DNA

A. Gambaran umumAsam nukleat adalah makromolekul biokimia yang kompleks, berbobot molekul tinggi, dan tersusun atas rantai nukleotida yang mengandung informasi genetik.Asam nukleat yang paling umum adalah Asam deoksiribonukleat (DNA) and Asam ribonukleat (RNA). Asam nukleat ditemukan pada semua sel hidup serta pada virus.Asam nukleat dinamai demikian karena keberadaan umumnya di dalam inti (nukleus) sel. Asam nukleat merupakan biopolimer, dan monomer penyusunnya adalah nukleotida.Setiap nukleotida terdiri dari tiga komponen, yaitu sebuah basa nitrogen heterosiklik (purin atau pirimidin), sebuah gula pentosa, dan sebuah gugus fosfat.Jenis asam nukleat dibedakan oleh jenis gula yang terdapat pada rantai asam nukleat tersebut (misalnya, DNA atau asam deoksiribonukleat mengandung 2-deoksiribosa). Selain itu, basa nitrogen yang ditemukan pada kedua jenis asam nukleat tersebut memiliki perbedaan: adenin, sitosin, dan guanin dapat ditemukan pada RNA maupun DNA, sedangkan timin dapat ditemukan hanya pada DNA dan urasil dapat ditemukan hanya pada RNA.DNA merupakan polimer yang terdiri dari tiga komponen utama, yaitu gugus fosfat, gula deoksiribosa, dan basa nitrogen. Sebuah unit monomer DNA yang terdiri dari ketiga komponen tersebut dinamakan nukleotida, sehingga DNA tergolong sebagai polinukleotida.Rantai DNA memiliki lebar 22-24 , sementara panjang satu unit nukleotida 3,3 . Walaupun unit monomer ini sangatlah kecil, DNA dapat memiliki jutaan nukleotida yang terangkai seperti rantai. Misalnya, kromosom terbesar pada manusia terdiri atas 220 juta nukleotida.Rangka utama untai DNA terdiri dari gugus fosfat dan gula yang berselang-seling. Gula pada DNA adalah gula pentosa (berkarbon lima), yaitu 2-deoksiribosa. Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melalui ikatan fosfodiester antara atom karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon kelima pada gula lainnya. Salah satu perbedaan utama DNA dan RNA adalah gula penyusunnya; gula RNA adalah ribose.

DNA terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk struktur heliks ganda. Pada struktur heliks ganda, orientasi rantai nukleotida pada satu untai berlawanan dengan orientasi nukleotida untai lainnya. Hal ini disebut sebagai antiparalel. Masing-masing untai terdiri dari rangka utama, sebagai struktur utama, dan basa nitrogen, yang berinteraksi dengan untai DNA satunya pada heliks. Kedua untai pada heliks ganda DNA disatukan oleh ikatan hidrogen antara basa-basa yang terdapat pada kedua untai tersebut. Empat basa yang ditemukan pada DNA adalah adenin (dilambangkan A), sitosin (C, dari cytosine), guanin (G), dan timin (T). Adenin berikatan hidrogen dengan timin, sedangkan guanin berikatan dengan sitosin melalui ikatan hydrogen.

2. Sifat fisika dan kimia DNA1. Sifat fisika DNA Dalam perkembangan lanjut, implikasi dari model DNA menurut Watson dan Crick adalah sifat fisika DNA yang mudah membentuk dua rantai tunggal DNA apabila ikatan hidrogen purin-pirimidin "melele". Melalui pemanasan, misalnya, ikatan ini melele dan kekentalan (viscocity) larutan menurun. Dalam keadaan rantai tunggal, gugus amino dari purin dan pirimidin tersingkap dan siap bereaksi dengan formaldehida membentuk turunan hidroksimetil, yang dalam keadaan rantai ganda DNA gugus ini tidak reaktif. Akibat lanjut dari terbentuknya rantai tunggal DNA adalah serapan radiasi ultraviolet pada riak-gelombang 260 mm oleh DNA dalam larutan meningkat 40% (DNA memiliki serapan radiasi tertinggi pada riak-gelombang 260 mm). Dengan pemanasan, serapan radiasi ultraviolet oleh DNA meningkat secara drastis disaat suhu pemanasan melewati titik leleh (melting point).

