114.2,

120.4, 123.9, 126.7, 129.3, 132.3, 139.4, 150.4, 165.8.

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.2.


4‐Ammoniumbenzoyl‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)methyl]anilin Lithiumsalz

(BP2‐‐4ABz+) 40

NH

P

P

OMe

O-

O

O-

O O

MeO

NH3+ Li+

C17H21LiN2O7P2, MG: 434.25 g/mol


Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, D2O): δ = 2.99 (d, 2JHP = 20.5 Hz, 4 H, P‐CH2), 3.53 (d, 3JHP = 10.3

Hz, 6 H, POCH3), 6.81 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, ABz‐H), 6.98 (s, 1 H, Ar‐H), 7.20 (s, 2 H,

Ar‐H), 7.65 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, ABz‐H).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 26.9.

ESI‐MS (H2O, ESI negativ): m/z = 427 [M2‐+H+], 213 [M2‐].


121

N‐Glycinylglycinyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin BP‐Gly‐Gly‐NH2 41

NHP

P

MeO OMe

O

OMeOMe

O

O HN

ONH2

C16H27N3O8P2, MG: 451.35 g/mol

Darstellung: AAV I

Analytik:


1H‐NMR (300 MHz, d4‐MeOD): δ = 1.94 (br s, 2 H, NH2), 3.22 (d, 2JHP = 21.6 Hz, 4 H, P‐

CH2‐), 3.27 (s, 2 H, ‐CH2NH2), 3.67 (d, 3JHP = 10.6 Hz, 12 H, ‐OCH3), 4.05 (s, 2 H, Gly‐α‐

CH2), 6.98 (s, 1 H, Ar‐H), 7.22 (s, 1 H, NH), 7.44 (s, 2 H, Ar‐H), 7.65 (s, 1 H, NH).

13C‐NMR (50 MHz, d4‐MeOD): δ = 32.5 (d, 1JCP = 91.0 Hz), 41.6, 44.0, 53.8 (d, 2JCP = 4.5

Hz), 121.1, 128.2, 133.6 (d, 2JCP = 4.9 Hz), 139.9, 168.0, 169.4.

31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 34.2.

ESI‐MS (MeOH): m/z = 452 [M+H+]+, 474 [M+Na+]+.


122

N‐{5‐[N3‐(tert‐butoxycarbonyl)guanidinylcarbonyl]pyrrol‐2‐carbonylglycinyl}‐3,5‐

bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin

(BP‐Gly‐PyrGua‐Boc) 46

NHP

P

OMeMeO

O

MeOMeO

O

O

HN

O

NH

NH

OHN

NH

O

O

C26H38N6O11P2, MG: 672.56 g/mol

N‐{5‐[N3‐(tert‐butoxycarbonyl)guanidinylcarbonyl]pyrrol‐2‐carbonyl‐

glycinyl}glycinyl‐3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin

(BP‐Gly‐Gly‐PyrGua‐Boc) 43

NHP

P

MeO OMe

O

OMeOMe

O

O HN

ONH

OHN HN

ONH

HNO

O

C28H41N7O12P2, MG: 729.61 g/mol

Gemeinsame Vorschrift zur Darstellung von 46 und 43:

49 mg der Guanidiniumcarbonylpyrrolcarbonsäure 42 (165 μmol, 1.0 Äq.) werden in

absolutem DMF gelöst und nacheinander 55 μL NMM (495 μmol, 3.0 Äq.) und 95 mg

PyBOP (182 μmol, 1.1 Äq.) zugegeben. Nach etwa 30 Minuten wird zu dieser Lösung

eine Suspension von 65 mg BP‐Gly‐NH2 21a bzw. 75 mg BP‐Gly‐Gly‐NH2 41 (165

μmol, 1.0 Äq.) in einigen mL absolutem DCM gespritzt. Die Mischung wird 40 h bei

RT gerührt und klart in dieser Zeit auf. Anschließend wird die Reaktion durch

Zugabe von gesättigter, wäßriger Natriumchloridlösung beendet und die wäßrige

Phase dreimal mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen

werden bis zur Trockene unter vermindertem Druck eingeengt. Das so erhaltene


123

Rohprodukt wird säulenchromatographisch (EE/EtOH 2:1) über Kieselgel

aufgereinigt. Es werden 31 mg BP‐Gly‐Pyr‐GUA‐Boc 46 (46 μmol, 28 %) bzw. 38 mg

BP‐Gly‐Gly‐Pyr‐GUA‐Boc 43 (52 μmol, 32 %) als weißer Feststoff erhalten.

Analytik 46:

DC: (EE/EtOH 2:1 v/v): RF = 0.12.

1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.45 (s, 9 H, tBu‐CH3), 2.99 (d, 2JHP = 20.3 Hz, 4 H,

PCH2), 3.59 (d, 3JHP = 10.5 Hz, 12 H, POCH3), 4.09 (br s, 2 H, Gly‐CH2), 6.75 (br s, 1 H,

Pyr‐H), 6.81 (br s, 2 H, Pyr‐H und Ar‐H), 7.21 (s, 1 H, NH), 7.34 (s, 2 H, Ar‐H), 7.61

(br s, 1 H, NH), 7.68 (br s, 1 H, NH), 8.42 (s, 1 H, NH), 9.72 (s, 1 H, NH).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.2.


Analytik 43:

DC (EE/EtOH 2:1 v/v): RF = 0.17.

1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.48 (s, 9 H, tBu‐CH3), 3.06 (d, 2JHP = 21.7 Hz, 4 H,

PCH2), 3.64 (d, 3JHP = 10.7 Hz, 12 H, POCH3), 3.93 (s, 2 H, Gly‐CH2), 4.02 (s, 2 H, Gly‐

CH2), 6.73 (s, 1 H, Pyr‐H), 6.83 (s, 2 H, Pyr‐H und Ar‐H), 7.16 (s, 1 H, NH), 7.46 (s, 2

H, Ar‐H), 7.60‐7.71 (m, 1 H, NH), 8.21 (s, 1 H, NH), 8.55 (s, 1 H, NH), 9.42 (s, 1 H,

NH).

13C‐NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 27.9, 31.9 (d, 1JCP = 90.2 Hz), 46.1, 46.2, 53.0 (d, 2JCP = 4.5

Hz), 82.5, 113.4, 114.4, 118.4, 119.8, 126.0, 128.5, 131.9, 138.6, 158.8, 161.9, 164.1, 168.1,

170.9.

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.6.

ESI‐MS (MeOH): m/z = 630 [M‐Boc+H+], 652 [M‐Boc+Na+], 668 [M‐Boc+K+], 730

[M+H+], 752 [M+Na+], 768 [M+K+].


124

N‐[5‐(Guanidinylcarbonyl)pyrrol‐2‐carbonylglycinyl]‐3,5‐

bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin Hydrochlorid

(BP‐Gly‐PyrGua) 46a

NHP

P

OMeMeO

O

MeOMeO

O

O

HN

O

NH

NH

O

H2N

NH2+Cl-

C21H31ClN6O9P2, MG: 608.91 g/mol

Darstellung:

AAV II (Ausbeute quant.)

Anschließend wird das Produkt in 0.1 M Salzsäure aufgenommen und lyophilisiert,

um das Trifluoracetatsalz in ein Hydrochlorid umzusalzen.

Analytik:

1H‐NMR (400 MHz, D2O): δ = 3.29 (d, 2JHP = 21.8 Hz, 4 H, PCH2), 3.72 (d, 3JHP = 10.9

Hz, 12 H, POCH3), 4.20 (s, 2 H, Gly‐CH2), 6.88 (d, 3JHH = 4.2 Hz, 1 H, Pyr‐H), 7.01 (s, 1

H, Ar‐H), 7.02 (d, 3JHH = 4.2 Hz, 1 H, Pyr‐H), 7.32 (s, 2 H, Ar‐H), 6.88‐7.61 (m, 3 H,

NH).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 35.3.

ESI‐MS (MeOH): m/z = 573 [M+], 595 [M‐H++Na+].


125

N‐[5‐(Guanidinylcarbonyl)pyrrol‐2‐carbonylglycinyl]‐3,5‐

bis(dimethoxyphosphorylmethyl)anilin Hydrochlorid

(BP‐Gly‐Gly‐PyrGua) 43a

NHP

P

MeO OMe

O

OMeOMe

O

O HN

ONH

OHN HN

ONH2

+Cl-

NH2

C23H34ClN7O10P2, MG: 665.96 g/mol

Darstellung:

AAV II (Ausbeute quant.)

Anschließend wird das Produkt in 0.1 M Salzsäure aufgenommen und lyophilisiert,

um das Trifluoracetatsalz in ein Hydrochlorid umzusalzen.

Analytik:


Hz, 12 H, POCH3), 4.04 (s, 2 H, Gly‐CH2), 4.10 (s, 2 H, Gly‐CH2), 6.83 (d, 3JHH = 4.3 Hz,

1 H, Pyr‐H), 7.01 (s, 1 H, Ar‐H), 7.02 (d, 3JHH = 4.2 Hz, 1 H, Pyr‐H), 7.27 (s, 2 H, Ar‐H),

7.50‐7.83 (m, 2 H, NH).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 35.1.

ESI‐MS (MeOH): m/z = 630.2 [M+], 652.4 [M‐H++Na+].

HRMS (ESI, MeOH), ber. für C23H34N7O10P2+: 630.1842, gef.: 630.1854.


126

N‐[5‐(Guanidinylcarbonyl)pyrrol‐2‐carbonylglycinyl]‐3,5‐bis[(methoxyphosphoryl)‐

methyl]anilin Lithiumsalz (BP‐Gly‐PyrGua 2Li+) 47

NHP

P

O-MeO

O

-OMeO

O

O

HN

O

NH

NH

O

H2N

NH2+

Li+

C19H25LiN6O9P2, MG: 550.33 g/mol

Darstellung: AAV III (Ausbeute quant.)

Analytik:

Smp.: >300 °C.


Hz, 6 H, POCH3), 4.12 (s, 2 H, Gly‐CH2), 6.85 (d, 3JHH = 4.3 Hz, 1 H, Pyr‐H), 6.93 (s, 1

H, Ar‐H), 7.02 (d, 3JHH = 4.2 Hz, 1 H, Pyr‐H), 7.15 (s, 2 H, Ar‐H).

31P‐NMR (81 MHz, D2O): δ = 27.0.

ESI‐MS (MeOH): m/z = 545 [M+2H+]+, 667 [M+H++Na+]+.


Ein 13C‐NMR‐Spektrum konnte wegen unzureichender Löslichkeit des Rezeptors nicht erhalten

werden.


127

N‐[5‐(Guanidinylcarbonyl)pyrrol‐2‐carbonylglycinyl]glycinyl‐3,5‐bis[(methoxy‐

phosphoryl)methyl]anilin Lithiumsalz (BP‐Gly‐Gly‐PyrGua 2Li+) 44

NHP

P

MeO O-

O

O-

OMeO

O HN

ONH

OHN HN

ONH2

+

NH2Li+

C21H28LiN7O10P2, MG: 607.38 g/mol

Darstellung: AAV III (Ausbeute quant.)

Analytik:

Smp.: Zers. > 245 °C.


Hz, 6 H, POCH3), 4.13 (s, 2 H, Gly‐CH2), 4.20 (s, 2 H, Gly‐CH2), 6.96 (d, 3JHH = 4.2 Hz, 1

H, Pyr‐H), 7.06 (s, 1 H, Ar‐H), 7.09 (d, 3JHH = 3.8 Hz, 1 H, Pyr‐H), 7.27 (s, 2 H, Ar‐H).

31P‐NMR (81 MHz, D2O ): δ = 26.8.

ESI‐MS (MeOH): m/z = 602.2 [M+2H+]+, 608.2 [M+H++Li+]+, 624.1 [M+H++Na+]+, 630.1

[M+Li++Na+]+.

HRMS (ESI, MeOH), ber. für C21H29LiN7O10P2+: 608.1611, gef.: 608.1601.

Ein 13C‐NMR‐Spektrum konnte wegen unzureichender Löslichkeit des Rezeptors nicht erhalten

werden.


