집중력 및 기억력 개선 관련 기능성평가§‘중력 및 기억력 개선.pdf · 검사시행에서는 어두운 곳으로 들어가지 않고 밝은 곳에서 오래

집중력 및 기억력 개선 관련 기능성평가

배현수1, 심인섭2

경희대학교 한의과대학 생리학 교실1, 경희대학교 동서의학대학원2

1. 집중력 및 기억력 / 646

(1) 집중력 및 기억력 개념 설정 ·······································································646

(2) 기억력 및 집중력 개선의 객관적 표현에 관한 조사 ·································647

2. 학습 및 기억능력 향상 기능식품의 평가기준 모델 설정 / 648

(1) in vivo ··········································································································648

(2) 임상실험상 ·····································································································651

(3) 기억력감퇴 동물모델의 확립: ····································································652

3. 학습 및 기억능력 향상 기능식품에 관한 평가모델의 실제

수행 / 661

(1) Cold water immersion stress ······································································661

(2) Passive avoidance test ···············································································663

(3) 사상관련전위 (Event Related Potential: ERP), 청각 oddball

paradigm 및 연속재인 과제 ·········································································666

(4) 혈관성 기억감퇴모델 ····················································································674

(5) Ibotenic acid lesion 실험결과 ··································································678

4. 참고문헌 / 683

1. 집중력 및 기억력

(1) 집중력 및 기억력 개념 설정

가. 기억의 정의

인간의 행동을 전제하여 내재된 과정, 정신활동에 필요한 정보를 받아들여 뇌 속

에 저장했다가 필요한 때에 의식세계로 꺼내어 사용하는 능력 (William F, 1999)

나. 기억의 분류

기억저장의 독특한 구조적 특징에 따라 감각기억, 단기기억, 장기기억의 세 가지

종류로 나눌 수 있다(이주용 역, 1991; 장현갑 et al., 1992).

① 감각기억

정보가 감각기관을 통하여 저장되는 수동적인 과정이며, 이 정보들 중에서 주의

를 기울인 정보만이 단기기억으로 넘어간다

② 단기기억

기억대상에 따라 언어성 기억과 공간성 기억으로 구분. 현재 의식하고 있는 정

보들을 정보처리 하는 동안의 작업대와 같은 역할을 하는 비교적 짧은 기간 동

안의 기억

③ 장기기억

삽화적 기억과 의미적 기억, 절차적 기억으로 분류. 나중에 재생할 수 있도록

비교적 영구히 저장되는 강화된 기억. 다양한 형식으로 저장될 수 있으며, 적절

한 자극으로 언제든지 인출

다. 집중의 정의

개인이 필요한 자료를 얻기 위해서 외부 환경을 탐색하는 적극적이고 선택적인

힘. 어떤 것을 효과적으로 다루기 위해서 다른 것으로부터 분리하는 것을 뜻하

며, 혼란된 상태와는 반대되는 상태로서 주의의 능동적 선택적 측면을 강조한 것

이므로 집중력은 선택된 주의력이라 한다 (Sieb RA., 1990).

라. 집중의 분류

① 명료화

이는 환경이나 신체적 자극에 반응하기 위한 신체적, 정신적 각성상태를 말한

다. 즉 자극에 대한 준비상태의 정도라 할 수 있다.

② 선택적 주의력

자극에 대해 눈을 돌리거나 귀를 쫑긋거리는 식으로 필요한 자극에 대해 방향과

관심을 돌리는 것이다. 앞서의 다양한 생각이나 자극을 잊고 새로운 것으로 관

심을 돌리는 것이라고 생각하면 쉽다.

③ 지속적 주의력

시간의 경과에도 특정 자극에 대해 주의력을 유지하는 것을 말한다.

(2) 기억력 및 집중력 개선의 객관적 표현에 관한 조사

가. 단기기억의 호전

병리상태가 아닌 정상상태 혹은 노화상태의 단기기억(short term memory)의 호전

에 관한 기술은 그리 많지 않다. 자료의 대부분이 1990년대 초반 이전의 연구들

이며, 과학기술의 한계로 인하여 다양한 객관적 표현을 기술하지 못하고 있으며,

주로 임상적인 청각, 시각, 재인검사를 위주로 진행되었다.

① 정상상태에서의 단기기억에 관한 연구

Cacace 등 (Cacase AT. et al., 1992)은 delayed matching-to-sample paradigm

(DMS)을 통해 정상 성인과 학동의 청각인지를 통한 단기기억의 차이를 연구하였

다. 7가지 요소로 이루어진 청각빈도패턴의 과제를 부여하였으나 1-10초간의 단

기기억에서는 별다른 차이를 보이지 않았음을 보고하였다.

또한 Agrawal 등 (Agrawal R. et al., 1987)은 15명의 7-9세 학동을 주의결핍장

애군과 공격적 기질을 가진 학동군으로 분류하고 이들에게 Bi-colored,

alphanumeric arrays 과제를 부여하여 short term score를 분석하였다. 그 결과

주의결핍장애군의 score가 공격적 기질을 가진 학동군의 score보다 점차 낮아짐

을 보고하였다.

② 노화상태에서의 단기기억에 관한 연구

Murphy 등 (Murphy DR. et al., 2000)은 무소음상태와 소음상태에서의 청각적

단기기억의 양상을 조사하여보고자 청년과 장년층에게 Paired associate recell

과제를 수행하였고, 그 결과 무소음상태에서의 단기기억은 청장년간에 통계적

차이를 보이지 않았으나 소음상태에서는 많은 단어쌍을 제시하면 할수록 청년의

단기기억 score가 높음을 알 수 있다고 보고하였다. 이는 노화와 소음에 의한

기억력의 손상이 존재한다는 것을 확인하는 것으로 볼 수 있다고 발표하였다.

Adamowicz (Adamowicz JK., 1976)는 청장년의 단기기억 상태를 연구하고자 시각

적 회상 및 재인과제를 수행하였다. 그 결과 노화가 short term memory의 손상

을 유발한다는 보고를 발표하였다.

나. 장기기억의 호전

장기기억은 Raskin (Raskin LM., 1969)이 정상학동과 교육가능한 발달지연학동을

대상으로 연구한 결과를 내놓은 이후로, Davis 등 (Davis KL. et al., 1978)에

의해 Physoostigmine이 장기기억의 개선에 관여한다는 연구결과가 촉매가 되어

활발하게 연구되어왔다. 이후 건망증 환자군과 정상군의 친숙한 목소리에 관한

장기기억연구 (Meudell PR. et al., 1980), CREB mutant mice가 공간지각훈련을

통해 손상된 장기기억를 회복한다는 연구발표 (Kogan JH. et al., 1997), neuron

의 Transgenic mice overexpressing truncated trkB neurotrophin receptors가

장기공간기억은 손상되지만 hippocampus의 Long term potentiation에는 변화가

없다는 연구 (Saarelainen T. et al., 2000) 등이 발표되었다.

다. 선택적 주의력에 관한 연구

1978년 Hallahan 등 (Hallahan DP. et al., 1978)이 교육이 불가능한 학동과 정

상 학동군을 대상으로 선택적 주의력에 차이를 보인다는 연구논문을 발표한 이

후, 선택적 주의력에 관한 연구가 활발하게 이루어지게 되었다. 이후 Carlin 등

(Carlin MF. et al., 1983)이 50인의 정상 여대생을 대상으로 Goldman-Fristoe-

Woodcock Test를 이용하여 선택적 주의력이 정상군 내에서도 차이가 있음을 발

표하였다. 이후 계속된 연구에서 Solfrizzi 등 (Solfrizzi V. et al., 2002)은

Symbol Cancellation을 통해 정상 노인군과 알츠하이머 질환 환자간에 선택적 주

의력에 차이가 있음을 증명함으로서 노화유발 기억력 손상과 알츠하이머 질환의

주의력 양상이 다름을 보고하였다.

2. 학습 및 기억능력 향상 기능식품의 평가기준 모델

설정

(1) in vivo

가. 생리적 기억력 및 집중력 저하의 유도

Cold water immersion stress(or with restraint stress) (McAndrew FT., 1978)

생존본능이 작용된 운동에 의한 발열을 방지하기 위해 앞, 뒷다리에 adhesive

plaster를 발라 plastic mesh에 고정시킨 후 실험동물의 상체 1/4를 물위로 나오

게 한 채 22℃ water bath에 1시간 동안 담금으로서 일시적인 빈혈을 유발, 기억

능력의 저하상태에서 행동실험을 진행한다.

노화 동물모델

12개월 이상 사육된 rat 이나 mice (senescence-accelerated mice strain; SAM

strain 포함)를 이용하여 자연노화에 의한 기억능력 저하 상태에서의 행동실험을

진행한다.

정상 동물

인위적 또는 자연적인 기억력 저하상태가 아닌 9∼16 주령의 rat이나 mice를 사

용하여 행동실험을 진행한다

나. 동물실험 (Behavioral test)

공간학습능력검토: Morris water maze 검사

수중 미로로 이용되는 수조는 직경이 180㎝, 높이가 50㎝인 원형통으로 온도가

22±2℃되는 물이 30㎝ 높이로 채워지게 하였다. 수중 미로의 주변은 비디오 카메

라, 실험대, 그리고 수조 주위 벽면에 걸려있는 각종 도형 모양의 공간단서

(cue)들을 일정하게 유지하였다. 도피대는 직경이 12㎝인 원형 투명 아크릴에 받

침대를 부착하고, 수면보다 1.5㎝ 낮게 위치시켰다. 수중 미로는 사분면으로 나

누어져서 북동 (NE), 북서 (NW), 남동 (SE), 남서 (SW)로 구분되고 이중 북동 사

분원의 중심부에 도피대가 놓여지고, 나머지 중 하나가 출발위치로 사용되었다.

실험동물은 하루에 180초간 4행씩 6일간 훈련을 받으며 (acquisition test), 7일

째 마지막 시행이 끝나면 자유수영 검사가 시행되는데 (retention test) 이때 동

물들은 도피대가 제거된 채로 60초간 수영을 하게 하였다. 모든 동물들의 행동은

비디오 카메라로 녹화되는데, 훈련 시행에서는 출발에서부터 도피대에 올라가는

데 걸린 시간을 S-MART 프로그램 (Pab Lab, Spain)을 이용하여 측정한다. 이는

관계학습에 의한 공간기억력을 알 수 있다.

명시적 기억능력검사: Passive avoidance test

전기충격발생기와 회피장피로 구성되어있다. 회피장치는 검은 아크릴로 만들어진

어두운 상자 (30×30×30 ㎝)이고, 바닥에는 알미늄 막대가 일정한 간격으로 깔려

있으서 이를 통해 동물의 발바닥에 전기충격을 가할 수 있다. 상자의 전면 바깥

벽에는 한 마리의 동물을 가까스로 올려놓을 수 있는 크기 (5×15 ㎝)의 난간이

설치되어 있다. 난간 위쪽 45 ㎝ 지점에는 할로겐 전구 (AC12V-50W)가 설치되어

있다. 난간과 회피상자 사이에는 작은 문 (5×5 ㎝)이 장치되어 있다. 동물에게

전기충격을 가하는 장치는 Coulboum 사에서 생산한 scramble shock generator 이

었다.

