Załącznik nr 2 do wniosku o wszczęcie postępowania habilitacyjnego dra Michała Pikuły z dnia

27.11.2015r.

Autoreferat

Dr n. med. Michał Pikuła

Zakład Immunologii Klinicznej i Transplantologii

Katedra Immunologii

Wydział Lekarski

Gdański Uniwersytet Medyczny

Gdańsk, 2015

2

1. Imię i nazwisko: Michał Pikuła

2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne – z podaniem nazwy, miejsca i

roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej.

2010-2011 Studia Podyplomowe „Zarządzanie firmą w opiece zdrowotnej”, Wydział

Zarządzania i Ekonomii, Politechnika Gdańska (Gdańsk, 08.06.2011r.)

13.12.2007 Akademia Medyczna w Gdańsku, Uchwała Rady Wydziału Lekarskiego z

dnia 13.12.207, uzyskanie stopnia doktora nauk medycznych w zakresie

biologii medycznej, specjalność: biologia komórki. Tytuł pracy:

Charakterystyka ludzkich komórek macierzystych naskórka i próba

wykorzystania ich do odtworzenia naskórka z uwzględnieniem różnego

wieku dawców. Promotor pracy doktorskiej: prof. dr hab. med. Andrzej

Myśliwski

2000-2005 Akademia Medyczna w Gdańsku, Wydział Farmaceutyczny, kierunek:

farmacja, specjalność: farmacja apteczna (mgr farmacji, Gdańsk

31.12.2005r. z uwzględnieniem stażu, ocena końcowa: bardzo dobra)

1998-2003 Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii, Geografii i Oceanologii,

kierunek: biologia, specjalność: biologia molekularna (mgr biologii

molekularnej, Gdańsk, 25.06.2003r., ocena końcowa: bardzo dobra)

3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/

artystycznych.

2009-do teraz Adiunkt, Zakład Immunologii Klinicznej i Transplantologii, Katedra

Immunologii, Wydział Lekarski, Gdański Uniwersytet Medyczny

(Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. med. Piotr Trzonkowski)

2006-2009 Asystent, Zakład Histologii, Katedra Histologii i Immunologii, Wydział

Lekarski, Akademia Medyczna w Gdańsku (Kierownik Zakładu: Prof. dr

hab. med. Andrzej Myśliwski, od roku 2008 Prof. dr hab. med. Zbigniew

Kmieć)

2003-2006 Doktorant, Dzienne Studia Doktoranckie Akademii Medycznej w

Gdańsku, Wydział Lekarski, Zakład Histologii, Katedra Histologii i

Immunologii (Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. med. Andrzej Myśliwski)

3

4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca

2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w

zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.):

a) tytuł osiągnięcia naukowego/artystycznego:

Badania związków przeciwbakteryjnych i wspomagających prawidłowe gojenie ran z

wykorzystaniem modeli komórkowych in vitro.

Łączna wartość prac objętych cyklem: IF=10,748 MNiSW=154

b) wykaz publikacji (autorzy, tytuł publikacji, nazwa wydawnictwa, rok wydania)

Prace poglądowe

1. Pikuła M.#, Langa P., Kosikowska P., Trzonkowski P. Komórki macierzyste i czynniki

wzrostu w gojeniu ran. Post Hig Med Dośw. 2015; 69: 874-885. #Autor korespondencyjny

IF= 0,573; MNiSW=15

2. Pikuła M.#, Imko-Walczuk B., Nowacka-Pikuła D., Okuniewska A., Langa P.,

Jaśkiewicz J., Trzonkowski P. Możliwości hodowli keratynocytów oraz komórek

macierzystych naskórka i ich zastosowania w leczeniu trudno gojących się ran. Przegl

Dermatol. 2012; 99(3): 222-229. #Autor korespondencyjny

IF=0.00; MNiSW=5

Prace oryginalne

3. Kosikowska P.*, Pikuła M.*, Langa P., Trzonkowski P., Obuchowski M., Lesner A.

Synthesis and evaluation of biological activity of antimicrobial – pro-proliferative

peptide conjugates. PlosOne. 2015 Oct 16;10(10):e0140377. doi: 10.1371/

journal.pone.0140377. eCollection 2015.

*równy udział w pracy

IF=3,234; MNiSW=40

4. Barańska-Rybak W., Pikuła M., Dawgul M., Kamysz W., Trzonkowski P.,

Roszkiewicz J. Safety profile of antimicrobial peptides: camel, citropin, protegrin,

temporin a and lipopeptide on HaCaT keratinocytes. Acta Pol Pharm. 2013; 70(5):

795-801.

IF=0,693; MNiSW=15.

4

5. Pikuła M.#, Zieliński M., Specjalski K., Barańska-Rybak W., Dawgul M., Langa P.,

Jassem E., Kamysz W., Trzonkowski P. In vitro evaluation of the allergic potential of

antibacterial peptides: camel and citropin. Chem Biol Drug Des. 2015 Nov 18. doi:

10.1111/cbdd.12688. #Autor korespondencyjny

IF=2,485; MNiSW=25

6. Dębowski D., Lukajtis R., Lęgowska A., Karna N., Pikuła M., Wysocka M.,

Maliszewska I., Sieńczyk M., Lesner A., Rolka K. Inhibitory and antimicrobial

activities of OGTI and HV-BBI peptides, fragments and analogs derived from

amphibian skin. Peptides. 2012; 35(2): 276-284.

IF=2,522; MNiSW=25

7. Pikuła M.#, Żebrowska M.E., Pobłocka-Olech L., Krauze-Baranowska M.,

Sznitowska M., Trzonkowski P. Effect of enoxaparin and onion extract on human skin

fibroblast cell line - Therapeutic implications for the treatment of keloids. Pharm Biol.

2014; 52(2): 262-267. # Autor korespondencyjny

IF=1,241; MNiSW=20

8. Pikuła M.#, Żebrowska M.E., Trzonkowski P., Myśliwski A., Sznitowska M. Effects

of enoxaparin and onion extract on cytokine production in skin fibroblasts. Centr Eur

J Immunol. 2009; 34(2): 68-71. # Autor korespondencyjny

IF=0,00; MNiSW=9

c) Omówienie celu naukowego /artystycznego ww. prac i osiągniętych wyników

wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania.

Wprowadzenie

Skóra stanowi największy organ ludzkiego organizmu, spełniający szereg niezwykle

istotnych funkcji. Stanowi ona warstwę ochronną przed działaniem szkodliwych czynników

zewnętrznych, w tym chemicznych (substancje toksyczne), fizycznych (promieniowanie), czy

biologicznych (patogeny). Skóra bierze udział także w termoregulacji, odbieraniu bodźców,

utrzymaniu równowagi hormonalnej oraz funkcjonowaniu układu immunologicznego.

Krytycznym czynnikiem dla prawidłowego działania skóry, jak i całego organizmu, jest

zapewnienie jej ciągłości. Rany oraz ubytki skóry mogą prowadzić do zakażeń miejscowych i

systemowych, jak również do uogólnionych zaburzeń homeostazy organizmu. Ocenia się, że

w Polsce ok. 0,5 mln osób cierpi z powodu ran przewlekłych, co stanowi nie tylko istotny

5

problem medyczny, ale również społeczny, ekonomiczny i psychologiczny. Etiologia ran

przewlekłych związana jest z szeregiem czynników, m. in. niedokrwieniem, cukrzycą,

chorobami autoimmunologicznymi oraz zakażeniami bakteryjnymi i grzybiczymi.

Szczególnym problemem są zakażenia wywołane przez bakterie wielooporne np. niektóre

szczepy Staphylococcus aureus.

Dodatkowym zagadnieniem medycznym związanym z nieprawidłowym gojeniem ran

są blizny przerostowe i keloidy. Zmiany te mają różną etiologię i są związane przede

wszystkim z aktywacją fibroblastów, nadmiernym odkładaniem się włókien kolagenowych i

macierzy zewnątrzkomórkowej w skórze, nieprawidłową angiogenezą i procesem zapalnym.

