Dra. Liliana Rivas

Cátedra de Inmunología Escuela de Medicina José Ma Vargas - UCV

1.-Describir los mecanismos de citotoxicidad mediada

por células, precisando mediadores solubles, de

membrana y celulares implicados

2.-Describir las características morfológicas y

funcionales de los fagocitos

3.- Describir el proceso de fagocitosis y destrucción

intracelular de patógenos

4.- Explicar el fundamento de las diversas pruebas

de la función fagocítica ***

5.- Enumerar los trastornos de la función fagocítica

en humanos

“Killing”

APOPTOSIS

Destrucción:

INTRACELULAR Citotoxicidad Celular

EXTRACELULAR Fagocitosis

Mecanismo efector esencial de la respuesta inmunitaria

Rama celular

Defensa contra:

Patógenos intracelulares (Virus, algunas bacterias y parásitos)

Células tumorales

Células propias alteradas sometidas a estrés térmico o traumático.

Importante en el rechazo de tejidos alógenicos (Trasplantes)

CTL Linfocitos T citotóxicos

Específicos de antígeno

Linfocitos NK Células Asesinas Naturales

Inespecíficas de antígeno

Linfocitos

NKT

Reconocimiento antigénico: 1.- Linfocitos T Citotóxicos (CTLs) CD8+: Reconocimiento de antigenos (péptidos virales) procesados y presentados por moléculas MHC-I en células infectadas.

2.- Linfocitos Citotoxicos Naturales (Natural Killer) Reaccionan contra células que no expresan MHC-I

Mecanismos de citotoxicidad por células linfoides

Importantes en inmunidad antiviral Células nucleadas Expresión de MHC-I Células infectadas expresan péptidos virales unidos a MHC-I Reconocimiento por parte de células T CD8+

Actividad efectora: Citotoxicidad (muerte de células infectadas)

Citotoxicidad mediada por Linfocitos T (CTLs)

Recordar…!!!!!!

Cada tipo de linfocito T efector expresa un conjunto particular de moléculas efectoras

IFN- TNF-β

IFN- IL-2 IL-4, IL-5

GRÁNULOS TÓXICOS:

FAS-L CD40L

CD40L

CITOCINAS: MOLÉCULAS DE MEMBRANA:

Perforinas y Granzymas

FAS

CD40 CD40

Marcadores: CD3 y CD8 Maduran en timo

Pre-CTL: LT CD8+ que todavía no tienen actividad citotóxica

Generación de CTL efectores:

1.- Señal específica de Ag transmitida por el complejo TCR (reconocimiento péptido-MHC clase I)

2.- Señal co-estimuladora (CD28-B7)

3.- Interacción IL-2 con receptor IL-2:

• Proliferación y diferenciación de CTL-P activado por Ag hacia CTL efector

Generación de linfocitos T citotóxicos

Activación, expansión clonal y

diferenciación de linfocitos T citotóxicos

5 días luego del encuentro con el

antígeno

Proliferación de CTL memoria no requiere de Th1

2. Interacciones Celulares

Indirectas: Citoquinas,

Fas-Fas L soluble

1. Interacciones

Celulares Directas

Mecanismo de citotoxicidad

1. Reconocimiento TCR-

PP/MHC 1

2. Adherencia firme. Mayor

afinidad LFA-1 por ICAM-

1(5-10min) luego disminuye

afinidad y se disocian.

1. Formación de conjugado CTL-Célula Blanco. (aumento de Ca 2+

intracelular)

2. Orientación de gránulos (Aparato de Golgi) hacia membrana y fusión con esta

(exocitosis)

3. Liberación perforina monomérica

4. Cambio de conformación monomeros de perforina (inducido por Ca2+) Se

insertan en membrana célula blanco

5. Se polimerizan dentro de la membrana

6. Formación de poros Entrada de granzimas

Linfocitos Citotoxicos CD8+ y células NK: gránulos líticos

Contenido de los gránulos y su acción sobre células diana

Proteína de los gránulos de las células T citotóxicas

Acción sobre la célula diana

Perforina Se polimeriza para formar un poro en la membrana

Granzimas Serin-proteasas Activan la apoptosis al llegar al citoplasma de la célula diana. Fragmentación del DNA.

