www.ophthalmology.org 945

대한안과학회지 2013년 제 54 권 제 6 호J Korean Ophthalmol Soc 2013;54(6):945-953

pISSN: 0378-6471eISSN: 2092-9374

http://dx.doi.org/10.3341/jkos.2013.54.6.945

= 증례보고 =

약물 유도 망막변성 생쥐 모델에서 안구내

면역세포에서의 F4/80와 nestin 발현 양상

안상일⋅온영훈⋅박태관

순천향대학교 의과대학 부천병원 안과학교실

목적: MNU (N-methyl-N-nitrosourea)로 망막변성을 유도한 생쥐의 섬모체와 시신경에서 F4/80와 nestin의 발현양상을 알아보고자 한다.대상과 방법: 30마리 생쥐를 대상으로 MNU (60 mg/kg)를 복강내 주사한 후 2일, 4일, 7일, 30일에 각각 안구를 적출하여 Hematoxylin and eosin (H&E) 염색 및 Terminal deoxyribonucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) 염색, F/80와 nestin의 면역조직형광염색을 시행하였다.결과: MNU 주입후 세포자멸사에 의한 광수용체의 파괴가 나타났다. 면역조직형광염색 결과 대조군에서는 F4/80와 nestin이 함께 발현되지 않았으나, 실험군에서는 시신경 및 섬모체 내부에서 F4/80의 발현이 증가하였고, 이 세포들은 nestin을 함께 발현하였다. 망막의 외핵층에서도 F4/80와 nestin을 함께 발현하는 세포가 관찰되었다.결론: 망막의 손상에 반응하여 F4/80 및 nestin을 함께 발현하는 세포가 섬모체와 시신경을 따라 망막 내부로 이동하여 일시적으로 증식 및 활성화된다. <대한안과학회지 2013;54(6):945-953>

￭ Received: 2012. 7. 13. ￭ Revised: 2013. 1. 3.￭ Accepted: 2013. 4. 10.￭ Address reprint requests to Tae Kwann Park, MD, PhD

Department of Ophthalmology, Soonchunhyang University Bucheon Hospital, #170 Jomaru-ro, Wonmi-gu, Bucheon 420-767, KoreaTel: 82-32-621-5426, Fax: 82-32-621-5435E-mail: tkpark@schmc.ac.kr

* 이 논문은 2011년도 정부(교육과학기술부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임(No. 2011-0014354).