먼저 상자 바깥에 설치되어 있는 난간에 동물을 머리가 바깥을 향하게 올려놓는

동시에 상자로 통하는 문을 연다. 문이 열리지마자 난간 위 45 ㎝ 지점에 설치된

조명장치를 통해 50W의 불빛을 동물에게 비춘다. 장치는 바닥에서 60 ㎝되는 곳

에 설치되어 있어서 난간 위의 동물은 혐오 상황에 노출된다. 이런 조건에서 동

물은 밝은 곳을 피해 어두운 상자로 들어가면 회피반응을 보인다. 동물이 상자로

들어가면 10초간의 시행간 간격을 두었다가 두 번째 시행을 실시한다. 이런 시행

이 3회 반복되고, 3번째 시행에서는 동물이 어두운 상자로 들어가는 순간 상자의

바닥에 깔려있는 알미늄 격자를 통해 전기충격 (0.4 mA, 5초)이 제시된다. 네발

이 모두 상자 안으로 들어가는 경우에만 반응을 한 것으로 간주한다. 이것으로

훈련시행이 종료된다. 24시간이 지난 다음날 동일한 절차를 사용하여 기억 검사

시행 (retention test)을 실시한다. 검사시행에서는 동물이 상자로 들어가면 전

기충격이 제시되지 않고 바로 시행이 종료된다. 훈련시행과 검사시행 모두에서

동물이 혐오 상황인 난간에서 어두운 상자로 들어가는데 소요된 반응잠재기

(response latency)가 훈련 또는 기억성적으로 측정된다. 동물이 싫어하는 밝은

곳에서 어두운 곳으로 들어갔을 때 전기충격을 경험한 기억을 잘 형성하면 기억

검사시행에서는 어두운 곳으로 들어가지 않고 밝은 곳에서 오래 머물게 되므로

반응잠재기가 바로 기억성적이 된다.

작업(단기기억)검사: Radial arm maze 검사

투명한 아크릴로 제작된 8개의 통로가 중앙의 출발영역 (central platform)을 중

심으로 매 45도 각도 (방사형)로 뻗어 나온 형태의 장치가 이용된다. 중앙 출발

영역은 직경 38 cm인 원에 내접하는 정팔각형 상자로 높이는 30 cm이다. 주로는

출발 상자의 각 면에 뚫린 9×9 cm 크기의 통로와 연결되어 있으며, 길이는 70 cm

이고 뚜껑이 있어서 동물이 바깥으로 나가지 못한다. 주로의 끝에는 보상으로 제

공하는 먹이나 물을 담을 수 있는 5×5×2 cm 크기의 용기 (음식 접시)가 설치되어

있다. 각 주로의 출발 지점으로부터 15 cm되는 지점과 주로의 끝에서 8 cm되는

지점에 각각 광전탐지기 (photoelectric sensor)를 부착하여 동물이 주로 출입

행동을 탐지하도록 한다. 비디오를 이용하여 동물의 움직임이 감지괴면 이 신호

가 컴퓨터 인터페이스를 거쳐 디지털 값으로 변환되어 컴퓨터의 I/O port로 입력

된다. 컴퓨터에서는 이 신호를 기호로 하여 쥐들이 각 주로를 방문한 횟수와 오

류 여부가 계산되고 그 값이 저장된다.

실험에 들어가기 전 36시간 동안 사육상자에서 물과 먹이를 박탈하고 갈증을 유

발시킨 쥐를 행동 관찰실로 옮겨와 30분간 환경에 적응시킨다. 각 주로의 끝에

있는 보상 용기에 0.1cc의 물 또는 먹이를 넣고 주로로 통하는 통로를 닫는다.

쥐를 미로의 출발 상자에 넣고 1분간 두어 상황에 적응시켰다. 1분이 지나면 각

주로로 통하는 통로를 개방하여 쥐가 자유롭게 미로 속을 돌아다니게 된다. 쥐가

주로를 방문하여 끝까지 다다르면 보상 용기에서 한 방울의 물 또는 먹이를 먹을

수 있다. 그러나 동일한 주로를 반복해서 방문하면 두 번째 방문부터는 물 또는

먹이가 제공되지 않고, 반응은 오류로 기록된다. 쥐가 5분 동안에 8개의 주로를

모두 방문하지 못하면 시행을 중지시키고, 그 시행은 실패로 간주한다. 쥐가 학

습 준거에 도달하는 경우 24시간 후에 기억검사를 실시한다.

(2) 임상실험상

지능검사 (K-WAIS)

가장 대표적인 숫자외우기와 토막짜기를 시행, 상식, 이해, 산수, 공통성, 숫자,

어휘 분야로 이루어진 언어성검사와 바꿔쓰기, 빠진곳 찾기, 토막짜기, 차례맞추

기, 모양맞추기 분야로 이루어진 동작성 검사로 구분한다. 숫자외우기의 경우 주

의력 평가의 유용한 도구이며, 토막짜기의 경우 비언어적 사고수준 평가의 유용

한 도구이다.

임상실험에서 K-WAIS 검사상 숫자외우기의 연령별 환산점수, 토막짜기의 연령별

환산점수와 그 합을 평가하여 인지기능의 호전이 보일 경우 기억력 및 집중력 개

선의 효과를 의미한다고 할 수 있다.

사상관련전위 (Event Related Potential: ERP)

피험자는 외부 소음이 차단된 전자기 차폐실의 안락한 의자에 앉은 후 나이, 시

력, 청력 등에 관한 간단한 질문에 답하고, 이어서 실험자가 전극을 부착한다.

과제 수행에 앞서 5분 정도 EEG를 측정하면서 충분히 안정시킨 후, oddball 과제

와 연속재인과제를 수행하면서 ERP를 측정한다.

청각 oddball paradigm

피험자의 과제는 85dB 크기로 제시되는 1000Hz의 표준자극과 1500Hz의 목표자극

중 목표 자극의 개수를 세는 것이다. 피험자는 전체 시행 시간동안 내적으로 목

표자극의 회수를 세어서 실험 종료 후 구두로 보고한다.

연속재인과제

두 글자로 구성된 한글 단어 240개를 선택하여 100개는 즉각적으로 반복 제시되

고, 100개는 5개의 간섭 단어 후에 지연 반복 제시되며, 40개는 반복 제시되지

않는다. 피험자는 연속적으로 제시되는 일련의 단어들을 주시하면서 단어가 앞서

제시된 단어인지 아닌지를 판단하여 양손의 엄지손가락으로 반응 버튼을 누른다.

청각 Oddbal paradigm 및 연속재인과제 시행 중의 사상전위검사시 P300 요소를

측정하여 P300 진폭의 증가 및 잠재기 (latency)의 감소가 회기 및 집단간에 유

의한 차이를 보이며 나타나는 경우, 기억력 개선효과를 의미한다고 할 수 있다.

alpha wave 및 beta wave

주의 지속 수행과제를 검사하는 동안의 뇌의 변화를 EEG에 의해 확인하면, 알파

파 (8-13Hz)에서 베타파 (>13Hz)로의 이행이 쉽고 뇌가 긴장 태에서 알파파 상태

로 돌아와 베타파를 준비시키는 상태가 지속될 때 주의 집중이 가장 효과적으로

이루어진다고 말할 수 있다 (Klimesch W. et al., 1998).

고로 ERP 측정시 약물투여 전과 약물투여 후의 alpha band의 증가와 동시에 beta

band의 감소는 집중력 개선효과를 의미한다고 할 수 있다.

(3) 기억력감퇴 동물모델의 확립:

기능성 식품들의 집중력 및 기억력 개선 및 신경세포 보호효과를 평가하기 위하

여

- 치매모델인 192 saporin, ibotenic acid손상, beta amyloid 손상, scopolamine

투여 등 치매동물모델을 확립함

- 혈관성 기억감퇴모델인 4VO cerebral ischemia 모델확립

기능성 식품의 기억력감퇴모델에서 학습수행 증진에 미치는 효과 규명

- 공간학습능력검토: Morris water maze 검사

- 명시적 기억능력검사: Passive avoidance test

- 작업 (단기기억)검사: Radial arm maze 검사

- 기능성 식품들의 Biomarker 측정을 통한 신경세포 보호효과를 규명: 조직염색

법을 이용하여 뇌내 신경세포 사멸의 수를 측정하며 행동 연구 결과와의 관련성

검토

가. 기억감퇴모델실험동물

본 실험에 사용한 흰쥐는 Sprague-Dawley계로 생후 8주령 (체중 280±10g)의 수컷

(샘타코, 한국)을 구입하여 동물실험실 내 사육실에서 7일간의 적응기간을 갖도

록 함. 사육실의 온도는 23±3℃, 상대습도 50±10%의 환경을 유지하면서 08：00부

터 20：00까지 12시간 간격으로 명암을 조절하고, 고형사료 (삼양사료, 경기도)

와 물은 무제한 공급.

해마로 투사하는 acetylcholine성 신경세포의 주 입력구조물인 medial septum,

nucleus basalis등에 ibotenic acid (a glutamate analogue) 국소 주입에 의한

손상 또는 Medial septum, nucleus basalis부위에 192 IgG-saporin (a highly

specific immunotoxin against cholinergic neurons), amyloid beta peptide

25-35 (20㎍) 국소 주입에 의한 손상모델, 또는 acetylcholine 길항물질인

scopolamine(1-4mg/kg, s.c)을 이용. 이들 손상집단에게 선정된 식품을 투여.

실험군은 쥐에 sodium pentobarbital (50mg/kg, i.p.)로 마취시킨 후 입체정위

수술장치 (stereotaxic apparatus)를 이용하여 내측 중격(AP:-0.2, L: ±0.3,

H:-6.2)위치에 ibotenic acid, (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 양쪽으로 4㎍씩

주입하였음. 192 IgG-saporin은 동일 부위에 양쪽으로 1㎍ 씩, amyloid beta

peptide 25-35은 20㎍ 투여함. 미세주입은 1㎖ gas-tight glass syringe(Hamil-

ton, Reno, NV, USA)에 polyethylene 튜브로 연결하여 perfusion pump (Pump 22,

Harvard Apparatus, South Natick, MA, USA)를 이용하여 0.2㎕/min 유속으로 1㎕

주입 후에 5분간 방치한 다음 syringe를 제거. 각각 손상군에 대한 약물처치는

그 다음날부터 시행. 대조군은 손상약물 대신 145mM NaCl, 2.7mM KCl, 1.2mM

CaCl2, 1.0mM MgCl2로 만든 인공 뇌척수액을 같은 방식으로 주입함.

나. 혈관성 기억감퇴모델인 중대 뇌동맥 폐색(MCA)에 의한 쥐의 동물모델

일시적인 국소 뇌허혈은 중대뇌동맥을 폐색시켜 만들었다. 실험동물을 70%

N2/30% O2와 혼합된 5% isoflurane을 이용하여 흡입마취 유도를 한 후, 2%

isoflurane으로 마취상태를 계속 유지시켰다. 흰쥐의 직장에 체온측정 probe를

삽입하고 가온등과 가온 메트리스를 이용하여 실험기간 동안 체온을 38℃로 유지

하였다.