Titik leleh dari setiap potongan DNA bersifat spesifik. Misalnya, titik leleh untuk DNA dari Diplococcus pneumoniae, E. coli, Serratia marcescens, dan Mycobacterium phlei masing-masing berturut-turut: 86, 90, 94 dan 97 oC. Naiknya titik leleh ini berhubungan langsung dengan naiknya kadar [G] + [C] pada suatu spesies. Setiap spesies bakteri dan vertebrata memiliki kadar G/C yang berbeda-beda (Tabel 2.1). Marmur (1959) melakukan percobaan denaturasi DNA yang mengandung berbagai kadar AT (termasuk DNA sintetik kaya AT. Hasilnya menunjukan bahwa suhu titik denaturasi menurun dengan naiknya kadar A/T. Percobaan transformasi pneumococci resipien dengan DNA yang di panasi dari D. pneumoniae donor, menyebabkan aktifitas transformasi terhenti disaat pemanasan mencapai suhu 86oC, yaitu suhu dimana denaturasi DNA Pneumococci di capai. Hal ini disebabkan oleh ketidakmampuan bakteri ditransformasi oleh rantai tunggal polinukletida.Hal yang menarik adalah bahwa ternyata dua rantai tunggal DNA yang telah dipanasi dapat berpasangan kembali di dalam larutan. Marmur di tahun 1960 memanaskan larutan DNA pneumococci pada suhu 100oC. Larutannya kemudian didinginkan. Sepanjang pemanasan dan pendinginan, dilakukan uji kemampuan DNA mentrasnformasi bakteri resipien. Pewarisan kemampuan bakteri menerima DNA berlangsung sejalan dengan naiknya suhu pemanasan DNA. Sewaktu pendinginan, dan suhu mencapai 86oC, transformasi mulai mengalami restorasi dan mencapai maksimumnya pada suhu sekitar 60oC, dan tetap konstan sampai suhu pendinginan mencapai 30oC. Denaturasi dan renaturasi DNA dapat juga diikuti dengan mengukur absorbansi sinar ultraviolet sepanjang naik dan turunnya suhu larutan.2. Sifat kimia DNASifat-sifat asam nukleaat adalah stabilitas asam nukleat, pengaruh asam, pengaruh alkali denaturasi kimia, viskositas, dan kerapatan apung.

1. Stabilitas asam nukleaKetika kita melihat susunan asam nukleat baik itu RNA maupun DNA, nampaknya susunan asam nukleat itu nampak stabil akibat adanya ikatan hidrogen diantara basa-basa nitrogennya. Padahal sebenarnya tidaklah demikian. Ikatan hidrogen di antara pasangan-pasangan basa hanya akan sama kuatnya dengan ikatan hidrogen antara basa dan molekul air apabila DNA berada dalam bentuk rantai tunggal. Dengan demikian sudah terbukti bahwa ikatan antar pasangan bisa tidak menentukan stabilitas asam nukleatnya tetapi menenntukan spesifikasi pasangan basa.Penentu stabilitas struktur asam nukleat terletak pada interaksi penempatan (stacking interactions) antara pasangan-pasangan basa. Permukaan basa yang bersifat hidrofobik menyebabkan molekul-molekul air dikeluarkan dari sela-sela perpasangan basa sehingga perpasangan tersebut menjadi kuat.2. Pengaruh alkali terhadap asam nukleat akan mengakibatkan terjadinya perubahan status tautomerik basa. Contohnya peningkatan pH akan menyebabkan perubahan struktur guanin dari bentuk keto menjadi bentuk enolat karena molekul tersebut kehilangan sebuah proton. Selanjutnya, perubahan ini akan menyebabkan terputusnya sejumlah ikatan hidrogen sehingga pada akhirnya rantai ganda DNA mengalami denaturasi. Hal yang sama terjadi pula pada RNA. Bahkan pada pH netral sekalipun, RNA sangat rentan terhadap hidrolisis bila dibadingkan dengan DNA hal ini dikarenakan adanya gugus OH pada atom C nomor 2 di dalam gula ribosanya.3. Denaturasi KimiaTelah diketahui ada beberapa bahan kimia yang dapat menyebabkan denaturasi asam nukleat pada pH netral. Contoh yang paling dikenal adalah urea (CO(NH2)2) dan formamid (COHNH2). Pada konsentrasi yang relatif tinggi, senyawa-senyawa tersebut dapat merusak ikatan hidrogen. Artinya, stabilitas struktur sekunder asam nukleat menjadi berkurang dan rantai ganda mengalami denaturasi.3. Sintesis DNA dan reaksi polimerasi