Szczególnym problemem są keloidy, które są wynikiem nadmiernego, niekontrolowanego

procesu naprawczego, który przekracza granice pierwotnego urazu. Ryzyko powstania

keloidów zwiększają dodatkowo wtórne infekcje bakteryjne. Zarówno blizny przerostowe jak

i keloidy są bardzo trudne w leczeniu, przede wszystkim z uwagi na duże ryzyko nawrotu

choroby (po usunięciu chirurgicznym zmiany), działania niepożądane stosowanych tu leków,

jak również ich niską efektywność. W leczeniu blizn przerostowych i keloidów wykorzystuje

się wiele technik i leków: kortykosteroidy, interferon α2b, bleomycynę, żele silikonowe,

terapię uciskową. Istnieją na rynku także preparaty oparte na heparynie oraz wyciągach z

cebuli. Ich skuteczność jest wciąż dyskutowana, a potencjalny mechanizm działania nie do

końca poznany.

Wciąż poszukuje się zatem leków wspomagających prawidłowe gojenie ran,

szczególnie ran przewlekłych oraz keloidów. W odkrywaniu potencjalnych leków

dermatologicznych bardzo ważnym elementem są modele in vitro. W modelach tych

wykorzystywane są głównie keratynocyty i ich progenitory – komórki macierzyste oraz

fibroblasty skórne. Mimo, iż jak powiedział słynny farmakolog Howard Skipper „model to

kłamstwo, które pomaga ci ujrzeć prawdę” (ang. "A model is a lie that helps you see the

truth") to właśnie modele in vitro pozwalają nam na zbadanie aktywności biologicznej

różnych związków chemicznych a także umożliwiają wczesną ich selekcję i dają podstawy do

przejścia do fazy badań na zwierzętach i badań klinicznych.

Dzięki moim wcześniejszym badaniom wykazałem, iż komórki linii transformowanej

HaCaT stanowią wiarygodny model badawczy komórek pierwotnych (Zbytek B., Pikuła M.

et. al., Br J Dermatol. 2005;152(3):474-80). Jak pokazały również badania innych Autorów,

komórki te reagują na hormony peptydowe podobnie do komórek pacjentów. Dzięki moim

badaniom, udało się rozwinąć metodę izolacji oraz hodowli komórek progenitorowych

naskórka, a także scharakteryzować te komórki pod kątem biologicznym(dynamika

proliferacji, ekspresja markerów, analiza długości telomerów) (Pikuła M., et. al., Cell Biol Int.

2010;34(9):911-5). Wykorzystane powyżej metody, szczególnie izolacja enzymatyczna oraz

cytometria przepływowa stanowiły ważne wsparcie metodyczne w moich dalszych

badaniach. Obie przywołane publikacje (poza cyklem habilitacyjnym), stanowiły ważny

punkt wyjścia i podstawę metodyczną do właściwych badań oceniających potencjał związków

dermatologicznych.

W poszukiwaniu nowych leków dermatologicznych, szczególnie przeciwbakteryjnych

coraz większą uwagę skupia się na peptydach otrzymywanych drogą syntezy chemicznej,

których struktura oparta jest na związkach naturalnych. Duże zainteresowanie tymi

związkami w ostatnich latach wynika m.in. z faktu, iż peptydy mogą działać selektywnie na

6

dane receptory i rodzaje komórek oraz mogą być dowolnie modyfikowane chemicznie. W ten

sposób możliwe jest dostosowywanie ich aktywności, specyficzności oraz parametrów

farmakokinetycznych do odpowiedniej terapii. Następuje aktualnie powrót do poszukiwania

aktywnych substancji/związków izolowanych z roślin. Przykładem czego jest Nagroda Nobla

w dziedzinie medycyny i fizjologii przyznana w roku bieżącym (2015) Dr Tu Youyou za

odkrycie metody leczenia malarii związkami pochodzenia roślinnego.

W niniejszym cyklu prac przedstawiam działanie biologiczne wybranych związków

chemicznych, które mogą być wykorzystane w leczeniu zakażeń skóry, ran przewlekłych oraz

blizn przerostowych i keloidów. W przedstawianym cyklu prac obok badania syntetycznie

otrzymanych peptydów (powstałych na bazie peptydów naturalnych) oceniałem również

aktywność enoksaparyny (pochodnej heparyny) oraz wyciągu z cebuli. Na wszystkie

przedstawiane badania uzyskałem zgody Niezależnej Komisji Bioetycznej ds. Badań

Naukowych przy Gdańskim Uniwersytecie Medycznym. Badania były finansowane z

grantów Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego oraz Narodowego Centrum Nauki,

które są wyszczególnione w punkcie 7 niniejszego autoreferatu.

Tabela przedstawiająca wybrane patomechanizmy prowadzące do powstania ran przewlekłych i

keloidów oraz możliwości ich terapii w oparciu o związki przedstawione w rozprawie habilitacyjnej.

Faza gojenia rany

Wybrane

patomechanizmy

Efekt kliniczny Koncepcja badawcza

potencjalna terapia

Zapalenie

(1-3 dni)

Zakażenia bakteryjne i

grzybicze (szczególnie

szczepy wielooporne)

Infekcja miejscowa

lub ogólnoustrojowa

Zastosowanie

peptydów

przeciwbakteryjnych

bezpiecznych dla

komórek skóry,

opornych na działanie

proteaz, o dodatkowym

działaniu

stymulującym gojenie

rany. Ocena

przedklinczna

właściwości

alergogennych

peptydów w modelu in

vitro

Proliferacja

(2 tygodnie)

Zakażenia bakteryjne i

grzybicze, nadprodukacja

enzymów proteolitycznych

Zaburzenia proliferacji i

migracji keratynocytów

oraz fibroblastów

Infekcja miejscowa

lub ogólnoustrojowa,

zaburzenia

homeostazy

organizmu, utrudnione

gojenie rany

Rana przewlekła

Przebudowa

(do dwóch lat)

Aktywacja fibroblastów

przez czynniki

niespecyficzne i

specyficzne, stan zapalny

Blizna przerostowa/

keloid

Zastosowanie

enoksaparyny i

wyciągu z cebuli

7

Cel naukowy

Celem naukowym przedstawianego osiągnięcia naukowego było zbadanie w modelach

komórkowych in vitro związków o działaniu przeciwbakteryjnym i wspomagającym

prawidłowe gojenie rany.

Podstawy teoretyczne i doświadczenia własne – modele komórkowe i możliwości

wspomagania prawidłowego gojenia ran

W pracy (przeglądowej) nr 1 (Post Hig Med Dośw. 2015;69:874-885) omówiono

dokładnie rolę czynników wzrostu i różnych rodzajów komórek macierzystych w

prawidłowym i patologicznym gojeniu ran. Szczególnie skupiono się na czynnikach z rodzin

PDGF, EGF, FGF, VEGF, TGF-beta oraz na peptydach otrzymywanych drogą syntezy

chemicznej lub otrzymywanych ze źródeł naturalnych. W pracy przedstawiono również

mechanizmy receptorowe/wewnątrzkomórkowe działania czynników wzrostu. Wiedza ta

może być pomocna w projektowaniu nowych leków peptydowych, które będą imitowały

działanie naturalnie występujących czynników wzrostu.

W pracy omówiłem także rolę komórek macierzystych w procesach gojenia ran, w

tym przede wszystkim komórek macierzystych naskórka, tkanki tłuszczowej oraz szpiku.

Wiedza na temat właściwości tych komórek jest niezbędna do projektowania nowych leków

dermatologicznych wpływających na proces gojenia ran. W publikacji zwracam też uwagę na

możliwość połączenia terapii peptydowej/białkowej z terapiami komórkowymi.

Przedstawiamy ponadto nasze własne doświadczenia uzyskane zarówno z modeli

eksperymentalnych in vitro jak również badań klinicznych. W pracy zwracamy uwagę na

pewne ograniczenia terapii białkowych i komórkowych oraz aktualne drogi ulepszania i

modyfikacji tych terapii (modyfikacje genetyczne, chemiczne). W podsumowaniu, praca

oprócz aktualnego przeglądu piśmiennictwa, dostarcza podstaw do poszukiwania nowych

związków, które mogą być wykorzystane w leczeniu ran przewlekłych i keloidów.