128

(S)‐3‐Amino‐N3‐{5‐[N3‐(tert‐butoxycarbonyl)guanidinylcarbonyl]pyrrol‐2‐carbonyl}‐

2‐{3,5‐bis[(dimethoxyphosphoryl)methyl]benzamido}propionsäuremethylester

(BOC‐ASER‐BP) 48a

MeOO

NH

P

P

OMeO

MeO

MeO

MeOO

O

HN

ONH

HN

O

HN

NH

O

O

C29H42N6O13P2, MG: 744.62 g/mol

Darstellung:

20 mg (50.5 nmol; 1 Äq.) des Argininanalogons 48, 18.5mg (50.5 nmol; 1 Äq.) 3,5‐

Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)benzoesäure 1, 26.3 mg PyBOP (50.5 nmol; 1 Äq.)

und 17 μL (152 nmol; 3 Äq.) N‐Methylmorpholin werden in 5 mL absolutem

Dichlormethan gelöst und 15 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wird unter

vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand säulenchromatographisch

(EE/EtOH 5:1 v/v) gereinigt, um 19 mg (25.5 nmol; 51%) eines weißen Feststoffes zu

erhalten.

Analytik:

1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.50 (s, 9 H, tBut‐CH3), 3.23 (d, 2JHP = 21.7 Hz, 4 H,

PCH2), 3.68 (d, 3JHP = 10.8 Hz, 6 H, POCH3), 3.70 (d, 3JHP = 10.8 Hz, 6 H, POCH3), 3.76

(s, 3 H, COCH3), 3.88‐4.10 (m, 2 H, NCH2), 4.67‐4.74 (m, 1 H, α‐CH), 6.78 (d, 3JHH = 4.0

Hz, 1 H, Pyr‐H), 6.95 (d, 4JHH = 2.7 Hz, 1 H, Ar‐H), 7.34 (s, 1 H, NH), 7.71 (d, 4JHH = 1.7

Hz, 2 H, Ar‐H), 8.12‐8.18 (m, 1 H, NH), 8.57 (d, 3JHH = 5.7 Hz, 1 H, Pyr‐H), 10.96 (br s,

1 H, NH).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 32.5.



129

(S)‐3‐Amino‐N3‐[5‐(guanidinylcarbonyl)pyrrol‐2‐carbonyl]‐2‐{3,5‐bis[(dimethyl‐

phosphoryl)methyl]benzamido}propionsäuremethylester Trifluoracetat

(ASER‐BP) 48b

MeOO

NH

P

P

OMeO

MeO

MeO

MeOO

O

HN

ONH

HN

O

+H3N

NH

F

FF

O-

O

C26H35F3N6O13P2, MG: 758.53 g/mol

Darstellung:

19 mg (25.5 nmol) BOC‐ASER‐BP werden in eine Mischung aus 4 mL Dichlormethan

und 1 mL Trifluoressigsäure gegeben und 3 h bei RT gerührt. Anschließend werden

die Lösungsmittel dreimal nach Zugabe von ca. 10 mL Toluol unter vermindertem

Druck so weit wie möglich abdestilliert. Nach Trocknen im HV bleiben 19 mg

(25 nmol; quant.) eines weißen Feststoffes als Produkt zurück.

Nachfolgendes Umsalzen mit 0.1 M Salzsäure ergibt quantitativ das Hydrochlorid.

Analytik:

1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 3.23 (d, 2JHP = 21.7 Hz, 4 H, PCH2), 3.62‐3.76 (m, 12 H,

POCH3), 3.90 (s, 3 H, COCH3), 4.48‐4.49 (m, 2 H, NCH2), 4.67‐4.75 (m, 1 H, α‐CH),

6.78 (br s, 1 H, Pyr‐H), 7.32‐8.05 (m, 6 H, Ar‐H, Pyr‐H und NH).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 32.4.

ESI‐MS (MeOH): m/z = 645.1 [M+], 667 [M+Na+].

HRMS (ESI, MeOH), ber. für C24H34N6NaO11P2: 667.1653, gef.: 667.1664.


130

(S)‐3‐Amino‐N3‐[5‐(guanidinylcarbonyl)pyrrol‐2‐carbonyl]‐2‐{3,5‐bis[(methoxy‐

phosphoryl)methyl]benzamido)propionsäuremethylester Lithiumsalz

(ASER+BP2‐) 49

MeOO

NH

P

P

O-

O

MeO

-O

MeOO

O

HN

ONH

HN

O

+H3N

NH

Li+

C22H29LiN6O11P2, MG: 622.39 g/mol

Darstellung:

19 mg (25 nmol; 1 Äq.) ASERBP 48b werden zusammen mit 11 mg (125 nmol; 5 Äq.)

LiBr in 10 mL absolutem Acetonitril suspendiert und 12 h unter Rückfluß erhitzt. Das

ausgefallene Produkt wird abzentrifugiert und dreimal mit Diethylether

aufgeschlämmt und wiederum abzentrifugiert. Zur Entfernung von Trifluoracetat

wird mit Salzsäure umgesalzt. Dazu wird das Produkt in einigen mL 0.1 N Salzsäure

aufgenommen und unter vermindertem Druck bis zur Trockene eingeengt. Zurück

bleiben 16 mg (25 nmol; quant.) Produkt als weißer Feststoff.

Analytik:

1H‐NMR (300 MHz, d4‐MeOD): δ = 2.95 (d, 2JHP = 20.5 Hz, 4 H, PCH2), 3.41 (d, 3JHP =

10.5 Hz, 6 H, POCH3), 3.63 (s, 3 H, COCH3), 3.72‐3.80 (m, 2 H, NCH2), 4.56 (dd, 3JHH =

4.7 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 1 H, α‐CH), 6.63 (d, 3JHH = 4.3 Hz, 1 H, Pyr‐H), 6.97 (d, 3JHH = 4.3

Hz, 1 H, Pyr‐H), 7.25 (s, 1 H, Ar‐H), 7.56 (s, 2 H, Ar‐H).

31P‐NMR (81 MHz, d4‐MeOD): δ = 28.5.

ESI‐MS (MeOH, ESI negativ): m/z = 615 [M‐].

HRMS (ESI, MeOH), ber. für C22H29N6O11P2: 615.1364, gef.: 615.1351.


131

(S)‐Bromacetyl‐O‐(tert‐butyl)alanin (BrAc‐Ala‐OtBu) 56

BrHN

OO

O

C9H16BrNO3, 266.13 g/mol

Darstellung:

48 μL (0.550 mmol; 1 Äq.) Bromacetylbromid werden in 5 mL absolutem

Dichlormethan gelöst und auf 0 °C gekühlt. Dazu wird langsam, weiterhin unter

Eiskühlung, eine Lösung von 100 mg (0.550 mmol; 1 Äq.) L‐Alanin‐

tertbutylesterhydrochlorid und 229 μL (1.65 mmol; 3 Äq.) Triethylamin in weiteren

5 mL absolutem Dichlormethan zugetropft. Die sich rot färbende Lösung lässt man

auf Raumtemperatur erwärmen und 2 Stunden rühren. Anschließend wird die

organische Phase mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck entfernt.

Der verbleibende feste Rückstand wird säulenchromatographisch gereinigt

(EE/MeOH 30:1), um 40 mg (0.15 mmol; 27 %) BrAcAlaOtBu 56 zu erhalten.

Analytik:

DC: RF = 0.71 (EE/MeOH 10:1).

1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.28 (d, 3JHH = 4.9 Hz, 3 H, Ala‐CH3), 1.45 (s, 9 H, tBu‐

CH3), 3.07 (d, 2JHH = 11.5 Hz, 1 H, Br‐CH), 3.19 (q, 3JHH = 4.8 Hz, q H, Ala‐α‐CH), 3.38

(d, 2JHH = 11.3 Hz, 1 H, Br‐CH).


132

(S)‐Bromacetyl‐O‐methyl‐(O‐tert‐butyl)serin (BrAc‐Ser(OtBu)‐OMe) 57

BrHN

OO

O

O

C10H18BrNO4, 296.16 g/mol

Darstellung:

100 mg Bromessigsäure (0.720 mmol, 1 Äq.) werden in 15 mL DCM gelöst und

0.105 mL Chlorenamin (0.720 mmol, 1 Äq.) langsam zugegeben. Die Mischung wird

3 h bei RT gerührt, bis 126 mg H‐Ser(tBu)‐OMe (0.720 mmol, 1 Äq.) und 60 μL

Pyridin (0.720 mmol, 1 Äq.) zugefügt werden. Die nun tiefgelbe Lösung wird weitere

16 h bei RT gerührt. Nach Ende der Reaktion wird die organische Phase mehrmals

mit Wasser extrahiert und anschließend bis zur Trockene eingeengt. Zurück bleiben

192 mg 57 (0.648 mmol, 90 %) als weißer Feststoff, der keiner weiteren Aufreinigung

bedarf.

Analytik:

DC (EE/MeOH 5:1 v/v): RF = 0.72

1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.11 (s, 9 H, tBu‐CH3), 3.55 (dd, 2JHH = 9.1 Hz, 3JHH =

3.2 Hz, 1 H, OCH2), 3.73 (s, 3 H, OCH3), 3.81 (dd, 2JHH = 9.1 Hz, 3JHH = 2.9 Hz, 1 H,

OCH2), 4.02 (d, 2JHH = 11.0 Hz, 1 H, Br‐CH), 4.09 (d, 2JHH = 11.0 Hz, 1 H, Br‐CH), 4.65

(m, 1 H, α‐Ser‐CH), 7.32 (br s, 1 H, NH).


133

syn‐9‐Hydroxy‐10‐(tert‐butyloxycarbonyl)glycinyloxyl‐1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐

dimethanoanthracen

syn‐9‐Hydroxy‐10‐(tert‐butyloxycarbonyl)valinyloxyl‐1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐

dimethanoanthracen

(BK‐OH‐GlyBoc) 55a (BK‐OH‐ValBoc) 55b

OH

O O

NH

OO

OH

O O

NH

OO

C23H25NO5, MG: 395.45 g/mol C26H31NO5, MG: 437.53 g/mol

Gemeinsame Vorschrift zur Darstellung von 55a und 55b:

100 mg 1,4,5,8‐Tetrahydro‐1,4,5,8‐dimethanoanthracen‐9,10‐diol 51 (0.42 mmol, 1.0

Äq.), 74 mg Boc‐Gly‐OH bzw. 91 mg Boc‐Val‐OH (0.42 mmol, 1.0 Äq.) 71 mg HOBt

(0.46 mmol, 1.1 Äq.), 8 mg DMAP (63 μmol, 0.15 Äq.) und 65 μL DIC (0.42 mmol, 1.0

Äq.) werden in 10 mL absolutem DCM gelöst und 24 h bei RT gerührt. Anschließend

wird je zweimal mit 0.2 M Salzsäure, ges. NaHCO3‐Lösung und ges. NaCl‐Lösung

extrahiert. Die organische Phase wird über MgSO4 getrocknet, unter vermindertem

Druck abdestilliert und der verbleibende Rückstand säulenchromatographisch

gereinigt (DCM/Aceton 30:1 v/v).


134

Analytik:

syn‐9‐Hydroxy‐10‐(tert‐butyloxycarbonyl)glycinyloxyl‐1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐

dimethanoanthracen

Ausbeute: 90 mg (0.23 mmol, 54 %) weißer Feststoff

DC (DCM/Aceton 15:1 v/v): RF = 0.60.

1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.49 (s, 9 H, Boc‐CH3), 2.17‐2.24 (m, 4 H, ‐CH2‐), 3.80

(s, 2 H, ‐CH), 3.98‐4.01 (m, 2 H, ‐CH), 4.20 (d, 3JHH = 8.3 Hz, 2 H, Gly‐α‐CH2), 4.66 (br

s, 1 H, ‐OH), 5.13 (br s, 1 H, NH), 6.69‐6.75 (m, 4 H, =CH).

syn‐9‐Hydroxy‐10‐(tert‐butyloxycarbonyl)valinyloxyl‐1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐

dimethanoanthracen

Ausbeute: 72 mg (0.165 mmol, 39 %) weißer Feststoff


1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.06 (d, 3JHH = 7.1 Hz, 3 H, Val‐CH3), 1.13 (d, 3JHH = 6.8

Hz, 3 H, Val‐CH3), 1.49 (s, 9 H, Boc‐CH3), 2.18‐2.19 (m, 4 H, ‐CH2‐), 2.22‐2.35 (m, 1 H, ‐

CH(CH3)2), 3.82 (s, 2 H, ‐CH), 3.98 (s, 2 H, ‐CH), 4.42‐4.50 (m, 1 H, Val‐α‐CH), 5.08 (d,

3JHH = 9.3 Hz, 1 H, NH), 6.69‐6.79 (m, 4 H, =CH).

