Ekstraksi & Pengujian DNA

I. Pendahuluan

1.1 Latar Belakang

Pada dasarnya, sel mengandung dua asam nukleat yaitu DNA dan RNA. DNA

terletak pada kromosom, dijumpai di nucleus, mitokondria dan ribosom.

Sedangkan RNA dijumpai di Nukleus, sitoplasma dan Ribosom. DNA disebut

cetak biru kehidupan karena memiliki pearanan yang sangat penting yaitu

sebagai pembawa informasi genetic (hereditas) yang menentukan struktur

protein dan proses metabolism lain.

DNA murni bisa didapatkan dari suatu sel dalam jaringan tubuh makhluk

hidup, yaitu dilakukan dengan berbagai cara, tetapi pada sikap jenis maupun

bagian tanaman menimbulkan masalah berbeda, antara lain karena adanya

senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat

menghambat pemurnian DNA dan juga mempengaruhi enzim-enzim seperti

polymerase, ligase, endonuclease retriksi, atau enzim untuk kegiatan molekuler

lain yang dapat menyebabkan DNA tidak dapat digunakan untuk aplikasi.

1.2 Tujuan

1. Mengekstrak DNA dari jaringan buah dan hewan.

2. Menentukan karakteristik komposisi nukleotida penyusun DNA

1.3 Aplikasi

1. Dapat mengetahui bahwa dalam buah terdapat DNA dengan

ditunjukkannya pemisahan antara serat buah dengan ekstrak buahnya

2. Dapat mengetahui karakteristik nukleotida penyusun DNA dalam buah.

II. Teori

Asam Nukleat adalah makromolekul yang berfungsi sebagai pembawa

informasi genetic pada makhluk hidup. Monomer asam nukleat adalah

nukleotida. Komponen penyusun nukleotida adalah basa nitrogen,

monosakarida dengan 5 atom C dari gugus phospat. Untuk memperoleh DNA

dapat dilakukan dengan mengekstraknya dari sel dengan menggunakan

beberapa reagen tertentu.

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya

adalah :

a. Sentrifugasi

Merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat

molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul yang

lebih besar akan berada dibagian bawah tabung dan molekul yang lebih

kecil akan berada dibagian atas atabung.

b. Presipitasi

Merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu

komponen dari campuran.

Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahap-tahap antara lain :

a. Preparasi ekstrak sel

b. Pemurnian DNA dan ekstrak Sel

c. Presiptasi DNA

Jika isolasi DNA yang dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air

pada masing-masing buah berbeda, sehingga memberikan hasil yang berbeda-

beda pula. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut didalam ekstrak aan

semakin sedikit, sehingga DNA yang terpresipitasi juga akan sedikit.

Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini

bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lainnya yang tidak

menyebaban kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel dapat

dilakukan secara mekanik dengan penggerusan menggunaan mortar dan pistil.

Sedangkan cara kimiawi dapat dengan pemberian yang merusak membrane sel

dan membrane inti, salah satunya dengan penambahan detergen.

Penambahan detergen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena

detergen melalui sisi hidrofobik detergen dengan protein dan lemak pada

membrane membentuk senyaw lipid proyein-detergen kompleks. Senyawa

tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan

hidrofobik. Demikian halnya dengan detergen, sehingga dapat membentuk

suatu ikatan kimia.

Proses ekstraksi DNA bertujuan untuk memisahan DNA dari protein,

lemak, dan karbohidrat. DNA hasil isolasi dilakukan cek kuantitas dan kualitas

untuk melihat konsentrasi dan kemurniannya dengan menggunakan

spktrofotometer dan elektroforesis gel. Prosedur ekstraksi yang baik untuk

isolasi DNA mencakup tiga hal penting, yaitu harus bisa dihasilkan DNA dengan

kemurnian yang tinggi, DNA-nya harus utuh, dan jumlahnya mencukupi

(konsentrasi tinggi).