W drugiej pracy (przeglądowej) nr 2 (Przegl Dermatol. 2012;99(3):222-229)

przedstawiliśmy zarówno własne, jak również innych Autorów doświadczenia dotyczące

izolacji i hodowli keratynocytów. W pracy zwracamy uwagę na to, iż za prawidłową odnowę

i odbudowę naskórka po zranieniu odpowiadają komórki macierzyste naskórka. Komórki te

zapewniają jednocześnie odpowiednie warunki hodowli komórek in vitro. Tak wyhodowane

komórki mogą być wykorzystane następnie w modelach gojenia ran, jak również w terapii

komórkowej trudno gojących się ran. W pracy przedstawiono dokładnie procedurę izolacji

komórek ze skóry przy pomocy metody enzymatycznej połączonej z mechaniczną. Dzięki

zastosowaniu enzymów możliwa jest izolacja zarówno keratynocytów (dyspaza, trypsyna),

jak również fibroblastów skórnych (dyspaza, kolagenaza). Dodatkowo zaprezentowano

możliwości izolacji specyficznej komórek macierzystych przy pomocy sortera komórkowego

na podstawie ekspresji beta-1 integryny oraz receptora CD71. W pracy przedstawiono

również aktualnie stosowane modele hodowli keratynocytów oraz komórek macierzystych.

Zwróciliśmy uwagę na kwestię powierzchni hodowlanych (plastik, białka macierzy) oraz

8

kluczową rolę składu pożywek hodowlanych. Należy pamiętać, iż rutynowo stosowana w

hodowli płodowa surowica bydlęca posiada wiele ograniczeń i może indukować efekty

niespecyficzne. W związku z tym, dla utrzymania komórek progenitorowych w stanie

niezróżnicowania powinno się dążyć do eliminacji surowicy i hodowli komórek w mediach

opartych na rekombinowanych czynnikach wzrostu. Jest to szczególnie istotne przy

testowaniu nowych leków w modelach in vitro. Surowica może bowiem niwelować pewne

efekty biologiczne, niespecyficznie stymulować komórki a także działać ochronnie, przez co

utrudniać obiektywną ocenę toksyczności potencjalnych leków dermatologicznych. W pracy

przedstawiliśmy także bardziej złożone modele hodowli naskórka, w których keratynocyty

ulegają różnicowaniu tworząc wielowarstwowy naskórek. Mimo znacznego postępu w tych

technikach badawczych, uzyskany naskórek różni się pod pewnymi względami od

naturalnego (różna przepuszczalność, skład białkowy). Dodatkowym problem jest duża

zmienność osobnicza w proliferacji i zachowaniu keratynocytów in vitro.

Podsumowując, praca jest opisem metod hodowli keratynocytów zarówno dla celów

badań przedklinicznych (testowania nowych leków), jak również klinicznych (terapia

komórkowa). W pracy zwracamy także uwagę na istotną kwestię eradykacji bakterii

(szczególnie podczas terapii komórkowej), które mogą utrudniać proces gojenia ran.

Peptydy o działaniu przeciwbakteryjnym i stymulującym gojenie ran

Jak zaznaczono we wprowadzeniu, patogenna flora bakteryjna utrudnia prawidłowe

gojenie ran, co często prowadzi do powstawania przewlekłych, trudno gojących się ran. Jest

to wynikiem m. in. zaburzenia naturalnych mechanizmów naprawczych przez przewlekły stan

zapalny oraz wytwarzanie toksyn i enzymów bakteryjnych. Dlatego kluczowym jest

znalezienie leków, które będą posiadały zarówno działanie przeciwbakteryjne jak i

stymulujące gojenie rany. Dodatkowo, czynnikiem krytycznym leków podawanych na rany

jest ich cytotoksyczność, która często towarzyszy związkom o silnym działaniu

przeciwbakteryjnym i przeciwgrzybiczym. Celem opisywanej pracy nr 3 (PlosOne. 2015;

16;10(10):e0140377) było uzyskanie stosunkowo krótkich (do 20 aminokwasów),

bifunkcyjnych peptydów, które będą posiadały zarówno działanie przeciwbakteryjne, jak

również stymulujące gojenie ran. Peptydy pierwszej grupy oparte były na temporynie

(peptyd występujący u płazów) oraz KSLW (peptyd syntetyczny), natomiast w drugiej grupie

znalazły się pochodne: enkefaliny (DAL, dalargina), karnozyny (CAR) oraz

sześcioaminokwasowy fragment tenascyny X (CTEN2), której zwiększona ekspresja

zachodzi m.in. podczas embriogenezy i procesów naprawczych tkanek. Zastosowana przez

nas strategia opierała się na łączeniu dwóch peptydów o różnych funkcjach przy pomocy

związku PEG. Co ważne PEG jest związkiem zaaprobowanym przez FDA i jest dodawany do

leków białkowych/peptydowych w celu przedłużenia ich okresu półtrwania. W pracy łącznie

ocenialiśmy 15 związków, włączając pojedyncze peptydy oraz ich koniugaty. Ocenie

podlegały właściwości chemiczne, działanie przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze,

proproliferacyjne oraz promigracyjne wobec pierwotnych fibroblastów skórnych (pacjentów)

oraz keratynocytów linii HaCaT. Aktywność przeciwbakteryjną testowano m.in. wobec

bakterii: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas

aeruginosa, Proteus mirabilis, natomiast przeciwgrzybiczą wobec grzybów: Candida

albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida tropicalis. Nasze

9

badania wykazały, iż niektóre peptydy natywne (syntetyczne DK5, LK6, KSLW) są bardzo

wrażliwe na modyfikacje chemiczne, które diametralnie zmieniają właściwości

przeciwbakteryjne (w większości zmniejszają).

W przypadku S. aureus największy potencjał przeciwbakteryjny wykazywały peptydy:

KSLW i DAL-PEG-LK6 (MIC 25 µg/mL) oraz DAL-PEG-DK5 (MIC 50 µg/mL). Oceniając

działanie wobec bakterii gram-ujemnych, wykazaliśmy, że P. mirabilis jest całkowicie oporny

na testowane peptydy. Może to być związane z wytwarzanym przez przez P. mirabilis

enzymem ZapA (mirabilizyna), dla którego substratem mogą być testowane peptydy jak

również ich koniugaty oraz in vivo inne ważne związki biorące udział w odpowiedzi

przeciwbakteryjnej (przeciwciała, układ dopełniacza, endogenne peptydy przeciwbakteryjne,

np. LL-37, hBD1). Natomiast wzrost E. coli oraz P. aeruginosa był zahamowany przez

KSLW (odpowiednio MIC 10 µg/mL oraz 25 µg/mL) oraz DAL-PEG-LK6 (w obu

przypadkach MIC 25 µg/mL). Najsilniejsze właściwości przeciwgrzybicze wykazywały

związki: KSLW, DAL-PEG-DK5 oraz DAL-PEG-LK6. Natomiast związkami o

najsilniejszych właściwościach proproliferacyjnych wobec skórnych fibroblastów były:

KSLW (50 µg/mL) oraz CTEN2 (1,0 oraz 10,0 µg/mL), natomiast wobec keratynocytów

HaCaT: Dal (10 µg/mL) oraz koniugaty peptydu CAR z DKS (1,0 oraz 10 µg/mL).

Związkami, które wykazywały właściwości promigracyjne wobec keratynocytów HaCaT

były: KSLW, DAL-PEG-KSLW oraz CAR (efekt zbliżony do kontroli pozytywnej, tj. 10%

surowicy płodowej). Natomiast wobec fibroblastów efekt promigracyjny obserwowano

głównie dla KSLW oraz DAL-PEG-KSLW. Co ciekawe dla peptydu DK5 obserwowano

znaczący hamujący wpływ na migrację fibroblastów. W opisywanej pracy zastosowaliśmy

transformowane keratynocyty (HaCaT) jako model komórkowy, który zachowuje

fizjologiczne właściwości pierwotnych keratynocytów, np. potencjał do różnicowania.

Dodatkowo, z powodu braku różnic międzyosobniczych, które zawsze istnieją w hodowlach

pierwotnych, komórki HaCaT oferują wiarygodne i powtarzalne wyniki.

Podsumowując, praca wskazuje, iż nasza strategia łączenia peptydów może być

obiecującym i innowacyjnym narzędziem w poszukiwaniu nowych związków ułatwiających

gojenie ran. Należy jednak pamiętać, iż tego typu modyfikacje mogą również prowadzić do

zwiększania toksyczności niektórych peptydów wobec komórek skóry lub utracenia ich

właściwości przeciwbakteryjnych. W naszej ocenie najbardziej obiecującym koniugatem jest

DAL-PEG-KSLW, którego badania powinno się kontynuować pod kątem zarówno

chemicznym, jak i biologicznym (modele zwierzęce).

