José Luis Rodríguez Peralto

HOSPITAL 12 DE OCTUBRE,

BIOLOGÍA MOLECULAR DEL MELANOMA

DR. JOSÉ LUIS

RODRÍGUEZ PERALTO

UN PROBLEMA DE SALUD

IMPORTANTE

• Tumor maligno muy agresivo (79% muertes por cáncer de piel)

• En Europa 2.5% de todos los cánceres. 1-2% de muerte por cáncer (5000

muertes por melanoma en Europa cada año)

• Incremento de la incidencia en las últimas décadas (15 veces en los

últimos 50 años).

• España: 15:100.000 habitantes (según zonas). 4000 casos nuevos año.

• No incremento de la mortalidad en la misma proporción (diagnóstico

precoz)

• Pronóstico ominoso en fases avanzadas. Resistencia a la quimioterapia

0

10

20

30

40

50

60

70

80

BRESLOW 80 25 62 8

0.75-1mm 1-1.5mm >1.5mm ?

Distribución del espesor de Breslow

- Los Rayos UV son la causa más importante del MC (Melanoma

Cutaneo)

- Hipótesis:

La variabilidad Clinical en Melanomas quizá sea debida a la

diferente susceptibilidad genética de los melanomas a la luz

ultravioleta

-Método: Comparar las alteraciones genéticas en numero de

copias de DNA (CGH arrays) y el status de BRAF y NRAS (PCR)

-126 MM (Melanoma) (incluidos en parafina de 7 centros)

- 30 MC inducidos por daño solar crónico (cara)

- 40 MC no inducidos por daño solar crónico (tronco, brazos y piernas)

- 36 MC acrales (palmas, plantas, subungueales)

- 20 M mucosos

BACKGROUND

CGH to BAC (Bacterial Artificial

Chromosomes)

Pinkel

Hibridizati

on

J. Cruz uses a oligonucleotide platform (Agilent) with 44.000 sequences (vs 4000 in BACs arrays)

Melanomas

cutáneos no

inducidos por

daño solar

Melanomas

cutáneos

inducidos por

daño solar

MELANOMAS

DE MUCOSAS

MELANOMA

ACRAL

Homozygous deletions

Amplifications

Gains

Losses

Homozygous deletions

Amplifications

Gains

Losses

Homozygous deletions

Amplifications

Gains

Losses

Homozygous deletions

Amplifications

Gains

Losses

BASADOS EN LAS ALTERACIONES GENÉTICAS, SE PUEDEN

CASIFICAR CORRECTAMENTE LOS MELANOMAS EN 4

GRUPOS CON UN 70% DE PRECISIÓN

Si hacemos sólo dos grupos: MM que surgen en piel CON daño

solar y SIN se pueden clasificar con un 84 % de precisión

Genes alterados en lesiones melanocíticas

Congenital

Blue nevus Spitz nevus Spitz nevus

Common nevus Atypical Common

Halo nevus

BRAFV600E NRASQ61

HRASG12V

??

Biología Molecular en el Melanoma : Múltiple Entidades Tumorales

BRAF

BRAF

CyclinD1

KIT

cKIT

cKIT

GNAQ

BIOLOGÍA DEL MELANOMA

PROGRESIÓN EN TRES FASES CLINICO-HISTOLÓGICAS

RELACIONADA CON ALTERACIONES EN REGULACIÓN DEL

CICLO CELULAR Y APOPTOSIS

RADIAL VERTICAL METÁSTASIS

TISSUE-ARRAY (MATRICES TISULARES)

•Preservación del bloque original

• Herramienta que permite el estudio simultáneo de

numerosas muestras usando las mismas condiciones y

criterios

“Cada fase en la progresión del melanoma se caracteriza

por un pérfil de expresión proteico específico”

