ENZIMOLOGIJA H T T P : / / W W W. C H E M . Q M W. A C . U K / I U B M B / E N Z Y M E

DNK polimeraze struktura, funkcija, evolucija i primena

MEHANIZAM ODRŽAVANJA GENOMA

REPLIKACIJA REKOMBINACIJA REPARACIJA

Uvod

Pravilna i tačna replikacija DNK je neophodna da bi se sačuvao integritet genetičke informacije kroz generacije.

Učestalost greške tokom replikacije je niska, 10-10–10-11

Tačnost replikacije se zasniva na dva koncepta

DNK mora da bude intakta što je više moguće. Bez bilo kakvih oštećenja pre procesa replikacije.

Tačnost relikacije koja se izvodi na neoštećenoj DNK ima svoja ograničenja.

Opšta shema koja pokazuje kako tri nezavisna procesa doprinose ukupnoj tačnosti replikacije

Bez obzira na raznolikost prokariota i njihovih staništa, sekvenca DNK polimeraze I je ostala

nepromenjena

Otkriće DNK polimeraze I

1956. godine Artur Kornberg je izolovao prvu polimerazu, a 1959. godine je sa Severno Oha dobio Nobelovu nagradu za fiziologiju i medicinu “za otkriće mehanizma biosinteze DNK”. Istraživanja na DNK Pol I su dala osnove za istraživanja strukurnih i biohemijskih mehanizama replikacije DNK.

Familije DNK polimeraza

Familija A - Pol I, Pol γ, T3, T5 i T7

Familija B – Pol II, Pol α, d, ε, ζ, T4, virusa, arhea

Familija C – Pol III

Familija D – nije dobro okarakterisna, Euryarchaeota

Familija X – Pol b, σ, λ, μ i TdT

Familija Y – TLS polimeraze (Pol η, ι, κ), Rev1, Pol IV, Pol V

Familija RT - retrovirusi, eukariotske telomeraze

DNK polimeraze prokariota Escherichia coli

DNK polimeraza I

Zahteva postojanje prajmera

Aktivna samo u prisustvu matrice

Egzonukleazne aktivnosti u oba smera

Niska proceivnost

Primarna uloga je da popuni pukotine u DNK molekulu koje nastaju tokom replikacije, reparacije i rekombinacije DNK

Mogućnost dopunjavanja aktivnosti između polimeraza koje su izolovane iz evolutivno udaljenih organizama

3D struktura DNK polimeraze I

Tri domena: dlan, palac i prsti

Prsti – dNTP i jednolačana DNK, Palac – dvolančana DNK i Dlan – sadrži katalitički centar i takođe vezuje dNTP

Na C – terminalnom kraju 6 konzerviranih motiva od kojih

3 liče na motive DNK Pol a sisara i označeni su kao motiv A, B i C. A i C – dlan; B – prsti.

Visok stepen aminokselinskih zamena u aktivnom mestu DNK Pol I:

- 3 od 26 aminokiseline neophodne za in vivo funkcionisanje enzima (motiv A Asp610) i (motiv B Arg659 i Lys663)

- zamena 3 od 4 aminokiseline dovodi do promene supstratne specifičnosti enzim (motiv A Ile614, Glu615 i Arg617)

3D struktura DNK polimeraze I

Evolucija aktivnog mesta DNK Pol I

Vrste istog roda imaju gotovo identično aktivno mesto na nukleotidnom

nivou što sugeriše da je brzina evolucije polA gena izuzetno spora.

Izuzetna plastičnost aktivnog mesta

- visoku toleranciju DNK Pol I na visok stepen mutacija sa kojima se sreće i

omogućava generisanje “dobrih” mutacija koje obezbeđuju kratkoročnu

selektivnu prednost.

- postoje mehanizmi za održavanje nukleotidne sekvence tokom evolucije

koji još nisu otkriveni.

DNK polimeraze prokariota Escherichia coli

Holoenzim DNK polimeraza III E. coli u toku replikacije vodećeg i zaostajućeg lanca

Shema delovanja dnk poli E. coli u nastajanju i sprečavanju grešaka u replikacionoj viljušci

ZAKLJUČAK Pomoćne polimeraze mogu, bar povremeno, da priđu replikativnoj

viljušci i učestvuju u procesu replikacije.

Učestalost greške tokom replikacije zavisi od tipa polimeraze.

Pol III nema tendenciju da proces sinteze novih lanca prepusti drugim polimerazama osim u određenim situacijama. Najverovatnije prva za to je Pol II.

Pol IV i Pol V moraju da se takmiče sa Pol II za ovu aktivnost i to prevashodno na zaostajućem lancu.

t je ključni faktor koji detektuje zastoj Pol III i omogućava njenu eventualnu zamenu drugom Pol koja nastavlja sintezu.

Sve napred rečeno daje odgovor na pitanje zašto je vernost replikacije u wt ćelijama nekoliko puta veća na zaostajućem nego na vodećem lancu.

