Upload
vuongkiet
View
268
Download
2
Embed Size (px)
Citation preview
Histološka i histohemijska bojenja
doc. dr Mirela UkropinaKatedra za biologiju ćelija i tkiva
Histologija
� Nauka o tkivima� Struktura – funkcija
� Organi, tkiva, ćelije – korelisati strukturu sa funkcijomfunkcijom
� SM, TEM, SEM� 2D – 3D
Priprema tkiva
� Paradoks – živo vs. mrtvo� Rutinski pripremljeni preparati bojeni H&E
� Fiksacija - metabolizam, struktura (formalin)Ispiranje� Ispiranje
� Dehidratacija – izvlačenje vode (alkoholi, 30-100%)� Ksilol – uklanjanje alkohola� Kalupljenje, parafin (tečan-čvrst)� Sečenje – mikroskopski preseci� (Bojenje)
� Može li histologija bez bojenja?� 1719. Leeuwenhoek – šafran � Neobojeni uzorci, grubo razdvojeno tkivo ili preseci
načinjeni slobodnom rukom, posmatrani u vodi� 1852. Kölliker – opis mikroskopske strukture tkiva� Industrija boja, primena komercijalnih boja u histologiji –
viđeni i proučavani detalji ćelijske struktureviđeni i proučavani detalji ćelijske strukture
� bukalna sluzokoža � neobojene ćelije i obojena metilenskim plavim
Priprema tkiva (cont.)
� Parafinski preseci su bezbojni� Izvlačenje parafina (ksilol)� Re-hidratacija (alkoholi,100-70%), voda� Hematoksilin – rastvoren u vodi� Eozin (rastvoren u alkoholu ili vodi)� Alkoholi, ksilol, montiranje DPX – trajni
preparat� Montiranje u nevodenom medijumu da bi sprečio gubitak
boje
Hematoksilin Eozin H&E
Drugi fiksativi, metode bojenja
� H&E – opšta histološka građa, ali ne hemijski sastav ćelija
� Mnoge komponente izgubljene tokom pripreme preparata (alkoholi i ksiloli uklanjaju pripreme preparata (alkoholi i ksiloli uklanjaju neutralne lipide→)
Lipidi
Oil Red Osmium tetroxide
H&E
Elastična vlakna
� Resorcin-fuksin
Retikularna vlakna
� impregnacija srebrom
� Hemijska osnova za mnoge metode bojenja nije poznata!
Histohemija i citohemija
� Procedure zasnovane na� Specifičnom vezivanju boje� Upotrebi (fluorescentno) obeleženih antitela � Upotrebi (fluorescentno) obeleženih antitela
� Inherentna enzimska aktivnost ćelijske komponente
Hemijski sastav histoloških preparata
� Razlikuje se od živog tkiva� Posle fiksacije preostaju mahom veliki � Posle fiksacije preostaju mahom veliki
molekuli koji se nerado rastvaraju, naročito u koracima koji slede nakon fiksativa
� Oni čine strukturu ćelija i tkiva, organizaciju vidljivu mikroskopom
� Struktura – funkcija� Proteini – vidljivi kontraktilni filamenti mišićne ćelije – učestvuju u kontrakciji
� RNK u citoplazmi motoneurona – Nislova tela –sinteza proteinasinteza proteina
Hemijski sastav histoloških preparata
� Nukleoproteini (nukl. kis. vezane za proteine)� Unutarćelijski citoskeletni proteini,
kompleksovani sa drugim proteinimakompleksovani sa drugim proteinima� Vanćelijski proteini u velikim nerastvorljivim
agregatima, povezani sa susednim sličnim molekulima, kolagena vlakna
� Membranski fosfolipid-protein (ili
ugljenohidratni) kompleksi
Rutinska priprema preparata
� Gubi se� Mali proteini, male nukleinske kiselina (tRNK)� Veliki molekuli – glikogen (unutar), proteoglikani i
GAG (van), neutralni lipidiGAG (van), neutralni lipidi� Rastvorljive komponente, joni, mali molekuli
(intermedijarni metaboliti, glukoza, Na, Cl..) –učestvuju u ćelijskom metabolizmu – ne čine formirane elemente tkiva
Hemijska osnova bojenja
� Kisele i bazne boje� Kisele boje - negativno naelektrisan obojeni
deo [Na+boja-] (eozin) Bazne boje - pozitivno naelektrisan obojeni � Bazne boje - pozitivno naelektrisan obojeni deo [boja+Cl-] (hematoksilin striktno govoreći nije bazna boja, ali ima osobine koje podsećaju na baznu boju)
� Bazne boje� Metil zeleno (zeleno)� Metilensko plavo (plavo)� Pironin G (crveno)� Toluidin plavo (plavo)� Toluidin plavo (plavo)
� Kisele boje� Kiseli fuksin (crveno)� Anilin plavo (plavo)� Eozin (crveno)� Oranž G (narandžasto)
Bazne boje (+)
� Reaguju sa anjonskim komponentama ćelija i tkiva (-)� Fosfatne grupe nukleinskih kiselina� Sulfatne grupe GAG� Sulfatne grupe GAG� Karboksilne grupe proteina
� Bazofilija – strukture koje se boje baznim bojama
� Mali broj tkivnih struktura pokazuje bazofiliju� Heterohromatin i nukleolus, citoplazma bogata
ribozomima, vanćelijski ugljeni hidrati
Bazne boje (+)
� Reakcija anjonskih grupa zavisna je od pH� pH 10: sve tri grupe jonizovane i interaguju sa
baznim bojama� pH 5-7: sulfatne i fosfatne grupe� pH 5-7: sulfatne i fosfatne grupe� pH <4: samo sulfatne grupe
� Bojenje na specifičnom pH vizualizuje određene anjonske grupe, karakteristične za određene makromolekule
Hematoksilin
� Hematoksilin→Hematein� Nije bazna boja, striktno gledajući� Koristi se sa mordantom (štavilom) –
intermedijarni link između tkiva i boje, i on čini intermedijarni link između tkiva i boje, i on čini da hematoksilin podseća na baznu boju (Al, Fe)
� Harisov, Majerov..