sReaksi Polimerisasi Polimer merupakan makromolekul yang tersusun atas banyak molekul kecil (monomer) yang bergabung menjadi molekul yang lebih besar melalui suatu reaksi polimerisasi. Polimerisasi merupakan reaksi pembentukan rantai polimer menjadi struktur yang panjang dan berulang dengan unit ulang yang sama. Berdasarkan jenis reaksinya, reaksi polimerisasi dibagi menjadi polimerisasi kondensasi dan polimerisasi adisi. Polimerisasi KondensasiPolimerisasi kondensasi merupakan polimerisasi bertahap karena terbentuk dari reaksi antara dua gugus fungsi. Reaksi polimerisasi kondensasi yang terjadi dapat berupa Polimerisasi kondensasi terjadi antara molekul yang ukurannya bervariasi, misalnya :Monomer + monomer dimerDimer + monomer trimerDimer + dimer tetramerTrimer + dimer petamerMi + Mj Mi+j Polimerisasi AdisiPolimerisasi adisi merupakan polimerisasi berantai karena monomer mempunyai ikatan rangkap. Berdasarkan pusat aktifnya, polimerisasi adisi terdiri atas polimerisasi radikal, polimerisasi ionik (kationik dan anionik), dan polimerisasi Ziegler Natta. Polimerisasi radikal mempunyai pusat aktif berupa radikal. Pada polimerisasi kationik pusat aktif merupakan kation (ion positif), sedangkan pada polimerisasi anionik pusat aktif merupakan anion (ion negatif). Pada polimerisasi Ziegler-Natta pusat aktif merupakan kompleks. Reaksi polimerisasi adisi terdiri atas tahap inisiasi, propagasi, dan terminasi.Sintesis DNA berlangsung dengan arah 5_ 3 dan semiterputusStrand DNA yang baru selalu disintesa dengan arah 5_ 3 (ujung 5 dan 3 strand DNA ). Karena kedua strand DNA anti parallel, strandtersebut bertindak sebagai template yang dibaca dari ujung 3 kemudian 5. Jika sintesis strand DNA selalu berlangsung dari arah 5_ 3, bagaimana mungkin kedua strand dapat disintesis secara seretntak? Jika dua-duanya disintesis secara berkelanjutanseperti cabang replikasi berpindah, salah satu harus disintesis dengan arah3_ 5. Permasalahn ini dipecahkan oleh Reiji Okazaki dan rekan-rekannya pada tahun1960an. Okazaki menemukan bahwa salah satu dari strand DNA baru disintesis dalamlembaran pendek, yang disebut fragmen Okazaki. Hasil ini kemudian membawa pasasebuah kesimpulan bahawa salah satu strand disinstesis secara berkelanjutan dansatunya lagi terputus (Gb. 24-4). Strand yang berkelanjutan atau leading strand adalahstrand yang mana sintesis 5_ 3 berlangsung dengan arah yang sama sepertiperpindahan cabang replikasi. Strand teputus atau lagging strand merupakan stranddimana sintesis 5 _ 3 berlangsung dengan arah yang berlawanan dengan perpindahancabang. Panjang fragmen Okazaki berkisar dari ratusan samapi ribuan nukleotida, tergantung jenis selnya.DNA disintesis dengan DNA polymerasePencarian enzim yang dapat mensistesis DNA telah dimulai dari tahun 1955 oleh ArthurKornberg dan rekan-rekannya. Penelitian ini membawa pada pemurnian dan pencirianDNA polymerase pada sel E. coli, enzim polipeptida tunggal yang sekarang dikenaldengan sebutan DNA polymerase I (Mr 103.000). kemudian, ditemukan bahwa E. colimengandung skurang-kurangnya dua DNA polymerase yang berbeda , yang akandijelaskan dibawah.Studi mendalam DNA polymerase I mengungkapkan ciri proses DNA sintetis yangdibuktikan secara umum pada semua DNA polymerase. Reksi pokoknya adalahserangan nukleopilik oleh kelompok nukleotida 3hidroksil pada ujung 3 strand yang tumbuh di 5-_-posporus deoxynucleoside 5-trifospat yang baru masuk . Pirofospat anorganik dihasilkan melalui reaksi tersebut. Persamaan reaksinya adalah: (dNMP)n + dNMP _ (dNMP)n + PPi DNA perpanjangan DNA Dimana dNMP dan dNTP merupakan deoxynucleoside 5-monofospat dan 5-trifospat, secara berturut-turut.Penelitian awal tentang DNA polymerase I membawa kepasa sebuah definisi tentangdua persyaratan sentral untuk DNA polymerase. Pertama, semua DNa polymerasemembutuhkan template (Gb. 24-5). Reaksi polimerisasi dipandu oleh template strandDNA sesuai denga aturan pasangan basa yang diasumsikan oleh Watson dan Crick: dimana terdapat guanine pada template, sitosin ditambahkan pada strand baru, dan sebagainya. Hal ini metupakan penemuan yang beda , tidak hanya karena penemuan ini menghasilkan dasar kimia untuk replikasi DNA semikonservatif, tetapi karena penemuan ini memberikan contoh tentang penggunaan template untuk memandu reaksi biosintetik. Kedua, dibutuhkan primer. Primer merupakan segmen strand baru(pelengkap template)dengan kelompok 3-hidroksil kemana nukleotida ditambahkan.Ujung 3 dari primer disebut primer terminus. Dengan kata lain, bagian dari strand baruharus sudak ditempatkan; polymerase hanya dapat menambahkan nukleotida padastrand yang sudah ada sebelumnya. Ini sudah dibuktikan sebagai kasus pada semuaDNA polymerase, dan penemuan ini dilengkapi dengan cerita pengerutan DNA yangmenarik. Tidak ada enzim sintesis DNA dapat memulai sisntesis pada strand DNA baru.Seperti yang akan kita lihat kemudian pada bab ini, enzim yang mensintesis RNA memiliki kemampuan memulai sintesis, dan akibatnya, primer sering merupakan oligonukleotida RNA. Setelah nukleotida ditambahkan pada strand DNA yang berkembang, DNA polymeraseharus harus dipisahkan atau dihilangkan dari template dan menambahkan nukleotidayang lain. Pemisahan dan penggabungan kembali polymerase dapat membatasikecepatan reaksi keseluruhan, oleh karena itu kecepatan reaksi umumnya bertambahjika polymerase menambahkan nukleotida tambahan tanpa pemisahan pada template. Jumlah nukleotida yang ditambahkan , rata-rata, sebelum polymerase dipisahkan didefinisikan sebagai processivity. DNA polymerase bervariasi dalam hal processivitynya, dengan beberapa penambahan sedikit nukleotida dan penambahan lainnya sebelum pemisahan terjadi.