W pracy nr 4 (Acta Pol Pharm. 2013;70(5):795-801) przedstawiliśmy działanie

przeciwbakteryjne wybranych peptydów otrzymanych drogą syntezy chemicznej oraz ich

wpływ na ludzkie keratynocyty linii HaCaT. W ludzkiej skórze syntezie ulega szereg

peptydów przeciwbakteryjnych, które stanowią ważny element odporności wrodzonej

organizmu. Ekspresja tych peptydów często ulega zmianie w różnych chorobach skóry, np. w

atopowym zapaleniu skóry. Może to być jednym z czynników zwiększonej podatności tych

pacjentów na skórne zakażenia bakteryjne, np. Staphylococcus aureus. Naturalnie

występujące w skórze człowieka peptydy przeciwbakteryjne, jak i występujące u innych

gatunków zwierząt, mogą być punktem wyjścia do projektowania i syntezy nowych

10

pochodnych o silnym działaniu przeciwbakteryjnym przy jednoczesnych niewielkich

skutkach ubocznych.

W pierwszej części pracy ocenialiśmy obecność bakterii Staphylococcus aureus w

skórze pacjentów z erytrodermią (materiał pochodził od 50 pacjentów z różnymi

schorzeniami pierwotnymi). Wykazaliśmy, iż w 37 pobranych próbkach znajdował się S.

aureus. Natomiast 13 próbek negatywnych pochodziło od pacjentów cierpiących na łuszczycę

(8 pacjentów) oraz pacjentów u których zmiany skórne związane były z przyjmowanymi

lekami (5 pacjentów). W dalszej części pracy oceniano aktywność przeciwbakteryjną

otrzymanych syntetycznie peptydów: camel, citropiny 1.1, lipopeptydu, protegryny,

temporyny (pochodne przebadane w pracy 3). Jednocześnie aktywność tą porównywano z

działaniem antybiotyków konwencjonalnych: chloramfenikolu, erytromycyny, kwasu

fusydowego i mupirocyny. Spośród peptydów najniższe wartości MIC50 oraz MIC90

(najsilniejsze działanie) wobec S. aureus posiadały: camel, lipopeptyd oraz protegryna (dla

wszystkich trzech wymienionych MIC50 oraz MIC90 wynosiły odpowiednio 4 oraz 8

µg/mL). Spośród badanych antybiotyków konwencjonalnych najniższe wartości MIC50 oraz

MIC90 wykazywał kwas fusydowy (0,25 µg/mL) oraz mupirocyna (0,25 oraz 2,0 µg/mL). W

pracy badano również wpływ zarówno peptydów jak również antybiotyków na toksyczność

wobec ludzkich keratynocytów linii HaCaT. Badania wykazały, że największą toksycznością

spośród peptydów cechował się lipopeptyd, który już w stężeniu 1 µg/mL okazał się

cytotoksyczny wobec keratynocytów. Może to być tłumaczone jego właściwościami

chemicznymi, w tym dużą hydrofobowością i co za tym idzie możliwością penetracji błony

komórkowej. W przypadku pozostałych peptydów toksyczność była widoczna przy wyższych

stężeniach: 25, 50 i 100 µg/mL (camel oraz protegryna) oraz 50, 100 µg/mL (citropina 1.1 i

temporyna). Co ważne w zastosowanym układzie doświadczalnym medium pozbawione było

surowicy co powodowało wyeliminowanie efektów niespecyficznych (czynniki wzrostu,

inhibitory, hormony etc.). Mając na uwadze efekty przeciwbakteryjne, cytotoksyczność

związków a także inne właściwości biologicznie, np. przeciwnowotworowe działanie peptydu

camel udowodnione przez innych Autorów, związkami które posiadają najwyższy potencjał

aplikacyjny mogą być camel i citropina 1.1. Oba peptydy stanowiły przedmiot moich

dalszych intensywnych badań, co zostało przedstawione i opublikowane w pracy poniżej (nr

5).

Peptydy, jak wspomniano we wstępie, stanowią bardzo obiecującą grupę

potencjalnych leków. Posiadają one jednak stosunkowe wysokie ryzyko wywołania reakcji

alergicznej, którą trudno przewidzieć na podstawie sekwencji aminokwasowej danego

peptydu lub jego właściwości chemicznych. W pracy nr 5 (Chem Biol Drug Des. 2015, doi:

10.1111/cbdd.12688) zaproponowaliśmy metodę oceny ryzyka wywołania reakcji alergicznej

przez potencjalne leki peptydowe; w tym wypadku były to peptydy przeciwbakteryjne

przebadane wcześniej: camel i citropina 1.1. Materiał do badań stanowiła krew obwodowa

pochodząca łącznie od 53 pacjentów spośród których 38 cierpiało na różnego rodzaju alergie

a 15 stanowiło kontrolę (pacjenci zdrowi, odpowiednio dobrani pod kątem płci i wieku). W

pracy oceniano cytometrycznie ekspresję trzech markerów CCR3 (marker bazofili), CD63

oraz CD203c (markery aktywacji bazofili). W doświadczeniach jako kontrolę pozytywną

zastosowano tripeptyd fMLP (aktywujący bazofile w sposób specyficzny, jak i

11

niespecyficzny) oraz przeciwciała FcεRI (aktywacja w mechanizmie immunologicznym).

Wyniki pracy wskazują, iż peptydy przeciwbakteryjne mogą indukować aktywację bazofili

oraz posiadają pewne podobieństwo do powszechnie występujących w środowisku alergenów

(analiza dokonana na podstawie dostępnej bazy danych alergenów). Dodatkowo, stopień

aktywacji bazofili stymulowanych peptydami silnie korelował z ich aktywacją pod wpływem

kwasu acetylosalicylowego. Aktywacja ta była szczególnie widoczna u osób cierpiących na

alergie i występowała częściej w przypadku inkubacji z peptydem camel. Wnioskujemy

zatem, iż po podaniu peptydów istnieje potencjalnie ryzyko bezpośredniej aktywacji bazofili,

jak również wystąpienia reakcji krzyżowej z przeciwciałami IgE skierowanymi przeciwko

alergenom środowiskowym. Ryzyko to dotyczy przede wszystkich osób uczulonych, które

powinno się brać pod uwagę na przedklinicznym etapie badań bezpieczeństwa nowych leków.

Według mojej wiedzy jako pierwsi zaproponowaliśmy wykorzystanie testu aktywacji bazofili

(BAT) w połączeniu z bazą danych alergenów środowiskowych w celu oceny ryzyka indukcji

reakcji alergicznej potencjalnych leków peptydowych. W pracy zaprezentowaliśmy również

pełną sekwencję procesu badania nowych peptydów przeciwbakteryjnych – od fazy

koncepcyjnej do fazy rejestracji.

W pracy nr 6 (Peptides 2012; 35(2): 276-284), stanowiącej wynik interdyscyplinarnej

współpracy, przedstawiliśmy właściwości chemiczne i biologiczne peptydów, będących

pochodnymi skórnych peptydów antybakteryjnych (Antimicrobial peptides, AMPs)

występujących u płazów (OGTI and HV-BBI). Peptydy przeciwbakteryjne stanowią bardzo

obiecującą grupę potencjalnych leków, przede wszystkim z uwagi na ich wysoką aktywność

antydrobnoustrojową (przeciw bakteriom, grzybom, wirusom) oraz rzadko występującą

oporność bakterii na te związki. Peptydy te są szeroko rozpowszechnione zarówno u zwierząt

jak i roślin i stanowią rodzaj wrodzonej odporności na mikroorganizmy. Jednak, podobnie jak

inne peptydy/białka, peptydy AMPs są bardzo wrażliwe na degradację proteolityczną przez

enzymy endogenne gospodarza, jak również przez proteazy bakteryjne. Dlatego peptydy o

podwójnej aktywności- przeciwbakteryjnej i jednocześnie antyproteolitycznej stanowią

obiecującą klasę nowych leków przeciwbakteryjnych. W pracy aktywność przeciwbakteryjną

oceniano wobec: bakterii E. coli, oraz S. aureus, jak również szczepów klinicznie

izolowanych: Enterococcus sp., Staphylococcus sp, S. epidermidis i Streptococcus sp. W

badaniu oceniano także efekt hamujący peptydów wobec trypsyny, chymotrypsyny,

katepsyny G oraz elastazy. Na podstawie badań cytotoksyczności wobec ludzkich

fibroblastów oraz aktywności przeciwbakteryjnej, najbardziej obiecującym związkiem

przeciwko skórnym zakażeniom S. aureus okazał się 17 aminokwasowy peptyd OGTI

(1949,4 Da).