N-methyl-N-nitrosourea (MNU)는 일상 환경에 널리

퍼져있는 질소화합물로 다양한 동물들에서 망막변성을 유

발하는 알킬(alkylating) 화합물이다.1,2 생쥐의 망막변성 모

델에서 MNU는 광수용체의 세포자멸사(apoptosis)를 유발

하며 그 손상은 용량과 시간에 비례하는 것으로 알려졌다.3 MNU에 의한 망막 손상 후 세포 잔해를 제거하고 이를 복

구하기 위해 면역세포의 침윤 및 뮬러세포(Müller cell)의

증식이 일어난다.4단핵구(monocyte)는 척추동물의 면역 시스템을 담당하

는 백혈구의 한 종류이다. 골수에서 생산되어 혈액속에 존

재하는 단핵구는 염증이나 감염에 반응하여 조직속으로 이

동하여 각 조직에 특이적인 대식세포(resident macro-phage)로 분화, 증식한다.5 또한 대식세포는 중추신경계 선

천면역시스템의 주 작용 세포로 외상이나 감염, 변성 등의

손상에 반응하여 혈액을 타고 손상된 조직으로 이주하여

사이토카인(cytokines), 산화제(oxidants) 등을 분비하며

면역반응을 유발한다.6 미세교세포(microglia)는 신경조직

의 특수화된 대식세포로 교세포(glia cell)의 한 종류이다. 미세교세포는 조혈모세포 기원의 단핵구에서 유래하여 섬

모체나 홍채, 망막혈관을 타고 망막 주변부와 시신경 유두

를 통해 망막으로 유입된다.7 망막의 미세교세포는 외부에

서 침입한 미생물에 대항하여 숙주의 방어기전에 중요한 기

능을 하는데, 정상 성체 망막에서는 휴지 상태에 있다가 변

성, 염증, 외상 등의 다양한 자극에 반응하여 활성화된다.8 활성화된 미세교세포는 잔해물의 탐식 및 재생 기전을 촉진

시키는데 관여한다.9 이처럼 망막에서 골수구계 세포(mye-loid cell)들은 혈액 기원의 혈관주위 대식세포(perivascular

macrophage) 및 망막 실질의 미세교세포(resident micro-glia) 두 가지 형태로 존재하게 된다.10,11

성체 쥐의 대식세

포와 미세교세포는 분자량 160 kDa의 막 단백질인 F4/80 항원을 가지고 있어 이 항원 표지자를 이용하여 이들 세포

들을 확인할 수 있다.12-15

대식세포, 수지상세포(dendritic cell) 등과 같은 다수의

면역세포들이 섬모체, 홍채, 맥락막 등의 혈관 결합조직에

존재하며 안구의 면역학적 항상성을 유지한다.16-18 망막의

손상이 발생하면 이 세포들의 망막내로 이동이 증가하는데, Kaneko et al19은 망막손상에 반응하여 다수의 골수기원 세

www.ophthalmology.org946

-대한안과학회지 2013년 제 54 권 제 6 호-

포들이 섬모체와 시신경, 망막의 혈관을 따라 망막내로 이

주하여 미세교세포로 분화한다고 하였다. 아울러 이러한 섬

모체 기원의 면역세포들이 nestin 등의 원시신경세포 표지

자를 발현하는 것이 보고되었다.20

중간섬유중의 하나인 nestin은 중추신경계의 원시신경세

포 표지자로 알려졌는데,21 망막에서는 뮬러세포 및 성상세

포(astrocyte), 미세교세포에서 발현되며22-27 혈관내피세

포(vascular endothelial cell)와 혈관주위세포(pericyte) 등에서도 발현된다.28

이번 연구에서는 생쥐에서 MNU로 망막변성을 유도한

후 시간 경과에 따른 세포자멸사를 포함한 망막의 조직병

리학적 변화를 관찰하고, 대식세포 및 미세교세포의 표지자

인 F4/80와 원시신경세포 표지자로 알려진 nestin의 발현

양상을 알아보고자 한다.

대상과 방법

대상

외견상 외안부 질환이 없고 각막, 수정체의 혼탁이 없는

8주령 체중 22-24 g 가량의 C57Bl/6N CrljOri mice(오리

엔트바이오, 성남, 경기도, 대한민국)를 대상으로 하였다. 실험동물을 이용한 모든 생체실험은 안과 및 시과학 연구회

(Association for Research in Vision and Ophthalmology)에서 규정하고 있는 동물사용에 대한 지침을 준수하였다.

실험방법

1. 망막변성의 유도와 약물의 주입

MNU (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 -20℃의 암실에서 보관하였으며, 사용 직전 0.05% acetic acid가

함유된 생리식염수에 MNU를 용해시켰다. MNU는 60 mg/kg의 용량을 단회 복강내 주사하였으며, 약물 주입 후

시간을 기록하였다. 약물주입 전과 약물주입 후 2일, 4일, 7일, 30일을 각 군으로 나누어, 각 군당 6마리 12안, 총 30마리 60안에 대해 실험을 하였다.

2. 조직의 고정 및 표본제작

생쥐를 희생시킨 후, 안구를 적출하여 4% paraf-ormaldehyde 용액에서 4시간 고정시켰다. 적도부위에서 안

구를 절개하고 수정체를 포함한 전안부와 유리체를 제거한

후, 냉동절편 형성 시 발생가능한 조직의 손상을 방지하기 위

하여 10, 20%의 sucrose 용액에 각각 1시간씩 방치한 후

30%의 sucrose 용액에서 12시간 방치하였다. OCT (Optical

Cutting Temperature, SaKura Finetek, Torrance, CA) 용액에 포매시킨 다음 4 μm 두께의 조직 절편을 제작하여

polylysine-coated 유리슬라이드에 표본제작하였다.

3. H&E 및 TUNEL 염색

조직학적 변화를 관찰하기 위해 Hematoxylin and eosin (H&E) 염색 및 세포자멸사의 확인을 위해 Terminal de-oxyribonucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) 염색을 하였다. Apoptosis 염색(TAKARA

BIO INC, Shiga, Japan)을 사용하여 제조회사에서 제공하

는 실험방법에 의해 TUNEL 염색을 하였다. 원리를 간략히

요약하면 Terminal deoxynucleotidyl transferase를 사용

하여 apoptosis의 결과로 생긴 nucleosome-sized DNA fragment의 양끝에 digoxigeninlabeled deoxyuridine tri-phosphate를 연결한 후 anti-digoxigenin peroxidase를 적

용하여 항원-항체 반응을 일으키고 0.05% diaminobenzidine을 가하여 발색반응을 일으켰다.

4. 면역조직형광염색

조직절편을 PBS (0.1M PBS+0.1% Triton X-100) 용액

으로 5분씩 3번 씻은 다음 blocking을 위해 0.1M Phosphate

buffer에 5% goat serum과 0.5% Triton X-100를 첨가한

용액에 담가 상온에서 1시간 처리하였다. 1차 항체로서 mouse

monoclonal anti-nestin antibody (1:1000; Chemicon, Temecula, CA, USA) 및 rat monoclonal anti-F4/80 an-tiserum (1:1000; AbD Serotec, Oxford, UK)을 5% goat serum에 희석하여 준비하였다. 각각의 일정에서 얻어진 조

직절편들을 두 가지의 일차항체가 섞여있는 반응액에 노출

시킨 다음 섭씨 4도의 조건에서 16시간 반응시킨 다음, 0.1% PBS 용액으로 5분씩 3번 씻은 후 각각의 일차항체와

반응하는 2차 항체로서 goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 (molecular Probes, Grand Island, NY) 및 goat an-ti-rat IgG Alexa Fluor 568 (molecular Probes, Grand Island, NY)를 5% goat serum에 1:1000으로 희석하여 실

온에서 1시간 처리하였다. 면역형광염색 반응을 마무리한

다음 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (D9542; Sigma, St Louis, MO)을 이용하여 세포내 핵의 대조염색

을 마무리하였다.