13C‐NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 18.1, 19.7, 28.7, 28.8, 31.5, 31.7, 46.7, 47.0, 48.2, 48.3,

48.4, 70.3, 70.4, 80.5, 136.7, 141.9, 143.0, 143.3, 143.4, 143.6.


135

syn‐9,10‐bis[(tert‐butyloxycarbonyl)glycinyloxyl]‐1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐

dimethanoanthracen (BK‐(GlyBoc)2) 55c

O O

O HNO

O

ONHO

O

C30H36N2O8, MG: 552.62 g/mol

Darstellung:


Äq.), 93 mg Boc‐Gly‐OH (0.53 mmol, 2.5 Äq.), 4 mg DMAP (31 μmol, 0.15 Äq.) und

65 μL DIC (0.42 mmol, 2.0 Äq.) werden in 10 mL absolutem DCM gelöst und 24 h bei

RT gerührt. Anschließend wird je zweimal mit 0.2 M Salzsäure, ges. NaHCO3‐

Lösung und ges. NaCl‐Lösung extrahiert. Die organische Phase wird über MgSO4

getrocknet, unter vermindertem Druck abdestilliert und der verbleibende Rückstand

säulenchromatographisch gereinigt (DCM/Aceton 30:1 v/v).

Analytik:

1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.49 (s, 18 H, Boc‐CH3), 2.16‐2.22 (m, 4 H, ‐CH2‐),

3.79‐3.82 (m, 3 H, ‐CH), 3.99‐4.01 (m, 1 H, ‐CH), 4.20 (d, 3JHH = 8.6 Hz, 4 H, Gly‐α‐

CH2), 5.10‐5.17 (m, 2 H, NH), 6.71‐6.75 (m, 4 H, =CH).


136

syn‐9‐Hydroxy‐10‐(tert‐butyloxycarbonyl)aminoethyloxyl‐1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐

dimethanoanthracen (BK‐OH‐EtNBoc) 53

OH

O

NH

OO

C23H27NO4, MG: 381.46 g/mol

Darstellung:

54 mg (0.226 mmol; 1 Äq.) BKOH2 51, 34 mg (0.249 mmol; 1.1 Äq.) Kaliumcarbonat

und eine katalytische Menge Kaliumiodid werden in 10 mL absolutem Acetonitril

suspendiert und erhitzt, bis sich alle Komponenten unter Gelbfärbung lösen.

Daraufhin werden 51 mg (0.249 mmol; 1.1 Äq.) N‐Boc‐2‐Bromethylamin zugegeben

und 16 h bei 70 °C gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel unter


(Hexan/EE 10:1) gereinigt. Man erhält 45 mg (0.12 mmol; 48 %) eines weißen

Feststoffes.

Analytik:

DC: RF = 0.5 (CHCl3/EE 5:1), RF = 0.1 (Hexan/EE 20:1)

1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.48 (s, 9 H, ‐CH3), 2.05‐2.25 (m, 4 H, CHCH2CH),

3.39‐3.43 (m, 2 H, CH2N), 3.90 (t, 3JHH = 5.1 Hz, 2 H, OCH2), 4.42 (s, 1 H, OH), 5.30 (br

s, 1 H, NH), 6.75‐6.91 (m, 4 H, =CH).

13C‐NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 28.4, 46.3, 46.5, 52.0, 70.9, 100.0, 142.6, 143.1 (einige

Signale fehlen, da das Spektrum keine ausreichende Auflösung zeigt).

ESI‐MS (MeOH): m/z = 404.1 [M+Na+], 420.1 [M+K+].

HRMS (ESI, MeOH), ber. für C23H27NNaO4+: 404.1832, gef.: 404.1833.


137

syn‐9‐[3,5‐bis(dimethoxyphosphorylmethyl)benzoyloxyl]‐10‐hydroxy‐1,4,5,8‐

tetrahydro‐1,4:5,8‐dimethanoanthracen (BK‐OH‐BP) 55d

OHO

O

P

P

OMe

OMeO

OMe

OMeO

C29H32O9P2, MG: 586.51 g/mol

Darstellung:


Äq.), 46 mg 3,5‐Bis(dimethoxyphosphorylmethyl)benzoesäure (0.13 mmol, 1.0 Äq.)

21 mg HOBt (0.14 mmol, 1.1 Äq.), 2 mg DMAP (19 μmol, 0.15 Äq.) und 20 μL DIC

(0.13 mmol, 1.0 Äq.) werden in 10 mL absolutem DCM gelöst und 24 h bei RT

gerührt. Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe von einigen mL Wasser

beendet und die flüssige Phase unter vermindertem Druck abdestilliert. Der

verbleibende Rückstand säulenchromatographisch gereinigt (EE/MeOH 15:1 v/v),

um 22 mg (39 μmol, 30 %).

Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 2.19‐2.25 (m, 4 H, CHCH2CH), 3.26 (d, 2JHP = 21.8 Hz,

4 H, PCH2), 3.74 (d, 3JHP = 10.7 Hz, 12 H, OCH3), 3.81 (s, 2 H, ‐CH), 4.04 (br s, 2 H, ‐

CH), 6.72‐6.80 (m, 4 H, =CH), 7.57 (s, 1 H, Ar‐H), 8.06 (d, J = 1.7 Hz, 2 H, Ar‐H).


138

(S)‐tert‐butyl‐2‐[2‐(10‐hydroxy‐1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐dimethanoanthracen‐9‐

yloxy)acetamido]propanoat (BK‐OH‐AcAlaOtBu) 54a

OH

O

NHOO

O

C25H29NO5, MG: 423.50 g/mol

Darstellung:

26 mg BK(OH)2 51 (0.109 mmol; 1.0 Äq.), 29 mg (S)‐Bromacetyl‐O‐(tert‐butyl)alanin

56 (0.109 mmol; 1.0 Äq.), 17 mg Kaliumcarbonat (0.120 mmol; 1.1 Äq.)und eine

katalytische Menge Kaliumiodid werden in 20 mL absolutem Acetonitril suspendiert

und zunächst 12 h bei 30 °C gerührt, anschließend noch 3 h unter Rückfluß. Die

Lösung färbt sich währenddessen gelb. Anschließend wird das Lösungsmittel unter


(DCM/Aceton 30:1 v/v) gereinigt. Man erhält 40 mg (0.094 mmol; 87 %) eines weißen

Feststoffes.

Analytik:


1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.36‐1.44 (m, 3 H, Ala‐CH3), 1.48 (s, 9 H, ‐C(CH3)3),

2.46‐2.34 (m, 4 H, CHCH2CH), 3.87‐3.89 (m, 1 H, α‐Ala‐CH), 3.99‐4.10 (m, 4 H, CH),

4.37‐4.49 (m, 2 H, OCH2), 6.74‐6.88 (m, 4 H, =CH).


139

syn‐9‐(tert‐butyloxycarbonyl)glycinyloxyl‐10‐(methylmethoxyphosphoryloxyl)‐

1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐dimethanoanthracen 55e

syn‐9‐(tert‐butyloxycarbonyl)valinyloxyl‐10‐(methylmethoxyphosphoryloxyl)‐1,4,5,8‐

tetrahydro‐1,4:5,8‐dimethanoanthracen 55f

(BK‐POMe‐GlyBoc) 55e (BK‐POMe‐ValBoc) 55f

O

O O

NH

OO

PMe

MeO

O

O

O O

NH

OO

PMe

MeO

O

C25H30NO7P, MG: 487.48 g/mol C28H36NO7P, MG: 529.56 g/mol

Gemeinsame Vorschrift zur Darstellung von 55e und 55f:

137 μmol des Alkohols (1.0 Äq., BK‐OH‐GlyBoc: 54 mg, BK‐OH‐ValBoc: 60 mg, BK‐

OH‐EtNBoc: 52 mg) werden in 10 mL absolutem THF gelöst und auf 0 °C abgekühlt.

Dazu werden 27 mg Methylphosphonsäuredichlorid (206 μmol, 1.5 Äq.) und 41 mg

Triethylamin (411 μmol, 3.0 Äq.) gegeben. Die Mischung wird zunächst eine Stunde

bei 0 °C und anschließend noch eine weitere Stunde bei RT gerührt. Dabei bildet sich

rasch ein weißer Niederschlag. Später kann sich die Lösung rötlich färben. Unter

Auflösung des Niederschlags werden 10 mL trockenes Methanol zugefügt und

nochmals 24 h gerührt. Die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck

entfernt und der Rückstand säulenchromatographisch gereinigt (DCM/Aceton 15:1

v/v).


140

Analytik:

syn‐9‐(tert‐butyloxycarbonyl)glycinyloxyl‐10‐(methylmethoxyphosphoryloxyl)‐

1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐dimethanoanthracen (BK‐POMe‐GlyBoc) 55e

Ausbeute: 53 mg (110 μmol, 80 %) weißer Feststoff.

DC (DCM/Ac 15:1 v/v): RF = 0.25.

1H‐NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.45 (s, 9 H, C(CH3)3), 1.55 (d, 2JHP = 17.2 Hz, 3 H,

PCH3), 2.14‐2.16 (m, 4 H, CH2), 3.68 (d, 3JHP = 11.0 Hz, 3 H, POCH3), 3.78 (br s, 2 H,

CH), 4.04 (br s, 2 H, CH), 4.46 (br s, 2 H, α‐Gly‐CH2), 5.04 (br s, 1 H, NH), 6.61‐6.74

(m, 4 H, =CH).

31P‐NMR (81 MHz, CDCl3): δ = 29.3.

syn‐9‐(tert‐butyloxycarbonyl)valinyloxyl‐10‐(methylmethoxyphosphoryloxyl)‐1,4,5,8‐

tetrahydro‐1,4:5,8‐dimethanoanthracen (BK‐POMe‐ValBoc) 55f

Ausbeute: 60 mg (114 μmol, 83 %) weißer Feststoff.

DC (DCM/Ac 15:1 v/v): RF = 0.22.

1H‐NMR (200 MHz, DMSO): δ = 1.03 (d, 3JHH = 7.0 Hz, 3 H, Val‐CH3), 1.06 (d, 3JHH = 7.0

Hz, 3 H, Val‐CH3), 1.42 (s, 9 H, C(CH3)3), 1.54 (d, 2JHP = 17.5 Hz, 3 H, PCH3), 2.15‐2.16

(m, 4 H, CH2), 2.22‐2.38 (m, 1 H, CH), 3.65 (d, 3JHP = 11.2 Hz, 3 H, POCH3), 3.77 (br s, 2

H, CH), 4.04 (br s, 2 H, CH), 4.36‐4.43 (m, 1 H, α‐Val‐CH), 5.01 (br s, 1 H, NH), 6.61‐

6.74 (m, 4 H, =CH).

31P‐NMR (81 MHz, DMSO): δ = 29.4.


141

syn‐9‐Valinyloxyl‐10‐(methyloxyphosphoryloxyl)‐1,4,5,8‐tetrahydro‐1,4:5,8‐

dimethanoanthracen (BK‐PO‐Gly) 55g

O

O O

NH3+

PMe O-

O

C22H26NO5P, MG: 415.42 g/mol

Darstellung: Erst AAV I, dann AAV III, ausgehend von 55f (Ausbeute quant.)

Analytik:

1H‐NMR (200 MHz, DMSO): δ = 1.20 (m, 6 H, CH3), 1.46 (d, 2JHP = 17.0 Hz, 3 H,

PCH3), 2.17 (s, 4 H, CH2), 3.97 (s, 2 H, CH), 4.18 (s, 2 H, CH), 4.40 (br s, 1 H, α‐Val‐

CH), 6.75 (br s, 2 H, =CH), 6.88 (br s, 2 H, =CH).

31P‐NMR (81 MHz, DMSO): δ = 27.8.


142

8‐Hydroxy‐19‐((tert‐butyloxycarbonyl)alaninylacetyloxyl)‐5,7,9,11,16,18,20,22‐

octahydro‐5,22:7,20:9,18:11,16‐tetramethanononacen (Pi‐OH‐AcAlaBoc) 60a

OH

O

NHOO

O

C51H45NO5, MG: 751.91 g/mol

Darstellung:

100 mg Pi(OH)2 50 (0.176 mmol; 1.0 Äq.), 47 mg (S)‐Bromacetyl‐O‐(tert‐butyl)alanin

56 (0.176 mmol; 1.0 Äq.), 27 mg Kaliumcarbonat (0.194 mmol; 1.1 Äq.) und eine

katalytische Menge Kaliumiodid werden in 20 mL absolutem Acetonitril im

Ultraschallbad gelöst und 16 h unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wird das

Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand

säulenchromatographisch (Chloroform/Aceton 5:1 v/v) gereinigt. Man erhält 50 mg

Produkt (0.066 mmol, 38 %).