Peptyd ten wykazywał niewielką toksyczność (spadek liczby komórek o średnio 8%)

tylko w najwyższym badanym stężeniu (100 µg/mL). Peptyd ten ulegał jednak częściowej

hydrolizie pod wpływem trypsyny. Spośród innych peptydów analogi HV-BBI (IX, X, XI)

posiadały wysoką aktywność przeciwbakteryjną, jednak dwa z nich (X, XI) były toksyczne

wobec fibroblastów skórnych we wszystkich przebadanych stężeniach (25, 50, 100 µg/mL).

W pracy podkreślamy konieczność wykonywania testów cytotoksyczności wobec ludzkich

komórek skóry, które powinny stanowić jeden z wcześniejszych etapów badania nowych

peptydów przeciwbakteryjnych. Dzięki testom biologicznym możliwa jest modyfikacja

12

metody chemicznej w celu zmniejszenia efektów ubocznych zaprojektowanych peptydów lub

zwiększenia ich biologicznych właściwości. Praca wskazuje również na potrzebę tworzenia

projektów o charakterze interdyscyplinarnym, dzięki którym możliwe jest połączenie

wyników wielu badań i kompleksowej analizy potencjalnych leków.

Związki hamujące powstawanie blizn przerostowych i keloidów

Jak zaznaczono we wstępie, keloidy stanowią poważny problem medyczny i

wyzwanie dla współczesnej dermatologii i chirurgii. Powstają one m.in. jako wynik

nadmiernej proliferacji skórnych fibroblastów, w których ponadto obserwuje się zaburzenia

apoptozy. Dodatkowo komórki te cechuje podwyższona ekspresja integryn, która powoduje,

iż komórki te mają zdolność do zwiększonej migracji, będącej jednym z czynników

powodujących progresję keloidu. W pracy nr 7 (Pharm Biol. 2014; 52(2): 262-267)

postanowiliśmy zbadać efekt wyciągu z cebuli (uzyskanego zmodyfikowaną metodą) oraz

enoksaparyny na proliferację, apoptozę i ekspresję integryn beta-1 w hodowanych in vitro

skórnych fibroblastach (linia BR.1N). Cebula [Allium cepa L. (Alliaceae)] zawiera wiele

organicznych związków siarkowych, flawonoidów, saponin, witamin (B1, B2, B6, C, E) oraz

innych związków chemicznych, z których część niestety może ulegać degradacji podczas

ekstrakcji. Cebula posiada wiele udowodnionych efektów biologicznych, w tym

przeciwbakteryjnych, przeciwwirusowych, antyoksydacyjnych, a także wg niektórych

autorów, antynowotworowych. Heparyna stanowi natomiast polisacharyd należący do rodziny

glikozaminoglikanów (GAG) i jest stosowana od wielu lat jako antykoagulant. Od kilku lat

rutynowo stosowane są również heparyny drobnocząsteczkowe (Low molecular weight

derivatives of heparyn, LMWH), takie jak enoksaparyna, dalteparyna, nadroparyna

posiadające podobne właściwości biologiczne co heparyna. W opisywanej pracy

wykazaliśmy, że zarówno enoksaparyna jak również wyciąg z cebuli we wszystkich badanych

stężeniach silnie hamują proliferację ludzkich fibroblastów in vitro (linia BR.1N).

Zahamowanie to było najsilniejsze dla najwyższego stężenia enoksaparyny (500 µg/mL) oraz

wyciągu z cebuli (250 µg/mL) - redukcja proliferacji odpowiednio o 91,5 i 50,8%. Co ważne,

badania te przeprowadziliśmy wykorzystując bardzo czułą radioizotopową metodę

inkorporacji tymidyny znakowanej trytem. W pracy badaliśmy również, przy użyciu

cytometrii przepływowej, wpływ enoksaparyny i wyciągu z cebuli na apoptozę fibroblastów.

Co ciekawe, obserwowaliśmy niewielki wpływ badanych substancji na indukcję zarówno

wczesnej jak i późnej apoptozy (wzrost tylko dla najwyższych stężeń enoksaparyny i wyciągu

z cebuli). Dodatkowo w pracy wykazaliśmy, że enoksaparyna (20 µg/mL) i wyciąg z cebuli

(1000 µg/mL) hamują w nieznacznym stopniu ekspresję integryny beta-1. Efekt ten był

jednak szczególnie widoczny gdy komórki stymulowano łącznie enoksaparyną i wyciągiem z

cebuli. Warto dodać, że badania innych autorów wskazują, iż przyjmowanie

drobnocząsteczkowych heparyn przedłuża długość życia pacjentów onkologicznych, co jest

aktualnie przedmiotem intensywnych badań (J Clin Oncol. 2005;23:2123-9). Niewykluczone,

iż efekt ten może być związany z wykazanym przez nas mechanizmem antyproliferacyjnym.

Podsumowując, praca dowodzi, iż enoksaparyna oraz wyciąg z cebuli mogą być

wykorzystane w terapii keloidów. Dodatkowo, nasze wyniki mogą być przesłanką do

kolejnych badań nad zastosowaniem analizowanych związków w terapii innych schorzeń, w

których dochodzi do aktywacji fibroblastów np. w twardzinie.

13

W pracy nr 8 oceniano wpływ wyciągu z cebuli oraz enoksaparyny na produkcję

przez fibroblasty skórne (linia 46 BR.1N) cytokin: TNF-α (czynnik martwicy nowotworów

alfa), IL-6 oraz VEGF (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego). Pomiaru dokonywano

metodą cytometrii przepływowej (FlexSet) z materiału pochodzącego z nadsączy

komórkowych. Badania wykazały, że pod wpływem enoksaparyny oraz wyciągu z cebuli

dochodzi do spadku produkcji IL-6 i VEGF przez fibroblasty. W przypadku IL-6 spadek ten

obserwowany był dla stężeń 20 i 500 µg/mL enoksaparyny, 50 i 1000 µg/mL wyciągu z

cebuli oraz łącznej stymulacji enoksaparyny i wyciągu z cebuli (odpowiednio w stężeniach

500 µg/mL i 250 µg/mL). Poziom VEGF obniżał się po stymulacji enoksaparyną w stężeniu

20 oraz 500 µg/mL jak również po inkubacji z wyciągiem z cebuli (50 µg/mL). Połączenie

wyciągu z cebuli razem z enoksaparyną nie wpłynęło natomiast na produkcję VEGF. W tym

miejscu należy zaznaczyć, iż stosowana w naszym modelu enoksaparyna posiada niższą masą

cząsteczkową niż heparyna, stosowana w maściach i kremach (odpowiednio 4500 Da oraz

12–15 kDa). Jak pokazały badania innych autorów enoksaparyna efektywniej przechodzi

przez barierę naskórkową osiągając wyższe stężenia w skórze właściwej w porównaniu do

heparyny (Int J Pharm. 2015 Mar 15;481(1-2):79-83). W związku z tym, enoksaparyna może

być ciekawą i efektywną alternatywą dla heparyny. Coraz większa liczba dowodów wskazuje

że za udział w tworzeniu i rozwoju blizn przerostowych oraz keloidów odpowiedzialne są

czynniki wzrostu i niektóre cytokiny. IL-6 powoduje stymulację proliferacji fibroblastów oraz

syntezę kolagenu a jej podwyższona ekspresja obserwowana jest w tkance keloidu. Natomiast

VEGF stymuluje zarówno proliferację jak również migrację komórek śródbłonka oraz

tworzenie nowych naczyń krwionośnych, w tym także obecnych w tkance keloidu. Stąd

wydaje się, iż zastosowane przez nas związki mogą hamować rozwój blizn przerostowych i

keloidów. Co ciekawe ostatnio udowodniono, iż poziom VEGF w surowicy, jak i liczba

progenitorów komórek śródbłonka obecnych we krwi pacjentów z keloidami, jest wyższa niż

u osób zdrowych (Clin Exp Dermatol. 2015 Jun 30. doi: 10.1111/ced.12695). W przyszłości

możliwe jest zatem rozważenie terapii systemowej a nie tylko miejscowej keloidów w oparciu

o badane związki.