5. 이미지 분석

조직의 면역형광염색을 형광 현미경(Axioplan micro-scope; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 관

찰하였으며, image-capture software (Axiovision; Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany)로 사진을 분석하였다.

www.ophthalmology.org 947

-안상일 외 : 망막변성 생쥐에서 F4/80와 nestin의 발현-

A B C D

Control MNU 2 days MNU 7 days MNU 30 daysFigure 1. H&E staining results of the retina. (A) Normal. (B) 2 days after MNU treatment, the retinal thickness is slightly decreased and the arrangement of PRL and ONL is distorted. (C) 7 days after MNU treatment, the depletion of PRL and RPE are noticed and the ONL is reduced to a few layers of cells. (D) 30 days after MNU treatment, the ONL completely disappeared (RPE = retinal pigment epithelium; PRL = photoreceptor layer; ONL = outer nuclear layer; OPL = outer plexiform layer; INL = inner nuclear layer; IPL = inner plexiform layer; GCL = ganglion cell layer).

Control MNU 2 days MNU 7 days MNU 30 days

A B C D

Figure 2. TUNEL staining results of the retina. (A) No TUNEL+ cells are observed in the control group. (B) Large number of TUNEL+ cells are shown in the ONL at 2 days after MNU treatment. (C) Seven days after MNU treatment, small num-ber of TUNEL+ cells are remained in the ONL and GCL. (D) Thirty days after MNU treatment, no TUNEL+ cells are observed as the ONL disappeared (RPE = retinal pigment epithelium; PRL = photoreceptor layer; ONL = outer nuclear layer; OPL = outer plexiform layer; INL = inner nuclear layer; IPL = inner plexiform layer; GCL = ganglion cell layer).

결 과

조직학적인 변화

MNU 주입후 시간 경과에 따른 망막의 조직병리학적인

변화를 H&E 염색을 통해 관찰하였다. MNU 주입 2일 후엔

대조군과 비교하여 망막의 두께가 다소 감소하였으며 광수

용체층(photoreceptor layer)과 외핵층(outer nuclear lay-er)의 배열이 무질서해지고, 색소상피층(retinal pigment epithelium)의 파괴가 나타났다. MNU 주입 4일 후에는 광

수용체층과 외핵층의 파괴가 더욱 진행되었고, MNU 주입

7일 후에는 광수용체층 및 색소상피층이 완전히 소실되었

으며 외핵층은 1-2층만이 남아있고 내핵층(inner nuclear layer) 또한 얇아졌다. 30일 후에는 외핵층도 완전히 사라

20 µm

20 µm

www.ophthalmology.org948

-대한안과학회지 2013년 제 54 권 제 6 호-

A B C

D E F

G H I

J K L

Figure 3. Immunochemistry examination of the optic nerve head. Immunofluorescent labeling with F4/80 (red) and nestin (green). In the control optic nerve head, there are some of F4/80+ cells (A: arrowhead) and nestin+ cells (B: asterisk), but no cells co-ex-pressed F4/80 and nestin (C: merged image of A and B). Two days after MNU treatment, some of F4/80+ cells are also positive for nestin (D-F: arrow). Four days after MNU treatment, large number of F4/80 and nestin co-expressing cells are observed (G-I: arrow). Seven days after MNU treatment, these cells are decreased (J-L). Scale bar: 100 μm.

져서 내핵층의 일부와 얇아진 내망상층(inner plexiform layer), 신경절세포층(ganglion cell layer)만이 남아있다

(Fig. 1).망막세포의 세포자멸사를 관찰하기 위해 시행한 TUNEL

염색에서 대조군에서는 TUNEL 양성세포가 보이지 않으나

MNU 주입 2일째는 다수의 TUNEL 양성세포들이 외핵층

내에 나타났으며, 신경절섬유층에도 일부 나타났다. 4일째

는 외핵층내 TUNEL 양성세포들의 비율이 감소하였으며, 7일째는 1-2층만 남아 있는 외핵층에 TUNEL 양성세포가

일부 남아 있으며, 신경절세포층에서도 TUNEL 양성세포

가 보이고 있다. 주입 30일째는 외핵층이 완전히 소실됨에

따라 TUNEL 양성세포들도 관찰되지 않았다(Fig. 2).