Cell cycle

Cyc A

Cyc D1

CDK1

CDK2

P21

RB

pRB

HDM-2

Apoptosis

Survivin

Transcription factors

STAT-1

Membrane receptors

C-KIT

Caveolin

Others

Topoisomerase II

BMI-1

Apoptosis

Survivin

Transcription factors

MUM-1

PKCB

Cell cycle

Cyc D1

CDK2

p27

MIB-1

Membrane receptors

C-KIT

DNA repair

MLH-1

Cell cycle

Cyc D1

Cyc D3

CDK6

p16

p21

DNA repair

MLH-1

MSH-2

Others

Topoisomerase II

RING 1B

Apoptosis

BCL-2

Transcription factors

STAT-1

PKCB

MUM-1

RESULTADOS

VERTICAL METASTASIS RADIAL

Adhesion Caderina E

B Catenina

p120

Adhesion Caderina E

B Catenina

p120

0 % p 0.303 22% p 0.073 8% p 0.009 32%

CYC- D3

CYC- D1

0 % p 0.007 48% p 0.002 14% p 0.021 32%

Activadores de Ciclo Celular

NEVUS FASE RADIAL FASE VERTICAL METÁSTASIS

p16 INK4

100 % p 0.553 88% p 1.000 89% p 0.009 71%

Inhibidores del Ciclo Celular

NEVUS FASE RADIAL FASE VERTICAL METÁSTASIS

p27 KIP

70% p 0.694 76% p 0.010 45% p 0.380 37%

Inhibidores del Ciclo Celular

NEVUS FASE RADIAL FASE VERTICAL METÁSTASIS

SURVIVINA

0% p 0.038 36% p 0.002 71% p 0.356 62%

Apoptosis

NEVUS FASE RADIAL FASE VERTICAL METÁSTASIS

100% p 0.157 77% p 0.336 87% p 0.000 45%

BCL-2

Moléculas de adhesión

Cada fase del crecimiento del Melanoma se define

por un marcador específico

Sin diferencias Cadherina E

B Catenina

N Caderina

Cadherina E

B Catenina

N Caderina

B Catenina Nuclear

Cyclin A

Degradation

Cyclin B

Degradation

G2 DNA REPAIR

S DNA

REPLICATION

G1

G0

M CELL DIVISION

p53

Hdm2 p14

_

_

P

Rb

G2

+

Rb P

CycA

CycD

CDK4/6

CycE

CDK2

CDK2

CycA/B

CDK1

AUMENTO DE

ACTIVADORES

DE CICLO

CELULAR

p21

p16

p27

_

_

_

_

PÉRDIDA DE

INHIBIDORES

DE CICLO

CELULAR S DNA

REPLICATION

G1

Cyt C

SURVIVIN

Surv

p53

NF-kB

NF-kB

C-IAP

CELL SURVIVAL

DEATH LIGAND

DEATH RECEPTOR

TNF

TNFR

Bcl-6

FLIP

BCL-2

Bcl-XL

Bcl-2

APOPTOSIS

CASP

3,6,7

CASP9

FADD

Bcl-XL

BAD

CASP 8

BAX

BID

SMAC

APAF-1

APOPTOSOMA

Aplicaciones prácticas de la patología molecular al

diagnóstico, pronóstico y tratamiento del melanoma

TRATAMIENTO

TRATAMIENTO

• Cirugía: excisión quirúrgica con márgenes

de seguridad.

• Disección ganglionar electiva

• Extirpación quirúrgica si metástasis

aisladas

• Radioterapia regional

• Inmunomoduladores farmacológicos

• Quimioterapia…

IFN a2b : en melanomas de riesgo intermedio (Breslow 1.5-4mm) o riesgo alto de recidiva sistémica (Breslow >4 mm y/o afectación linfática).

Eficacia limitada. 10-20% mejoría supervivencia libre de enfermedad, pero no disminuye mortalidad.

Quimioterapia: en estadios avanzados. Dacarbacina/Temozolomida.

Útil en menos del 20% de los pacientes. Respuestas transitorias.

IL-2: aprobado para el estadío IV.