Familije DNK polimeraza

Familija A - Pol I, Pol γ, T3, T5 i T7

Familija B – Pol II, Pol α, d, ε, ζ, T4, virusa, arhea

Familija C – Pol III

Familija D – nije dobro okarakterisna, Euryarchaeota

Familija X – Pol b, σ, λ, μ i TdT

Familija Y – TLS polimeraze (Pol η, ι, κ), Rev1, Pol IV, Pol V

Familija RT - retrovirusi, eukariotske telomeraze

Jedna DNK polimeraza – više funkcija Jedan događaj sinteza DNK – učešće više DNK polimeraza

POLIMERAZNA subjedinica i druge funkcionalne subjedinice

Aktivno mesto veoma konzervirano tokom evolucije

5’-3’ polimerazna aktivnost

nema egzonukleaznu aktivnost

niska procesivnost

započinje sintezu DNK sintetišući

prajmer i kratak lanac DNK

B familija

Glavna karakteristika svih DNK polimeraza je njihova nesposobnost da sintetišu lanac DNK de novo.

49kDa subjedinica -počinje sintezu DNK de novo -katalitički centar primaze

67-86kDa (B) subjedinica -nema enzimsku aktivnost -ukljucena u regulaciju inicijacije replikacije

58kDa i 49kDa subjedinice -formiraju heterodimer primaze i tada je njena aktivnost max

165kDa subjedinica -elongacija početnog prajmera od najmanje 7, a obično 40 nukleotida

DNK pol α igra značajnu ulogu u koordinisanju replikacije, DNK reparaciji i kontrolnim tačkama ćelijskog ciklusa

Kinaze zavisne od ćelijskog ciklusa fosforilišu i na taj način regulišu aktivnost DNK pol α tokom ćelijskog ciklusa

- Dva domena na polipeptidnom lancu od 39kDa:

31kDa domen (DNK polimerazna aktivnost)

8kDa domen ( dRPase za uklanjanje fosfata sa 5‘-kraja)

-Tri aspartata u aktivnom mestu su ukljucena u trasfer dNMP isto kao i kod Pol I prokariota.

- Učestvuje u procesu isecanja baza tokom reparacije kod sisara:

short patch BER - (zamena jednog nukleotida) Pol β

long patch BER - (zamena nekoliko nukleotida, 2-13) Pol δ i Pol ε

Replikacija i reparacija mitohondrijalne DNK

Bailey and Doherty, Bioche. Soc. Trans. 2017

Replikacija i reparacija mitohondrijalne DNK

Heterotrimer - katalitička γA subjedinica (POLG1) - γB subjedinica (POLG2) – homodimerni pomoćni protein

Replikacija i reparacija mitohondrijalne DNK

Mutacije POLG gena dovode do brojnih poremećaja.

Polimerazna 5’-3’ aktivnost Egzonukleazna 3’-5’ aktivnost Reparacija

kompleks od četiri subjedinice (heterodimer)

5’-3’ polimerazna i 3’-5’ egzonukleazna aktivnost

katalitička aktivnost zavisi od PCNA

visoka procesivnost i tačnost

replikacija i reparacija

(isecanje nukleotida,

“mismatch”, TLS)

C terminalni domen katalitičke subjedinice

- neophodan i dovoljan za funkcionisanje

- senzor replikacije, Zn2+ prstići (koordiniše transkripcioni odgovor, odgovor ćelije

na blokiranje replikacije i oštećenje DNK tokom S faze ćelijskog ciklusa)

- nije odgovorna za proveru kontrolnih tačka u S fazi (DNK polimeraza α-primaza)

kompleks od četiri subjedinice

5’-3’ polimerazna i 3’-5’ egzonukleazna aktivnost

visoka procesivnost i tačnost

replikacija i reparacija

Replikativna viljuška 27 godina kasnije

A. Model iz 1990. godine B. Trenutno važeći model

Rezultati eksperimenata sa mutantima Pol δ i Pol ε koji nisu imali egzonukleaznu aktivnost Obe polimeraze su uključene u replikaciju Sinergisički efekat njihove egzonukleazne aktivnosti Mora da postoji neki mehanizam po kome se određuje koja polimeraza replikuje određeni lanac DNK molekula Rezultati eksperimenata sa različitim mutantima Pol δ i Pol ε Pol δ popravlja greške koje napravi Pol α Pol ε uključena u replikaciju vodećeg lanca Pol α i Pol δ sintetišu zaostajući lanac, a Pol ε sintetiše vodeći lanac.