면역조직형광 염색

1. 시신경

MNU를 주입하지 않은 정상 대조군 시신경의 내부에선

F4/80 양성인 세포들이 일부 관찰되었고(Fig. 3A; arrow-

www.ophthalmology.org 949

-안상일 외 : 망막변성 생쥐에서 F4/80와 nestin의 발현-

A B C

D E F

G H I

Figure 4. Immunochemistry examination of the ciliary body. Immunofluorescent labeling with F4/80 (red) and nestin (green). In the control ciliary body, F4/80 immunoactivity is seen in the ciliary epithelium, but nestin is not expressed (A-C: arrow). The stroma of ciliary body is non-specifically stained by nestin, but F4/80 is not expressed (B, E, H: asterisk). In the choroid, F4/80 and nestin co-expressing cells are observed (A-C: arrowhead). Two days after MNU treatment, F4/80 immunoactivity of ciliary epithelium is more increased (D: arrow) and there are some of cells which co-expressed F4/80 and nestin (D-F: arrowhead). Four days after MNU treatment, F4/80+ cells are seen in the ciliary epithelium (G: arrow), and F4/80 and nestin co-expressing cells are seen in the fibrovascular tissue of ciliray body (G-L: arrowhead). (CB: ciliary body). Scale bar: 100 μm.

heads) nestin을 발현하는 세포도 보였으나(Fig. 3B; as-terisks) F4/80 및 nestin을 함께 발현하는 세포는 관찰되

지 않았다(Fig. 3C). MNU 주입 2일째는 F4/80 양성인 세

포와 nestin을 발현하는 세포가 일부 보였으며 F4/80 및

nestin을 함께 발현하는 세포들도 관찰되었다(Fig. 3D-F). 이러한 변화는 MNU 주입 4일째 더욱 뚜렷해져서 시신경

내부에서 F4/80 및 nestin을 발현하는 세포들이 다수 관찰

되었고 이들은 F4/80 및 nestin을 함께 발현하였다(Fig.

3G-I; arrow). MNU 주입 7일째 시신경에서는 F4/80 또는 nestin을 발현하는 세포들이 감소하는 양상을 보였다

(Fig. 3J-L).

2. 섬모체

정상 대조군 섬모체 조직에서 F4/80는 섬모체 상피에서

발현되고 있으나 nestin은 함께 발현하지 않았다(Fig. 4A-C; arrow). 섬모체 기질(stroma)은 비특이적으로 nes-

www.ophthalmology.org950

-대한안과학회지 2013년 제 54 권 제 6 호-

A B C

D E F

G H I

Figure 5. Immunochemistry examination of the retina. Immunofluorescent labeling with F4/80 (red) and nestin (green). In the con-trol retina, there are no F4/80+ cells (A), but nestin is found in retinal blood vessels (B: arrowheads) and muller cells (B: asterisk). Two days after MNU treatment, F4/80 and nestin are co-expressed between INL and ONL (D-F: arrow). Four days after MNU treatment, F4/80 is also expressed in the ONL (G-I: arrow). Nestin immunoactivity of the muller cells was increased (E, H) (PRL = photoreceptor layer; ONL = outer nuclear layer; OPL = outer plexiform layer; INL = inner nuclear layer; IPL = inner plexi-form layer; GCL = ganglion cell layer). Scale bar: 50 μm.

tin에 염색되고 있으나 F4/80는 발현하지 않았다(Fig. 4B, E, H; asterisks). 맥락막에서는 F4/80과 nestin을 동시에

발현하는 세포가 관찰되었다(Fig. 4A-C; arrowhead). MNU 주입 2일째 조직에서는 섬모체 상피에서 F4/80 양성

세포들의 발현이 더욱 증가하였으며(Fig. 4D; arrow) 이

세포들은 nestin은 발현하지 않았다. 반면에 섬모체 내부의

섬유혈관조직에서 F4/80 및 nestin을 동시에 발현하는 세

포들이 관찰되었다(Fig. 4D-F; arrowhead). MNU 주입 4일째 및 7일째에도 2일째와 마찬가지로 섬모체 상피에서

F4/80만을 발현하는 세포들이 보이며(Fig. 4G; arrow), 섬모체 내부 섬유혈관조직에서는 F4/80 및 nestin을 동시에

발현하는 세포들이 관찰되었다(Fig. 4G-L; arrowhead).

3. 망막

정상 망막에서는 F4/80을 발현하는 세포가 보이지 않으

나(Fig. 5A) nestin은 수평하게 망막을 가로지르는 망막의

혈관에서 발현되고 있으며(Fig. 5B; arrowheads), 신경절

섬유층의 성상세포와 방사상으로 망막에 위치하는 뮬러세

포에서도 발현되고 있음을 알 수 있다(Fig. 5B; asterisks). MNU 주입후 F4/80 양성 세포들이 외핵층 부위에 나타났

으며, 이 세포들은 nestin도 함께 발현하였다(Fig. 5D-F; arrow). 또한 대조군보다 성상세포와 뮬러세포에서의 nestin

발현이 증가되었는데(Fig. 5E), 이러한 변화는 MNU 주입

4일째 최고조로 나타났으며 7일째 및 30일째는 F4/80 및

nestin의 발현이 감소하였다.

