Forenzicka DNK Analiza

8/13/2019 Forenzicka DNK Analiza

1/36


2/36

Dezoksiribonukleinska kiselina

(DNK)

Otkrice- Friedrich Miescher 1869.

Phoebus Levene 1919.: DNK se sastoji od

azotne baze, ecera i fosfatne jedinice.

Watson & Crick 1953. Struktura DNK.

TIPOVI DNKnuklearna (jedarna) DNKnDNK (3109bp)mitohondrijalna DNKmDNK (16649 bp)


3/36

A

Struktura DNK

Dvostruki polinukleotidni lanacnukleotid

nukleozid

a. baza

T

G C


4/36

ORGANIZACIJA DNK U CELIJI

centromera

telomera

p

qhromatide


5/36

Delovi DNK koji sadre informacijuneophodnu za sintezu proteina nazivaju se

geni.Samo oko 5 % DNK sadri ovakveinformacije.

Mesto na DNK na kojem je smeten gennaziva se lokus

Sestrinske hromatide sadre kopije istoggena (alele), koji se mogu biti istovetne

(homozigot) ili razlicite (heterozigot)

Delovi DNK koji se nalaze izmedju genskihlokusa nazivaju se introni


6/36

VNTR DNK

Satelitska DNK (2-100 bp sa ponavljanjemvie od 1000 puta)

Minisatelitska DNK (9-100 bp saponavljanjem od 10 do 100 puta)

Kratki tandemski ponovci (STR, 3-5 bp saponavljanjem od 10 do 100 puta)

Mikrosateliti (1-2 bp sa ponavljanjem od10 do 100 puta)

Alurepovi (1-5 bp sa ponavljanjem od 10do 40 uta


7/36

DNK analiza

1984 Alec Jeffreys RFLP (restrictionfragment lenght polymorphism)metod

Uoio je da intronski delovi DNKsadre segmente koji se sastoje odviestrukog ponavljanja istovetne

sekvencije nukleotida VNTR (variablenumber of tandem repeats)

Broj ponavljanja u tim segmentima

varira izmedju osoba-osnova za


8/36

Ubistva u Narborough-u

1983, 1986 ubistva dve tinejderke,isti modus operandi

posle ispitivanja Richard Bucklandpriznao ubistvo jedne rtve osloboen na osnovu DNK analize

5000 analiziranih uzoraka Colin Pitchfork- osuen na osnovu

DNK analize


9/36

Algoritam DNK analize

Prikupljanje uzoraka - biolokih tragova Uzimanje biolokih uzoraka od nesporno

identifikovane osobe

Izolovanje molekula DNK iz biolokogmaterijala

Provera koliine i kvaliteta molekula u DNK

materijalu Obrada molekula DNK primenom

odgovarajuih enzima

Dobijanje DNK profila iz biolokih uzoraka


10/36

ta sve moe biti uzorak zaDNK analizu

Bioloki fluidi/ekskrementi Tragovi na nosaima

Krv Zalogaj hrane

Sperma Konac za ciscenje zubaPljuvaka Cetkica za zube

Koncentrovan urin akalica

Znoj Opuak

Feces Upotrebljena papirna maramica

elijski bris Posteljina

Sve to sadri celije sa jedrom

... ...


11/36

Tip uzorka Koliina DNK

Krv 20.000 - 40.000 ng/ml

mrlja 1 cm2 200 ng

mrlja 1 mm2 2 ng

Sperma 150.000 - 300.000 ng/mlKosa

Icupana 1 - 750 ng/dlaka

Pokidana 1 - 12 ng/dlaka

Pljuvacka (tj. saliva) 1.000 - 10.000 ng/ml

Urin 1 - 20 ng/ml

Kolicine DNK u pojedinim uzorci


12/36

Izolovanje DNK

Chelex ekstrakcija (primena jonizmenjivackihsmola)

QiaAmp ekstrakcija

Organska ekstrakcija (serija organskihekstrakcija)

Diferencijalna ekstrakcija


13/36

Odredjivanje kolicine DNK u

uzorku


14/36

RFLP analiza

1. Isecanje DNK molekula na restrikcione

fragmente upotrebom restrikcionih

enzima (endonukleaza)

2. Razdvajanje DNK fragmenata razliiteveliine korienjem gel elektroforeze

3. Prenoenje DNK sa gela na najlonsku

membranu, Southern-blot metodom4. Hibridizacija DNK probe na membrani

5. Vizualizacija lokacije hibridizovanih proba

6. Inter retaci a rezultata


15/36

Razdvajanje DNK fragmenata

A

-Razvajanje se vri po ejstvomelektrinog polja u agaroznom gelu

-Kradi fragmenti bre putuju kapozitivnoj elektrodi

-Fragmenti restrikcije se izdvajaju u

obliku diskretnih trka

-Specifina boja se vezuje za traketako da postaju vidljive pod UV

svetlou


16/36

Southern blot i hibridizacija

traka RFLP trake se prenose na nitroceluloznu ili

najlonsku membranu (Southern blot)

Hibridizacija- vezivanje komplementarne DNKprobe koja je obeleena raioaktivnimizotopom (32P) ili fluorescentnim agensom


17/36

Detekcija FRLP fragmenata

Autoradiografija

Luminescencija


18/36

Primeri RFLP tehnike

Utvrivanje oinstva Utvrivanje poinioca


19/36

Karakteristike RFLP analize

Visoka specifinost

Neophodan dvostruki lanac DNK

Ne moe da radi sa deliminodegradiranom DNK.