Analytik:

DC (Chloroform/Aceton 5:1 v/v): RF = 0.81.

1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.32‐1.39 (m, 3 H, Ala‐CH3), 1.43 (s, 9 H, C(CH3)3),

2.25‐2.38 (m, 8 H, CH2), 3.38 (br s, 2 H, OCH2), 3.98 (s, 4 H, CH), 4.14 (s, 4 H, CH),

4.35‐4.44 (m, 1 H, α‐Ala‐CH), 6.67‐6.70 (m, 4 H, Ar‐H), 6.97‐7.05 (m, 4 H, Ar‐H), 7.04

(s, 2 H, Ar‐H), 7.05 (s, 2 H, Ar‐H).

MS (ESI, MeOH): m/z = 774.3 [M+Na+].



143

8‐(Methylmethoxyphosphoryloxyl)‐19‐hydroxyl‐5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐

5,22:7,20:9,18:11,16‐tetramethanononacen (Pi‐POMe‐OH) 60b

O

OH

PMe

MeO

O

C44H35O4P, MG: 658.72 g/mol

Darstellung:

50 mg (0.088 mmol, 1 Äq.) Pi(OH)2 50 werden in 15 mL absolutem THF gelöst und

auf 0 °C abgekühlt. Nach Zugabe von 14 mg (0.106 mmol, 1.2 Äq.)

Methylphosphonssäuredichlorid und 27 μL Triethylamin (0.265 mmol, 3.0 Äq.) wird

die resultierende Lösung eine Stunde unter Eiskühlung gerührt und daraufhin eine

weitere Stunde bei Raumtemperatur. Nun werden 5 mL absolutes Methanol

zugefügt und wiederum 16 h bei RT gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel

unter vermindertem Druck entfernt und der feste Rückstand

säulenchromatographisch (Chloroform/Aceton 15:1 v/v) gereinigt, um 41 mg

(0.062 mmol, 70 %) des Produktes als weißem Feststoff zu erhalten.

Analytik:


1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.53 (d, 2JHP = 21.0 Hz, 3 H, PCH3), 2.41 (d, 3JH‐P = 11.1

Hz, 3 H, POCH3), 2.43‐2.45 (m, 8 H, CH2), 4.05‐4.09 (m, 4 H, CH), 4.22 (d, 3JHH = 7.7

Hz, 2 H, CH), 4.42 (d, 3JHH = 8.7 Hz, 2 H, CH), 5.30 (s, 1 H, OH), 6.60‐6.74 (m, 4 H, Ar‐

H), 6.90‐7.05 (m, 4 H, Ar‐H), 7.12 (d, 2 H, Ar‐H), 7.38 (d, 2 H, Ar‐H).

31P‐NMR (121 MHz, CDCl3): δ = 28.6.

MS (ESI, MeOH): m/z = 681.3 [M+Na+], 697.3 [M+K+].


144

8‐Hydroxy‐19‐(tert‐butyloxycarbonyl)glycinyloxyl‐5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐

5,22:7,20:9,18:11,16‐tetramethanononacen (Pi‐OH‐GlyBoc) 60

OH

O O

NH

OO

C49H41NO5, MG: 723.85 g/mol

Darstellung:

150 mg (0.27 mmol, 1.0 Äq.) der Dihydroxylpinzette 50, 53 mg (0.30 mmol, 1.1 Äq.)

Boc‐Gly‐OH und 145 mg (0.27 mmol, 1.0 Äq.) PyBOP werden in 10 mL absolutem

Dichlormethan gelöst. Nach Zugabe von 88 μL (0.79 mmol, 3.0 Äq.) N‐

Methylmorpholin wird die Lösung 3 Tage bei 40 °C gerührt. Das Lösungsmittel wird

anschließend unter vermindertem Druck entfernt und der feste Rückstand


(0.16 mmol, 60%) PiOHGlyBoc 60.

Analytik:

DC: RF = 0.40 (Chloroform/Aceton 15:1 v/v).

1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.54 (s, 9 H, C(CH3)3), 2.33‐2.46 (m, 8 H, CH2), 3.98 (s,

2 H), 4.07 (s, 4 H), 4.22‐4.26 (m, 4 H), 5.19 (s, 1 H), 6.74‐6.77 (m, 4 H, Ar‐H), 7.06‐7.09

(m, 4 H, Ar‐H), 7.13 (s, 2 H, Ar‐H), 7.16 (s, 2 H, Ar‐H).

13C‐NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 28.4, 30.8, 42.5, 47.4, 48.7, 51.3, 51.4, 68.9, 70.1, 80.2,

82.6, 116.3, 116.7, 121.4, 121.5, 124.6, 126.6, 133.3, 135.8, 140.7, 142.3, 146.4, 146.7, 147.5,

150.3, 150.4, 155.8, 159.1, 168.8.




145

8‐(Methylmethoxyphosphoryloxyl)‐19‐(tert‐butyloxycarbonyl)glycinyloxyl‐

5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐5,22:7,20:9,18:11,16‐tetramethanononacen

(Pi‐POMe‐GlyBoc) 65

O

O O

NH

OO

PMe

MeO

O

C51H46NO7P, MG: 815.89 g/mol

Darstellung:

100 mg (0.138 mmol, 1 Äq.) Boc‐Gly‐Pi 60 werden in 10 mL absolutem THF gelöst

und auf 0 °C abgekühlt. Nach Zugabe von 28 mg (0.21 mmol, 1.5 Äq.)






säulenchromatographisch (Chloroform/Aceton 15:1 v/v) gereinigt, um 47 mg

(0.058 mmol, 42%) des Produktes als weißem Feststoff zu erhalten.

Analytik:

DC: RF = 0.5 (Chloroform/Aceton 15:1 v/v).

1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.50‐1.62 (m, 3 H), 1.56 (s, 9 H), 2.36‐2.52 (m, 8 H),

2.72 (d, 3JH‐P = 11.1 Hz, 3 H), 4.00 (d, 3JH‐H = 3.2 Hz, 2 H), 4.07 (s, 4 H), 4.25‐4.29 (m, 3


146

H), 4.42 (s, 1 H), 5.18 (s, 3JH‐H = 3.2 Hz, 1 H), 6.71‐6.77 (m, 4 H), 7.01‐7.16 (m, 7 H), 7.32

(s, 1 H).

31P‐NMR (121 MHz, CDCl3): δ = 28.5.

13C‐NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 10.2, 12.2, 16.5, 28.4, 30.9, 48.7, 51.2, 52.4, 68.4, 69.6,

80.3, 116.5, 116.6, 116.7, 117.2, 120.9, 121.6, 121.7, 124.6, 124.8, 136.1, 136.7, 136.8, 141.5,

141.8, 141.9, 146.1, 146.3, 146.5, 146.7, 147.6, 168.5.


HRMS (ESI, MeOH), ber. für C51H46NNaO7P+: 838.2904, gef.: 838.2889.

8‐(Methylmethoxyphosphoryloxyl)‐19‐glycinyloxyl‐5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐

5,22:7,20:9,18:11,16‐tetramethanononacen Trifluoracetat (Pi‐POMe‐Gly) 65b

O

O O

NH3+

PMe

MeO

O

CF3COO-

C48H39F3NO7P, MG: 829.80 g/mol

Darstellung:

20 mg PIPOMeGlyBOC 65 (0.025 mmol) werden in 5 mL Dichlormethan gelöst und

unter starkem Rühren 1 mL Trifluoressigsäure zugegeben. Die Mischung wird 2 h

bei RT gerührt und anschließend nach Zugabe von 10 mL Toluol unter

vermindertem Druck bis zur Trockene eingeengt. Zur vollständigen azeotropen

Destillation überschüssiger Trifluoressigsäure wird noch mindestens zwei weitere

Male nach Zugabe von Toluol unter vermindertem Druck destilliert. Der zurück

bleibende weiße Feststoff wird im HV getrocknet und ergibt in quantitativer

Ausbeute das Ammoniumsalz.


147

Analytik:

1H‐NMR (300MHz, CDCl3): δ = 1.45‐1.53 (m, 3 H), 2.30‐2.35 (m, 8 H), 2.82 (d, 3JHP =

10.95 Hz, 3 H), 3.91‐4.30 (m, 10 H), 6.66‐6.68 (m, 4 H), 6.97‐7.25 (m, 8 H).

31P‐NMR (121 MHz, CDCl3): δ = 28.7.

MS (ESI, MeOH): m/z = 716.4 [M+H+], 738.3 [M+Na+], 754.3 [M+K+].

HRMS (ESI, MeOH), ber. für C46H39NO5P+: 716.2560, gef.: 716.2565.

8‐(Methyloxyphosphoryloxyl)‐19‐(tert‐butyloxycarbonyl)glycinyloxyl‐

5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐5,22:7,20:9,18:11,16‐tetramethanononacen Lithiumsalz

(Pi‐PO‐GlyBOC) 65a

O

O O

NH

PMe

-O

O

Li+

OO

C50H43LiNO7P, MG: 807.79 g/mol

Darstellung:

45 mg PIPOMeGlyBoc 65 (0.055 mmol, 1 Äq.) und 10 mg getrocknetes

Lithiumbromid (0.11 mmol, 2 Äq.) werden in 5 mL absolutem Acetonitril suspendiert

und 24 h unter Reflux erhitzt. Das Produkt fällt als weißes Präzipitat aus und wird

durch Zentrifugation von der auf RT abgekühlten Lösung getrennt (5 min, 4400 rpm)

und noch dreimal mit Diethylether gewaschen und wiederum zentrifugiert. Nach

Trocknen im HV erhält man 39 mg (0.048 mmol, 88%) Produkt.


148

Analytik:

1H‐NMR (300MHz, d4‐MeOD): δ = 1.15 (d, 2JHP = 16.41 Hz, 3 H), 1.42 (s, 9 H), 2.14 (d,

2JHH = 7.17 Hz, 2 H), 2.21 (s, 4 H), 2.33 (d, 2JHH = 6.60 Hz, 2 H), 3.86 (s, 2 H), 3.89 (s, 4

H), 3.98 (s, 2 H), 4.36 (s, 2 H), 6.66‐6.68 (m, 4 H), 6.89‐6.91 (m, 4 H), 6.94 (s, 2 H), 7.01

(s, 2 H).

31P‐NMR (121 MHz, d4‐MeOD): δ = 21.6.

13C‐NMR (75 MHz, d4‐MeOD): δ = 12.7, 28.9, 43.2, 52.4, 69.1, 69.4, 80.9, 117.3, 122.0,

122.2, 125.9, 142.6, 143.4, 148.4, 148.8, 149.0, 151.8, 151.9, 170.6, 185.7.

MS (ESI‐negativ, MeOH): m/z = 800.3 [M‐].

HRMS (ESI‐negativ, MeOH), ber. für C50H43NO7P‐: 800.2772, gef.: 800.2743.

8‐(Methyloxyphosphoryloxyl)‐19‐glycinyloxyl‐5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐

5,22:7,20:9,18:11,16‐tetramethanononacen (Pi‐PO‐Gly) 67

O

O O

NH3+

PMe

-O

O

C45H36NO5P, MG: 701.74 g/mol

Darstellung:

39 mg PiPOGlyBoc 65a (0.048 mmol) werden in 5 mL Dichlormethan suspendiert

und unter starkem Rühren 1 mL Trifluoressigsäure zugegeben. Die nun klare Lösung

wird 2 h bei RT gerührt und anschließend nach Zugabe von 10 mL Toluol unter

vermindertem Druck bis zur Trockene destilliert. Der zurück bleibende weiße

Feststoff wird dreimal in Toluol aufgenommen und wieder bis zur Trockene


149

eingeengt und schließlich im HV getrocknet. Zurück bleiben 39 mg (quant.) Rezeptor

als weißer Feststoff.

Analytik:

Smp.: > 310 °C.

1H‐NMR (300 MHz, d4‐MeOD): δ = 1.37 (d, 2JHP = 17.19 Hz, 3 H), 2.19 (d, 2JHH = 7.17

Hz, 2 H), 2.26 (s, 4 H), 2.38 (d, 2JHH = 6.60 Hz, 2 H), 3.93‐3.98 (m, 5 H), 4.19 (s, 2 H),

4.35 (s, 2 H), 6.72‐6.73 (m, 4 H), 7.00‐7.13 (m, 8 H).