Útil en un pequeño porcentaje de pacientes. Larga estancia hospitalaria. Toxicidad importante

… Ningún tratamiento sistémico ha

demostrado prolongar significativamente

la supervivencia en melanomas

metastásicos…

...“En 30 años, no ha habido, hasta

ahora, ningún avance relevante que

suponga una nueva opción de

tratamiento”…

… ¿Una nueva era? …

- Anti B-RAF PLX4032

- Anti CTLA-4 Ipilimumab

Vemurafenib

Dabrafenib

Vemurafenib inhibe kinasa BRAF

mutated V600

Cellular

Proliferation

RTK

RAF

VEMURAFENIB (PLX4032, RG7204, RO5185426)

ATP

ATP

ERK

MEK

BRAFV600mut

RAS

50%* of melanomas

Cellular

Survival *Total V600 mutation rate for BRIM-3 (cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test); 9.9% of the cobas-positive cases subjected

to retrospective Sanger sequencing had V600K mutations

Growth factor

RAS

MEK

ERK

Normal cell growth

BRAF

Cell membrane

Nucleus

BRAF is a protein involved in sending signals in cells for cell growth

Cell growth and survival The role of BRAF

Receptor tyrosine kinase

RAS-RAF

pathway

Normal cell

proliferation and

survival

Nucleus

MEK

ERK

Abnormal

cell growth

BRAF

mutation

A single codon mutation (V600) in the gene for the BRAF protein leaves it “switched on”

Growth factor

RAS

Cell membrane

Mutated BRAF is present in many cancers:

>50% melanomas

~10% colorectal

~8% all solid tumors

Mutated BRAF The role of “V600”

Receptor tyrosine kinase

Excessive cell

proliferation and survival

MELANOMA: INIBIDORES DE LA MUTACIÓN BRAFV600E

Cellular

Proliferation

RTK

RAF

VEMURAFENIB

ATP

ERK

MEK

BRAFV600mut

RAS

Cellular

Survival

cobas® Real-time PCR

June, 2011

50% Melanomas

• Resistencia y recidivas en la gran mayoría de los pacientes tratados

• ¿Heterogeneidad de la expresión de BRAF intra / inter-tumoral?

BRAFWT BRAFV600E

Dr. Santos Briz et al.

MELANOMA: INIBIDORES DE LA MUTACIÓN BRAFV600E

DISCUSIÓN

•Revision Literatura:

REFERENCE YEAR METHODS CONCLUSION

1 Lin et al. January 2011 single/cell mutation analysis, shifted

termination assay, subcloning Intra tumoral heterogeneity

2 Capper et al. May 2011 IHC VE1 and PCR/sequencing Intra tumoral homogeneity

3 Capper et al. October 2011 IHC VE1 and PCR/sequencing Intra and Inter tumoral homogeneity

4 Yancovitz et al. January 2012 MS-PCR, Conventional sequencing,

Laser capture microdissection/ SNaPshot technology

Intra and Inter tumoral heterogeneity

5 Colombino et al. June 2012 Automated DNA sequencing Inter tumoral heterogeneity

6 Willmot et al. September 2012 Sanger sequencing Intra tumoral homogeneity after

treatment with Vemurafenib

7 Long et al. January 2013 IHC VE1, PCR-HRM Sequencing Intra tumoral homogeneity

8 Willmot et al. February 2013 IHC VE1 Intra tumoral heterogeneity

9 Busam et al. March 2013 IHC VE1, Sequenom Mass ARRAY

system Intra tumoral heterogeneity

10 Kristensen et al. May 2013 Quatitative real time PCR,

Pyrosequencing Intra tumoral homogeneity (rare

subclones)

11 Boursault et al. August 2013 IHC VE1, Roche PCR Inter and Intra tumoral homogeneity

(4.5% discordant)

PARES CONCORDANTES % DISCORDANTES % TOTAL

Hospital 12 Octubre 26 83,9 5 16,1 31

Hospital Macarena 26 83,9 5 16,1 31

Hospital Salamanca 38 82,6 8 17,4 46

TOTAL 90 83,3 18 16,7 108

PARES METAS MULTIPLES CONCORDANTES % DISCORDANTES % TOTAL

Hospital 12 Octubre 9 81,8 2 18,2 11

RT-qPCR Cobas

RESULTADOS

BRAFMUT

BRAFWT

Primarios: •BRAFWT: 8 casos Metástasis: •BRAFMUT: 4 ganglios 5 piel/subcutáneo

METASTASIS PRIMARIO

Primarios: •BRAFMUT: 10 casos Metástasis: •BRAFWT: 10 ganglios

CASOS DISCORDANTES:

RESULTADOS

RT- PCR Cobas (18/108)

BRAFMUT

BRAFWT

METASTASIS PRIMARIO

RESULTADOS

RT- PCR Cobas (18/108)

IHQ anti-BRAF

El análisis estadístico de los datos demuestra que la sensibilidad de la

inmunohistoquímica es del 100% y la especificidad del 97%.