Co warte podkreślenia, wyniki uzyskane między innymi dzięki powyższym badaniom

(prace nr 7 i 8), były punktem wyjścia do opracowania nowej technologii otrzymywania

opatrunku medycznego. Wynalazek “Adhezyjny opatrunek silikonowy, zawierający suchy

wyciąg z cebuli i heparynę drobnocząsteczkową oraz sposób jego otrzymywania” otrzymał 2

listopada 2015 roku Dokument Patentowy z Urzędu Patentowego Rzeczpospolitej Polskiej o

numerze 220765 przyznany na rzecz Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego.

Podsumowanie

Prezentowany cykl prac przedstawia obiecujące związki peptydowe, które potencjalnie

mogą być wykorzystane w leczeniu trudno gojących się ran, szczególnie powstałych na tle

zakażeń bakteryjnych. Enoksaparyna i wyciąg z cebuli wykazały natomiast in vitro potencjał

do hamowania rozwoju blizn przerostowych i keloidów. Przedstawione osiągniecie wskazuje

również strategię opracowywania nowych leków dermatologicznych. Założenie tej strategii

opiera się przede wszystkim na odpowiednich modyfikacjach chemicznych naturalnie

14

występujących peptydów, szczególnie występujących u człowieka i płazów, a następnie

testowaniu ich przy użyciu modeli komórkowych in vitro. W osiągnieciu habilitacyjnym

przedstawiam również innowacyjną metodę oceny ryzyka wywołania reakcji alergicznej

przez leki peptydowe przy użyciu dostępnych baz danych oraz modeli in vitro (bezpiecznych

dla pacjenta).

5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo‐badawczych (artystycznych)

a) Komórki macierzyste w leczeniu ran przewlekłych – modele in vitro oraz badania

kliniczne

Równolegle do prowadzonych przeze mnie badań potencjalnych leków dermatologicznych,

rozwijam również w Zakładzie Immunologii Klinicznej i Transplantologii Gdańskiego

Uniwersytetu Medycznego metodę terapii komórkowej trudno gojących się ran. W ramach części

realizowanych przeze mnie grantów KBN/NCN w których pełniłem/pełnię funkcję głównego

wykonawcy (2009-2012) lub kierownika (2012- do teraz) zajmuję się optymalizacją izolacji,

hodowli i odpowiednej aplikacji klinicznej komórek macierzystych naskórka. Podstawą tych badań

była wcześniejsza charakterystyka komórek macierzystych naskórka oraz opracowanie

odpowiednich technik ich efektywnej ekspansji (Postepy Hig Med Dosw. 2009;63:449-56; Cell

Biol Int. 2010;34(9):911-915). Badania kliniczne wykazały m.in., iż aplikowane na ranę komórki

dla odpowiedniego efektu terapeutycznego, powinny być połączone/zawieszone w odpowiednim,

bezpiecznym materiale, ułatwiającym adherencję komórek do podłoża oraz ich właściwą aktywację

(Przegl. Dermatol. 2012; 99(3):230-234). Rezultatem tych obserwacji było zastosowanie przez nas

żelu fibrynowego, który, jak pokazały nasze dokładne analizy (mikroskopia elektronowa) oraz

badania innych Autorów, jest w pełni bezpieczny dla komórek oraz pacjenta (komercyjnie dostępny

lek). Wyniki tych prac zostały dotychczas przedstawione w opracowaniach książkowych oraz w

prezentacjach na konferencjach krajowych i międzynarodowych (spis wybranych pozycji poniżej).

Badania te wpisują się również w nurt cyklu moich prac habilitacyjnych. Ideą współczesnej

medycyny regeneracyjnej opartej na inżynierii tkankowej, którą chciałbym dalej rozwijać, jest

bowiem połączenie odpowiednio przygotowanych komórek, czynników wzrostu/peptydów oraz

nośników, np. rusztowań/biomateriałów (ang. tissue engineering triad). Kontynuacją tych badań

jest aktualnie realizowany przeze mnie projekt finansowany z funduszy NCBiR STRATEGMED I,

w ramach którego poszukujemy związków o charakterze proregeneracyjnym oraz

biokompatybilnych rusztowań, które będą mogły tworzyć złożone układy przyspieszające gojenie

ran zakażonych i /lub przewlekłych. Badane związki/konstrukty mają w założeniu stymulować

głównie komórki macierzyste naskórka oraz komórki macierzyste mezenchymalne. Oba

wspomniane rodzaje komórek są dla mnie również przedmiotem aktualnych badań (Expert Opin

Biol Ther. 2013;13(10):1357-1370). Podsumowując, przedstawiona część drugiego osiągniecia jest

kompatybilna z cyklem prac habilitacyjnych. Jednocześnie uzyskane wyniki mogą stanowić ważne

wskazówki dla ośrodków przeszczepiających hodowane in vitro komórki macierzyste w celu

leczenia ran przewlekłych.

15

Prace oryginalne

Pikuła M., Kondej K., Jaśkiewicz J., Skokowski J., Trzonkowski P. Flow cytometric sorting and

analysis of human epidermal stem cell candidates. Cell Biol Int. 2010; 34(9): 911-915.

IF=1,747; MNiSW=13.

Imko-walczuk B., Okuniewska A., Pikuła M., Nowacka-Pikuła D., Jaśkiewicz J., Trzonkowski P.

Możliwość klinicznego wykorzystania hodowli keratynocytów i komórek macierzystych naskórka w

leczeniu przewlekłych owrzodzeń podudzi: doniesienie wstępne. Przegl Dermatol. 2012; 99(3): 230-

234.

IF=0,00; MNiSW=5

Prace przeglądowe

Pikuła M., Marek-Trzonkowska N., Wardowska A., Renkielska A., Trzonkowski P. Adipose tissue-

derived stem cells in clinical applications. Expert Opin Biol Ther. 2013, 13(10): 1357-1370.

IF=3,653; MNiSW=30

Pikuła M., Trzonkowski P. Biology of epidermal stem cells: impact on medicine. Postepy Hig Med

Dosw. 2009; 63: 449-56.

IF=0,654; MNiSW=15

Książki

Michał Pikuła. Karcynogeneza skórna. W: Problemy dermatologiczne chorych po

przeszczepieniu narządów. Red. Beata Imko-Walczuk, Alicja Dębska-Ślizień, Jacek

Szepietowski, Bolesław Rutkowski. Cornetis, Wrocław, 2014.

Piotr Trzonkowski, Michał Pikuła, Natalia Marek-Trzonkowska. „Cellular therapy in

medicine.” Intercollegiate Faculty of Biotechnology UG & MUG, Gdansk, 2013. Książka dla

Studentów i Doktorantów Wydziału Biotechnologii UG-GUMed.

Wybrane doniesienia konferencyjne (pełen wykaz znajduje się w załączniku nr 4)

M. Pikuła, P. Langa, A. Wardowska, J. Zieliński, K. Kondej, A. Renkielska, P. Trzonkowski.

Medical applications of epidermal progenitor cells. Central European Conference on Regenerative

Medicine, Bydgoszcz, Poland, 14-15 March 2015.

M. Pikuła. Isolation, expansion, and clinical application of autologous epidermal progenitor cells.

J. Tissue Eng. Regen. Med. 2014; vol. 8, Tissue Engineering & Regenerative Medicine

International Society, Genova, Italy, 10-13 June, 2014.

P. Langa, M. Pikuła, K. Kondej, A. Wardowska, J. Zieliński, A. Renkielska, P. Trzonkowski.

Epidermal progenitor cell culture and quality control using flow cytometry: a way to improve

chronic wounds cell therapy. XXIX Congress of the International Society for Advancement of

Cytometry: Cytometry Advancing Science, Ft. Lauderdale, USA, May 17-21, 2014.

16

b) Badania właściwości biologicznych peptydów – inhibitorów/substratów enzymów

proteolitycznych

Dzięki możliwości współpracy m.in. z naukowcami z Uniwersytetu Gdańskiego mogłem także

uczestniczyć w interdyscyplinarnych badaniach, które są rozszerzeniem mojej pracy habilitacyjnej.