Replikativna viljuška 27 godina kasnije Šta se ne slaže u u modelu jedna plimeraza jedan lanac DNK

Kada je deletiran gen za Pol ε, Pol δ može da je zameni, ali ne i obrnuto Kada je inaktivirana egzonukleazna aktivnost Pol δ znatno se povećava stopa mutacija u genomu, ali ne kada se naprave analogne mutacije u Polε Pol δ i Pol ε imaju afinitet ka istom tipu grešaka koje nastaju pri replikaciji (u tom slučaju bi smo imali aditivni efekat njihove aktivnosti) Pojava lezija na matrici regrutuje TLS polimeraze, a u tome učestvuje Pol δ i to na oba lanca in vitro eksperimenti su pokazali da je Pol δ efikasnija od Pol ε

Replikativna viljuška 27 godina kasnije Šta se ne slaže u u modelu jedna plimeraza jedan lanac DNK

Autonomous Replication Sequence

Kada je inaktivirana egzonukleazna aktivnost Pol δ znatno se povećava stopa mutacija u genomu Pol δ i Pol ε imaju afinitet ka istom tipu grešaka koje nastaju pri replikaciji U korelaciji je sa starim modelom da su obe polimeraze angažovane u replikaciji na odvojenim lancima, ali se to dešava samo u domenu starta replikacije U replikaciji genoma učestvuju i TLS polimeraze, sa posebnim osvrtom na ulogu Pol ζ

Četvrta polimeraza iz B familije

Jezgro od dve subjedinice koje su u asocijaciji sa Rev 1 proteinom:

Rev3 katalitička polimerazna subjedinica

Rev7 subjedinica (povećava katalitičku aktivnost polimeraze)

nema egzonukleaznu aktivnost

Transleziona sinteza DNK

Najverovatnije četvrta polimeraza u replikativnoj viljušci čije je uključivanje u proces replikacije ograničeno i veoma dobro kontrolisano.

Član Y familije eukariotskih DNK polimeraza

Ima ubikvitin-vezujući domen za interakciju sa PCNA

C-terminalni domen (AK 1130-1251) za interakciju u kompleksu Rev3-Rev7 i sa drugim translezionim polimerazama

Hoolog UmuC kod E.coli (Pol IV) Johanson et al., PNAS 1999

Eubacteria – familija C DNK polimeraza

Archaea/Eukarya – familija B DNK polimeraza

Zn prsti na C – terminusu Pol ε homologi Zn prstima Pol II i polimeraza iz D familije

Hipoteza da je arhea predak eukariota kodirao tri DNK polimeraze, dve zasebne B familije i D familiju polimeraza.

Inaktivirani Pol-Exo domen Pol ε je esencijalan za život ćelije što ukazuje na neku njegovu još ne otkrivenu funkciju.

Eukariotska B familija polimeraza vodi poreklo od dve evolutivno udaljene B familije Archaea, jedna je dala Pol ε,

druga je najverovatnije predak Pol α, Pol δ i Pol ζ

DNK POLIMERAZE I NJIHOVA BIOTEHNOLOŠKA PRIMENA

Aschenbrenner and Marx., Curr. Opin. Biotech. 2017

DNK POLIMERAZE I NJIHOVA

BIOTEHNOLOŠKA PRIMENA

Kristalna struktura odabranih DNK polimeraza najčešće korišćenih za

biotehnološku primenu Aschenbrenner and Marx., Curr. Opin. Biotech. 2017

Klenow fragment

DNK POLIMERAZE I NJIHOVA BIOTEHNOLOŠKA PRIMENA

DNK polimeraze za primenu u PCR:

High-fidelity PCR, Nested PCR, Multiplex PCR, Quantitative PCR, Revrse-transcriptase PCR, Whole genome amplification, itd.

DNK POLIMERAZE I NJIHOVA BIOTEHNOLOŠKA PRIMENA

DNK polimeraze za primenu u sekvenciranju genoma: Sekvenciranje po Sangeru, pirosekvenciranje, sekvenicranje nove generacije (Next generation sequencing - NGS), third generation sequencing (SMART).

DNK POLIMERAZE I NJIHOVA BIOTEHNOLOŠKA PRIMENA

DNK polimeraze za primenu u sekvenciranju genoma: Sekvenciranje po Sangeru, pirosekvenciranje, sekvenicranje nove generacije (Next generation sequencing - NGS) , third generation sequencing (SMART).

DNK POLIMERAZE I NJIHOVA BIOTEHNOLOŠKA PRIMENA

DNK POLIMERAZE I NJIHOVA BIOTEHNOLOŠKA PRIMENA

DNK polimeraze za primenu u sintezi korišćenjem modifikovanih nukleotida.

Aschenbrenner and Marx., Curr. Opin. Biotech. 2017

DNK POLIMERAZE I NJIHOVA BIOTEHNOLOŠKA PRIMENA

Veliki napredak u biotehnologiji je povezan sa otkrićem različitih DNK polimeraza

Posledično i dalje postoji potreba za DNK polimerazama određenih karakteristika

Sofisticirane metode za selekciju enzima značajno pomažu

Dodatne modifikacije metodama genetičkog inženjerstva

Identifikacija i karakterizacija novih DNK polimeraza bakterija, arhea i virusa