중대뇌동맥을 폐색하기 위하여 경부 정중선을 따라 피부를 절개하고 흉골혀근과

흉골저작근 사이에 총경동맥을 노출한 후 내경동맥내로 intraluminal filament

(￠0.28mm, rounded tip)을 삽입하여 그 끝이 중대뇌동맥의 기시부를 지나 전대

뇌동맥의 근위부까지 도달하도록 하였다. 총경동맥과 외경동맥은 결찰하고 혈류

차단 2시간이 지난 후 filament를 제거하고 우측 총경동맥을 결찰하여 측부 순환

을 통하여 재관류 하도록 하였다.

다. 조직염색법을 통한 뇌 조직의 손상 확인

뇌 손상 유발 부위의 확인을 위하여 우선 조직 염색 이전, 고정을 위해 몇가지

buffer를 준비함. formaiin buffer는 100㎖ formalin (37%), 900㎖증류수, 6.5g

Na2HP4 (dibasic) 4g NaH2PO4HCl (monobasic)을 mixing하여 만들고, 생리식염수

9g의 NaCl을 증류수 1ℓ 에 녹여서 준비. 다음으로 Pre-stain solution으로 증류

수, 70% alcohol, 95%alcohol, 100% alcohol, xylene 용액을 갖추고, 끝으로 염

색용 solution인 cresyl violet solution (cresyl violet acetate 0.5g)을 제조.

Buffer를 모두 준비한 뒤, 본격적인 조직 검사에 들어가기 앞서서 고정을 위한

생리식염수와 formalin buffer를 각각 4ℓ 증류수 통에 넣어 peristaltic pump

(Ismates ISM22IC)에 연결하여 tube를 통해 관류할 수 있도록 한 뒤 복부에

sodium pentobarbital을 80mg/kg을 주사하여 마취시킨 뒤 수술대에 고정하여 흉곽

을 열고 descending aorta를 결찰시킴. 심첨 부위에 첨자하여 먼저 생리식염수를

300㎖/min의 유속으로 흘려서 혈액을 씻어낸 뒤, 처음에는 formalin buffer를 300

㎖/min의 유속으로 충분히 관류한 뒤 130㎖/min의 유속으로 흘린다. 두개골로부터

뇌를 분리하여 formalin buffer에 2시간동안 고정해 두었다가 20% surose에 넣어

서 4℃에서 overnight해 둔다. 미세절편기를 이용하여 뇌로부터 30㎛의 뇌절편을

만들어 뇌를 염색하기 이전 증류수 (5min), 70% alcohol (5min) 100% alcohol

(5min), 95%a alcohol (5min),70% alcohol(5min), 증류수(5min)순 으로 담구어서

탈지, 탈수를 시킨 뒤, cresyl violet buffer로 염색을 하였음. 염색이 끝난 조

직은 광학현미경으로 관찰. Paxinos와 Watson의 Atlas에서 주어진 coordinate를

참고하여 해마, 내측 중격과 기저핵의 뇌손상 부위를 확인하였으며 위와 동일한

방법으로 약물의 신경세포 보호효과를 조직 염색법을 이용하여 평가함.

라. 기능성 식품들의 학습 및 기억에 미치는 영향 (행동검사)

Morris 수중 미로의 장치 및 절차

기억감퇴를 위한 손상유발후 3주동안 식품을 투여한 다음 행동검사를 실시함. 동

물수중미로로 이용되는 수조는 직경이 180cm 높이가 50cm인 원형 통으로 온도가

22 ± 2℃되는 물이 30cm 높이로 채워짐. 수중 미로의 주변은 비디오 카메라, 실

험대, 실험대 위에 있는 수온 조절용 장치 등 공간단서들을 일정하게 유지함. 도

피대는 직경이 12cm인 원형 투명 아크릴에 받침대를 부착하고, 수면보다 1.5cm낮

게 위치시킴. 수중미로는 4개의 동일한 사분원으로 나누어져서 북동 (NE), 북서

(NW), 남동 (SE), 남서 (SW)로 구분되고 이중 북동 사분원의 중심부에 도피대가

놓여지고, 나머지 중 하나가 출발위치로 사용된다. 쥐를 하루에 4시행씩 7일간

훈련을 받으며 7일째 마지막 시행이 끝나면 자유수영 검사시행이 삽입되는데, 동

물들은 도피대가 제거된 채로 60초간 수영을 하게된다. 모든 동물들의 행동은 비

디오 카메라로 녹화되는데, 훈련 시행에서는 출발에서부터 도피대로 올라가는데

걸린 시간을 측정하고, 60초간의 검사시행에서는 훈련시에 도피대가 있었던 사분

원에 머문 시간을 측정.

(Morris water maze)

방사형 미로의 장치 및 절차

투명한 아크릴로 제작된 8개의 통로가 중앙이 출발영역 (cenrral platform)을 중

심으로 매 45도 각도 (방사형)로 뻗어 나온 형태의 장치가 이용된다. 중앙 출발

영역은 직경 38cm 인 원해 내접하는 정팔각형 상자로 높이는 30cm이다. 주로는

출발상자의 각 면에 뚫린 9X9cm 크기의 통로와 연결되어 있으며, 길이는 70cm이

고 뚜껑이 있어서 동물이 바깥으로 나가지 못한다. 주로의 끝에는 보상으로 제공

하는 먹이나 물을 담을수 있는 5X5X2cm크기의 용기가 설치되어 있다. 각 주로의

출발 지점으로부터 15cm되는 지점에 각각 주로의 끝에서 8cm되는 지점에 각각 광

전탐지기를 부착하여 동물이 주로 출입행동을 탐지하도록 함. 주로에 장치된 광

전탐지기에 동물의 움직임이 감지되면 이 신호가 컴퓨터 인터페이스를 거쳐 디지

털 값으로 변화된어 컴퓨터의 I/O port 입력됨. 컴퓨터에서는 이 신호를 기초로

하여 쥐의 각 주로를 방문횟수와 오류 여부가 계산되고 그 값이 저장됨. 이를 이

실험에 들어가기전 36시간 동안 사육상자에서 먹이를 박탈하고 배고픔을 유발시

킨 쥐를 행동 관찰실로 옮겨와 30분간 환경에 적응 시킴. 보상용기에 먹이를 두

고 주로로 통하는 통로를 닫음. 쥐를 미로의 출발상자에 넣고 1분간 두어 상황에

적응시킴. 이분이 지나면, 각 주로로 통하는 통로를 개방하여 모래쥐가 자유롭게

미로속을 돌아다니게 됨. 쥐가 주로를 방문하여 끝까지 달리면 보상 용기에서 소

량의 먹이를 먹을 수 있게 됨. 그러나 동일한 주로를 반복해서 방문하면 두 번째

방문부터는 먹이가 제공되지 않고, 반응은 오류로 기록됨. 5분동안에 8개 주로를

모두 방문하지 못하면 시행을 중지시키고, 그 시행은 실패로 간주한다. 동물이

학습준거에 도달하는 경우 24시간 후에 기억검사를 실시.

(Radial arm maze task)

수동적 회피과제에서의 기억능력 측정

동물의 학습 및 인지 능력을 알아보기 위하여 미로형 장치가 광범위하게 이용되

고 있지만, 미로 학습으로는 명시적 기억 (explicit memory)을 알아보는 것이 곤

란하다는 지적이 있었고, 이러한 맥락에서 수동적 회피 과제에서의 학습과 기억

에 대한 연구가 설치류를 대상으로 꾸준히 진행되고 있음. 수동적 회피 훈련 과

정에서 실험동물은 자발적 행동에 대해 즉각적인 처벌을 받게 됨. 흔히 이용되는

절차로는, 높은 곳에서 아래 쪽으로 내려왔을 때, 바닥의 스테인레스 스틸 격자

를 통해 발바닥에 전기 쇼크를 가하는 방법과, 밝은 곳에서 어두운 곳으로 이동

해갔을 때 마찬가지로 전기쇼크를 주는 방법이 선호되고 있음. 전자의 경우를

‘ step down' 절차라 하고, 후자의 경우를 ’ step through'절차라 칭하기도 함.

이와 같은 방식으로 혐오적 경험을 하게 한 뒤, 실험동물은 일정시간 경과후 재

차 동일한 상황에 놓이게 됨. 이때 과거에 있었던 혐오적 사건에 대한 기억은 실

험동물이 자발적 행동을 얼마나 억제하느냐로써 측정할 수 있게 됨. 즉, 실험동

물들은 처음 놓여진 위치에서 가만히 있는 것으로써 학습과 기억 여부를 보여주

게 됨. 수동적 회피 절차의 장점은 단 1회 시행으로도 회피를 학습할 수 있으며,

따라서 새로운 학습의 획득이 일어나는 시간을 비교적 분명하게 측정할 수 있다

는 것임. 또한, 대부분의 미로 학습과는 달리 장기간의 먹이 박탈이 필요하지 않

다는 것도 수동적 회피 절차의 장점이라 할 수 있음.

수동적 회피 절차는 학습과 기억의 연구에서 다양한 목적으로 이용되고 있지만,

주로 노화 (aging)나 중풍 연구에서 기억의 결함을 알아보고자 할 때 많이 적용

되고 있음. 본 연구에서는 허혈성 중풍 환자들이 호소하는 기억력 감퇴의 문제에

대한 실험적 검증을 위하여 전뇌허혈성 모래쥐 중풍모델에서의 수동적 회피 학습

능력과 기억 능력을 알아보고자 하였고, 본 연구에서 이용된 수동적 회피 절차는

Essman과 Essman (1971)의 방법을 응용한 것임.

- 실험 장치

수동적 회피 과제를 위한 장치는 전형적인 조건화 장치를 약간 변형함으로써 쉽

게 완성할 수 있음. 본 연구에서는 스테인레스 스틸 봉 (직경 4.5mm)이 9mm 간격

으로 배열된 grid 바닥의 28×23.5×20cm의 조건화 상자에 출입문과 플랫폼을 설치

함으로써 수동적 회피 과제를 위한 장치를 제작하였음. 조건화 상자의 3벽면과

천장은 2mm 두께의 스틸로 되어 있으며, 나머지 한 벽면은 검정 아크릴로 되어

있어, 아크릴의 아래 정면에 6×6.5cm의 출입문을 장착하였음. 출입문은 위 아래

로 움직이는 sliding door 방식이며, 도르래가 연결되어 있어 실험자의 조작에

의해 쉽게 열리고 닫힐 수 있게 만듬. 출입문과 바로 연결된 플랫폼 역시 검정

아크릴로 제작하였으며, 폭이 5cm 길이가 18cm임. 플랫폼 위에는 100W 백열등과

스위치를 설치하여 실험자의 조작에 따라 강한 조명이 가해지도록 하였고, 쥐가

플랫폼에 있을 때 전구의 위치는 쥐 머리 위로 약 6-7cm 되는 지점에 위치하였

음. 바닥의 grid에는 AC 가변전원 전기충격발생기를 연결하여 5V/0.25mA의 발바

닥 전기 쇼크가 가해지도록 하였음. 전기충격발생기에는 타이머를 부착해 스위치

를 누르면 원하는 시간 동안 전기 쇼크가 가해지도록 장치하였음.