31P‐NMR (121 MHz, d4‐MeOD): δ = 23.99.

19F‐NMR (282 MHz, d4‐MeOD): δ = ‐78.6.

MS (ESI, MeOH): m/z = 702.4 [M+H+], 724.4 [M+Na+], 740.5 [M+K+].

HRMS (ESI, MeOH), ber. für C45H37NO5P+: 702.2404, gef.: 702.2409.


150

8‐Hydroxy‐19‐{5‐[N3‐(tert‐butoxycarbonyl)guanidinylcarbonyl]pyrrol‐2‐

carbonyloxyl}‐5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐5,22:7,20:9,18:11,16‐

tetramethanononacen Pi‐OH‐PyrGUABoc 61

OH

O O

NH

ONH

NHHN O

O

C54H44N4O6, MG: 844.95 g/mol

Darstellung:

150 mg (0.27 mmol, 1.0 Äq.) der Dihydroxylpinzette 50, 121 mg (0.30 mmol, 1.2 Äq.)

Boc‐Gly‐OH und 151 mg (0.29 mmol, 1.1 Äq.) PyBOP werden in 10 mL absolutem

Dichlormethan gelöst. Nach Zugabe von 88 μL (0.79 mmol, 3.0 Äq.) N‐

Methylmorpholin wird die Lösung 3 Tage bei 40 °C gerührt. Das Lösungsmittel wird

anschließend unter vermindertem Druck entfernt und der feste Rückstand


(0.11 mmol, 43%) Produkt als weißen Feststoff.

Analytik:

Smp.: >330 °C.


1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.53 (s, 9 H), 2.35‐2.49 (m, 8 H), 4.02 (s, 2 H), 4.07 (s, 4

H), 4.25 (s, 2 H), 6.76‐6.78 (m, 4 H), 7.10‐7.17 (m, 10 H).

13C‐NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 28.0, 30.8, 47.4, 48.7, 51.2, 68.9, 70.0, 116.3, 116.7, 117.4,

121.4, 121.5, 124.6, 133.2, 135.7, 141.1, 141.8, 146.3, 146.7, 147.5, 150.4, 158.0, 158.9.

MS (ESI, MeOH): m/z = 845.2 [M+H+], 867.4 [M+Na+].

HRMS (ESI, MeOH), ber. für C54H44N4NaO6+: 867.3153, gef.: 867.3146.


151

8‐(Methylmethoxyphosphoryloxyl)‐19‐{5‐[N3‐(tert‐butoxycarbonyl)guanidinyl‐

carbonyl]pyrrol‐2‐carbonyloxyl}‐5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐5,22:7,20:9,18:11,16‐

tetramethanononacen (Pi‐POMe‐PyrGUABoc) 66

O

O O

PMe

MeO

O

NH

ONH

NHHN O

O

C56H49N4O8P, MG: 936.98 g/mol

Darstellung:

47 mg (0.040 mmol, 1 Äq.) Boc‐PyrGua‐Pi 61 werden in 5 mL absolutem THF gelöst

und auf 0 °C abgekühlt. Nach Zugabe von 8 mg (0.060 mmol, 1.5 Äq.)






säulenchromatographisch (Essigsäureethylester/Methanol 20:1 v/v) gereinigt, um

26 mg (0.028 mmol, 69%) des Produktes als weißem Feststoff zu erhalten.

Analytik:


1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.56 (m, 3 H, PCH3), 1.58 (s, 9 H, C(CH3)3), 2.23‐2.61

(m, 8 H, CH2), 2.73 (d, 3JHP = 11.2 Hz, 3 H, POCH3), 4.03‐4.14 (m, 7 H, CH), 4.30‐4.43

(m, 1 H, CH), 6.74‐6.76 (m, 4 H, Ar‐H), 6.98‐7.32 (m, 10 H, Ar‐H und Pyr‐H).


152

13C‐NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 14.2, 27.9, 48.7, 48.9, 51.1, 51.2, 60.4, 68.4, 69.7, 76.6,

78.0, 116.7, 117.2, 117.5, 120.9, 121.6, 124.6, 141.8, 142.3, 146.3, 147.5, 147.7, 147.8, 150.3,

150.4, 150.5, 150.6.

31P‐NMR (121 MHz, CDCl3): δ = 28.6.

ESI‐MS (MeOH): m/z = 959.3 [M+Na+].

HRMS (ESI, MeOH), ber. für C56H49N4NaO8P+: 959.3180, gef.: 959.3173.

8‐(Methylmethoxyphosphoryloxyl)‐19‐[5‐(guanidinylcarbonyl)pyrrol‐2‐

carbonyloxyl]‐5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐5,22:7,20:9,18:11,16‐

tetramethanononacen

Pi‐POMe‐PyrGUA 66b

O

O O

PMe

MeO

O

NH

ONH

NH2+

H2N CF3COO-

C53H42F3N4O8P, MG: 950.89 g/mol

Darstellung: AAV I

Analytik:

1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.64 (d, 2JHP = 17.0 Hz, 3 H, PCH3), 2.34‐2.49 (m, 8 H,

CH2), 2.68 (d, 3JHP = 11.3 Hz, 3 H, POCH3), 3.99‐4.30 (m, 8 H, CH), 6.67‐6.69 (m, 4 H,

Ar‐H), 6.92‐7.54 (m, 10 H, Ar‐H und Pyr‐H).

31P‐NMR (121 MHz, CDCl3): δ = 29.3.

19F‐NMR (282 MHz, CDCl3): δ = ‐75.6.


153

8‐(Methyloxyphosphoryloxyl)‐19‐{5‐[N3‐(tert‐butoxycarbonyl)guanidinylcarbonyl]‐

pyrrol‐2‐carbonyloxyl}‐5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐5,22:7,20:9,18:11,16‐

tetramethanononacen Lithiumsalz (Pi‐PO‐PyrGUA‐Boc) 66a

O

O O

PMe

-O

O

NH

ONH H

NHN

O

O

Li+

C55H46LiN4O8P, MG: 928.89 g/mol

Darstellung:

45 mg PiPOMePyrGUABoc 66 (0.048 mmol, 1 Äq.) und 10 mg getrocknetes

Lithiumbromid (0.11 mmol, 2.3 Äq.) werden in 5 mL absolutem Acetonitril

suspendiert und 24 h unter Reflux erhitzt. Das Produkt fällt als weißes Präzipitat aus

und wird durch Zentrifugation von der auf RT abgekühlten Lösung getrennt (5 min,

4400 Upm), noch dreimal mit Diethylether gewaschen und wiederum zentrifugiert.

Nach Trocknen im HV erhält man 35 mg (0.038 mmol, 78%) Produkt.

Analytik:

1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.19 (d, 2JHP = 16.41 Hz, 3 H), 1.49, (s, 9 H), 2.20 (d, J =

7.35 Hz, 2 H), 2.25 (s, 4 H), 2.41 (d, J = 7.38 Hz, 2 H), 3.89‐3.98 (m, 6 H), 4.43 (s, 2 H),

6.70‐6.73 (m, 4 H), 6.85 (d, 3JHH = 3.96 Hz, 1 H), 6.93‐6.97 (m, 6 H), 7.05 (d,

3JHH = 4.5 Hz, 1 H), 7.10 (s, 2 H).

31P‐NMR (121 MHz, CDCl3): δ = 21.5.

ESI‐MS (ESI negativ, MeOH): m/z = 921.3 [M‐].

HRMS (ESI negativ, MeOH), ber. für C55H46N4O8P‐: 921.3048, gef.: 921.3017.


154

8‐(Methyloxyphosphoryloxyl)‐19‐(5‐(guanidinylcarbonyl)pyrrol‐2‐carbonyloxyl)‐

5,7,9,11,16,18,20,22‐octahydro‐5,22:7,20:9,18:11,16‐tetramethanononacen

(Pi‐PO‐PyrGUA) 68

O

O O

PMe

-O

O

NH

ONH

NH2+

H2N

C50H39N4O6P, MG: 822.84 g/mol

Darstellung:

25 mg PiPOPyrGuaBoc 66a (0.027 mmol) werden in 5 mL Dichlormethan suspendiert

und unter starkem Rühren 1 mL Trifluoressigsäure zugegeben. Die nun klare Lösung

wird 2 h bei RT gerührt und anschließend nach Zugabe von 10 mL Toluol unter

vermindertem Druck bis zur Trockene destilliert. Der zurück bleibende weiße

Feststoff wird dreimal in Toluol aufgenommen und wieder bis zur Trockene

eingeengt und schließlich im HV getrocknet. Zurück bleiben 25 mg (quant.) Rezeptor

als weißer Feststoff.

Analytik:

1H‐NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.55 (d, 3JHP = 17.55 Hz, 3 H), 2.30‐2.45 (m, 8 H), 3.90‐

3.99 (m, 6 H), 4.40 (s, 2 H), 6.73‐6.76 (m, 4 H), 6.94‐6.98 (m, 4 H), 7.00 (s, 2 H), 7.08 (d,

3JHH = 4.5 Hz, 1 H), 7.16 (s, 2 H), 7.30 (d, 3JHH = 4.6 Hz, 1 H).


155

13C‐NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 31.8, 37.4, 42.7, 48.6, 51.0, 51.1, 52.5, 53.7, 109.3, 113.1,

116.9, 118.0, 120.7, 121.3, 121.6, 122.6, 124.2, 124.7, 124.8, 125.4, 128.6, 129.0, 136.2,

142.7, 146.7, 147.4, 148.3, 150.6, 151.1, 159.6, 160.2, 163.9, 164.9.

31P‐NMR (121 MHz, CDCl3): δ = 24.7.

19F‐NMR (282 MHz, CDCl3): δ = ‐76.0.

ESI‐MS (MeOH): m/z = 823.3 [M+].

HRMS (ESI, MeOH), ber. für C50H40N4O6P+: 823.2680, gef.: 823.2689.


156

7.3 Titrationen

7.3.1 Theoretische Grundlagen zu NMR‐Titrationen

Für die Bildung eines dimeren Komplexes [WG] aus einem Wirtmolekül W und

einem Gastmolekül G gibt das Massenwirkungsgesetz die Assoziationskonstante Kass

an.

W + G [WG] GW

WGass cc

cK

⋅= ][ Gleichung 1

][0 WGWW ccc −= und ][0 WGGG ccc −= Gleichung 2

Die Lage des Gleichgewichts läßt sich über unterschiedliche spektroskopische

Methoden, z.B. durch UV/Vis‐, Fluoreszenz‐ oder insbesondere NMR‐Spektroskopie

durch ein Titrationsexperiment ermitteln, bei dem die Konzentration cW des Wirtes

möglichst konstant gehalten und die Konzentration cG des Gastes systematisch

variiert wird. Ersetzt man in Gleichung 1 die Gleichgewichtskonzentrationen cW und

cG gemäß den beiden Gleichungen 2 durch die Ausgangskonzentrationen cW0 und cG0

und die Komplexkonzentration c[WG], so erhält man durch Lösen des resultierenden

quadratischen Gleichungssystems für die Komplexkonzentration im

Gleichgewichtszustand:

⎪⎭

⎪⎬⎫

⎪⎩

⎪⎨⎧

⋅⋅−⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛++−++⋅= 00

2

0000][ 41121

GWGWass

GWass

WG ccccK

ccK

c Gleichung 3

Ist die Austauschrate des dynamischen Gleichgewichts der Komplexbildung

langsam bezogen auf die NMR‐Zeitskala, so beobachtet man unterschiedliche

Signalsätze für Wirt, Gast und den Komplex. Ihre Konzentration im

Gleichgewichtszustand läßt sich dann direkt durch Integration der Signale

bestimmen. In der Regel geschieht dieser Austausch jedoch so schnell, daß man

lediglich gemittelte Signale detektiert. Die beobachtete chemische Verschiebung δobs

eines Kerns im Wirtmolekül setzt sich dann zusammen aus den Signalen δW für den

freien Wirt und δ[WG] für den im Komplex gebundenen Wirt:


157

][0

][

0

][0WG

W

WGW

W

WGWobs c

cccc

δδδ ⋅+⋅−

= Gleichung 4

oder mit WWG δδδ −=∆ ][max Gleichung 5

max0

][ δδδ ∆⋅+=W

WGWobs c

c Gleichung 6

Durch Einsetzen von Gleichung 6 in Gleichung 3 erhält man die beobachtete

chemische Verschiebung δobs eines Kerns im Wirtmolekül als:

⎪⎭

⎪⎬⎫

⎪⎩

⎪⎨⎧

⋅⋅−⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛++−++⋅

⋅∆

+= 00

2

00000

max 4112 GWGW

assGW

assWWobs cccc

Kcc

Kcδ

δδ Gleichung 7

Nach Aufnahme von NMR‐Spektren der isolierten Wirtverbindung und Mischungen

mit verschiedenen Anfangskonzentrationen cW0 und cG0 von Wirt und Gast lassen sich

die Komplexbindungskonstante Kass und die maximale komplexinduzierte

Verschiebung Δδmax des beobachteten Kerns durch nichtlineare Regression iterativ

berechnen.