Granulisina Media la despolarización de la membrana mitocondrial en células diana y liberación de citocromo c, promoviendo la apoptosis

5 Granzimas en humanos Granzimas A, B y C

Muerte celular mediada

por Receptores

Muerte celular mediada

por Receptores

Moléculas de la familia del receptor de TNF

Dominios de muerte: Involucrados en el reclutamiento de caspasas

Linfocitos T CD8+ inician muerte celular a través de la expresión de FasL

Entrecruzamiento de Fas (CD95) o TNFR1

Trimerización del receptor

Unión de proteínas adaptadoras a (FADD)

dominios de muerte

Reclutamiento y activación de caspasas

Apoptosis.

Apoptosis Proceso de autodestrucción

activo Requiere expresión de genes

y síntesis proteica activa Culmina en

desnaturalización del genoma por endonucleasas

Formación de cuerpos apoptóticos

Encogimiento celular Degradación de la cromatina Los eventos son ordenados No hay inflamación

Necrosis

Daño tisular masivo por: Trauma, calor, hipoxia, tóxicos, etc.

Asociada a lesiones de membrana (lisis osmótica).

Se pierde organización celular.

Conduce a inflamación del tejido circundante

No ocurre bajo condiciones fisiológicas

NECROSIS APOPTOSIS

Fragmentación del núcleo Integridad de la membrana

Cuerpos apoptóticos

Fagocitosis sin INFLAMACION

Fagocitosis con INFLAMACION

Son linfocitos grandes granulares

No tienen TCR, no expresan Ig de membrana

Se activan por IFN- y TNF

Su mecanismo de destrucción no es específico, pero no

es al azar (células infectadas y algunas líneas tumorales

pero no células normales)

No tienen restricción por MHC

Defensa contra virus y tumores

Citotóxicas de manera constitutiva. Siempre tienen

gránulos en su citoplasma.

No genera memoria inmunitaria

Las células NK son componentes

tempranos en la respuesta del hospedador

Actividad Citotoxica de Células NK

Balance entre señales activadoras e inhibidoras de

receptores en células NK

Las células modificadas pueden expresar bajos niveles de MHC I.

Los virus pueden inhibir la síntesis de proteínas entre ellas la mayor producción de MHC I inducida por IFN.

Proteína virales pueden bloquear el ensamblaje y transporte de las moléculas clase I.

Los virus pueden alterar la glicosilación de proteínas celulares del hospedador.

La unión de Receptores Activadores (como NKR-P1) junto con una baja expresión o unión a Receptores KIR activa a las células NK para que maten a las células blanco por Apoptosis.

Actividad Citotoxica de Células NK

Receptores:

1.Activadores

-Tipo Lectina:

CD94/NKG2D o C

(dominios ITAM)

ligando MIC A y B

-Tipo Inmunoglobulina:

NKp30,44,46

-CD16 (R de Ac)

2.Inhibidores

-Tipo Lectina:

CD94/NKG2A

(dominios ITIM)

ligando HLA-E

-Tipo Inmunoglobulina:

KIR. Ligando móleculas

HLA B o C

Citotoxicidad Celular Dependiente de

Anticuerpos (ADCC)

RESUMEN

El sistema inmune incluye dos tipos de células efectoras: CTL y linfocitos T CD4+

Actividad de CTL incluye dos fases:

Fase de activación

Fase efectora

CTL inducen muerte celular por dos vías:

Perforina/granzima

Fas/FasL

Existen células citotóxicas inespecíficas

Papel de células NK en la eliminación de células tumorales e infectadas por virus

Concepto

Células Fagocitarias

Fases

Métodos de estudio

Trastornos

Fagocitosis se define como el acto de engullir, con el propósito de destruir, un objeto, tal como un microorganismo

Liu H, Pope RM. Phagocytes: mechanisms of inflammation and tissue destruction. Rheum Dis Clin N Am 2004; 30:19-39

Neutrófilos Macrófagos

Localización Sangre periférica

Tejidos

Vida Media Horas Prolongada

Blanco Bacterias Piógenas

Bacterias, Virus y Protozoarios intracelulares

Gránulos Específicos

Gránulos Azurófilos

Gránulos Azurófilos 0,5 μM 1.500/ célula

Lisozima Mieloperoxidasa Elastasa Catepsina G H+ Hidrolasas

Defensinas

BPI: proteína bactericida

estimuladora de la permeabilidad

Gránulos Específicos 0,2 μM 3.000/ célula

Lisozima Citocromo b558

OH- fosfatasa

Lactoferrina

Proteína Fijadora de Vitamina B12

- Depósitos de Glucógeno Les permite

actuar de forma eficiente en Anaerobiosis.