- 조건화 절차 및 파지 검사

치매유발 후 3주 동안 약물을 처치한 후 수동적 회피 조건화를 실시하였음. 수동

적 회피 조건화 절차와 파지 검사 절차는 다음과 같음. 조건화에 앞서 쥐들은 사

육실에서 수동적 회피 장치가 있는 방으로 옮겨져 30분 동안 적응하도록 함. 조

건화 절차는, 1차례의 적응 시행과 2차례의 회피 시행, 그리고 1차례의 학습 시

행으로 구성되는데, 적응 시행에서는 쥐들을 출입문이 닫힌 조건화 상자 속에서

1분간 머무르게 하였음. 그런 다음, 회피 시행에서는 쥐들을 플랫폼 끝부분 난간

에 꼬리가 회피 상자쪽으로 향하게 하여 올려 놓은 다음, 100W 백열등을 켬과 동

시에 회피상자의 출입구를 열어 주었음. 이때부터 실험동물이 180°회전하여 상자

안으로 완전히 도피하는데 소요되는 시간을 측정하여 반응 시간 기준치로 삼음.

이와같은 회피 훈련을 한 차례 더 반복하고 난 후, 세 번째 시행(학습 시행)에서

는 실험동물이 어두운 조건화 상자로 들어가는 즉시 출입문을 닫고 5V/0.25mA의

직류전기를 10초간 가하였음. 첫 번째 전기자극 후 쥐들을 계속 조건화 상자 안

에 머물게 하였고, 30초 후 다시 한번 5V/0.25mA의 직류전기를 10초간 가해 주었

음. 두 번째 전기자극을 가하고 나서 30초 후에 쥐들을 조건화 상자에서 꺼내,

다시 플랫포옴의 끝에 올려놓고 검사 시행을 실시하였음. 쥐가 플랫폼에 놓임과

동시에 백열등을 켜고 조건화 상자로의 문을 개방하고, 이때부터 쥐가 180°회전

하여 다리와 꼬리가 완전히 조거화 상자로 들어가는데 소요되는 반응 시간을 측

정하였음. 이는 전기자극에 대한 수동적 회피를 학습하였는지 여부를 확인하기

위한 제 1차 파지 검사 시행이 되며, 쥐가 2차 전기자극을 경험한 후 최소한 40

초가 경과되었을 때 실시된 것이므로 40초 파지검사에 해당 됨. 이상과 같은 수

동적 회피훈련을 실시한 후 나머지 4주 동안 중풍처치와 한약물을 투여하면서 계

속 2차, 3차, 4차, 5차, 6차 파지 검사를 실시함. 2차 파지 검사는 수동적 회피

훈련 24시간 후에 실시되었고, 3차∼6차 파지검사는 수동적 회피 훈련 후 각각 1

주일, 2주일, 3주일, 4주일이 경과한 시점에서 실시하였음. 모든 파지 검사의 절

차는 1차 파지 검사와 동일한 방법으로, 부적 강화에 대한 기억 정도를 측정하였

음. 매 파지 검사에서 쥐가 조건화 상자로 들어가는데 소요되는 반응 시간은 최

대 90초로 정함. 즉, 쥐들은 90초 동안 플랫폼에 머물 경우 완전한 수행을 한 것

으로 간주되고, 곧바로 개별장에 되돌려 보냄.

(Passive avoidance task)

Operant conditioning (Skinner box; 스키너 상자)

동물 (주로 쥐 ·비둘기)의 자발적 행동을 분석하기 위한 실험 장치로서 B.F.스키

너가 고안하였다. 상자 안쪽 벽에 레바가 있어 그것을 누르면 밑에 있는 먹이통

에서 보수로서 먹이가 나온다. 이 보수를 얻는 것이 강화 (强化)되어 쥐는 레바

누르기를 학습하게 된다.

비둘기를 쓸 때는 레바 대신 표적을 만들어서 이것을 쪼으면 먹이가 나온다. 이

본체와는 따로 급이장치가 있어서 레바 (또는 표적)를 조작하면 작동한다. 더욱

발전된 제품에서는 프로그램용 부속장치를 연결시켜 여러가지 강화 스케줄을 짤

수 있도록 되어 있다. 예를 들면, 4-5일 사이에 모든 쥐가 스스로 레바를 눌러서

먹이를 먹을 수 있게 되었다. 하루 한번, 20분 동안에 40개 이상의 먹이를 집을

수 있게 되면 먹이를 얻는 방법을 수료했다고 판단, 다음 실험으로 들어간다. 다

음 실험에서는 밝기를 수시로 바꾸어 주면서 레바를 누르면 먹이를 얻을 수 있지

만 어두울때에는 (밝을 때 빛의 1/1000의 밝기) 레바를 눌러도 먹이를 얻을 수

없는 조건으로 한다. 처음 며칠은 밝기의 식별이 불가능하기 때문에 반응 횟수는

똑같이 증가한다. 그러는 동안, 어두울 때에는 레바를 눌러도 먹이를 얻을 수 없

음을 확인하고, 쥐는 레바를 누르지 않게 된다. 고로 누르는 횟수가 일정치에 달

한 후에는 줄어 들어드는 정도를 살펴봄으로서 학습능력를 측정한다. 자발적 반

응과 강화의 유무는 기록장치에 의하여 자동적으로 누적 기록된다. 같은 원리로

원숭이나 어린이들의 행동분석에도 쓰인다.

그 외 행동실험

(cerebellar-dependent tasks show age-related deficits)

Eyeblink classical conditioning paradigm

Elevated plus maze

Acoustic startle response

Prepulse inhibition

Rotorod

마. 기억감퇴 동물 모델에서의 Biomarker에 관한 연구

학습과 기억손상은 대뇌의 측두엽, 전두엽, 두정엽의 일차연합령 (primary asso-

ciation area)이 담당하고 있으며, 해마와 편도핵도 중요한 역할을 한다. 특히

해마의 CA1 부위에서 추체세포 (pyramidal cell)들이 선택적으로 손상되면 학습

과 기억의 장애가 심각하게 나타난다. 아세틸콜린 (Acetylcholine), 도파민 (do-

pamine), 세로토닌 (serotonine), GABA의 경우에는 노화에 따라 감소하는 것으로

알려져 있는데, 그 중 Alzheimer's disease (AD) 환자에 있어서 시냅전 신경 표

지자 (presynaptic neuronal marker)의 생성에 관여하는 효소, 특히 콜린 아세틸

트랜스퍼라제 (choline acetyltransferase, ChAT)의 활성도가 측두엽의 신피질

(neocortex), 내측중격과 편도등에서 약 50∼90% 정도 감소한다. 또한 AD의 1차

증상인 기억력 손상 증상은 콜린성 신경계와 밀접한 관계가 있다는 증거가 다양

하게 제시되고 있는데, AD에서 나타나는 기억력 상실과 다른 인지 결함이 신호를

전달해 주는 화학물질인 아세틸콜린 (acetylcholine)을 만들어 내는 신경세포의

퇴화 때문이라고 설명할 수 있으며 실험적인 예로 쥐에게 내측중격 (medial

septum)과 NBM (Nucleus Basalis Magnocellularis) 부위에 이보테닉산 (ibotenic

acid)을 주입하였을 때 각각 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (choline acetyltransfer-

ase)의 활성이 감소하였다고 보고된 바 있다. 또한 아세틸콜린 (acetylcholine)

이 해마에서 줄어드는데 현재 치매의 치료제로써 아세틸콜린에스테라제 (acety-

lcholinesterase)를 억제하여 해마내에서의 아세틸콜린의 작용을 증진시키려는

시도가 이루어지고 있다. 따라서 본 연구에서는 아세틸콜린성 신경세포가 주로

위치하는 내측중격 (medial septum)에 신경몀역독소인 192사포린을 주입함으로서

직접적으로 중추신경을 파괴하여 약물을 투여한 후 세포보호효과를 MS내에서 시

냅전 신경 표지자 (presynaptic neuronal marker)의 생성에 관여하는 효소인 콜

린 아세틸트랜스퍼라제 (choline acetyltransferase, ChAT)의 활성도로 관찰하고

자 함.

Medial septum, hippocampus 부위에서 ChAT (choline Acetyltransferase) 면역화

학조직염색을 통한 acetylcholine성 신경세포 관찰

모든 행동 실험이 끝난 직후 실험동물을 sodium pentobarbital (100mg/kg, i.p.)

로 마취시키고 saline 100㎖에 이어 phosphate buffer로 준비한 4% formalin 고

정액 (fixative) 900㎖로 심장을 통해 관류함. 처음 고정액 200㎖은 5분간 빠른

유속으로, 그리고 나머지 700㎖은 25분간 천천히 관류함. 그 다음 뇌를 꺼내 같

은 고정액으로 2∼3시간동안 고정시키고 20% sucrose가 함유된 인산완충액 (PBS)

에 넣어 4℃에서 하루동안 보관. 다음날 뇌를 급속 냉동한 후 microtome (Leica,

CM1850, Germany)을 이용하여 뇌 조직을 배측 (dorsal)과 복측 (ventral)의 해

마, 내측 중격 부위에서 30㎛의 두께로 자른 다음 PBS로 조직을 몇 차례 씻은 후

ChAT 유전자 발현 연구에 가장 널리 사용되고 있는 primary sheep polyclonal

ChAT antibody (Cambridge Research Biochemicals, Wilmington, DE, USA)를 사

용. 1차 항체는 PBS에 0.3% Triton X-100 첨가한 PBST에서 2% 토끼 혈청과 0.1%

sodium azid (Sigma, St. Louis, MO, USA)로 2000배 희석하여 준비하였음. 뇌 조

직은 1차 항혈청에 4℃에서 72시간동안 지속적으로 흔들어 주면서 배양. 그 후 3

번 이상 조직을 PBST로 씻은 다음 2시간동안 실온에서 2% 토끼 혈청을 함유하는

PBST에서 200배 희석한 biotinylated anti-sheep serum (Vector Laboratories,

Burlingame, CA, USA)에 반응시킴. PBST로 3번 씻은 다음, 뇌 조직은 실온에서 2

시간 동안 Vectastain Elite ABC reagent (Vector)에 담굼. PBS로 몇 번 헹군 다

음 조직을 nickel chloride로 강화시키고 착색제로서 diaminobenzadine (DAB)을

사용하여 발현시킴.

모든 처리를 거친 뇌 조직을 gelatine-coated slide에 고정하고 공기를 제거하면

서 커버글라스를 덮은 후 현미경으로 관찰하였다. 200×200 ㎛ 크기의 microscope

4각 격자 (rectangle grid)를 사용하여 200배로 확대하여 내측 중격과 해마에서

ChAT-immunoreactive 신경세포의 수를 측정.

Hippocampus에서 AChE (Acetylcholineterase) 조직염색법을 통한 acetylcholine의

활성 관찰

뇌 조직을 PBS에 3회 정도 세척한 후 0.1M sodium hydrogen phosphate

buffer(NaH2PO4H2O, pH 6.0) 325㎖에 acetylcholine iodide 250㎎을 녹인 용액에

0.1M sodium citrate 25㎖, 30mM copper sulfate 50㎖, 5mM potassium ferricya-

nide 50㎖, 증류수 50㎖을 넣어 혼합한 후 수초간 기다리면 엷은 녹색을 나타내

는데 이때 뇌 조직을 넣고 실온에서 1∼2시간동안 배양. 모든 처리를 거친 뇌 조

직을 slide에 고정하고 공기를 제거하면서 커버글라스를 덮은 후 현미경으로 관

찰. 200×200 ㎛ 크기의 microscope 4각 격자 (rectangle grid)를 사용하여 100배

로 확대하여 해마에서 AchE 신경세포의 밀도를 Scion image program (Scion

Corp. MD, USA)을 이용하여 측정.