Für den Fall der Selbstassoziation eines Substrates S zu einem Dimer S2 ergibt sich

aus dem Massenwirkungsgesetz die Assoziationskonstante Kass:

2S S2 22

][][

SSK ass = Gleichung 8

Die beobachtete Verschiebung δobs eines Kerns im NMR‐Spektrum läßt sich als

Funktion von Kass, der Konzentration [S] des Substrats und den chemischen

Verschiebungen δagg und δfrei für das im Dimer gebundene Substrat bzw. bei

unendlicher Verdünnung ausdrücken. Gleichung 9 kann dabei direkt aus Gleichung

7 entwickelt werden.

][21][41][2

)(SK

SKSK

ass

assassaggfreiaggobs

+−+⋅−+= δδδδ Gleichung 9

Durch nichtlineare Regression kann Kass so aus einer Verdünnungsreihe NMR‐

spektroskopisch bestimmt werden.[126, 127]


158

7.3.2 Praktische Durchführung von NMR‐Titrationen

In dieser Arbeit kamen einige im Detail unterschiedliche Methoden der NMR‐

Titration zum Einsatz. Grundsätzlich ist zu berücksichtigen, daß die Konzentration

der Wirtverbindung etwa dem Kehrwert der erwarteten Bindungskonstante

entsprechen sollte, um durch einen günstigen Verlauf der Titrationskurve den

statistischen Fehler der Regressionsanalyse zu minimieren.[128] Nichtsdestotrotz liegt

aus meßtechnischen Erwägungen heraus die Konzentration für NMR‐Titrationen

i.d.R. zwischen 10‐4 und 10‐2 mol/L, unabhängig von der zu erwartenden

Bindungskonstante.

a) Titration in einem einzelnen NMR‐Probenröhrchen

600‐700 μL der Wirtlösung werden vorgelegt und bis etwa 250 μL Gastlösung

sukzessive zutitriert, bis mindestens 5 Äquivalente Gast zugefügt worden sind. Diese

Methode ist sehr einfach und erfordert nur minimalste Stoffmengen. Nachteile sind

ein relativ hoher Zeitaufwand, weil durch die periodisch notwendigen

Titrationsschritte nicht in Automation gemessen werden kann. Zu berücksichtigen ist

weiterhin, daß bei dieser Methode die Wirtlösung etwas verdünnt wird. Zuvor ist

daher zu testen, daß der Wirt im erforderlichen Bereich keine

konzentrationsabhängigen Signalverschiebungen aufweist.

Alternativ kann ein größeres Volumen der Wirtlösung hergestellt werden. Der Gast

wird dann in einem Teil dieser Wirtlösung gelöst. Wird diese Wirt/Gast‐Lösung

schließlich zu einer reinen Wirtlösung hinzutitriert, so ändert sich im Verlauf der

Titration die Wirtkonzentration nicht. Für diese Methode sind schon etwas erhöhte

Stoffmengen erforderlich.

b) Verteilte Meßreihe in mehreren NMR‐Probenröhrchen

Die komplette Titrationsreihe kann auch auf etwa 10 Proben verteilt werden. Hierfür

muß ein entsprechend größeres Volumen der Wirt‐ und Gastlösung hergestellt

werden. Falls gewünscht kann auch hier die Wirtkonzentration in allen Proben

konstant gehalten werden oder eine reine Gastlösung klassisch zutitriert werden. Die

Wirtlösung wird gleichmäßig auf 10 Proben aufgeteilt und die Menge an zugefügtem


159

Gast systematisch in dem verschiedenen Proben zwischen 0 und 5‐7 Äquivalenten

variiert. Es sollte beachtet werden, daß mindestens 4‐5 Proben vor dem

Äquivalenzpunkt der Titration liegen und einige im Sättigungsbereich, um später

eine gute Datenbasis für die nichtlineare Regression zu erhalten.

NMR‐Titration BP2‐PGly‐Z 14 (Wirt) gegen Methylguanidiniumhydrochlorid

(Gast)

Einwaage Wirt: 6.05 mg in 7.0 mL d4‐MeOD

Einwaage Gast: 3.57 mg in 1.29 mL d4‐MeOD

Äq. Gast c(Wirt)

[mol/L]

c(Gast)

[mol/L]

δa

[ppm]

δb

[ppm]

δc

[ppm] 0.00 1.622E‐03 0.000E+00 7.0700 4.6131 3.4725 0.25 1.599E‐03 4.018E‐04 7.0512 4.6153 3.4890 0.50 1.577E‐03 7.925E‐04 7.0269 4.6186 3.5100 0.75 1.556E‐03 1.172E‐03 7.0059 4.6230 3.5266 1.00 1.535E‐03 1.542E‐03 6.9915 4.6252 3.5388 1.25 1.514E‐03 1.902E‐03 6.9805 4.6274 3.5487 1.50 1.494E‐03 2.252E‐03 6.9750 4.6297 3.5587 2.01 1.456E‐03 2.926E‐03 6.9628 4.6308 3.5653 3.01 1.385E‐03 4.175E‐03 6.9506 4.6319 3.5753 5.02 1.262E‐03 6.340E‐03 6.9429 ‐ 3.5841 Δδmax 0.1423

± 3 %

0.0243

± 14 %

0.1256

± 3 % Ø (Ka) 1500 M‐1 Ka 1661

± 12 %

1295

± 49 %

1542

± 12 %


160

Äq. MeGUA0 1 2 3 4 5 6

∆δ

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

Ka = 1660 +/- 12%; Ar-HKa = 1300 +/- 50%; α-CHKa = 1540 +/- 12%; POMe3

predictedpredictedpredicted

OHN

O P

O

MeO OLiO

NH

P

P

LiOMeO

O

OLiMeO

O

vs.NH2Cl

HN

NH2

Ha

c

b

Wiederholung der Titration in D2O ergab keine komplexinduzierten

Signalverschiebungen.

NMR‐Titration BP2‐PGly‐Z 14(Wirt) gegen Argininmethylesterdihydrochlorid

(Gast)

Einwaage Wirt: 8.45 mg in 7.0 mL d4‐MeOD

Einwaage Gast: 10.98 mg in 1.16 mL d4‐MeOD

Äq. Gast c(Wirt)

[mol/L]

c(Gast)

[mol/L]

δa

[ppm]

δb

[ppm] 0.00 1.972E‐03 0.000E+00 7.0711 3.4725 0.25 1.944E‐03 4.869E‐04 7.0396 3.4907 0.50 1.917E‐03 9.603E‐04 6.9943 3.5327 0.75 1.891E‐03 1.421E‐03 6.9567 3.5736 1.00 1.866E‐03 1.869E‐03 6.9324 3.5935 1.25 1.841E‐03 2.305E‐03 6.9268 3.5957 1.50 1.816E‐03 2.729E‐03 6.9290 3.5968 2.00 1.770E‐03 3.546E‐03 6.9302 3.5957 3.00 1.684E‐03 5.059E‐03 6.9268 3.5979 5.00 1.534E‐03 7.682E‐03 6.9302 3.5979 Δδmax 0.1437

± 1 %

0.1246

± 2 % Ø (Ka) 7.6 ∙ 105 M‐1 Ka 6.9 ∙ 105

± 27 %

8.3 ∙ 105

± 33 %


161

Äq. Arg

0 1 2 3 4 5 6

∆δ

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

OHN

O P

O

MeO OLiO

NH

P

P

LiOMeO

O

OLiH3bC

O

vs.

NH

NH2

NH2ClCOOMe

ClH3N

Ha

NMR‐Titration BP2‐PGly‐Z 14 (Wirt) gegen Argininmethylesterdihydrochlorid

(Gast)

Einwaage Wirt: 8.45 mg in 7.0 mL D2O

Einwaage Gast: 10.98 mg in 1.16 mL D2O

Äq. Gast c(Wirt)

[mol/L]

c(Gast)

[mol/L]

δa

[ppm]

δb

[ppm]

δc

[ppm]

δd

[ppm] 0.00 2.300E‐03 0.000E+00 7.2175 7.0550 4.5649 3.6498 0.25 2.300E‐03 5.762E‐04 7.2175 7.0541 4.5640 3.6500 0.50 2.300E‐03 1.152E‐03 7.2194 7.0536 4.5635 3.6506 0.75 2.300E‐03 1.728E‐03 7.2216 7.0525 4.5668 3.6506 1.13 2.300E‐03 2.593E‐03 7.2243 7.0497 4.5685 3.6511 1.50 2.300E‐03 3.457E‐03 7.2291 7.0479 4.5688 3.6526 2.00 2.300E‐03 4.609E‐03 7.2306 7.0461 4.5692 3.6530 3.01 2.300E‐03 6.914E‐03 7.2323 7.0444 4.5709 3.6536 5.01 2.300E‐03 1.152E‐02 7.2372 7.0405 4.5725 3.6540 Δδmax 0.0352

± 25 %

0.0295

± 20 %

0.0358

± 22 %

0.0068

± 26 % Ø (Ka) 140 M‐1 Ka 129

± 48 %

95

± 34 %

145

± 45 %

189

± 56 %


162

. Argininmethylester * 2HCl

0 1 2 3 4 5 6

∆δ

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

Ka = 129 +/- 48%; Ar-HKa = 95 +/- 34%; Ar-H (Z)Ka = 145 +/- 45%; POMeKa = 185 +/- 56%; α-CH

OHN

O P

O

MeO OLiO

NH

P

P

LiOMeO

O

OLiMeO

O

vs.

NH

NH2

NH2ClCOOMe

ClH3N

ab

c

d

NMR‐Titration H‐RGD‐OH (Wirt) gegen BP2‐PGly‐NH3+ 14 (Gast)

Einwaage Wirt: 7.467 mg in 3.12 mL d4‐MeOD/D2O (3:1 v/v)

Einwaage Gast: 9.260 mg in 0.70 mL d4‐MeOD/D2O (3:1 v/v)

Äq. Gast c(Wirt)

[mol/L]

c(Gast)

[mol/L]

δa

[ppm]

0.0 1.494E‐03 0.000E+00 3.9919 0.3 1.494E‐03 3.736E‐04 3.9676 0.5 1.494E‐03 7.472E‐04 3.9466 0.8 1.494E‐03 1.121E‐03 3.9223 1.0 1.494E‐03 1.494E‐03 3.9035 1.3 1.494E‐03 1.868E‐03 3.8914 1.5 1.494E‐03 2.242E‐03 3.8759 2.0 1.494E‐03 2.989E‐03 3.8560 3.0 1.494E‐03 4.483E‐03 3.8372 5.0 1.494E‐03 7.472E‐03 3.8051 Δδmax 0.3344

± 7 %

Ka 95

± 14 %


163

. BPPG

0 1 2 3 4 5 6

∆δ

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

+H3N

P

O

MeO O-O

NH

P

P

-OMeO

O

O-MeO

O

vs.

HN

NH2+H2N

+H3NO

NH O

HN COO-

COO-

Ha

Wiederholung der Titration mit größerem Wassergehalt (d4‐MeOD/D2O 1:4 v/v)

ergab keinerlei komplexinduzierte Signalverschiebungen mehr.

NMR‐Titration BP2‐Gly‐NH3+ 32 (Wirt) gegen H‐RGD‐OH (Gast)

Einwaage Wirt: 4.65 mg in 7.0 mL

d4‐MeOD/D2O (3:1 v/v)

Einwaage Gast: 19.08 mg in 2.0 mL

d4‐MeOD/D2O (3:1 v/v)

Äq. Gast c(Wirt)

[mol/L]

c(Gast)

[mol/L]

δa

[ppm] 0.0 1.200E-03 0.000E+00 3.5058 0.3 1.200E-03 3.442E-04 3.5058 0.6 1.200E-03 6.883E-04 3.5080 0.9 1.200E-03 1.032E-03 3.5091 1.1 1.200E-03 1.377E-03 3.5091 1.4 1.200E-03 1.721E-03 3.5102 1.7 1.200E-03 2.065E-03 3.5113 2.3 1.200E-03 2.753E-03 3.5135 3.4 1.200E-03 4.130E-03 3.5157 Δδmax 0.0686

± 32 % Ka 45

± 40 %

vs.