- Estallido respiratorio mayor que MO

generan mayor cantidad de reactivos de O2 y

Nitrógeno.

- Tamaño 5-10 veces - Complejidad

estructural y organelas

- Capacidad fagocítica - Enzimas líticas

Fases de la Fagocitosis

Movilidad

Reconocimiento y Adhesión

Ingestión

Desgranulación

Muerte intracelular

Fases de la Fagocitosis

Moléculas de Adhesión

Quimiocinas

Complemento

Sistema de la Coagulación

Interacción PAMP-PRR

Opsonización

Complemento

IgG

Moléculas de Reconocimiento

Patrones Moleculares Asociados a Patógenos

PAMPs

Receptores de Reconocimiento De Patrones

PRR

También receptores

para moléculas

opsonizantes:

-Inmunoglobulinas

-Complemento

PAMPs en la superficie de los patógenos

Receptores de Reconocimiento de Patrones (PRR) en la superficie de los fagocitos

Se unen a residuos de carbohidratos altamente conservados en procariotas

PAMPs

Receptor de Manosa

Receptor de LPS (CD14)

Receptor Scavenger

Receptor de Glucanos

CD11b/CD18

PAMPs

Infecciones Extracelulares

Lipopolisacárido Bacterias Gamnegativas

Ácido lipoteicoico Bacterias Grampositivas

Mananos Pared celular de levaduras

Glicolípidos Micobacterias

Infecciones Intracelulares

Secuencias no metiladas CpG DNA Bacteriano

RNA bicatenario Virus RNA

Reconocimiento de la Señal de Peligro y activación del Macrófago

Fases de la Fagocitosis

Activación del

Citoesqueleto

Emisión de Pseudópodos

Englobamiento

Formación del Fagosoma

Fases de la Fagocitosis

En minutos Formación del

fagolisosoma

Clase de Mecanismo Productos específicos

Acidificación pH = ~ 3.5-4.0, bacteriostático o bactericida

Productos tóxicos derivados de Oxígeno

Superóxido, Peróxido de Hidrógeno, radical hidroxilo, hipoclorito

Productos tóxicos derivados de Nitrógeno

NO

Péptidos Antimicrobianos Defensinas y proteínas catiónicas

Enzimas

Lisozima (disuelve la pared celular de ciertas bacterias grampositivas)

Hidrolasas ácidas (digestión de la bacteria)

Competidores Lactoferrina (une Fe) y proteína fijadora de vitamina B12

Destrucción mediante intermediarios reactivos de Oxígeno

Citosol

Gránulo

Proceso fagocítico

Desencadenante

Membrana

Flavo-citocromo b558

Proceso oxidativo

1. Anión

superóxido

Enzima:

Oxidasa

fagosómica de

NADPH2

2. Peróxido de

Hidrogeno:

enzima:

Superoxido

dismutasa

3. Radicales

hidroxilo

4. Hipoclorito:

Enzima

Mieloperoxidasa

Destrucción mediante intermediarios reactivos de Nitrógeno

NO Sintetasa

L-NMMA

L-ARGININA CITRULINA

1. Óxido Nítrico

2. Superóxido

3. Dióxido de Nitrógeno

Destrucción mediante mecanismos independientes de Oxígeno

Catepsina G

Defensinas de bajo PM

Proteínas catiónicas de alto PM

Proteína incrementadora de la permeabilidad bacteriana (BPI)

Daño a las Membranas microbianas

Lisozima Escinde los mucopéptidos de la pared celular bacteriana

Lactoferrina Forma complejos con el hierro

Enzimas proteolíticas

Otras enzimas hidrolíticas diversas

Digestión de microorganismos digeridos

Factores secretados por Macrófagos Activados

Interleukina 1 (IL-1) Promueve respuestas inflamatorias y fiebre

Interleukina 6 (IL-6)