고 찰

중추신경계와 망막의 손상에 반응하여 손상된 세포 잔해

를 제거하고 조직을 복구하기 위해 미세교세포 및 대식세

포가 활성화되어 면역반응을 유발한다.7,8,29 손상된 뇌에서

의 미세교세포 및 대식세포의 활성화에 대해서는 많은 연

구가 보고되어 왔으며, 망막에서도 시신경을 일부 절단하거

나 레이져로 유발한 망막 손상에 대한 연구는 많이 보고된

www.ophthalmology.org 951

-안상일 외 : 망막변성 생쥐에서 F4/80와 nestin의 발현-

바 있으나,23,30-32 MNU 등의 약물로 유발된 망막변성 모델

에서의 미세교세포 및 대식세포의 발현에 대한 연구는 아

직 많지 않은 실정이다.19 이에 본 연구에서는 MNU로 유발

된 망막변성의 시간경과에 따른 조직병리학적인 변화와, F4/80 및 nestin 발현 양상을 함께 보고자 하였다.

발암물질로 알려져 있는 MNU는 질소화합물로서 p-450 system의 대사 활성화없이 직접적으로 알킬화를 일으키는

강력한 돌연변이원이다.26,27,33 여러 동물실험에서 MNU가

망막변성을 일으키는 것이 알려져, 안과영역에서는 주로 망

막색소변성을 연구하는 실험에 사용되고 있다.3,31,34 MNU

는 광수용체 세포에 독성을 나타내어 선택적으로 광수용체

의 세포자멸사를 유발하여 망막변성을 일으키는데, 이러한

MNU의 독성은 광수용체 핵에서의 DNA adduct 형성을 억

제하고 Bax 단백질의 상향조절(up-regulation)과 Bcl-2 단백질의 하향조절(down-regulation) 그리고 caspase fam-ily의 활성화에 의해 야기된다.35

MNU의 광수용체에 대한

독성은 시간과 용량에 비례하여 증가하는 것으로 알려졌

다.36,37 망막의 조직염색소견에서 MNU 주입 후 24시간 후

에 망막 두께의 감소가 관찰되었고, 세포자멸사를 나타내는

TUNEL 양성 세포들은 약물 주입 후 12시간부터 관찰되기

시작하여 24시간 후에 최고조를 이루었다고 한다.35 Nambu

et al3은 MNU에 의한 망막변성의 첫 번째 변화로 약물 주

입후 3시간째에 광수용체 내 ․ 외분절(photoreceptor inner and outer segments)의 무질서화(disorientation)가 나타

난다고 하였다. 이후 광수용체 핵의 파괴가 진행되고 5일째

가 되면 최종적으로 광수용체의 내 ․ 외분절이 사라지고, 7일째는 외핵층이 사라진다고 하였다.