W przedstawionych poniżej publikacjach wykazaliśmy m.in., że niektóre inhibitory trypsyny

(pochodne SFTI) mogą również hamować aktywność proteasomów. To doniesienie może mieć

istotne znaczenie w leczeniu schorzeń związanych z defektami degradacji białek, np. chorób

nowotworowych (PLoS One. 2014;9(2):e89465). Podobne inhibitory mogą również tworzyć trwałe

koniugaty ze znacznikami fluorescencyjnymi i być internalizowane zarówno przez komórki

nowotworowe, jak i komórki zdrowe (fibroblasty skórne). Proponowanym przez nas mechanizmem

odpowiedzialnym za ten efekt może być makropinocytoza (oceniana wstępnie przy pomocy

mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej). To może pozwolić w przyszłości na

tworzenie znaczników, dzięki którym możliwe będzie śledzenie losów aktywnych biologicznie

związków in vitro oraz in vivo (Biopolymers Pept Sci. 2014;102(1):124-135). Dodatkowo postuluje

się, że nadmierna aktywność enzymów proteolitycznych bierze udział w patogenezie ran

przewlekłych. Stąd badane przez nas inhibitory mogą stanowić w przyszłości alternatywę w

leczeniu ran przewlekłych. Nasze badania wykazały również różną aktywność enzymu katepsyny

(Cat L) w skórnych komórkach nowotworowych i keratynocytach linii HaCaT. Enzym Cat L jest

proteazą zaangażowaną m.in. w dojrzewanie białek MHC II oraz modyfikacje histonów H3.

Zaprezentowana w pracy ultraczuła metoda detekcji tego enzymu może być pomocna w przyszłości

w monitorowaniu i prognozowaniu niektórych schorzeń, w tym chorób nowotworowych lub chorób

skóry (Anal Biochem. 2014;466:30-37).

Artykuły oryginalne

Dębowski D., Pikuła M., Lubos M., Langa P., Trzonkowski P., Lesner A., Łęgowska A., Rolka K.

Inhibition of human and yeast 20S proteasome by analogues of 1 trypsin inhibitor SFTI-1. PLoS

One. 2014; 9(2):e89465.

IF=3,234; MNiSW=40

Lesner A., Karna N., Psurski M., Łęgowska A., Wysocka M., Guzow K., Sieradzan A., Sieńczyk

M., Trzonkowski P., Pikuła M., Zieliński M., Kosikowska P., Łukajtis R., Łęgowska M., Dębowski

D., Wiczk W., Rolka K. Fluorescent analogs of trypsin inhibitor SFTI-1 isolated from sunflower

seeds: synthesis and applications. Biopolymers. Pept Sci. 2014; 102(1): 124-135.

IF=2,879; MNiSW=20

Łęgowska M., Wysocka M., Burster T., Pikuła M., Rolka K., Lesner A. Ultrasensitive internally

quenched substrates of human cathepsin L. Anal Biochem. 2014; 466: 30-37.

IF=2,305; MNiSzW=25

17

c) Cytomeria przepływowa jako narzędzie do badania fenotypu komórek oraz oznaczeń

cytokin

Cytometria przepływowa jest jedną z podstawowych technik badawczych, służącą m. in. do

wieloparametrycznej analizy komórek, jak również oceny stężenia białek zawartych np. w surowicy

lub mediach komórkowych. Metoda ta posiada ogromne spektrum możliwości i aplikacji stąd

pojawia się dziś w większości prac z dziedziny nauk o życiu. W pracach wyszczególnionych

poniżej zajmowałem się analizą cytometryczną hodowanych in vitro komórek oraz badaniami

cytokin w supernatanantach komórkowych lub surowicach pacjentów. Wspólnie z innymi

zespołami wykazaliśmy m.in. że witamina D3 hamuję ekspresję integryn oraz cytokin prozapalnych

w hodowanych in vitro komórkach mięśniówki gładkiej (J Steroid Biochem Mol Biol. 2010;121(1-

2):208-211). Wykazaliśmy również, iż hodowane in vitro podocyty pod wpływem wysokich stężeń

glukozy zmieniają ekspresję reduktazy aldozowej, co może mieć istotne implikacje kliniczne dla

monitorowania i leczenia pacjentów z cukrzycą (Exp Diabetes Res. 2011, Volume 2011 (2011),

doi:10.1155/2011/278963). Ostatnio wykazaliśmy także, iż silny wzrost stężenia cytokin

prozapalnych u pacjentów po zawale mięśnia sercowego zwiększa ryzyko pojawienia się u nich w

późniejszym czasie depresji. Może to stanowić ważny element tłumaczący udział mechanizmów

immunologicznych w rozwoju depresji (Psychiatr Pol. 2015; 49,3:455-46).

Tukaj C., Trzonkowski P., Pikuła M., Hallmann A., Tukaj S. Increased migratory properties of

aortal smooth muscle cells exposed to calcitriol in culture. J Steroid Biochem Mol Biol. 2010;

121(1-2): 208-211.

IF=2,886; MNiSW=27

Lewko B., Latawiec E., Maryn A., Barczyńska A., Pikuła M., Zieliński M., Rybczyńska A.

Osmolarity and glucose differentially regulate aldose reductase activity in cultured mouse

podocytes. Exp Diabetes Res. 2011, Volume 2011 (2011), doi:10.1155/2011/278963.

IF=1,200; MNiSW=30

Wilkowska A., Pikuła M., Rynkiewicz A., Wdowczyk-Szulc J., Trzonkowski P., Landowski J.

Wzrost stężenia cytokin prozapalnych w osoczu pacjentów po zawale mięśnia sercowego a

obecność depresji w okresie następnych 6 miesięcy. [Increased plasma pro-inflammatory cytokine

concentrations after myocardial infarction and the presence of depression during next 6-months].

Psychiatr Pol. 2015; 49,3:455-46.

IF= 0,733; MNiSW=15

6. Analiza bibliometryczna

Łączna wartość prac objętych cyklem: IF=10,748 MNiSW=154

Liczba punktów

z wyłączeniem osiągnięcia: IF=21,035 MNiSW= 243

18

Liczba cytowań: Web of Science=56 Scopus=63

Wartość indeksu h: h=3 (WoS) h=4 (Scopus)

Łączna liczba streszczeń zjazdowych: 44

Pełen wykaz publikacji, opracowań książkowych, doniesień konferencyjnych znajduje się w

załączniku nr 4.

Szczegółowa analiza bibliometryczna znajduje się w załączniku nr 5.

7. Kierowanie międzynarodowymi i krajowymi projektami badawczymi oraz udział w

takich projektach.

Projekty w trakcie realizacji

1. „Nowe technologie farmakologicznej stymulacji regeneracji” (2014 – 2017). Grant

finansowany przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju (Akronim-Regennova, konsorcjum

naukowe PhaStER), realizowany w ramach programu strategicznego „Profilaktyka i leczenie

chorób cywilizacyjnych” - STRATEGMED I (umowa nr STRATEGMED1/235077/9/NCBR/2014).

Łączna kwota projektu: 17 769 556 PLN. Charakter udziału: kierownik/lider 3 z 13 pakietów

zadań (WP4: Selekcja wstępna oddziaływań peptydów oraz rusztowań na unieśmiertelnione linie

komórkowe; WP5: Pozyskiwanie, charakterystyka i bankowanie komórek macierzystych; WP6:

Badanie in vitro potencjału regeneracyjnego wybranych peptydów i rusztowań).

2. „Profil ekspresji genów w hodowlach ludzkich komórek progenitorowych naskórka i jego

wpływ na powodzenie terapii ran u ludzi” (2012 – 2016). Grant finansowany przez Narodowe

Centrum Nauki (2011/03/D/NZ5/00555); kwota projektu: 402 780 PLN. Zakład Immunologii

Klinicznej i Transplantologii, Katedra i Klinika Chirurgii Plastycznej, Gdański Uniwersytet

Medyczny. Charakter udziału: kierownik projektu.

3. „Zmiany epigenetyczne w toczniu rumieniowatym trzewnym - znaczenie metylacji DNA”

(2013 – 2016). Grant finansowany przez Narodowe Centrum Nauki (2012/05/D/NZ5/01224).

Zakład Immunologii Klinicznej i Transplantologii, Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych,

Chorób Tkanki Łącznej i Geriatrii, Gdański Uniwersytet Medyczny. Charakter udziału: główny

wykonawca.