Factor de Necrosis Tumoral α (TNF-α)

Promueven la inmunidad Innata y la eliminación de Patógenos

Proteínas del Complemento Promueven la respuesta Inflamatoria y la eliminación de patógenos

Enzimas hidrolíticas Promueven la respuesta Inflamatoria

Interferón α (IFN-α)

Activa genes celulares, dando lugar a la producción de proteínas que confieren un estado antiviral a la célula

Factor de Necrosis Tumoral α (TNF-α) Destruye algunas células tumorales

GM-CSF

G-CSF

M-CSF

Promueve la hematopoyesis inducible

Conteo de PMN – Conteo de monocitos y

Macrófagos

Pruebas de Movilidad de PMN Prueba de Movilidad al azar: Método del tubo capilar

Prueba de la membrana para quimiotaxia

Pruebas de reconocimiento y adherencia CD18 (Subunidad β de LFA-1, Mac-1 y CR4)

Receptores para CC e IG – FcR y CR

TAREA…..!!!!!!

Two chambers are separated by a filter through which cells migrate. Chemotactic gradients can be set up by placing different concentrations of the putative chemo-attractant in the upper and lower chambers. The advantage of the Boyden chamber is that is can discriminate between chemo-kinetic and chemotactic influences. The use of this chamber requires that the cells under test have to move in three dimensions (most do) and to squeeze between the pore size of the particular filter. Filters are available in different average pore sizes, so this latter point is seldom a problem. The Boyden chamber is reproducible and the chemokinetic, chemotactic response easy to quantify.

Prueba para quimiotaxia de PMN

PMN

Sust. Quimiotáctica

Sust. No

Quimiotáctica

Prueba para quimiotaxia de PMN

Pruebas de Ingestión Cuenta Directa al Microscopio de Luz

Estimación de la radioactividad emitida por fagocitos que han ingerido partículas marcadas

Medición de la tinción de lípidos

Análisis mediante citometría de flujo

Pruebas de Desgranulación Fagocitosis Frustrada

Pruebas de Muerte Intracelular Prueba de Reducción del Azul de Tetrazolio

Nitrado

Quimioluminiscencia

Citometría de Flujo (Estallido Oxidativo)

Análisis Microbicida de Neutrófilos

IgG agregada

PMN

Enzimas Lisosómicas

Látex NBT

Formazán Piridina

Quimioluminiscencia

O2 H2 O2

O2-

O2

O2

O2

H2 O2

H2 O2

H2 O2

O2-

O2-

O2-

Quimioluminiscencia

O2 H2 O2

O2-

O2

O2

O2

H2 O2

H2 O2

H2 O2

O2-

O2-

O2-

Quimioluminiscencia

O2 H2 O2

O2-

O2

O2

O2

H2 O2

H2 O2

H2 O2

O2-

O2-

O2-

Quimioluminiscencia

O2

H2 O2

O2-

O2 O2

O2

H2 O2 H2 O2

H2 O2

O2- O2

-

O2-

COO- Inestable

Quimioluminiscencia

O2

H2 O2

O2-

O2 O2

O2

H2 O2 H2 O2

H2 O2

O2- O2

-

O2-

COOH

Edo. Basal

Citometría de Flujo

2’,7’ diclorofluoresceína

Análisis Microbicida de Neutrófilos

Neutropenia

Síndrome de Job

Deficiencia de Mieloperoxidasa

Deficiencia de Glucosa-6-P Deshidrogenasa

Leucemia aguda

Disfunción Transitoria del Neutrófilo

Infecciones agudas

Ataxia-Telangiectasia

Crioglobulinemia

Enfermedad Granulomatosa Crónica

Síndrome de Chédiak-Higashi

Déficit de Adhesión leucocitaria

Prematuridad

Síndrome de Down

Susceptibilidad a infección por micobacterias

Modelo de Enfermedades autoinmunes

Roitt: Inmunología Fundamentos

Kuby: 5ta. Edición

Stites (Sección de métodos de estudio)