본 연구에서도 이와 비슷한 변화를 확인할 수 있었는데, MNU 주입 후 망막의 전반적인 두께가 감소하였으며, 망막

의 다른 층에서보다 주로 광수용체층과 외핵층의 파괴가

나타났고, 이러한 변화는 MNU 주입 7일째 극명해졌다. 또한 세포자멸사가 일어나고 있음을 나타내는 TUNEL 양성

세포들은 MNU 주입후 외핵층에서 주로 나타났다. 이는 광

수용체를 선택적으로 파괴하는 MNU의 작용기전 때문에

주로 광수용체층 및 외핵층에서 세포자멸사가 일어나고 세

포층의 두께 감소가 일어난 것으로 보인다.이러한 망막의 손상에 반응하여 망막에서 면역세포들의

활성화가 일어나게 되는데, 손상된 망막으로 이주하여 증식

하는 세포가 대식세포인지 미세교세포인지에 대해서는 논

란이 있다. Kaneko et al19은 MNU로 유도한 생쥐의 망막변

성 모델에서 골수 기원의 세포들이 섬모체와 시신경, 망막

혈관등을 통해 망막내로 이주하여 미세교세포로 분화한다

고 하였고, Wohl et al25,30은 시신경병변을 유발한 성체 쥐

에서 망막과 섬모체에서 F4/80 양성 미세교세포들의 발현

이 증가한다고 보고하였다. Thanos38는 유전성 망막이상증

쥐에서 손상된 광수용체세포가 미세교세포의 활성화와 이

주를 유도한다고 하였고, Roque et al39은 망막 변성 모델

쥐에서 광수용체 세포의 변성에 반응하여 이주하는 세포들

이 대식세포가 아니고 망막의 미세교세포라고 하였다.이와는 달리 망막손상에서 혈액 기원의 대식세포의 침윤

이 더 우세하다고 한 연구도 있는데, Caicedo et al40은 레

이져로 생쥐 망막에 CNV (choroidal neovascularization)를 유도한 후, 혈액 기원 대식세포들이 CNV 부위로 이주하

여 증식하며, 이 대식세포들은 뮬러세포의 활성화와 밀접한

관련이 있다고 보고하였다. 이들은 레이져로 생쥐의 망막에

CNV를 유발한 후 F4/80의 발현 정도를 관찰하였는데, F4/80를 함께 발현하는 혈액 기원의 대식세포와 망막의 미

세교세포를 구분하기 위해 GFP (green fluorescent pro-tein)로 표지한 골수를 생쥐에게 이식한 후 GFP의 발현유

무를 함께 관찰하였다. 그 결과 F4/80를 발현하는 세포의

대부분이 GFP를 함께 발현하였는데, 이를 토대로 CNV 유도 쥐 모델에서 활성화되어 망막으로 이주한 세포들이 망

막의 미세교세포가 아니라 혈액의 대식세포라고 하였다. 그런데 Caicedo et al40의 연구가 미세교세포의 이주를 주장

한 연구들과 다른 점은 쥐의 망막변성을 유발한 다른 연구

와는 달리 CNV를 유발한 쥐를 대상으로 한 점이다. 망막변

성과 CNV의 병태생리 차이가 망막손상에 반응하여 이주하

는 주된 면역세포 종류의 차이를 야기하였을 가능성이 있

으며, 이에 대해서는 좀더 많은 연구가 필요하다고 하겠다. Nestin은 6번째 중간섬유로서 포유류의 중추신경계 및

망막에서 뮬러세포와 미세교세포 등의 교세포와 원시신경

세포의 표지자로 이용되고 있다.41 최근 연구에서 성체 망

막에 약물이나 레이져로 손상을 유발하면 분화된 뮬러세포

및 미세교세포에서 nestin을 발현한다고 보고하였다.42,43

그러나 아직 대식세포가 nestin을 발현한다고 보고된 바는

없다. 따라서 본 연구에서 F4/80 양성 세포들이 nestin을

함께 발현하는 것으로 보아, MNU에 의해 변성된 망막에

침윤한 세포들은 대식세포라기 보다는 미세교세포라고 해

석하는 것이 타당할 것으로 생각한다.망막손상에서 nestin 양성 세포의 발현이 의미하는 바에

대해서는 아직 논란이 있다. 일부 연구에서는 nestin 양성

세포가 손상된 신경조직을 재생시킬 수 있는 능력이 있는

원시신경세포의 특성의 발현을 의미한다고 한 반면에,42,43

다른 연구에서는 nestin의 발현이 단지 망막손상에 반응하

여 나타나는 신경교증(gliosis)을 의미한다고 하였다.22,43,44

본 연구에서는 정상 대조군에서는 망막과 시신경 및 섬

모체에 F4/80과 nestin을 함께 발현하는 세포가 존재하지

않았으나, MNU에 의해 망막변성을 유도한 후에는 시신경

www.ophthalmology.org952

-대한안과학회지 2013년 제 54 권 제 6 호-

내부 및 섬모체의 섬유혈관조직에 F4/80의 발현이 증가하

였으며 이들은 nestin을 함께 발현하였다. 그리고 망막의

외핵층에서도 F4/80과 nestin을 함께 나타내는 세포들의

발현이 증가하였다. 이는 정상 망막에서는 존재하지 않던

F4/80 및 nestin 양성 세포들이 망막변성에 의해 망막외에

서 망막내로의 이동이 유도되어 섬모체 및 시신경을 통해

망막내로 이동하여 증식하였다고 볼 수 있을 것이다. 아울

러 이러한 F4/80 양성 세포들이 nestin을 함께 발현하는 것

으로 보아 손상된 망막신경의 재생에 관여하는 원시신경세

포의 특성을 일시적으로 발현하는 것으로 유추해 볼 수 있겠

으나, 이에 대해서는 좀더 연구가 필요할 것으로 생각한다.

REFERENCES

1) Herrold KM. Pigmentary degeneration of the retina induced by N-methyl-N-nitrosourea. An experimental study in syrian hamsters. Arch Ophthalmol 1967;78:650-3.

2) Nakajima M, Nambu H, Shikata N, et al. Pigmentary degeneration induced by N-methyl-N-nitrosourea and the fate of pigment epi-thelial cells in the rat retina. Pathol Int 1996;46:874-82.

3) Nambu H, Yuge K, Nakajima M, et al. Morphologic characteristics of N-methyl-N-nitrosourea-induced retinal degeneration in C57BL mice. Pathol Int 1997;47:377-83.

4) Nakajima M, Yuge K, Senzaki H, et al. Photoreceptor apoptosis in-duced by a single systemic administration of N-methyl-N-nitro-sourea in the rat retina. Am J Pathol 1996;148:631-41.