Projekty zakończone

4. „Badanie aktywności i toksyczności wybranych antybiotyków peptydowych pod kątem ich

zastosowania w gronkowcowych zakażeniach skórnych” (2010 – 2013). Grant finansowany

przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego (N N405 627838). Gdański Uniwersytet

Medyczny, Katedra i Klinika Dermatologii, Wenerologii i Alergologii, Zakład Immunologii

Klinicznej i Transplantologii, Katedra Chemii Nieorganicznej. Charakter udziału: główny

wykonawca.

19

5. „Leczenie trudno gojących się ran u ludzi z zastosowaniem autologicznych przeszczepów

hodowanych in vitro komórek macierzystych naskórka oraz keratynocytów” (2009 – 2013).

Grant finansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego (N N403 089335), Gdański

Uniwersytet Medyczny, Zakład Immunologii Klinicznej i Transplantologii, Katedra i Klinika

Chirurgii Plastycznej. Charakter udziału: główny wykonawca.

6. „Preparaty silikonowe z wyciągiem z cebuli i heparyną na keloidy i blizny przerostowe”

(2008 – 2010). Grant finansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego “Preparaty

silikonowe z wyciągiem z cebuli i heparyną na keloidy i blizny przerostowe” (N N405 008320528).

Gdański Uniwersytet Medyczny, Katedra Histologii i Immunologii, Katedra Farmacji Stosowanej,

Katedra Farmakognozji. Charakter udziału: wykonawca.

7. "Optymalizacja namnażania ludzkich komórek macierzystych naskórka z uwzględnieniem

dawców w wieku podeszłym" (2005 – 2008). Grant finansowany przez Ministerstwo Nauki i

Szkolnictwa Wyższego (2 P05A 00928). Gdański Uniwersytet Medyczny, Katedra Histologii i

Immunologii (40 000 PLN). Charakter udziału: główny wykonawca/współautor (grant

promotorski).

8. Członkostwo w międzynarodowych i krajowych organizacjach oraz towarzystwach

naukowych.

Członek Międzynarodowego Towarzystwa Przeszczepienia Narządów (ESOT) (05.2015 – do teraz)

Przewodniczący Gdańskiego Oddziału Polskiego Towarzystwa Immunologii Doświadczalnej i

Klinicznej (05.06.2014 – do teraz)

Członek Międzynarodowego Towarzystwa Inżynierii Tkankowej i Medycyny Regeneracyjnej,

TERMIS (2012 – do teraz)

Sekretarz Gdańskiego Oddziału Polskiego Towarzystwa Immunologii Doświadczalnej i Klinicznej

(2011 – 2014)

Skarbnik Gdańskiego Oddziału Polskiego Towarzystwa Histochemii i Cytochemii (2006 – 2009)

9. Udział w konsorcjach naukowych

Członek konsorcjum naukowego PhaStER powstałego w ramach współpracy i realizacji grantu

NCBiR STRATEGMED I („Nowe technologie farmakologicznej stymulacji regeneracji”

Regennova). Skład Konsorcjum: Gdański Uniwersytet Medyczny, Uniwersytet Gdański,

Politechnika Gdańska, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN w Warszawie,

ProScience Polska, MedVentures. Charakter udziału: lider trzech pakietów zadań z ramienia

GUMed.

20

10. Praca dydaktyczna i popularyzacja nauki

2014-do teraz „Nowatorskie sposoby prezentacji historii odkryć naukowych oraz

wynalazków jako sposób na popularyzację nauki”, II Edycja programu

ENGAGE2014 Fundacji na rzecz Nauki Polskiej. Charakter udziału:

główny wykonawca (wykłady/prezentacje w liceach ogólnokształcących

dotyczące historycznych i dzisiejszych odkryć naukowych)

2014-do teraz Przewodniczący Gdańskiego Oddziału PTIKiD - organizowanie spotkań

naukowych oraz wykładów otwartych dla studentów, pracowników

naukowych i klinicystów (wykłady gości – specjalistów m.in. z dziedziny

diagnostyki i leczenia chorób o podłożu immunologicznym)

2013 „Cellular therapy in medicine”, Trzonkowski P., Pikuła M., Marek-

Trzonkowska N. Wyd. MUW Biotechnologii UG-GUMed, Gdańsk, 2013.

Podręcznik dla studentów i doktorantów (praca w języku angielskim)

2013-do teraz Promotor pomocniczy dwóch prac doktorskich (prace w trakcie) na

stopień doktora nauk medycznych w zakresie biologii medycznej (GUMed)

2009-2014 Promotor dwóch prac magisterskich studentów Wydziału Biotechnologii

UG-GUMed (zakończone 2009, 2010) oraz bezpośredni opiekun dwóch

prac magisterskich studentów Analityki Medycznej Wydziału

Farmaceutycznego GUMed (zakończone 2013, 2014; obie prace z

wyróżnieniem)

2011-2013 Kształcenie podyplomowe. Kurs dla diagnostów laboratoryjnych w

ramach specjalizacji z laboratoryjnej diagnostyki medycznej (temat kursu:

"Badania układu odpornościowego”). Charakter udziału: Wykładowca

2011 „Wielka Encyklopedia Medyczna” (t.1-23), wydanie polskie, Warszawa,

2011. Charakter udziału: członek kolegium naukowego wydania polskiego

2009-do teraz

(Adiunkt)

Immunopatologia - seminaria dla studentów kierunku Analityka

Medyczna, Wydziału Farmaceutycznego GUMed

Immunologia - ćwiczenia laboratoryjne dla kierunku Analityka Medyczna,

Wydziału Farmaceutycznego GUMed

Immunologia - seminaria dla studentów II-go i IV-go roku Wydziału

Lekarskiego GUMed, kierunek lekarski (polskojęzycznych i

angielskojęzycznych)

Komórki macierzyste w medycynie - zajęcia fakultatywne dla studentów

polskojęzycznych i angielskojęzycznych kierunku lekarskiego Wydziału

Lekarskiego GUMed. Charakter udziału: współautor kursu/wykładowca

2006-2009

Asystent

Histofizjologia i biologia komórki - ćwiczenia oraz seminaria dla

studentów Wydziału Lekarskiego (prowadzone w języku polskim i

angielskim) oraz ćwiczenia dla studentów Wydziału Farmaceutycznego

21

2003-2006

Doktorant

Histofizjologia i biologia komórki - ćwiczenia oraz seminaria dla

studentów Wydziału Lekarskiego (prowadzone w języku polskim i

angielskim)

11. Wybrane staże naukowe i kursy

Wielka Brytania, Uniwersytet w Oksfordzie, Nuffield Department of Surgical Sciences,

Transplantation Research Immunology Group, 02.08.2015 – 29.08.2015, pobyt naukowy

(„Academic Visitor”) w ramach grantu Europejskiego Towarzystwa Przeszczepiania

Narządów (ESOT)

Francja, Reims, Uniwersytet w Reims, Laboratorium Biochemii i Biologii Molekularnej-

wyjazd z programu „LLP-Erasmus Programme, Teaching Staff Mobility”, 29.09 –

03.10.2008

Belgia, Erembodegem, Becton Dickinson, szkolenie z zakresu izolacji i analizy komórek przy

użyciu cytometru sortującego, 5.02 – 10.02.2005

Polska, Uniwersytet Warszawski, Zakład Cytologii, Kurs Hodowli Komórek Zwierzęcych

(dla zaawansowanych), 13.06 – 15.06.2005

Polska, Uniwersytet Gdański, kurs pedagogiczny (obejmujący przedmioty z zakresu

psychologii, pedagogiki, socjologii, dydaktyki), 2001 – 2002

12. Wyróżnienia

Otrzymanie grantu Europejskiego Towarzystwa Przeszczepiania Narządów (European

Society for Organ Transplantation) na wyjazd i pobyt naukowy w celu wykonania

projektu „Induced pluripotent stem cells as a source of insulin-producing cells for

transplantation” realizowanego we współpracy z naukowcami z Uniwersytetu w

Oxfordzie (Short Stay and Study Grant), sierpień, 2015

Nagroda Rektora II-go stopnia za osiągnięcia dydaktyczne, Gdańsk, 2014

Wyróżnienie w 13. Międzynarodowej Konferencji Naukowej Studentów i Młodych

Lekarzy w Gdańsku, "PhD student report session", 2005

Zajęcie I-szego miejsca w Sesji Biologii Molekularnej 11. Międzynarodowej Konferencji

Naukowej Studentów i Młodych Lekarzy w Gdańsku, 2003

Gdańsk, 27.11.2015 Michał Pikuła