Polimerasi merupakan rekasi yang menguntungkan secara termodinamikPentingnya interaksi nonkovalen dan kovalen dalam proses biokimia. Pembahasan tentang reaksi polimerisasi energetic dapat dilaksanakan jika ada ikatan kovalen. Penyusunan kembali ikatan kovalen yaitu: satu ikatan anhidridposporik (dalam dNTP) dihidrolisis dan dibentuk satu ikatan phospodiester (dalam DNA).hasil ini merupakan perubahan yang tidak terlalu bagus (tak diinginkan) dalam standar energy bebas ( D G=2 kJ/mol)untuk semua reaksi yang ditunjukan padapersamaan 24-1. Hidrolisis pirofospat menjadi 2 molekul fospat anorganik oleehpirofospat yang ada pada sel menghasilkan D G= -30 kJ/mol, dan denganmenggabungkan dua reaksi ini sel mampu menyediakan termodinamika kuat secarapenuh dapa arah polimerisasi, dengan menerima energy sebesar DG= -28kJ/mol. Halini sangat penting untuk sel, namundalam kasus ini, ini bukanlah keseluruhan cerita.Jika kalkulasi ini telah lengkap, polymerase cenderung mengkatalisasi degradasi DNA dengan keberadaan hidrolisis pirofospat. Polymerase DNA murni, melangsungkan pilimerisasi secara efisien di dalam vitro dengan ketidakadaan pirofospatase.