5) Swirski FK, Nahrendorf M, Etzrodt M, et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science 2009;325:612-6.

6) Becher B, Prat A, Antel JP. Brain-immune connection: immuno-reg-ulatory properties of CNS-resident cells. Glia 2000;29:293-304.

7) Langmann T. Microglia activation in retinal degeneration. J Leukoc Biol 2007;81:1345-51.

8) Chen L, Yang P, Kijlstra A. Distribution, markers, and functions of retinal microglia. Ocul Immunol Inflamm 2002;10:27-39.

9) Streit WJ. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia 2002;40:133-9.

10) Provis JM, Diaz CM, Penfold PL. Microglia in human retina: a het-erogeneous population with distinct ontogenies. Perspect Dev Neurobiol 1996;3:213-22.

11) Hume DA, Perry VH, Gordon S. Immunohistochemical local-ization of a macrophage-specific antigen in developing mouse reti-na: phagocytosis of dying neurons and differentiation of microglial cells to form a regular array in the plexiform layers. J Cell Biol 1983;97:253-7.

12) Haidl ID, Jefferies WA. The macrophage cell surface glycoprotein F4/80 is a highly glycosylated proteoglycan. Eur J Immunol 1996;26:1139-46.

13) Hirsch S, Austyn JM, Gordon S. Expression of the macro-phage-specific antigen F4/80 during differentiation of mouse bone marrow cells in culture. J Exp Med 1981;154:713-25.

14) Austyn JM, Gordon S. F4/80, a monoclonal antibody directed spe-cifically against the mouse macrophage. Eur J Immunol 1981;11: 805-15.

15) Perry VH, Hume DA, Gordon S. Immunohistochemical local-ization of macrophages and microglia in the adult and developing mouse brain. Neuroscience 1985;15:313-26.

16) McMenamin PG. Dendritic cells and macrophages in the uveal tract of the normal mouse eye. Br J Ophthalmol 1999;83:598-604.

17) McMenamin PG, Crewe J, Morrison S, Holt PG. Immunomorphologic studies of macrophages and MHC class II-positive dendritic cells in the iris and ciliary body of the rat, mouse, and human eye. Invest Ophthalmol Vis Sci 1994;35:3234-50.

18) Kezic J, McMenamin PG. Differential turnover rates of mono-cyte-derived cells in varied ocular tissue microenvironments. J Leukoc Biol 2008;84:721-9.

19) Kaneko H, Nishiguchi KM, Nakamura M, et al. Characteristics of bone marrow-derived microglia in the normal and injured retina. Invest Ophthalmol Vis Sci 2008;49:4162-8.

20) Xu H, Sta Iglesia DD, Kielczewski JL, et al. Characteristics of pro-genitor cells derived from adult ciliary body in mouse, rat, and hu-man eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci 2007;48:1674-82.

21) Michalczyk K, Ziman M. Nestin structure and predicted function in cellular cytoskeletal organisation. Histol Histopathol 2005;20: 665-71.

22) Kohno H, Sakai T, Kitahara K. Induction of nestin, Ki-67, and cy-clin D1 expression in Muller cells after laser injury in adult rat retina. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 2006;244:90-5.

23) Xue L, Ding P, Xiao L, et al. Nestin, a new marker, expressed in Muller cells following retinal injury. Can J Neurol Sci 2010;37: 643-9.

24) Sahin Kaya S, Mahmood A, Li Y, et al. Expression of nestin after traumatic brain injury in rat brain. Brain Res 1999;840:153-7.

25) Wohl SG, Schmeer CW, Witte OW, Isenmann S. Proliferative re-sponse of microglia and macrophages in the adult mouse eye after optic nerve lesion. Invest Ophthalmol Vis Sci 2010;51:2686-96.

26) Warzok R, Thust R, Schneider J, et al. [Induction of malformations by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) (author's transl))]. Exp Pathol (Jena) 1977;13:11-9.

27) Bond SL, Singh SM. Methyl nitrosourea induced unscheduled DNA synthesis in vivo in mice. Effects of background genotype on excision repair during aging. Mech Ageing Dev 1987;41:177-87.

28) Alliot F, Rutin J, Leenen PJ, Pessac B. Pericytes and peri-endothelial cells of brain parenchyma vessels co-express amino-peptidase N, aminopeptidase A, and nestin. J Neurosci Res 1999; 58:367-78.

29) Zhang C, Lam TT, Tso MO. Heterogeneous populations of micro-glia/macrophages in the retina and their activation after retinal is-chemia and reperfusion injury. Exp Eye Res 2005;81:700-9.

30) Wohl SG, Schmeer CW, Friese T, et al. In situ dividing and phag-ocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PloS One 2011;6:e22408.

31) Ogino H, Ito M, Matsumoto K, et al. Retinal degeneration induced by N-methyl-N-nitrosourea and detection of 7-methyldeox-yguanosine in the rat retina. Toxicol Pathol 1993;21:21-5.