III. METODA KERJA

3.1.Alat dan Bahan

Alat

1. Gelas kimia 250 mL : sebagai wadah larutan

2. Gelas ukur 10 mL : sebagai wadah untuk menakar larutan

3. Tabung reaksi : sebagai wadah larutan

4. Erlenmeyer 250 mL : sebagai wadah pencampuran zat

5. Lumpang porselen : sebagai wadah penggerusan

6. Pipet tetes panjang : alat untuk mengambil larutan

7. Water bath : sebagai wadah untuk mendinginkan

8. Kain kasa : sebagai penyaring sampel

Bahan

1. NaCl : Sebagai pemekat DNA

2. Buah Kiwi : sebagai sampel

3. Detergen : perusak membrane sel

4. Etanol 95% dingin : Pengendap DNA

5. HNO3 pekat : Untuk uji fosfat

6. Amonium Molibdat 5% : Untuk uji Fosfat

7. As. Asetat 5% : Untuk uji basa nitrogen

8. CuSO4 5% : Untuk uji basa nitrogen

9. NaH2SO4 jenuh : Untuk uji ribose

10.Eter : Mengendapkan DNA

11.Reagen Benedict : Untuk uji Ribosa

12.Buffer TE : Buffer untuk melarutkan DNA

13.Akuades : pelarut

3.2.Skema Kerja

A. Ekstraksi DNA dari buah Kiwi

Buah Kiwi

- Dipotong, dihancurkan

- Dimasukkan kedalam gelas beaker 250 mL

- + 3 g NaCl

- + 10 mL detergen sambil diaduk

- + air sampai volume 100mL

- Hancurkan lagi, saring dengan kain kasa

Hasil

Filtrat Ampas

- Didiamkan beberapa menit

- Dipindahkan kedalam tabung reaksi (6mL)

- Didinginkan 5 menit

- + 9 mL etanol 95%

Lapisan Etanol

- Terbentuk kabut halus berwarna putih

- Diambil DNA-nya

Ekstrak DNA

- Dilakukan uji komposisi nukleotida pada DNA

B. Pengujian Ekstrak As. Nukleat (DNA)

Ekstrak DNA

Diambil masing-masing 5 mL

Uji Ribosa Uji Fosfat Uji Basa Nitrogen

- +4 mL Benedict - +1 mL HNO3 - + as. Asetat 5%

- Dikocok - dikocok - dikocok

- Dipanaskan - Dipanaskan - Dipanaskan

Hasil - + 2mL lar. - + 1mL CuSO4

- Diamati Ammonium - + 1mL NaH2SO4

Molibdat 5%

Hasil Hasil

- Diamati - Diamati

C. Uji Tingkat Kemurnian Estrak DNA

Ekstrak DNA

- Dilarutkan dengan buffer TE pH 8

Larutan

- Dimasukan kedalam kuvet

- Diukur dengan spektrosfotometer pada panjang gelombang

230,260, 280 nm.

Data

- Dihitung optikal densitynya

- Tentukan kemurnian ekstrak DNA

Hasil

D. Uji Denaturasi DNA

Ekstrak DNA

- Dilarutkan dengan buffer TE pH 8

- Dipanaskan dari 20 hingga 90C dengan kenaikan 10C

Absorban DNA

- Diukur pada lamda 260nm

- Tabung terakhir setelah diukur absorbannya segera dinginkan

selama 5 menit

- Ukur kembali absorbannya

Hasil

IV. PENGAMATAN DAN HASIL

13.1 Hasil dan Pengamatan

a. Hasil

Berat labu kosong = 107,10 g

Berat labu + lemak = 107,83 g

Berat lemak = 0,73 g

Berat sampel = 2 g

Kadar lemak :

% lemak = 0,73g2 gr

x 100% = 36,5%

b. Gambar

Campuran larutan sampel kacang,

HCl dan air dididihkan selama 15 menit.

Larutan disaring dankemudian diuji

dengankertas lakmus.

Proses sokletasiektrask lemak

kacang tanah yangdihasilkan.

V. DISKUSI

Padapraktikum kali ini telah dilakukan percobaan penentuan kadar lemak

dimana sampel yang digunakan berupa kacang tanah. Kacang tanah

merupakan sumber lemak dan minyak, yaitu minyak nabati.

Adapun prinsip dari percobaan ini yaitu gravimetri dan dengan

menggunakan metode sokletasi. Prinsip gravimetri ini digunakan karena untuk

mendapatkan kadar lemak yang terkandung dalam sampel kacang dilakukan

proses penimbangan antara berat sampel dan berat lemak yang dihasilkan.

Dalam proses ini, kacang tanah dihaluskan terlebih dahulu agar dapat

memperluas bidang sentuh dan mudah untuk dilarutkan. kemudian

ditambahkan HCl 25% agar mempermudah pelarutan dan memberikan

suasana asam. Fungsi penambahan asam itu sendiri adalah untuk dapat

membebaskan lemak yang terikat dari kacang tersebut dengan bantuan

pemanasan. Larutan tersebut kemudian disaring dan dicuci dengan air panas,

agar dapat menetralkan kembali pHnya. Pada saat penyaringan sudah mulai

terlihat adanya lemak dengan ditandai dengan adanya cairan kental pada

kertas saring yang tidak bersatu lagi dengan air..