Cresyl violet 염색법

모든 행동 실험이 끝난 직후 실험동물을 sodium pentobarbital (80mg/kg, i.p.)

로 마취시킨 후, 0.9% saline 200㎖에 이어 phosphate buffer으로 준비한 4%

formalin 용액 (fixative) 800㎖로 심장을 통해 관류하였다. 처음 고정액 200㎖

은 2분간 빠른 유속으로, 그리고 나머지 800㎖은 25분간에 걸쳐 천천히 관류하였

다. 고정이 끝난 쥐는 뇌를 꺼내 같은 고정액으로 2시간 동안 후고정시키고, 20%

sucrose가 함유된 phosphate beffered saline (PBS)에 넣어 4℃에서 하루 동안

보관하였다. 다음날 뇌를 급속 냉동한 후 뇌조직에서 hippocampus 부위를 30㎛의

두께로 자랐다. PBS로 조직을 몇 차례 씻고 xylene (5min), 100% alcohol

(2min), 95% alcohol (1min), 70% alcohol (1min), D.W. (2min) 순으로 담구어

탈지, 탈수를 시킨 후, cresyl violet buffer (5min)로 염색을 하였다. 염색이

끝난 조직은 고배율 (×200)에서 광학현미경으로 관찰하였다. Paxinos와 Watson의

atlas에서 주어진 coordinate를 참고하여 probe의 위치를 확인하였으며, 신경세

포수를 관찰하였다.

기타 검사

- In vivo microdialysis ; 살아있는 동물로부터 해마 등 기억과 관련된 뇌조직에

서의 아세틸콜린의 양을 측정하기 위하여 직접적으로 뇌부위에 guide cannula를

삽입하는 수술 후에 probe를 통하여 얻은 in vivo sample (dialysate)로부터

HPLC를 이용하여 아세틸콜린을 정량한다.

- Hippocampus에서 immediate-early gene인 c-Fos 면역조직화학 염색을 통한 신

경세포의 활성 관찰한다.

- Hippocampus에서 NADPH-d 염색법을 이용한 NO의 활성과의 상관성 규명한다.

- 그 외 분자생물학적 방법을 동원한다.

3. 학습 및 기억능력 향상 기능식품에 관한 평가모델의

실제 수행

(1) Cold water immersion stress

가. 육미지황탕이 정상과 찬물에 빠진 흰쥐의 해마 치상회에서 신경세포생성에 미

치는 영향

본 연구에서는 찬물에 빠뜨린 흰쥐의 해마 치상회에서 육미지황탕이 신경세포 생

성에 미치는 영향을 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) 면역조직화학법으로 실험하

였다. 5분간 찬물 (4℃)에 빠뜨린 흰쥐의 해마치상회에서는 신경세포의 생성이

급격히 감소한 반면 육미지황탕을 처치한 쥐에서는 찬물 스트레스에 의하여 감소

된 신경세포의 생성을 정상으로 증가시켰다. 육미지황탕은 물에 빠지지 않은 쥐

에서도 신경세포의 생성을 증가시켰다. 본 실험의 결과 육미지황탕은 정상상태에

서도 신경세포의 생성을 증가시키고 또한 급작스러운 스트레스 시에도 신경세포

의 생성을 증가시켜 스트레스에 의한 기억상실을 치료하는 효과가 있음을 보여주

었다.

Table 1. Numer of5-bro

groupsNumber of BrdU-positive cells in dentate gyrus/mm2

control group 129.43 ± 11.2710 mg/kg Liuweidihuang-tang-treated group 213.43 ± 21.34*.#50 mg/kg Liuweidihuang-tang-treated group 252.86 ± 12.43*.#cold water immersion group 85.14 ± 6.46*

cold water immersion and 10 mg/kg Liuweidihuang-tang-treated group

183.14 ± 19.01#

cold water immersion and 50 mg/kg Liuweidihuang-tang-treated group

214.29 ± 7.93*,#

mo-2'-deoxyuridine (BrdU)-positive cells in each group

Cell proliferation in the dentate gyrus was suppressed significantly by cold

water immersion, and Liuweidihuang-tang treatment increased cell proliferation

both under the normal and cold-water immersion conditions. * represents P < 0.05

compared to the control group. # represents P < 0.05 compared to the cold water

immersion group.

Fig. 1. Effect of Liuweidihuang-tangon cell proliferation in the dentate

gyrus of normal rats

Above: Photomicrographs of BrdU-positive cells in the dentate gyrus in each

group. Sections were stained for BrdU (black). Scale bar represents 100 μ m.

Below: Number of BrdU-positive cells per mm2 of cross-sectional area in the

dentate gyrus in each group. A, control group; B, 10 mg/kg Liuweidihuang-tang-

treated group; C, 50 mg/kg Liuweidihuang-tang-treated group. * represents P <

0.05 compared to the control group.

Fig. 2. Effect of Liuweidihuang-tang on cell proliferation in the dentate

gyrus of cold water-immersed rats

Above: Photomicrographs of BrdU-positive cells in the dentate gyrus in each

group. Sections were stained for BrdU (black). Scale bar represents 100 μ m.

Below: Number of BrdU-positive cells per mm2 of cross-sectional area in the

dentate gyrus in each group. A, cold water immersion group; B, cold water

immersion and 10 mg/kg Liuweidihuang-tang-treated group; C, cold water

immersion and 50 mg/kg Liuweidihuang-tang-treated group. * represents P < 0.05

compared to the cold water immersion group.

(2) Passive avoidance test

가. 육미지황탕가미방이 치매유발 흰쥐의 기억력 감퇴 예방에 미치는 영향

수동회피실험을 위해 제작된 왕복상자는 GEMINI Avoidance System (San Diego

Instruments, USA)의 모델을 바탕으로 크기를 60cm × 20cm × 20cm로 변경하여 아

크릴 판을 중심으로 동일한 크기의 두 방으로 나뉘어 있으며, 두 방을 나누는 벽

에는 가로, 세로 각 10cm인 단두대 형식의 문이 있어 외부에서 상하로 열고 닫을

수 있게 하였다. 좌측 방의 뚜껑에는 매우 밝은 (250W) 나트륨 전구를 달아 실험

동물이 싫어하는 매우 밝은 환경을 조성할 수 있게 하였다. 우측 방의 바닥에는

전기충격을 실험동물의 발바닥에 가할 수 있도록 밑면에 스테인레스 봉을 이용한

통전장치를 설치하였고 AC 가변전원 전기충격발생기를 이용하여 2.0mA의 전기충

격을 가할 수 있게 하였다. 좌측 방의 밝기를 증가시키기 위해 좌측 방의 벽은

알루미늄 호일로 코팅하여 빛의 반사를 최대화하였으며 우측 방은 무광의 검은

색으로 칠하였다. 실험동물이 어느 방에 있는지를 살피기 위해 밖에서 안을 살필

수 있도록 높이 1cm의 작은 반투명 창을 만들었다 (정도산업, 서울).

정상군 (Normal 군), scopolamine 투여군 (SCO 군), YMG 투여 후 scopolamine 투

여군 (SCO+YMG 군)의 3개의 군으로 나누고 각 군 당 5마리씩 실험을 진행하였으

며, 정상군은 정상상태의 흰쥐에게 특별한 처치 없이 물과 사료를 충분히 공급한

후 학습과 기억검사를 실시하였고, SCO 군은 정상상태의 흰쥐에게 최초의 기억

검사를 실시하기 전 5일간 실험동물에게 1ml의 normal saline을 복강 투여하였으

며 최초의 학습이 끝난 후 24시간 뒤 2일째 학습의 1시간 전에 scopolamine을 실

험동물의 체중 100g 당 0.1mg이 투여되도록 normal saline 1ml에 용해시켜 복강

투여하고, 학습 2일째 실험 후 아무런 처치 없이 24시간 동안 물과 사료를 충분

히 공급하고 retention test를 시행하였다. SCO+YMG 군은 정상상태의 흰쥐에게

최초의 기억검사를 실시하기 전 5일간 실험동물의 체중 100g 당 1mg 의 YMG를

1ml의 normal saline과 함께 복강 투여하였으며 최초의 學習이 끝난 후 24시간

뒤 2일째 학습의 1시간 전에 scopolamine을 실험동물의 체중 100g 당 0.1mg이 투

여되도록 normal saline 1ml에 용해시켜 복강투여하고, 학습 2일째 실험 후 아무

런 처치 없이 24시간 동안 물과 사료를 충분히 공급하고 retention test를 시행

하였다.

학습은 2일 동안 진행되었다. 실험 시작 1시간 전에 실험동물을 행동관찰실로 옮

기고 약물을 투여한 후 안정시켰다. 학습 1일째, 왕복상자의 좌측 방의 불을 켜

고 좌 우측 방을 막고 있는 문을 개방한 후 실험동물을 꼬리가 문쪽으로 향하게

하였다. 실험동물은 방을 탐색하다가 본능적으로 어두운 우측 방으로 이동하게

된다. 우측 방으로 이동하면 1분간 우측 방을 탐색하게 한 후 실험동물을 꺼내었

다. 상기 방법을 2회 반복하여 우측 방이 상대적으로 편안함을 학습시켰다. 학

습 2일째, 왕복상자의 좌측 방에 불을 켜고 실험동물을 꼬리가 문쪽으로 향하게

위치시키면 실험동물을 곧바로 우측 방으로 이동하게 된다. 이때 문을 닫고 우측

방의 바닥에 장치된 전기충격장치를 이용하여 실험동물의 발바닥에 2.0 mA의 전

기충격을 5초간 주고, 4초 후 문을 열어주면 실험동물은 곧바로 좌측 방으로 이

동하게 된다. 상기의 방법으로 우측 방에는 강력한 전기자극이 있음을 학습시켰

다. 기억 검사는 2일째의 학습이 끝난 후, 24시간 후에 실시하였다. 왕복상자의

좌측 방에 불을 켜고 문을 개방한 후 실험동물의 꼬리가 문 쪽으로 향하게 하였

다. 실험동물의 기억능력이 우수할 수록 학습 2일째 경험했던 강력한 전기자극을

기억하고 우측 방으로 진입하는 것을 꺼리게 된다. 앞발과 뒷발 모두가 우측 방

으로 들어간 시간을 측정하였고 측정시간은 초 단위로 기록하며 600초 이상이 경

과될 경우에는 600초로 기록하였다.

Table 2. The retention latency of passive avoidance response

No. of Rat Normal SCO SCO+YMG

retention

latency

(sec)

1 600 204 532

2 600 153 330

3 516 86 120

4 600 65 560

5 580 120 507

Mean+STD

(sec)579.2±36.38 125.6±55.16 409.8±185.27

The retention test was performed 24 hrs after training session.