Dugotrajna procedura


20/36

Polymerase chain reaction

(PCR)

1983 Kary Mullis

Umnoavanje delova ili itavog lanca

DNK Moe da funkcionie i sa samojednim molekulom DNK

Termoregulisani ciklusi umnoavanja identauracije

TAQ polimeraza


21/36

Postupak PCR

http://ubuntuone.com/5J4FvAwjJ1qD61VC8s8cRr
http://ubuntuone.com/5J4FvAwjJ1qD61VC8s8cRrhttp://ubuntuone.com/5J4FvAwjJ1qD61VC8s8cRrhttp://ubuntuone.com/5J4FvAwjJ1qD61VC8s8cRrhttp://ubuntuone.com/5J4FvAwjJ1qD61VC8s8cRr


22/36

SHORT TANDEM REPEATS

(STR)

Mesta (lokusi) na DNK molekulu kojisadre kratke segmente (obicno cetiri

baze) koji se ponavljaju STR koji se koriste za DNK

identifikaciju su visokopolimorfni.

Postoji vie od 10000 poznatih STRregiona, ali se u forenzickoj analizi

koristi svega 6-15


23/36

Razdvajanje fragmenata posle

STR analize

Kapilarna elektrofreza Elektroferogram


24/36

Primer STR analize

Uzorak sa

mesta zlocina

Uzorak DNKzrtve

1. osumnjiceni

2. osumnjiceni


25/36

Mitohodrijska DNK

Svaka mitohondija (5-100 po celiji) sadri2-3 molekula mDNK koje svaka za sebe

sadre tano 16569 baznih parova.

Kodirajui i nekodirajui regionisu razdvojeni

Regioni HV1 i HV2 (ukupno 1100baznih parova i koriste se u

forenzikoj analizi kada nijedostupna nuklearna DNK

Mitohondrijska DNK ne sadri


26/36

HV1 i HV2 regioni se umnoavajupomodu PCR ge se uz

stanarne sastojke oaju iprekiai sinteze obeleenidideoksi ribonuleotid fosfati


27/36

Analiza Y hromozoma

Nasledjuje se samo od oca

Slui za odreivanje DNA profila kada su u

uzorku prisutne celije vie osoba.

Ciljni lokusi se nalaze na delu hromozoma

koji nije podloan rekombinaciji.


28/36

Interpretacija rezultata DNK

analize Ukljucivanje (inkluzija) neiskljucivanje

Iskljucivanje (ekskluzija)

Nepotpuni/neuverljivi rezultati


29/36

Baze podataka

UK (NDNAD) oko 2 miliona profila

FBI (CODIS) 4, 5 milona profila

Nacionalne baze


30/36


31/36

Sluaj ubistva Nikol Simpson i RonalaGoldmana

12 juna 1994. u svom stanu pronadjena jeizbodena N. B. Simpson. U drugoj

prostoriji naeno je beivotno telo R.Goldmana.

Glavni osumnjieni je O. J. Simpson, biviigra amerikog fudbala i glumac


32/36

Mesto

zloina


33/36

Kua i automobil osumnjienog sapoloajima dokaznog materijala


34/36

Analizirano 45 uzoraka krvi pronaenih namestu zloina, u kui i vozilu

osumnjienog

Uzorci su analizirani pomou RFLP i STRmetode.

U veini uzoraka naena DNK O. J.Simpsona pomeana sa DNK rtvi.

Zbog proceduralnih greaka u uzorkovanjuDNK O. J. Simpson je osloboen


35/36

Carska porodica Romanov

STR tehnika je koridena za utvrivanje srostva

Analiza mDNA je koridena za utvrivanje ientiteta


36/36

mDNA Carice Aleksandre FjodorovneRomanov utvreni preko slinosti sa mDNA

princa Filipa. (1991, 1998)

mDNA Cara Nikolaja II Romanova je pokazivalaheteroplazmiju (6,126).

Poreenje sa mDNA njegovog brata Velikogvojvode Georgija pokazali su slaganje.

Carevid Aleksej i Velika kneginja Marija suimali ientian mDNA kao A. Fjoorovna

Documents

Forenzicka DNK Analiza