HN

NH2+H2N

+H3NO

NH O

HN COO-

COO-

NH

PP O-

OMe

O-O

MeO

O

O

+H3N

a

Äq. RGD0 1 2 3 4 5 6 7

∆δ

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

0,016

0,018


164

NMR‐Titration BP2‐Gly‐Gly‐NH3+ 33 (Wirt) gegen H‐RGD‐OH (Gast)



Äq. Gast c(Wirt)

[mol/L]

c(Gast)

[mol/L]

δa

[ppm]

δb


± 13 %

0.1813

± 9 % Ø (Ka) 780 M‐1 Ka 937

± 39 %

624

± 24 %

Äq. RGD

0 1 2 3 4 5 6 7

∆δ

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

abber.ber.

vs.

HN

NH2+H2N

+H3NO

NH O

HN COO-

COO-

NHP

P

MeO O-

O

O-

OMeO

O HN

ONH3

+

ab


165

NMR‐Titration BP2‐Ala‐Ala‐NH3+ 36 (Wirt) gegen H‐RGD‐OH (Gast)



Äq. RGD0 1 2 3 4

∆δ

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

Ka = 156 +/- 55 %

vs.

HN

NH2+H2N

+H3NO

NH O

HN COO-

COO-

NHP

P

MeO O-

O

O-

OMeO

O HN

ONH3

+

a

Äq. Gast c(Wirt)

[mol/L]

c(Gast)

[mol/L]

δa

[ppm] 0.0 1.226E‐03 0.000E+00 3.4857 0.3 1.226E‐03 3.442E‐04 3.4857 0.6 1.226E‐03 6.883E‐04 3.4890 0.8 1.226E‐03 1.032E‐03 3.4902 1.1 1.226E‐03 1.377E‐03 3.4902 1.4 1.226E‐03 1.721E‐03 3.4913 1.7 1.226E‐03 2.065E‐03 3.4913 2.2 1.226E‐03 2.753E‐03 3.4935 2.8 1.226E‐03 3.442E‐03 3.4957 3.4 1.226E‐03 4.130E‐03 3.4968 Δδmax 0.0299

± 36 % Ka 156

± 55 %


166

NMR‐Titration BP2‐Ala‐Gly‐Gly‐NH3+ 37 (Wirt) gegen H‐RGD‐OH (Gast)



Äq. Gast c(Wirt)

[mol/L]

c(Gast)

[mol/L]

δa

[ppm]

δb


± 24 %

0.0414

± 123 % Ka 2611

± 215 %

49

± 176 %

Äq. RGD

0 1 2 3 4 5 6

∆δ

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

vs.

HN

NH2+H2N

+H3NO

NH O

HN COO-

COO-

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

O HN

ONH

ONH3

+

Hb Ha

Die Bindung scheint tatsächlich sehr klein zu sein, wie die sehr kleinen Werte für

Δδmax andeuten. Die ermittelten Bindungskonstanten sind hier wegen der äußerst

hohen statistischen Fehler nur als Indiz für eine sehr schwache Bindung zu

verstehen. Die umgekehrt geführte NMR‐Titration mit H‐RGD‐OH als Wirt ergab

überhaupt keine auswertbare Sättigung.


167

NMR‐Titration BP2‐Gaba‐NH3+ 38 (Wirt) gegen H‐RGD‐OH (Gast)



Äq. Gast c(Wirt)

[mol/L]

c(Gast)

[mol/L]

δa

[ppm]

δb

[ppm]0.0 4.996E‐04 0.000E+00 3.5222 3.48790.2 4.996E‐04 1.249E‐04 3.5233 3.48900.5 4.996E‐04 2.498E‐04 3.5266 3.49130.7 4.996E‐04 3.746E‐04 3.5277 3.49351.0 4.996E‐04 4.995E‐04 3.5299 3.49571.2 4.996E‐04 6.244E‐04 3.5355 3.50011.5 4.996E‐04 7.493E‐04 3.5344 3.49903.0 4.996E‐04 1.499E‐03 3.5366 3.50344.0 4.996E‐04 1.998E‐03 3.5454 3.51125.0 4.996E‐04 2.498E‐03 3.5355 3.5012 Δδmax 0.0226

± 30 %

0.0248

± 34 % Ka 1796

± 98 %

1319

± 95 %

Äq. RGD0 1 2 3 4 5 6

∆δ

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

BP2-Gaba-NH3+ vs H-RGD-OH

H-RGD-OH vs BP2-Gaba-NH3+

Äq. BP2-Gaba-NH3+0 1 2 3 4

∆δ

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

Die Bindung scheint tatsächlich eher klein zu sein, wie die sehr kleinen Werte für

Δδmax andeuten. Die ermittelten Bindungskonstanten sind hier wegen der äußerst

hohen statistischen Fehler nur als Indiz für eine schwache Bindung zu verstehen. Die

Meßwerte erreichen keine richtige Sättigung, sondern streuen lediglich stark bei

Zugabe mehrerer Äquivalente Gast. Die umgekehrt geführte Reaktion führt zwar zu

deutlicheren Shifts. Die Meßwerte folgen aber einem eher linearen Verlauf und

erreichen überhaupt keine Sättigung mehr.

vs.

HN

NH2+H2N

+H3NO

NH O

HN COO-

COO-

NHP

P

-O OMe

O

O-

OMeO

ONH3

+


168

NMR‐Verdünnungsreihe in D2O mit BP2‐Gly‐PyrGua+ 47

NHP

P

O-MeO

O

-OMeO

O

O

HN

O

NH

NH

O

H2N

NH2+Cl-

2Li+

a

b

c

d

c

[mol/L]

‐ log c δa

[ppm]

δb

[ppm]

δc

[ppm]

δd

[ppm] 5.00E‐03 ‐2.3010 7.0320 4.2464 3.7580 3.0302 3.00E‐03 ‐2.5229 7.0381 4.2560 3.7597 3.0337 1.50E‐03 ‐2.8239 7.0452 4.2630 3.7615 3.0364 6.00E‐04 ‐3.2218 7.0574 4.2762 3.7659 3.0399 5.00E‐04 ‐3.3010 7.0644 4.2797 3.7676 3.0425 3.00E‐04 ‐3.5229 7.0601 4.2779 3.7668 3.0408 1.00E‐04 ‐4.0000 7.0750 4.2806 3.7676 3.0434 5.00E‐05 ‐4.3010 7.0723 4.2797 3.7685 3.0434 Ø (Ka)

330 M‐1

Ka 744

± 56 %

109

± 70 %

285

± 70 %

198

± 65 %

log c-4 -3 -2

∆δ

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

abcd744 +/- 56%109 +/- 70%285 +/- 70%198 +/- 65%


169

NMR‐Titration EtPyrGua+ 45 (Wirt) gegen BP2(Gast) 20

Einwaage Wirt: 1.450 mg in 7.50 mL D2O/d6‐DMSO (40:60 v/v)

Einwaage Gast: 6.006 mg in 0.80 mL Wirt‐Lösung

Äq. Gast c(Wirt)

[mol/L]

c(Gast)

[mol/L]

δa

[ppm] 0.0 7.436E‐04 0.000E+00 6.77930.5 7.436E‐04 3.608E‐04 6.76861.0 7.436E‐04 7.216E‐04 6.76991.5 7.436E‐04 1.082E‐03 6.76801.9 7.436E‐04 1.443E‐03 6.76672.4 7.436E‐04 1.804E‐03 6.76672.9 7.436E‐04 2.165E‐03 6.76365.8 7.436E‐04 4.330E‐03 6.75857.8 7.436E‐04 5.773E‐03 6.75739.7 7.436E‐04 7.216E‐03 6.7554

Δδmax 0.0281

± 6 % Ka 744

± 17 %

Äq. BP2-0 2 4 6 8 10 12

∆δ

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

P PMeO-O

OO-

OMe

O

NH

OHN HN

ONH2

+Cl-

NH2

Li+

Li+

vs.

Ha


170

NMR‐Titration BP2‐Gly‐Gly‐PyrGua+ 44 (Wirt) gegen H‐RGD‐OH (Gast)

Einwaage Wirt: 0.563 mg in 0.900 mL D2O (Phosphatpuffer 3 mM. pH 6.5)

Einwaage Gast: 2.412 mg in 0.450 mL D2O (Phosphatpuffer 3 mM. pH 6.5)

Äq. Gast c(Wirt)

[mol/L]

c(Gast)

[mol/L]

δa

[ppm]

δb

[ppm]

δc

[ppm]

δd

[ppm] 0.0 1.030E‐03 0.000E+00 7.2644 7.0513 7.0408 6.9706 0.2 1.015E‐03 2.028E‐04 7.2652 7.0592 7.0495 6.9715 0.4 9.995E‐04 3.996E‐04 7.2687 7.0688 7.0583 6.9733 0.6 9.848E‐04 5.906E‐04 7.2670 7.0750 7.0662 6.9741 0.8 9.705E‐04 7.760E‐04 7.2705 7.0837 7.0732 6.9759 1.0 9.566E‐04 9.562E‐04 7.2714 7.0916 7.0811 6.9759 1.4 9.301E‐04 1.301E‐03 7.2731 7.1048 7.0943 6.9776 1.8 9.049E‐04 1.628E‐03 7.2731 7.1179 7.1074 6.9803 2.4 8.697E‐04 2.086E‐03 7.2784 7.1346 7.1241 6.9838 3.0 8.371E‐04 2.510E‐03 7.2784 7.1469 7.1363 6.9838 4.0 7.878E‐04 3.150E‐03 7.2810 7.1635 7.1539 6.9873 6.0 7.049E‐04 4.227E‐03 7.2845 7.1793 7.3688 6.9899 Δδmax 0.0442

± 23 %

0.3067

± 10 %

0.3034

± 9 %

0.0524

± 20 % Ø (Ka) 190 M‐1 Ka 214

± 38%

192

± 15%

196

± 14 %

153

± 29%

Äq. RGD0 1 2 3 4 5 6 7

∆δ

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

214 +/- 38%192 +/- 15%196 +/- 14%153 +/- 29%

NHP

P

MeO O-

O

O-

OMeO

O HN

ONH

OHN HN

ONH2

+

NH2

vs.

HN

NH2+H2N

+H3NO

NH O

HN COO-

COO-

Hc

HbHd

Ha

Die gleiche Titration wurde auch in 80 mM Phosphatpuffer durchgeführt. Hierbei

wurde bei minimalen Shifts (< 0.02 ppm) keine Sättigung erreicht.


171

NMR‐Titration BP2‐Gly‐Gly‐PyrGua+ 44 (Wirt) gegen H‐RGD‐OH (Gast)

Einwaage Wirt: 1.069 mg in 1.500 mL D2O (BisTrispuffer 40 mM. pH 6.1)

Einwaage Gast: 2.508 mg in 0.340 mL D2O (BisTrispuffer 40 mM. pH 6.1)

Äq. RGD0,000 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006

∆δ

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

NHP

P

MeO O-

O

O-

OMeO

O HN

ONH

OHN HN

ONH2

+

NH2

vs.