Kisele boje (-)
� Reaguju sa katjonskim komponentama ćelija i tkiva (+)� Jonizovane amino grupe proteina
� Acidofilija – sposobnost katjonskih grupa iz � Acidofilija – sposobnost katjonskih grupa iz tkiva da reaguju sa kiselim bojama
� Bojenje kiselim bojama je manje specifično i precizno nego bojenje baznim bojama
� Citoplazmatski filamenti, citoplazma, većina vanćelijskih vlakna (amino grupe) – više tkivnih komponenti pokazuje acidofiliju
Trihromno bojenje
� Tri kisele boje – metod za vezivno tkivo� Kiseli fuksin (Mallory)/azokarmin (Heidenhain's AZAN)
(citoplazma) � Anilin plavo (kolagen, ali i hrskavica, mukus)� Orange G (eritrociti)
� Veličina molekula boje, permeabilnost/kompaktnost tkiva
Metahromazija
� Neke bazne boje reaguju sa komponentama tkiva koje menjaju njihovu normalnu plavu obojenost u crveno/ljubičasto
� Toluidin plavo� Toluidin plavo
Metahromazija
� Zbog prisustva polianjona u tkivima, molekuli boje formiraju polimerne agregate – različita apsorpciona svojstva od monomera boje
� Jonizovane sulfatne i fosfatne grupe u tkivima � Jonizovane sulfatne i fosfatne grupe u tkivima (granule mastocita-heparin, osnovna supstanca hrskavičavog tkiva)
Aldehidne grupe i Šifov reagens
� Izbeljeni bazni fuksin (Šifov reagens) reaguje sa aldehidnim grupama dajući specifično crveno/magenta obojenje
� PAS (Periodic Acid Schiff) metod – ugljeni � PAS (Periodic Acid Schiff) metod – ugljeni hidrati i makromolekuli bogati njima
� Glikogen, mukus, podepitelske lamine
H&E vs. PAS
� Intestinalne žlezde - podepitelska lamina i mukus PAS +
Enzimska digestija
� Pozitivna identifikacija obojenog materijala� Dva uzastopna tkivna preseka� Pretretman diastazom ili amilazom, zatim PAS –
ne boji se glikogenne boji se glikogen
AB-PAS Neutralni vs. kiseli mukus
BPB Proteini
� Pedomorfan Lissotriton vulgaris, 40x
Enzimska histohemija
� Za lokalizaciju enzima u tkivnim presecima� Vizualizuje se produkt enzimske aktivnosti, a
ne sâm enzimBoja ili teški metal vezuje produkt reakcije � Boja ili teški metal vezuje produkt reakcije enzima – precipitacija� Lizozomi – olovo fosfat nastaje dejstvom kisele
fosfataze – SM i EM� ATPaza, Na/K ATPaza..
Imunohistohemija - IHC
� Antigen – antitelo specifična reakcija
� U zavisnosti od toga šta je vezano za antiteloImunofluorescenca� Imunofluorescenca
� Imunoenzimološko bojenje / enzimska IHC� Imunokoloidno zlato – imunocitohemija, EM
� U zavisnosti od tipa procedure� Direktno bojenje� Indirektno bojenje
Enzimska IHC
� Enzimi - peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza (AP)
� Supstrat – DAB (braon), ...
Insulin Ki67
Propidijum jodid - apoptoza
� Tkiva bojena ne-jonskim bojama montiraju se vodenim medijumom
� Bojenje – vizuelno obeležavanje nekog entiteta vezivanjem, ili taloženjem u njegovoj blizini, markera karakteristične boje ili oblika
� Boja – marker, ili reagens korišćen da bi se � Boja – marker, ili reagens korišćen da bi se stvorio marker
Zašto se tkiva boje?
� Boja-tkivo afinitet � Afinitet – tendencija boje da pređe iz rastvora
na tkivni presek� Boja-tkivo interakcije� Boja-tkivo interakcije
� Elektrostatičke veze, Van der Valsove sile, vodonične veze, kovalentne veze; rastvorljivost
� Boja-boja interakcije� Molekuli boje se privlače – agregati; metahromazija
� Druge mogućnosti� Negativno bojenje – kanalikuli koštanog matriksa
� Tionin i pikrinska kiselina
� Vitalno bojenje � India Ink & H&E � Trypan Blue & Safranin & Orange G
� Autoradiografija
� Mali molekuli, prekursori većih – aminokiseline, nukleotidi – mogu se obeležiti radioaktivnim atomima (inkorporiraju se)
� Injektiraju se u životinju ili unesu u kulturu ćelija, uključuju se u sintezu proteina, nukleinskih uključuju se u sintezu proteina, nukleinskih kiselina...sekrecija, deoba
� Preseci tkiva se uranjaju u fotografsku emulziju, razvijaju standardnim fotografskim tehnikama, mogu se i obojiti, montiranje
� Partikule srebra u emulziji iznad radioaktivno obeleženih molekula – crne granule
� [3H] timidin – sinteza DNK
� Limfni čvor