BRAFMUT

BRAFWT

METASTASIS PRIMARIO

RESULTADOS

RT- PCR Cobas (18/108)

IHQ anti-BRAF

METASTASIS PRIMARIO

RT- PCR Cobas (18/108) IHQ anti-BRAF (1/18)

METASTASIS PRIMARIO

BRAFMUT

BRAFWT

RESULTADOS

Paciente con dos melanomas primarios diagnosticados a la vez

RESULTADOS

• IHQ anti-BRAFV600E: expresión homogénea

RESULTADOS

MELANOMA PRIMÁRIO METÁSTASIS

IHQ anti-BRAFV600E

IHQ anti-BRAFV600E

IHQ anti-BRAFV600E

IHQ anti-BRAFV600E

IHQ anti-BRAFV600E

IHQ anti-BRAFV600E

PO

SIT

IVO

INTE

NSO

P

OSI

TIV

O D

ÉBIL

N

EGA

TIV

O

BRAFMUT

BRAFWT

METASTASIS PRIMARIO

RESULTADOS

RT- PCR Cobas (18/108)

SEC SANGER

METASTASIS PRIMARIO

RT- PCR Cobas

METASTASIS PRIMARIO

IHQ anti-BRAF

RESULTADOS

V600K V600K V600K V600K

RESULTADOS SEC:

V600K V600K V600K V600K V600K V600K

V600K V600K V600K V600K

RESULTADOS

PARES CONCORDANTES % DISCORDANTES % TOTAL

Hospital 12 Octubre 26 83,9 5 16,1 31

Hospital Macarena 26 83,9 5 16,1 31

Hospital Salamanca 38 82,6 8 17,4 46

TOTAL 90 83,3 18 16,7 108

RT-qPCR Cobas

PARES CONCORDANTES % DISCORDANTES % TOTAL

Hospital 12 Octubre 31 100 0 0 31

Hospital Macarena 31 100 0 0 31

Hospital Salamanca 45 97,8 0 0 46

TOTAL 107 99,1 1 0 108

RT-qPCR Cobas → IHQ

CONCLUSIONES

• No hay heterogeneidad Intra- o Inter-

tumoral de la mutación BRAFV600E

• La inmunohistoquimica es un método

sensible y especifico para la identificación

de BRAFV600E, sin embargo, los casos

negativos deberían ser analizados por Cobas

o secuenciados (V600K)

• Los métodos de Cobas y SANGER pueden

generar falsos negativos, principalmente en

muestras con baja celularidad tumoral

IHQ

Mutado Nativo

RT-PCR

Mutado Nativo

SEC

Tratamiento

Tratamiento

50%

Baseline, 3/15/2011 Cycle 4 Day 1, 6/8/2011

PLX4032 = RG7204 = vemurafenib

Tumor Response to Vemurafenib

McDermott U et al. N Engl J Med 2011;364:340-350.

Metabolic response to treatment with

Vemurafenib

Vemurafenib treatment:

1.- Flaherty KT, et al. N Engl J Med 2010;363:809–19.