Fig. 3. The retention latency of passive avoidance response. The retention

test was performed 24 hrs after training session

Normal, group of rats without any treatments (n=5); SCO, group of rats injected

i.p. with 1ml of normal saline for 5 days before 1st training session and 1mg/kg

of scopolamine suspended in 1ml of normal saline after the session (n=5), then

24hrs after, estimated the retention latency; SCO+YMG, group of rats injected

i.p. with 10mg/kg of YMG suspended in 1ml of normal saline for 5 days before 1st

training session and then followed the same schedule of SCO group (n=5).

Error bars represent means ±SEM of retention latencies. Comparisons were made

by using One-way ANOVA with Dunnett's comparison post hoc test.

##, P<0.001 vs. Normal group; **, P<0.001 vs. SCO group.

(3) 사상관련전위 (Event Related Potential: ERP), 청각 oddball

paradigm 및 연속재인과제

가. 육미지황탕가미방이 정상인의 기억력, 집중력 향상에 미치는 영향에 관한 임

상실험

피험자는 외부 소음이 차단된 전자기 차폐실의 안락한 의자에 앉은 후 나이, 시

력, 청력 등에 관한 간단한 질문에 답하였고, 이어서 실험자가 전극을 부착했다.

과제 수행에 앞서 5분 정도 EEG를 측정하면서 충분히 안정시킨 후, oddball 과제

와 연속재인과제를 수행하면서 ERP를 측정하였다. Grass 모델 12를 사용하여 뇌

파를 측정증폭하였다. Ag/AgCl 전극을 국제표준 10-20 체계에 근거하여 일곱 군

데 (Fz, Cz, Pz, F3, F4, P3, P4)에 부착하였다. 눈 깜박임을 탐지하기 위해서

왼쪽 눈 위와 아래 약 5mm에 각각 전극을 부착하여 수직 방향으로 안전도 (EOG)

를 측정하였다. 모든 전극의 임피던스는 10㏀ 이하를 유지하도록 하였다. 기준

전극은 피험자의 한 쪽 귓불에 부착하고 접지 전극은 이마의 중앙에 부착하였다.

샘플링은 500Hz로 (oddball 과제는 250Hz) 이루어졌고, 온라인 상에서 하드웨어

필터를 통해 0.1 -100Hz 범위에서 대역 여파한 후, 오프라인에서 LabVIEW 6.i의

버터워스 (Buttterworth) 필터 함수를 통해 다시 한번 0.1-30Hz 로 여파하였다.

EOG의 범위가 200μ V를 넘어서는 경우에는 분석에서 제외하였다. oddball 과제의

경우에는 각 시행별 ERP 기록 시간이 자극 제시 전 100ms를 포함하여 1500ms이었

고, 연속 재인 과제의 경우는 자극제시전 100ms를 포함하여 1100ms이었다.

청각 oddball paradigm 실험상 피험자의 과제는 85dB 크기로 제시되는 1000Hz의

표준자극과 1500Hz의 목표자극 중에서 목표 자극의 개수를 세는 것이었다. 각각

의 자극 제시 시간은 300ms이고, ISI (Inter Stimulus Interval)는 1500ms이었

다. 전체 200시행 중 목표 자극은 25% 제시되고, 표준 자극은 75% 제시되었으며,

두 자극의 제시 순서는 무선적으로 배열되었다. 피험자는 전체 시행 시간동안 발

화나 신체적 움직임 없이 내적으로 목표자극의 회수를 세어서 실험 종료 후 구두

로 보고하였다.

Oddball 과제 분석을 위해서는 1, 2 회기 모두에서 잡음이 섞이지 않은

(artifact-free) 자료를 얻을 수 있었던 피험자들의 자료만을 사용하였다. 분석

에 사용된 피험자의 수는 각 집단 별로 13명 (YMG-1 집단), 10명 (YMG-2 집단),

13명(통제 집단)이었다. P300은 300ms 이후 나타나는 가장 큰 정적인 피크로 정

의하였다. 채널과 회기를 각각 반복 측정 요소로 설정하고 진폭과 잠재기에서 나

타나는 집단 간 차이를 비교하였다. 반복 측정 결과는 Greenhouse-Geisser의 ε

값으로 보정하였다. 집단 간의 차이는 Student-Newman-Keuls 기법으로 사후 검증

하여 동질성을 확인하였다. 아래 그림은 각 회기별 전 집단의 ERP 그래프를

Grand averaging한 것이다.

Fig. 4. Session 1 Grand

average at Cz site

Fig. 5. Session 2 Grand

average at Cz site

Table 3. Oddball task P3

amplitude (㎶)

YMG-1 Group (n=11) YMG-2 Group (n=10) Control Group (n=12)

Session1 Session2 Session1 Session2 Session1 Session2

Fz7.7268

(3.6968)

7.4685

(5.2918)

4.754

(4.5648)

4.5076

(6.2214)

2.9306

(5.6539)

2.6537

(4.3824)

Cz13.7133

(6.0586)

13.5267

(8.3519)

9.2092

(3.6022)

7.8652

(6.2571)

6.0936

(4.8799)

5.6174

(4.8568)

Pz17.0201

(8.0136)

17.3017

(9.5884)

11.7911

(2.4372)

11.5168

(6.7349)

9.8759

(5.409)

8.9382

(4.3926)

F36.7854

(3.4018)

6.7503

(5.2269)

2.788

(3.7492)

4.8094

(7.5566)

4.4631

(6.3548)

4.127

(4.2623)

F46.0848

(3.3088)

6.3205

(4.4083)

4.3584

(4.4013)

4.3207

(5.4549)

2.6934

(3.8058)

2.8449

(3.7831)

P316.1143

(7.0984)

15.5816

(8.1238)

10.7379

(2.0507)

9.5854

(6.4009)

9.2029

(4.7102)

9.185

(3.7095)

P415.5225

(6.184)

15.9657

(7.2468)

11.1201

(2.4219)

11.0806

(7.4428)

8.6743

(4.6171)

7.9657

(4.1189)

※ Numbers in parentheses indicate the standard deviation of the mean (SD).

Table 4. Oddball task P3 latency (ms)



Fz474.835

(56.6063)

465.0161

(44.49)

454.2825

(26.7695)

466.896

(29.7904)

459.3809

(50.0356)

471.4854

(46.539)

Cz473.3138

(56.6063)

448.0003

(54.0427)

451.9366

(26.7695)

467.6719

(30.4346)

450.5909

(50.0356)

467.6288

(49.1737)

Pz473.3138

(58.4228)

448.7231

(42.5987)

454.8471

(22.7807)

460.2433

(37.0161)

443.2778

(39.6658)

480.7128

(56.4794)

F3476.8493

(56.2438)

462.9845

(44.6273)

454.7936

(27.5501)

469.771

(36.605)

461.3855

(50.2443)

469.9375

(46.8249)

F4475.8892

(57.139)

464.1706

(46.3882)

455.7306

(27.4898)

467.4403

(28.8869)

462.1588

(51.8524)

478.0367

(52.3969)

P3473.6078

(66.511)

451.9787

(43.4129)

453.2284

(24.6953)

463.65

(38.3077)

451.3516

(37.5403)

475.9683

(47.2776)

P4474.5752

(56.7155)

448.3605

(44.813)

452.0442

(21.7048)

459.2737

(38.1461)

446.8545

(38.3353)

462.3489

(52.5789)

※ Numbers in parentheses indicate the standard deviation of the mean (SD).

진폭에 있어 회기 효과는 유의미하지 않은 것으로 나타났다 (F(1, 30) = .032, p

= .860). 전극위치간의 차이는 유의미한 것으로 나타났으나 (F(6, 54.35) =

80.49, p = .000, ε =.302), 회기와의 상호작용은 없었다. 진폭은 Fz, F3, F4 등

두피 앞쪽 영역에서 작게 나타났고, 뒤쪽으로 갈수록 커지는 경향을 보였다. 집

단 간의 차이는 유의미한 것으로 나타났으며 (F(2, 30) = 6.124, p = .006), 집

단과 측정위치간의 상호작용 역시 확인되었다 (F(12, 24) = 2.85, p = .037).

Student-Newman-Keuls 사후 검증에서는 YMG-1 집단과 통제 집단이 서로 비동질적

이라는 점을 확인할 수 있었다. 그러나 그림에서 확인할 수 있듯이 이런 차이는

각 집단 간의 기저 진폭 수준의 차이로 인한 것으로 보인다.

Session

21

Estimated Marginal Means

13

12

11

10

9

8

7

6

5

��GROUP

YMG-1

YMG-2

Con

��

Session

21


13

12

11

10

9

8

7

6

5

��GROUP

YMG-1

YMG-2

Con

��

Fig. 6. P300 Amplitude changing pattern for each group

잠재기에 있어 회기 효과 전극위치 효과, 그리고 회기와 전극위치간의 상호작용

은 유의미하지 않았다. 집단 간의 차이는 유의미하지 않았으나, 회기와 집단 간

의 상호작용은 F (2, 66) = 6.417, p = .004 수준에서 유의미하게 나타났다. 이

효과는 아래 그림에서 보듯 각 집단 간에 회기에 따른 변화 양상이 일정하지 않

았기 때문에 나타난 것이다. 또한 진폭의 경우와 마찬가지로 집단 간 잠재기 역

시 기저 수준에서 차이를 보이고 있다.

Fig. 7. The difference of mean P300 latency between YMG groups and control

The difference of mean P300 latency in each group was obtained from difference

of the mean value of P300 latency in each group before and after those drugs were

treated on subjects for 6 weeks. Con indicates control group, which does not

include any drug treatment. YMG-1 and 2 indicate drug treatment groups, which

include different components. Data from ten or thirteen such studies are pre-

sented as a histogram: each bar shows the mean value with the standard error of

the mean (SEM).Statistical analysis was based on Repeated-Measured ANOVA.

Significant difference (P< 0.05 denoted by asterik symbol) under measurements

from other conditions is designated: * compared with data in the absence of any

drug.

P300의 잠재기에서는 회기의 주효과가 유의미했다 (F(1, 21) = 8.95, p = .007).

모든 채널에서 2회기의 잠재기는 1회기에 비해 유의미하게 길어졌다.

Fig. 8. P300 mean latencies

for every area in 2 sessions

Channel

P4P3F4F3PzCzFz


480

470

460

450

440

��

Session

1

2

��

��

��

Channel

P4P3F4F3PzCzFz


480

470

460

450

440

��

Session

1

2

��

��

��

Fig. 9. ERP Grand average Wave form

연속재인과제의 수행에서, 현재까지 어휘빈도가 낮은 단어가 높은 단어에 비해서

더 잘 재인 된다고 알려져 있는데, 이에 근거하여 「현대 한국어의 어휘 빈도」

(연세대학교 언어정보개발연구원, 1998)에서 어휘 빈도가 30-70%에 속하고 두 글

자로 구성된 한글 단어 240개를 선택하여 사용한 김명선 등의 실험을 참조하여,

여기서 사용되었던 단어 목록을 수정사용하였다. 240개의 단어들 중에서 100개

는 즉각적으로 반복 제시되었고, 100개는 5개의 간섭 단어 후에 지연 반복 제시

되었으며, 40개는 반복 제시되지 않았다. 반복 제시된 단어들 중 처음 제시된 경

우와 전혀 반복 제시되지 않은 단어를 새로운 자극 (novel stimulus)으로 명명하

였다. 자극 단어는 컴퓨터 모니터의 중앙 부위에 500ms 동안 제시되었고 자극간

의 간격은 2초였다. 피험자는 연속적으로 제시되는 일련의 단어들을 주시하면서

단어가 앞서 제시된 단어인지 아닌지를 판단하여 양손의 엄지손가락으로 반응 버

튼을 눌렀다. 6주의 약물 복용 후에 이루어진 2차 회기 역시 모든 측정이 동일한

방식으로 이루어졌다.