32) Nickerson PE, Emsley JG, Myers T, Clarke DB. Proliferation and expression of progenitor and mature retinal phenotypes in the adult mammalian ciliary body after retinal ganglion cell injury. Invest Ophthalmol Vis Sci 2007;48:5266-75.

33) Lijinsky W, Kovatch RM, Saavedra JE. Carcinogenesis and muta-genesis by N-nitroso compounds having a basic center. Cancer Lett 1992;63:101-7.

www.ophthalmology.org 953

=ABSTRACT=

Expression Profiles of F4/80 and Nestin in Ocular Immune Cells Following Pharmaceutically Induced Retinal Degeneration in Adult Mice

Sang Il Ahn, MD, Young Hoon Ohn, MD, PhD, Tae Kwann Park, MD, PhD

Department of Ophthalmology, Soonchunhyang University Bucheon Hospital, Soonchunhyang University College of Medicine, Bucheon, Korea

Purpose: To evaluate the expression patterns of F4/80 and nestin in the ciliary body and the optic nerve following N-meth-yl-N-nitrosourea (NMU)-induced retinal degeneration in adult mice.Methods: After intraperitoneal injection of MNU (60 mg/kg) in adult mice, the eyes were enucleated at 2, 4, 7 and 30 days. Hematoxylin and eosin (H&E) stain, terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) stain and immunohistochemical stains of F/80 and nestin were performed.Results: After MNU treatment, the photoreceptors were destroyed by cell apoptosis. According to immunohistochemistry, F4/80 and nestin were not co-expressed in the control group, but F4/80 was expressed within the ciliary body and optic nerve in the MNU-treated group; the expression of nestin also increased. In the outer nuclear layer, F4/80 and nestin co-expressing cells were observed.Conclusions: In response to retinal damage, the F4/80 and nestin co-expressing cells migrated to the retina from the ciliary body and optic nerve and were activated.J Korean Ophthalmol Soc 2013;54(6):945-953

Key Words: F4/80, MNU, Nestin, Retinal degeneration

Address reprint requests to Tae Kwann Park, MD, PhDDepartment of Ophthalmology, Soonchunhyang University Bucheon Hospital#170 Jomaru-ro, Wonmi-gu, Bucheon 420-767, KoreaTel: 82-32-621-5426, Fax: 82-32-621-5435, E-mail: tkpark@schmc.ac.kr

-안상일 외 : 망막변성 생쥐에서 F4/80와 nestin의 발현-

34) Yoshizawa K, Tsubura A. [Characteristics of N-methyl-N-nitro-sourea-induced retinal degeneration in animals and application for the therapy of human retinitis pigmentosa]. Nippon Ganka Gakkai zasshi 2005;109:327-37.

35) Yoshizawa K, Nambu H, Yang J, et al. Mechanisms of photo-receptor cell apoptosis induced by N-methyl-N-nitrosourea in Sprague-Dawley rats. Lab Invest 1999;79:1359-67.

36) Yang J, Lin S, Hu S, et al. [The toxic effect of N-methyl-N- nitro-sourea on retina in rats]. Yan ke xue bao 2004;20:249-54.

37) Jeong E, Paik SS, Jung SW, et al. Morphological and functional evaluation of an animal model for the retinal degeneration induced by N-methyl-N-nitrosourea. Anat Cell Biol 2011;44:314-23.

38) Thanos S. Sick photoreceptors attract activated microglia from the ganglion cell layer: a model to study the inflammatory cascades in rats with inherited retinal dystrophy. Brain Res 1992;588:21-8.

39) Roque RS, Imperial CJ, Caldwell RB. Microglial cells invade the outer retina as photoreceptors degenerate in Royal College of

Surgeons rats. Invest Ophthalmol Vis Sci 1996;37:196-203.40) Caicedo A, Espinosa-Heidmann DG, Pina Y, et al. Blood-derived

macrophages infiltrate the retina and activate Muller glial cells un-der experimental choroidal neovascularization. Exp Eye Res 2005;81:38-47.

41) Kawaguchi A, Miyata T, Sawamoto K, et al. Nestin-EGFP trans-genic mice: visualization of the self-renewal and multipotency of CNS stem cells. Mol Cell Neurosci 2001;17:259-73.

42) Walcott JC, Provis JM. Muller cells express the neuronal progeni-tor cell marker nestin in both differentiated and undifferentiated human foetal retina. Clin Experiment Ophthalmol 2003;31:246-9.

43) Xue LP, Lu J, Cao Q, et al. Nestin expression in Muller glial cells in postnatal rat retina and its upregulation following optic nerve transection. Neuroscience 2006;143:117-27.

44) Xue LP, Lu J, Cao Q, et al. Muller glial cells express nestin coupled with glial fibrillary acidic protein in experimentally induced glau-coma in the rat retina. Neuroscience 2006;139:723-32.