Kertas saring dan isinya kemudian di ekstrak dengan melakukan

perendaman menggunakan alat sokletasi dengan larutan heksan yang

merupakan larutan non polar dalam beberapa jam. Ekstrak lemak tersebut

kemudian didinginkan dalam desikator agar uap dan semua lemak didinding

labu ikut terkumpulkan dan dapat ditimbang dengan baik dan bobot yang tetap.

Pada pecobaan kali ini diperoleh berat lemak sebesar 0,73 gram, sedangkan

berat sampel kacang tanah diawal adalah 2 gram. Jadi, kadar lemak yang

terkandung pada kacang tanah tesebut adalah sebesar 36,5%. Berdasarkan

hasil yang diperoleh, berat lemak yang dihasilkan pada praktikumkali ini cukup

sedikit. Kesalahan yang mungkin terjadi adalah pada saat penggerusan yang

menyebabkan kacang tanah tidak tergerus dengan halus, dan pada saat

penetralan pHnya masih asam dikarenakan jumlah HCl yang digunakan terlalu

banyak. Akibatnya pada proses sokletasi menghasilkan ekstrak lemak yang

sedikit pula.

VI. KESIMPULAN DAN SARAN

3.1.Kesimpulan

Setelahdilakukannyapercobaandandidapatkandata,makadapatdisimpulkanbahwa :1. Prinsip dari percobaan ini adalah gravimetri dan metode yang digunakan

adalah metode sokletasi.

2. Untuk dapat membebaskan lemak dari kacang tanah tersebut maka

harus dihidrolisa dalam suasana asam dengan menggunakan larutan

HCl.

3. Lemak merupakan senyawa non polar, oleh karena itu senyawa yang

dapat mengekstraknya juga non polar seperti larutanheksan.

4. Massa lemak yang diperoleh adalah sebesar 0,73 gram, dan kadar

lemak yang dikandung dalam 2gram kacang adalah sebesar 36,5%.

3.2.Saran

Untukdidapatkanhasil yang lebihmaksimal, makadisarankankepadapraktikanselanjutnyauntuk :1. Lakukan penimbangan sampel secara teliti dan bersifat analitik.

2. Lakukan penambahan zat dengan kadar yang tepat.

3. Fastikan senyawa yang akan diekstrak telah benar-benar memiliki

pHyang netral.

4. Lakukan proses sokletasi dengan benar dan pastikan tidak ada zat atau

senyawa yang menguap selama proses berlangsung.

DAFTAR PUSTAKA

Lehninger. 1998. DASAR-DASAR BIOKIMIA. Jakarta :Erlangga.

Soendoro, R. 1989. PRINSIP-PRINSIP BIOKIMIA. Jakarta : Erlangga.

Syafrudin dan Santoso Tj. 2011. OPTIMASI TEKNIK ISOLASI DAN PURIFIKASI DNA YANG EFISIEN DAN EFEKTIF PADA KEMIRI SUNAN. Jurnal Utri 17(1) : 11-17.

Yutranti, E. 2006. PENGEMBANGAN TEKNIK ISOLASI DNA TUMBUHAN MENGGUNAKAN DETERGEN KOMERSIAL. Seminar Nasional MIPA 2006.

TUGAS

1. Dua tahapan penting agar proses ekstraksi DNA berhasil yaitu,

a. Proses pemisahan atau penghancuran membrane dan dinding sel yang

bertujuan untuk mengeluarkan isi sel.

b. Proses pengendapan DNA dari larutan suspense sel dengan

menggunakan alcohol dimana dalam proses ini as. Nukleat diendapkan

dengan alcohol dingin sehingga terbentuk kabut atau benang yang

merupakan DNA.

2. Hasil DNA ekstraksi dapat diamati dengan jelas sedangkan RNA tidak,

karena pada tahapan presipitasi DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari

residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa. Residu juga mengalami

koagulasi namun tidka membentuk struktur fiber sehingga hasil ektraks

DNA dapat diamati dengan jelas.

3. Tujuan proses pengujian DNA hasil ekstraksi yaitu untuk menentukan

karakteristik komposisi nukleotida penyusun DNA . Komponen DNA yang

terkandung dalam buah sama dengan pada hewan dan manusia, karena

tergolong organism eukariotik. Ektraksi DNA dari organism eukariotik

dilakukan melalui proses pengahncuran dinding sel, penghilangan protein

dan RNA, pengendapan DNA dan pemanasan.

4. Ekstrak DNA darus dilarutkan dalam buffer pH 8 karena agar DNA tidak

rusak atau tidak terjadi denturasi pada DNA.