Computer tomography revealed regression of lung, liver and bone metastases following 8 weeks Vemurafenib treatment (with each pair of

images shown for a different patient)

23

June 1, 2014 page 49 ©2012 Roche

Vemurafenib: Inhibiton of BRAF V600 and the MAPK

pathway in biopsies of Melanoma1,2

Baseline[2] Day 15

Ras

GTP

pERK

Cyclin D

Ki67

Cyclin D

BRAFV600

MEK

ERK

P

P

Cell cycle

(Ki67)

Vemurafenib

Zelboraf

RTK

Y-P Y-P

GF

1. Ribas A. HemOnc Today: Melanoma. 2012.

2. Flaherty KT, et al. N Engl J Med. 2010;363:809-819.

Two Paradigms for Advancing the Therapy of

Metastatic Melanoma

Target host

Target

tumor

Immunotherapy Targeted

Therapy

Courtesy Dr. Ribas

T cell

TCR CTLA-4

APC

MHC B7

T-cell

inhibition

T cell

TCR

CTLA-4

APC

MHC B7

T-cell

activation

T cell

TCR

CTLA-4

APC

MHC B7

T-cell

potentiation

IPILIMUMAB

blocks

CTLA-4

CD28 CD28

Anti-CTLA-4 (Ipilimumab) Mechanism of Action

Fong L, Small EJ. J Clin Oncol 2008;26:5275–5283 CTLA-4 = cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4

Screening

Week 12 Initial increase in

total tumour burden (mWHO PD)

Week 16 Responding

Week 96 Durable & ongoing response

without signs of irAEs

Courtesy of K. Harmankaya, Vienna

Harmankaya K, et al. Presented at EADO 2009, Vienna, Austria

Evolution of Response: Patient Example

HR (95% CI) 0.72 (0.59–0.87) Median OS 11.2 vs 9.1 months P value 0.0009 Ipilimumab + DTIC

Placebo + DTIC

Estimated survival rate, % (95% CI)

1 year 2 year 3 year*

Ipilimumab + DTIC n=250

47.3 (41.0-53.6)

28.5 (22.9-34.2)

20.8 (15.7-26.1)

Placebo + DTIC n=252

36.3 (30.4-42.4)

17.9 (13.3-22.8)

12.2 (8.2-16.5)

*post-hoc analysis

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

0 1 2 3 4 Years

Pro

po

rtio

n a

live

Number at risk: Ipilimumab + DTIC 250 230 199 181 157 131 114 104 91 85 79 74 68 61 59 56 56 52 41 Placebo + DTIC 252 229 190 160 136 116 89 78 72 64 56 47 44 42 42 37 34 31 26

31 17 10 4 2 0 19 11 7 5 3 0

Robert C, et al. N Engl J Med 2011;364:2517–2526

K-M analysis of survival: Confirmation of Ipilimumab-driven Survival Benefit

APC T cell

Activation (cytokines, lysis, prolif., migration)

B7.1 CD28

TCR Signal 1 MHC-Ag

Tumor

Role of PD-1 in Suppressing Antitumor

Immunity

Tumor

PD-L1

PD-1

Keir ME et al, Annu Rev Immunol 2008; Pardoll DM, Nat Rev Cancer 2012

(-) (-)

(-)

Inhibition (anergy, exhaustion, death)

APC T cell

Activation (cytokines, lysis, prolif., migration)

B7.1 CD28

TCR Signal 1 MHC-Ag

Tumor

Role of PD-1 in Suppressing Antitumor

Immunity

Tumor

PD-L1

PD-1

Keir ME et al, Annu Rev Immunol 2008; Pardoll DM, Nat Rev Cancer 2012

(-) (-)

(-)

Inhibition (anergy, exhaustion, death)

Anti-

PD-1

Imatinib

(STI-571, Gleevec ®)

Inhibición cKit

4 semanas

Hodi et al. JCO, 2008

Casos aislados, responden

cKit mutado

Inhibición cKit: Imatinib

N Yamaguchi et al. Clin Exp Dermatol 2010

Mutación K642E cKit

Inhibición cKit: Imatinib

Solo aquellos pacientes

con mutaciones en

exones 11 o 13 de

cKit responden

D Guo et al. JCO 2011

CONCLUSIONES

•La determinación de la mutación de BRAF se puede efectuar bien por RTq

PCR o por IHQ

•Existe una plataforma en España para realizar las determinaciones:

Biomarker point

•Los tratamientos anti CTL4 que activan la inmunidad en el melanoma

están bien consolidados

•Existen varios ensayos con resultados esperanzadores anti PD1 y PDL1

•En algunos melanomas se puede utilizar la opción del tratamiento anti

CKit