Table 5. Recognition memory task P300 amplitude (㎶)



Fz

N4.08(5.20)

2.06(7.87)

5.44(6.38)

5.08(3.00)

2.60(4.52)

.64(4.81)

I8.12(5.92)

5.67(4.77)

7.70(4.21)

6.68(4.25)

3.18(3.30)

4.16(4.04)

D8.62(9.86)

2.56(7.17)

6.13(6.54)

5.93(4.82)

4.15(4.77)

2.52(4.37)

Cz

N5.79(5.85)

1.85(8.65)

6.85(5.92)

7.67(5.22)

2.20(6.39)

2.10(6.18)

I10.43(6.74)

7.92(6.37)

11.12(4.77)

10.87(6.36)

4.78(3.55)

6.76(5.56)

D9.37(6.42)

2.46(9.16)

9.16(6.68)

8.45(5.44)

4.58(4.54)

2.90(2.90)

Pz

N6.50(4.87)

3.18(9.14)

7.97(6.20)

8.92(5.44)

2.21(6.53)

.86(7.28)

I12.80(6.85)

9.94(5.96)

14.25(5.19)

14.84(6.60)

7.45(3.59)

8.05(4.49)

D9.67(6.40)

2.74(8.78)

10.07(5.47)

10.09(5.87)

4.98(4.36)

3.54(6.17)

F3

N4.57(5.84)

2.68(7.21)

5.26(5.87)

4.74(2.80)

2.34(4.47)

1.12(3.85)

I7.82(5.50)

4.60(4.21)

6.71(3.06)

6.33(3.32)

3.00(4.16)

4.22(4.94)

D9.28(11.57)

2.91(6.49)

6.40(6.24)

6.99(3.84)

4.68(4.28)

2.86(3.65)

F4

N5.03(4.85)

5.47(5.06)

6.02(6.31)

5.74(2.29)

3.31(4.01)

2.13(4.43)

I8.23(5.08)

6.10(6.41)

7.16(5.42)

7.33(4.29)

3.10(3.14)

4.50(5.35)

D8.95(9.70)

4.27(5.10)

6.34(5.87)

6.68(4.12)

5.87(3.89)

4.39(4.42)

P3

N6.57(4.48)

2.00(9.38)

6.05(7.03)

7.27(5.14)

1.60(6.05)

1.41(5.86)

I13.25(5.93)

9.17(5.73)

12.50(5.77)

13.29(5.59)

6.89(3.56)

8.38(5.14)

D10.14(5.99)

2.24(9.12)

8.28(6.52)

8.74(8.74)

4.06(3.75)

3.22(5.73)

P4

N5.98(4.39)

2.52(10.17)

7.20(6.41)

6.38(6.23)

1.34(6.07)

1.12(5.45)

I11.89(5.18)

8.94(6.23)

13.11(5.38)

12.24(7.64)

6.35(3.21)

7.12(4.90)

D8.83(5.09)

1.44(9.65)

8.51(6.79)

8.36(5.65)

3.68(4.81)

2.86(5.71)

※ Numbers in the parentheses indicate the standard deviation of the mean (SD).

Table 6. Recognition memory task P300 latency (ms)



Fz

N637.96

(90.51)

629.97

(110.11)

630.80

(103.15)

654.47

(95.67)

711.36

(78.32)

619.96

(126.56)

I461.53

(49.28)

460.44

(49.78)

468.93

(49.30)

485.59

(55.78)

480.95

(49.53)

494.74

(53.26)

D626.67

(105.27)

644.68

(110.27)

636.24

(95.12)

637.47

(87.66)

672.28

(86.41)

654.04

(116.96)

Cz

N620.83

(88.96)

568.98

(79.49)

615.52

(91.45)

635.48

(72.51)

678.01

(104.75)

615.57

(117.75)

I476.61

(40.08)

461.47

(50.18)

467.20

(37.59)

501.09

(42.03)

491.15

(55.80)

507.30

(50.51)

D611.70

(92.34)

603.37

(97.57)

596.23

(61.68)

637.41

(61.53)

657.69

(91.75)

616.24

(110.53)

Pz

N587.86

(60.86)

563.89

(59.90)

593.02

(74.05)

608.86

(72.52)

634.78

(105.53)

581.94

(96.10)

I484.05

(38.44)

467.23

(43.02)

465.94

(34.29)

478.53

(41.82)

506.00

(56.21)

489.86

(39.65)

D579.67

(43.52)

583.38

(85.11)

589.95

(70.76)

579.99

(59.04)

642.73

(88.26)

582.22

(89.34)

F3

N644.94

(83.61)

616.09

(106.80)

636.46

(101.34)

670.19

(89.67)

689.03

(94.32)

638.11

(115.60)

I470.75

(56.26)

479.30

(64.85)

473.01

(47.77)

485.50

(48.71)

507.85

(44.94)

487.84

(45.81)

D600.85

(86.90)

656.85

(111.76)

638.84

(638.84)

660.17

(88.98)

663.38

(95.70)

673.55

(85.86)

F4

N611.15

(74.26)

633.784

(106.14)

640.62

(102.98)

688.96

(93.71)

692.45

(96.99)

666.92

(126.36)

I488.40

(59.24)

479.86

(63.00)

467.69

(53.90)

487.33

(51.52)

500.08

(55.26)

486.15

(44.86)

D622.66

(107.42)

642.66

(112.57)

638.43

(79.00)

677.54

(92.26)

665.37

(90.01)

671.94

(94.99)

P3

N600.66

(79.09)

576.43

(65.25)

586.25

(77.13)

600.87

(64.50)

621.85

(111.61)

565.61

(81.73)

I474.14

(38.67)

458.00

(42.08)

461.48

(30.16)

479.00

(41.43)

498.41

(49.54)

491.35

(38.18)

D600.97

(78.62)

571.58

(87.81)

595.92

(74.20)

575.28

(55.56)

625.06

(89.85)

589.91

(89.85)

P4

N586.31

(61.74)

561.67

(57.12)

594.22

(74.87)

608.59

(70.69)

626.83

(104.79)

577.79

(94.99)

I489.94

(55.73)

461.28

(52.65)

470.72

(36.58)

487.55

(44.96)

492.68

(42.55)

490.91

(37.97)

D585.01

(50.72)

584.86

(90.89)

580.14

(55.47)

601.70

(56.40)

624.01

(92.61)

582.39

(89.42)

N 조건에서는 진폭에 대한 회기 효과는 유의미하지 않은 것으로 나타났다. 측정

위치간의 차이는 유의미한 것으로 나타났으나 (F(2, 78) = 2.492, p = .000, ε

=.315), 회기와의 상호작용은 없었다. 진폭은 Fz, F3, F4 등 두피 앞쪽 영역에서

작게 나타났고, 뒤쪽으로 갈수록 커지는 경향을 보였다. I 조건에서는 진폭에 있

어 회기의 효과는 유의미하지 않은 것으로 나타났다. 측정위치 효과는 유의미하

였으며, 측정위치와 집단 간의 상호작용은 경계역 수준에서 유의미한 것으로 확

인되었다 (F(4.93, 96.18) = 2.198, p = .062). D 조건에서 회기의 효과는 유의

미하였으나 (F(1,39) = 4.361 p = .043), 집단과 회기간의 상호작용은 관찰되지

않았다. 잠재기 역시 측정위치간 유의미한 효과를 보였다 (F(2.52, 14.98)=2.49)

, p = .000).

(4) 혈관성 기억감퇴모델

가. 실험방법

실험동물

실험동물은 삼육동물센터로부터 구입한 웅성 Sprague Dawley계 흰 쥐(260∼300g)

로, 일주일 정도 실험실 환경(온도는 22±3℃, 습도는 50±10%)에 적응시킨 후 사

용하였다. 실험동물은 각 cage 당 3∼4 마리씩 넣어 두었으며, 물과 사료(고형사

료: 실험동물 쥐用, 삼양유지(株))를 자유로이 섭취하도록 하였다.

실험군의 구성 및 절차

실험군의 분리는 쥐를 모의시술군 (SHAM, n=8), Forebrain ischemia 유발군

(SAL+ISCH, n=10), Forebrain ischemia 유발+MK-801처치군 (MK-801+ISCH, n=8),

Forebrain ischemia 유발+ 인삼400mg/kg 처치군 (인삼+ISCH, n=8), Forebrain

ischemia 유발+식품A 400mg/kg (산삼+ISCH, n=7), Forebrain ischemia 유발+식품

B 400mg/kg (n=8)으로 나누었으며, 각 군은 ischemia 유발 후 3주 동안 약을 처

치하였다. 다음 1주일간 방사형미로를 시행하였으며, 마지막 행동검사를 실시한

후 조직검사를 하였다.

약물 제조 및 약물 투여 방법

홍삼 (400mg/kg, i.p.), 식품A, B (400mg/kg, i.p.)등을 매일 한차례 일정한 시

간인 오전 10시경에 3주간 경구 투여한 후 행동검사를 실시하였다.

나. Focal cerebral ischemia 유발모델에서 방사형 미로 학습의 주로 정선택

(correct choice) 수 및 약물처치군의 효과

각 군 실험동물의 학습수행과 기억력 정도 측정은 아래 그림과 같다. 방사형 미

로 학습에서 5일 동안 300초내에 주로를 정확하게 찾는 횟수를 측정하는 획득시

행에서 제 1일째 군간은 유의성이 없이 비슷하게 나타났으며, 학습이 진행됨에

따라 마지막 5일째에는 집단간에 유의성 있는 차이를 보였다. 이에 집단별 사후

검정 결과, 4일째에는 약물투여군이 SAL+ISCH군 (P<0.01)과 SHA+ISCH군 (P<0.05)

에 대해 통계적으로 유의하게 증가하였다.

또한 방사형 미로 학습에서 마직막 날인 제 6일째의 공간인지에 대한 기억검사에

서 집단간의 유의성 있는 차이를 보였다 [F(4,27)=5.248, P<0.01]. 이에 집단별

사후검정 결과, 약물투여군이 SAL+ISCH군 (P<0.05)에 대해 통계적으로 유의하게

증가하였다. 따라서 약물처치군은 공간 인지에 대한 학습능력과 기억력의 증진효

과가 관찰되었다.

다. Focal cerebral ischemia 유발모델에서 방사형 미로 학습의 주로 오선택

(error rate) 수 및 약물처치군의 효과

각 군 실험동물의 학습수행과 기억력 정도 측정은 아래 그림과 같다. 방사형 미

로 학습에서 5일 동안 300초내에 한번 찾아갔던 주로를 다시 들어가는 오선택수

를 측정하는 획득시행에서 학습이 진행됨에 따라 마지막 5일째에는 집단간에 유

의성 있는 차이를 보였다 [F(4,23)=7.363, P<0.01]. 이에 집단별 사후 검정 결

과, 4일째에는부터 약물투여군이 SAL+ISCH군 (P<0.01)과 SHA+ISCH군 (P<0.05)에

대해 통계적으로 유의하게 감소하였다.