HN

NH2+H2N

+H3NO

NH O

HN COO-

COO-

Ha

Äq. Gast c(Wirt)

[mol/L]

c(Gast)

[mol/L]

δa

[ppm] 0.0 1.174E‐03 0.000E+00 7.1442 0.2 1.156E‐03 2.794E‐04 7.1451 0.5 1.139E‐03 5.505E‐04 7.1460 0.7 1.122E‐03 8.136E‐04 7.1460 1.0 1.106E‐03 1.069E‐03 7.1477 1.2 1.090E‐03 1.317E‐03 7.1477 1.5 1.075E‐03 1.558E‐03 7.1486 2.4 1.017E‐03 2.459E‐03 7.1504 3.4 9.657E‐04 3.268E‐03 7.1530 5.8 8.572E‐04 4.973E‐03 7.1539 Δδmax 0.0163

± 26 % Ka 233

± 46%


172

NMR‐Titration BP2‐Gly‐Gly‐PyrGua+ 44 (Wirt) gegen +H3N‐GDGRG‐OH (Gast)



Äq. Gast c(Wirt)

[mol/L]

c(Gast)

[mol/L]

δa

[ppm]

δb

[ppm]

δc

[ppm] 0.0 1.059E‐03 0.000E+00 7.0215 7.0110 6.9662 0.3 1.043E‐03 2.708E‐04 7.0267 7.0180 6.9671 0.5 1.027E‐03 5.334E‐04 7.0338 7.0241 6.9662 0.8 1.012E‐03 7.884E‐04 7.0390 7.0311 6.9689 1.0 9.973E‐04 1.036E‐03 7.0478 7.0373 6.9697 1.3 9.831E‐04 1.276E‐03 7.0513 7.0425 6.9697 1.6 9.693E‐04 1.510E‐03 7.0574 7.0478 6.9697 2.1 9.427E‐04 1.958E‐03 7.0671 7.0566 6.9715 3.1 8.937E‐04 2.785E‐03 7.0697 7.0697 6.9724 5.2 8.096E‐04 4.205E‐03 7.0943 ‐ 6.9733 Δδmax 0.1616

± 20 %

0.2039

± 9 %

0.0124

± 30 %Ø (Ka) 180 M‐1

(ohne δc)

Ka 204

± 32 %

162

± 13 %

391

± 60 %

Äq. GDGRG

0 1 2 3 4 5 6

∆δ

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

204 +/- 32%162 +/- 13%

ber.ber.

NHP

P

MeO O-

O

O-

OMeO

O HN

ONH

OHN HN

ONH2

+

NH2

vs.+H3N-GDGRG-OH

HcHa

Hb


173

NMR‐Titration BP2‐Gly‐Gly‐PyrGua+ 44 (Wirt) gegen +H3N‐GRGDG‐OH (Gast)



Äq. Gast c(Wirt)

[mol/L]

c(Gast)

[mol/L]

δa

[ppm]

δb

[ppm] 0.0 9.411E‐04 0.000E+00 7.0215 7.0110 0.3 9.268E‐04 2.325E‐04 7.0267 7.0180 0.5 9.130E‐04 4.580E‐04 7.0338 7.0241 0.8 8.996E‐04 6.770E‐04 7.0390 7.0311 1.0 8.865E‐04 8.895E‐04 7.0478 7.0373 1.3 8.739E‐04 1.096E‐03 7.0513 7.0425 1.5 8.616E‐04 1.297E‐03 7.0574 7.0478 2.0 8.380E‐04 1.682E‐03 7.0671 7.0566 3.0 7.944E‐04 2.391E‐03 ‐ 7.0697 5.0 7.197E‐04 3.610E‐03 7.0943 ‐ Δδmax 0.1681

± 12 %

0.2029

± 9 % Ø (Ka) 210 M‐1 Ka 236

± 19 %

191

± 13 %

Äq. GRGDG

0 1 2 3 4 5 6

∆δ

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

abber.ber.

NHP

P

MeO O-

O

O-

OMeO

O HN

ONH

OHN HN

ONH2

+

NH2

vs.+H3N-GRGDG-OH

Ha

Hb


174

NMR‐Titration BP2‐ASer‐PyrGua+ 49 (Wirt) gegen H‐RGD‐OH (Gast)

Einwaage Wirt: 1.059 mg in 1.000 mL D2O (BisTrispuffer 11 mM. pH 6.3)

Einwaage Gast: 3.990 mg in 0.430 mL D2O (BisTrispuffer 11 mM. pH 6.3)

Äq. RGD0 2 4 6 8

∆δ

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

vs.

HN

NH2+H2N

+H3NO

NH O

HN COO-

COO-

OO

HN

P

P

-O OOMe

O-

OMe

O

ONH

OHN

HN

O

NH3+

NH

Ha,b

Äq. Gast c(Wirt)

[mol/L]

c(Gast)

[mol/L]

δa

[ppm]

δb

[ppm] 0.0 1.427E‐03 0.000E+00 7.1014 7.0965 0.3 1.406E‐03 3.515E‐04 7.1039 7.0987 0.5 1.385E‐03 6.925E‐04 7.1087 7.1020 0.8 1.364E‐03 1.023E‐03 7.1112 7.1042 1.0 1.344E‐03 1.345E‐03 7.1145 7.1072 1.3 1.325E‐03 1.657E‐03 7.1167 7.1109 1.5 1.307E‐03 1.960E‐03 7.1182 7.1130 2.0 1.271E‐03 2.542E‐03 7.1225 7.1173 3.0 1.205E‐03 3.615E‐03 7.1307 7.1234 5.0 1.091E‐03 5.458E‐03 7.1353 7.1283 7.0 9.975E‐04 6.984E‐03 7.1414 7.1338 Δδmax 0.0506

± 11 %

0.0494

± 10 %Ø (Ka) 280 M‐1 Ka 288

± 24%

263

± 21%


175

7.3.3 Mikrokalorimetrische Verdünnungstitrationen

Einwaage BP2‐Gly‐PyrGua+ 47: 840 μg in 650 μL aquabidest. mit 20 mM BisTris‐Puffer

(pH 6.3). Titration der Rezeptorlösung in die wäßrige Pufferlösung hinein.

0.00 33.33 66.67 100.00 133.33 166.67

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Time (min)

µcal

/sec

-0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.50.004

0.005

0.006

0.007

0.008

0.009

0.010

0.011

0.012

0.013

Equivalent Monomer Concentration (mM)

ucal

/inje

ctio

n

Einwaage BP2‐Gly‐Gly‐PyrGua+ 44: 408 μg in 629 μL aquabidest. mit 20 mM BisTris‐

Puffer (pH 6.3). Titration der Rezeptorlösung in die wäßrige Pufferlösung hinein.

0.00 33.33 66.67 100.00 133.33 166.67

9.05

9.10

9.15

9.20

9.25

9.30

9.35

Time (min)

µcal

/sec

-0.020.000.020.040.060.080.100.120.140.160.180.200.22

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

Equivalent Monomer Concentration (mM)

cal/i

njec

tion

NHP

P

O-MeO

O

-OMeO

O

O

HN

O

NH

NH

O

H2N

NH2+Cl-

2Li+

NHP

P

MeO O-

O

O-

OMeO

O HN

ONH

OHN HN

ONH2

+Cl-

NH22Li+

Literaturverzeichnis

176

8 Abkürzungsverzeichnis

Abu α‐Aminobuttersäure Abz Aminobenzoesäure Äq. Äquivalente Ar‐ Aryl‐; Phenyl‐ ber. berechnet BisTris 2,2‐Bis(hydroxymethyl)‐2,2’,2’’‐nitrilotriethanol Boc‐ t‐Butyloxycarbonyl‐ Brine Gesättigte Natrumchloridlösung Bz‐ Benzyl‐ Chlorenamin 1‐Chlor‐N,N,2‐trimethylpropenylamin Cl‐HOBt 6‐Chlorhydroxybenztriazol DC Dünnschichtchromatographie DCM Dichlormethan DIEA Hünigbase; Diisopropylethylamin DMF Dimethylformamid ECM Extrazelluläre Matrix EE Essigsäureethylester ESI Elektronensprayionisation FD Felddesorption Gaba γ‐Aminobuttersäure h Horae; Stunden HBTU O‐(Benztriazol‐1‐yl)‐N,N,Nʹ,Nʹ‐

tetramethyluroniumtehexafluorophosphat HCTU 2‐(6‐Chlor‐1H‐benztriazol‐1‐yl)‐1,1,3,3‐

tetramethyluroniumhexafluorophosphat HOBt Hydroxybenztriazol HV Hochvakuum Mamb Meta‐Aminobenzoesäure MG Molekulargewicht min Minuten MS Massenspektrometrie Mukaiyama‐Reagenz N‐Methyl‐1‐chlorpyridiniumiodid N Normal NMM N‐Methylmorpholin NMR Kernresonanzspektroskopie PyBOP Benztriazol‐1‐yl‐oxytrispyrrolidino‐

phosphoniumhexafluorophosphat Pyr‐ Pyrrol‐ quant. quantitativ RF „ratio of fronts“ RT Raumtemperatur

Abkürzungsverzeichnis

177

TBTU O‐(Benztriazol‐1‐yl)‐N,N,Nʹ,Nʹ‐tetramethyluroniumtetrafluoroborat

tBu‐ tert‐Butyl‐, ‐C(CH3)3 TCTU 2‐(6‐Chlor‐1H‐benztriazol‐1‐yl)‐1,1,3,3‐

tetramethyluroniumtetrafluoroborat TFA Trifluoressigsäure Z‐ Benzyloxycarbonyl‐ Aminosäuren Aminosäure Abkürzung EinbuchstabencodeAlanin Ala A Arginin Arg R Asparagin Asn N Aspartat Asp D Cystein Cys C Glutamin Gln Q Glutaminsäure Glu E Glycin Gly G Histidin His H Isoleucin Ile I Leucin Leu L Lysin Lys K Methionin Met M Phenylalanin Phe F D‐Phenylalanin D‐Phe f Prolin Pro P Serin Ser S Threonin Thr T Tryptophan Trp W Tyrosin Tyr Y Valin Val V


178

Verwendete Abkürzungen für häufig benutzte Strukturen

PP

NHR

O O

MeOMeO

OMeOMe

BP‐R BP2‐‐R

PP

NHR

O O

-OMeO

O-OMe

HO

ONH

HN

O

HN

NH

O

O

Boc‐GUA‐Pyr‐COOH H‐PGly‐OH

H2N

P

O

MeO OMeO

OH

BK‐R1‐R2OR1

OR2

Pi‐R1‐R2OR1

OR2


179

9 Literaturverzeichnis

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Caulfield, G. Chang, T. Hendrickson, W. C. Still, J. Comp. Chem. 1990, 11, 440. [121] W. L. Jorgensen, J. Tirado‐Rives, J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 1657‐1666. [122] S. J. Weiner, P. A. Kollman, D. A. Case, J. Comp. Chem. 1986, 7, 230‐252. [123] WebLab Viewer Lite 3.7, Molecular Simulations Inc. 2000, www.msi.com. [124] PyMol 0.98, DeLano Scientific LLC 2005, www.pymol.org. [125] H. E. Gottlieb, V. Kotlyar, A. Nudelman, J. Org. Chem. 1997, 62, 7512‐7514. [126] O. Molt, Dissertationsschrift, Philipps‐Universität Marburg 2003.


183

[127] H.‐J. Schneider, A. Yatsimirsky, Principles and Methods in Supramolecular Chemistry, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 2000.

[128] L. Fielding, Tetrahedron 2000, 56, 6151‐6170.

Danke!

Zuvorderst möchte ich mich bei Prof. Dr. Thomas Schrader für die Bereitstellung und

intensive Betreuung des faszinierenden Arbeitsthemas bedanken, auch wenn die

neuen Rezeptoren am Ende nicht unser aller Hoffnungen auf neue Bindungsrekorde

erfüllen konnten.

Dank gilt Prof. Dr. C. Schmuck und Daniel Rupprecht für die Kooperation und die

Bereitstellung der Guanidiniumcarbonylpyrrolbausteine. Weiterhin sei Prof. Dr. A.

Geyer für die freundliche Übernahme des Koreferates gedankt.

Allen aktuellen und ehemaligen Mitarbeitern des AK Schraders danke ich herzlich

für die angenehme, offene und freundschaftliche Arbeitsatmosphäre. Stellvertretend

seien hier besonders Bruce, Christian, Gerhard, Katrin, Lutz, Micha, Michael S.,

Michi, Olli und Petra genannt, die mich stets in theoretischen und praktischen

Fragen der Chemie, sowie moralisch unterstützt haben.

Für das Korrekturlesen meiner Dissertation möchte ich mich zusätzlich bei Katrin,

Christian und Tina bedanken.

Über die Semester haben zahlreiche Vertiefungsstudenten mich bei meiner Arbeit

unterstützt: Markus Rudisile, Karin Kiewisch, Joachim Zettler, Maik Bierschenk,

Markus Krause, Christoph Pohling und Klaus‐Georg Rheinsberg.

Besonders wertvolle Beiträge stammen von Kai Bernitzky, der mir zweimal in den

Semesterferien als studentische Hilfskraft zur Seite stand.

Tina und natürlich Jonathan danke ich für Liebe, Zuneigung und Zuflucht an den

freien Tagen.

Die letzte Danksagung gebührt meinen Eltern, ohne deren Unterstützung, Vertrauen

und Liebe diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.

Documents

Dissertation Matthias Junkers: "Künstliche Rezeptoren zur Erkennung der RGD-Sequenz"