또한 방사형 미로 학습에서 마직막 날인 제 6일째의 공간인지에 대한 기억검사에

서 집단간의 유의성 있는 차이를 보였다 [F(4,27)=0.435, P<0.01]. 이에 집단별

사후검정 결과, 약물투여군이 SAL+ISCH군 (P<0.05)에 대해 통계적으로 유의하게

감소하였다.

따라서 약물투여 처치군은 공간 인지에 대한 학습능력과 기억력의 증진효과가 관

찰되었다.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5 R

No. of correct choic

S h am

Con tro l

MK-801(0.4mg/kg)

인삼(400mg/kg)

A (400mg/kg)

B(400mg/kg)

Fig. 10. Comparison of performance of correct choice on the eight-arm radial

maze task among the six groups of the rats. The task was started on the 2th

week after ischemia-induced treatment and was performed with four trials

per day for 5 days. Comparison of retention performance on the eight-arm

radial maze task among the groups of the rats. The task was started on

the 1 day after acquisition test.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5 R

No. of Error

Sham

Control

MK-801(0.4mg/kg)

인삼(400mg/kg)

A(400mg/kg)

B(400mg/kg)

Fig. 11. Comparison of acquisition performance (errors) on the eight-arm

radial maze task among the six groups of the rats. The task was started on

the 2th week after ischemia-induced treatment and was performed with

four trials per day for 5 days. Comparison of retention performance on

the eight-arm radial maze task among the groups of the rats.

건강식품의 기억증진효과 (retention)

0 .001 .002 .003 .004 .005 .00

Sham

Control

MK-

801(0.4mg/kg

) 인삼

(400mg/kg)

A(400mg/kg)

B(400mg/kg)Number of error

Fig. 12. Comparison of acquisition performance (retention test) on the

eight-arm radial maze task among the six groups of the rats

라. Cresyl violet을 이용한 신경세포 손상 및 약물처치군의 방어 효과

각 군에서 해마에서 신경세포 손상정도는 아래 그림과 같다. 해마 부위에서 신경

세포의 염색정도는 SHAM군의 염색정도를 100%로 두었을때, 집단간에 유의성 있는

차이를 보였다 [F(4,83)=5.310, P<0.05]. 이에 집단별 사후검정 결과, 약물투여

군이 SAL+ISCH군 (P<0.05)에 대해 통계적으로 유의하게 세포 수가 증가되었다.

이는 약물처치가 일시적인 국소 뇌허혈 유발로 인한 뇌의 hippocampus 신경세포

의 손실을 방어하였음을 보여주는 것이다.

Hippocampal cells

0.0020.0040.0060.0080.00100.00120.00

Sham

Control

MK-

801(0.4mg/kg

) 인삼

(400mg/kg)

A(400mg/kg)

B(400mg/kg)

Number of cells

Fig. 13. The values of density of cresyl violet-stained sections in the

hippocampal formation areas are shown

Fig. 14. Representative microphotographs of coronal sections showing cresyl

violet in the hippocampus of SHAM(A), SAL+ISCH(B), 인삼+ISCH(C), 식품

A+ISCH(D), 식품B+ISCH(E)

(5) Ibotenic acid lesion 실험결과

가. 실험방법

① 실험동물

본 실험에 사용한 흰쥐는 Sprague-Dawley계로 생후 10주령 (체중 280±10g)의 수

컷(샘타코, 한국)을 구입하여 동물실험실 내 사육실에서 7일간의 적응기간을 갖

도록 하였다. 사육실의 온도는 23±3℃, 상대습도 50±10%의 환경을 유지하면서 0

8：00부터 20：00까지 12시간 간격으로 명암을 조절하고, 고형사료 (삼양사료,

경기도)와 물은 무제한 공급하였다.

② 실험군의 구성 및 절차

실험군 분리는 모의시술군 (Sham, n=5), 내측 중격의 신경세포를 손상시키는

ibotenic acid 손상군 (Control, n=5), ibotenic acid 손상+목단피 투여군 (n=4)

, ibotenic acid 손상+육미지황탕 투여군 (n=5)으로 나누었다.

③ 약물 제조 및 약물 투여 방법

본 실험에 사용한 약재는 목단피와 육미지황탕으로서 시술 한 동물에게 매일 한

차례 일정한 시간인 오전 10시경에 kg당 100mg을 3주간 복강투여한 후 행동검사

를 실시하였다.

나. Ibotenic acid 손상모델에서 수중 미로 학습의 획득시행동안 약물처치군의 효

과

각 군 동물의 학습 정도 측정은 아래 그림과 같다. 수중 미로 학습에서 6일 동안

180초내 도피대에 도달하기까지의 시간을 측정하는 획득시행에서 제 1일째 모의

시술군은 122.0±17.0초, ibotenic acid 손상군은 120.2±20.9초, ibotenic acid

손상+목단피 투여군은 107.4±14.5초, ibotenic acid 손상+육미지황탕 투여군은

147.0±9.3초로 유의성 없이 비슷하게 나타내었으나, 학습이 진행됨에 따라 4일째

에는 도피대에 도달하는데 소요되는 시간이 모의시술군은 49.1±11.0초, ibotenic

acid 손상군은 103.0±20.1초, 목단피 투여군은 75.1±15.8초, 육미지황탕 투여군

은 99.8±19.5초로 학습수행에 유의한 증진효과가 관찰되었다 (P<0.05).

Acquisition test

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

1 2 3 4 5 6 day

sec

Sham

Control

목단피

육미지황탕

*

#

#

Fig. 15. Comparison of acquisition performance on the Morris water maze task

among the four groups of the rats. Mean swimming time traveled per trial.

Mean values of the four trials per day for 6 days for each of the four

groups are shown. Repeated measures of ANOVA of swimming time among the

groups followed by LSD test. *P<0.05 as compared with the corresponding

data of sham group. #P<0.01 as compared with the corresponding data of

control group.

다. Ibotenic acid 손상모델에서 수중 미로 학습의 검사(파지)시행동안 약물처치

군의 효과

각 군 동물의 기억력 측정은 Fig. 2-2와 같다. 수중 미로 학습에서 마지막 날인

제 7일째 도피대를 제거하고 도피대가 있었던 사분면이 머무르는 정도를 측정하

는 파지시행에서 모의시술군은 26.7±0.5%, ibotenic acid 손상군은 24.1±0.4%,

목단피 투여군은 25.1±0.8%, 육미지황탕 투여군 26.2±0.4% 로서 약물 투여군이

ibotenic acid 손상군에 비해 도피대에 머무르는 정도의 유의한 차이는 나타나지

않았으나, 목단피, 육미지황탕 투여군에서 공간기억력에 대한 증진의 경향성이

나타났다.

Retention Test (Q uater-Duration)

22

23

24

25

26

27

28

%

Sham

Control

목단피

육미지황탕

Fig. 16. Comparison of retention performance on the Morris water maze task

among the four groups of the rats. Mean percentage time of platform spent

swimming per trial. Mean values of the four trials for each groups are shown.

Separate measures of one-way ANOVA of swimming time among the groups followed

by LSD test. Showed no significant differences among the groups.

라. 내측 중격에서 choline acetyltransferase(ChAT) 발현

내측 중격에서 학습의 지표로 이용되는 ChAT를 이용하여 아세틸콜린성 신경세포

를 염색한 결과는 아래 그림과 같다. 모의시술군은 13.0±1.0, ibotenic acid 손

상군은 8.5±0.9, 목단피 투여군은 10.2±0.8, 육미지황탕 투여군은 11.8±0.9 로서

그룹간 유의한 차이를 나타냈으며 [F(3,40)=3.366, P<0.05], 사후검정 (LSD) 결

과 육미지황탕 투여군에서 대조군에 비하여 유의하게 ChAT 발현이 증가하였다

(P<0.05).

��

��

��

��

Medial septum

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Sham Control 목단피 육미지황탕

Number of ChAT-reactive neurons

*

#

Fig. 17. The mean(±SEM) values of quantities of choline

acetyltransferase(ChAT) immunostained nuclei in the medial septum of the

experimental groups after water maze learning task 7 days post-operatively.

The ChAT results were analysed by performing separate one way ANOVA of

neurons among the groups followed by post hoc comparisons using the

least significant difference(LSD). *P<0.05 as compared with the

corresponding data of sham group. #P<0.05 as compared with the

corresponding data of control group.

바. 해마에서 약물처치군의 choline acetyltransferase(ChAT) 발현

각 군의 해마에서 ChAT 발현정도는 아래 그림과 같다. 해마의 CA1 부위에서 ChAT

발현은 모의시술군은 18.7±1.2, ibotenic acid 손상군은 15.8±1.8, 목단피 투여

군은 6.3±1.1, 육미지황탕 투여군은 9.5±1.4 로서 그룹간 유의한 차이를 나타냈

다 [F(3,26)=8.002, P<0.01]. 그룹간 사후검정 (LSD) 결과 목단피와 육미지황탕

투여군의 ChAT 발현이 손상군에 비해 유의한 차이가 나타났다 (CA1, P<0.01;

CA3, P<0.05).

해마의 CA3 부위에서 ChAT 발현은 모의시술군은 18.3±2.0, ibotenic acid 손상군

은 17.2±1.0, 목단피 투여군은 8.8±1.1, 육미지황탕 투여군은 12.7±1.9로서 그룹

간 유의한 차이를 나타냈다 [F(3,27)=8.163, P<0.01]. 그룹간 사후검정 (LSD) 결

과 두가지 약물 투여군 모두 손상군에 비해 유의하게 ChAT 발현이 증가하였다

(CA1, P<0.001; CA3, P<0.01).

Hippocampus

0

5

10

15

20

25

CA1 CA3

Number of ChAT-reactive neurons

Sham

Control

목단피

육미지황탕**,

##

**,

#**,

###

*,

##

Fig. 18. The mean(±SEM) values of quantities of choline

acetyltransferase(ChAT) immunostained nuclei in the different hippocampal

areas of the experimental groups after water maze learning task 7 days

post-operatively. The ChAT results were analysed by performing separate

one way ANOVA of neurons among groups followed by post hoc comparisons

using the least significant difference(LSD). *P<0.05, **P<0.01 as

compared with the corresponding data of sham group respectively.

#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 as compared with the corresponding data of

control group respectively.

Hippocampus

20

40

60

80

100

120

140

160

180

CA1 CA3

Density of AchE-reactive neurons

(% of sham values)

Sham

Control

목단피

육미지황탕

#

***

Fig. 19. The percentage(±SEM) of sham values of density of acetylcholine

esterase(AchE) stained nuclei in the different hippocampal formation areas of

the experimental groups after water maze learning task 7 days

post-operatively. The AchE results were analysed by performing separate one

way ANOVA of neurons among the groups followed by post hoc comparisons using

the least significant difference(LSD). *P<0.05, **P<0.01 as compared with the

corresponding data of sham group respectively. #P<0.05 as compared with the

corresponding data of control group.

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Documents

집중력 및 기억력 개선 관련 기능성평가§‘중력 및 기억력 개선.pdf · 검사시행에서는 어두운 곳으로 들어가지 않고 밝은 곳에서 오래