自己免疫異常の検出指標：珪肺症での検証を背景に

2019.11/14

川崎医科大学医学部衛生学教授 大槻 剛巳

共同研究者 准教授 西村 泰光助教 李 順姫

じん肺

代表的なじん肺

肺病変

自己寛容の破綻

自己抗体の検出 SLE，強皮症

珪肺症例

Caplan 症候群(関節リウマチ)

珪肺症例の合併症

ANCA関連血管炎/腎炎

従来の考え方

珪酸粒子

アジュバントとして作用

自己抗原の抗原性を増強

免疫担当細胞に直接，作用して・・・T細胞などの変化をもたらす

自己寛容の調節異常

我々の考え方

その他多数の疫学調査結果が公表されている。

珪肺の経過中に末梢神経障害で発症した抗好中球細胞質抗体(ANCA)関連血管炎の1例(会議録/症例報告)：兵頭 正浩(川崎市立川崎病院 内科・総合診療科), 佐々木 雅世, 東野 俊洋, 田口 博章, 大曽根 康夫, 岡野 裕, 野崎 博之, 秋月 哲史： 日本内科学会関東地方会 618回 Page23(2015.10)

珪肺にびまん性肺胞出血で発症したANCA関連血管炎の一例(会議録/症例報告)：水橋 啓一(富山労災病院 アスベスト疾患センター)： 日本職業・災害医学会会誌 (1345-2592)62巻臨増 Page別152(2014.10)

肺胞出血を伴ったMPO-ANCA関連腎炎を発症し、剖検にて珪肺の合併を認めた1症例(原著論文/症例報告)：久米田 靖郎(景岳会南大阪病院 内科),北谷 香代子, 前野 孝明, 川口 祐司, 佐久間 知子, 廣渡 要, 森上 浩和, 澤 絢,宮越 一穂 , 小林 庸次： 南大阪病院医学雑誌 (0540-1259)60巻1号Page43-59(2013.04)

珪肺症に合併した顕微鏡的多発血管炎の1例(原著論文/症例報告)：中西 雅樹(京都府立医科大学 呼吸器内科), 伊達 紘二, 小山 泰則, 上田 幹雄, 有本太一郎, 岩崎 吉伸： 日本呼吸器学会雑誌 (1343-3490)49巻9号 Page636-641(2011.09)

職業的シリカ曝露の唯一の肺症状として胸膜炎を合併した顕微鏡的多発性血管炎(Microscopic Polyangiitis Accompanied by Pleuritis as the onlyPulmonary Manifestation of Occupational Silica Exposure)(英語)(原著論文/症例報告)：Shibuya Hideki(東京逓信病院 呼吸器内科), SanoHiroko, Osamura Kou, Kujime Kosei, Hara Kei, Hisada Tetsuya：Internal Medicine (0918-2918)49巻10号 Page925-929(2010.05)

珪肺症にANCA関連腎炎を合併した5症例についての検討(会議録)：中山和典(国立病院岡山医療センター 腎臓内科), 福岡 晃輔, 片山 尚美, 寺見 直人 , 太 田 康 介 ： 日 本 腎 臓 学 会 誌 (0385-2385)52 巻 3 号Page364(2010.05)

粉じん作業者にみられた腎障害 膜性腎症、MPO-ANCA陽性急速進行性糸球体腎炎、SLE関連wire-loop lesion(原著論文/症例報告)：海老原 勇(職業性疾患・疫学リサーチセンター)： 社会労働衛生 7巻1号 Page22-35(2010.01)

珪肺症患者における発熱、白血球減少および自己抗体の合併症に対するプレドニゾロン治療の奏効例 (Fever, Leukopenia and AutoantibodyComplications in a Patient with Silicosis Successfully Treated withPrednisolone)(英語)(原著論文/症例報告)：Matsui Kumiko(山口県立総合医療センター 血液内科 ), Tanaka Yoshinori, Matsuda Kazuhiro,Shinohara Kenji： The Bulletin of the Yamaguchi Medical School(0513-1812)53巻3-4号 Page45-48(2006.12)

珪肺とANCA陽性血管炎の合併

珪肺症に合併し,メサンギウム領域にIgA沈着を認めたANCA関連腎炎の1例(原著論文/症例報告)：岩津 好隆(自治医科大学 内科学講座腎臓内科学部門),井上 真, 小林 高久, 宮田 幸雄, 田中 亨, 斉藤 建, 浅野 泰, 草野 英二： 腎と透析 (0385-2156)59巻3号 Page563-566(2005.09)

珪肺症に合併したMPO-ANCA関連腎炎の1例(会議録/症例報告)：下芝 英明(京都大学 臨床病態医科学), 向山 政志, 横井 秀基, 澤井 一智, 吉本 明弘,吉岡 徹朗, 森 潔, 菅波 孝祥, 八幡 兼成, 槙野 久士, 永江 徹也, 藤永 有理子,越川 真男, 菅原 照, 中尾 一和： 日本腎臓学会誌 (0385-2385)44巻6号Page531(2002.08)

肺胞出血合併MPO-ACNA関連腎炎を呈した珪肺症の1例(原著論文/症例報告)：中島 英明(関西労災病院), 宮崎 睦雄, 今井 信行, 横川 朋子, 山本 茂生： 日本腎臓学会誌 (0385-2385)43巻4号 Page351-356(2001.05)

珪肺症経過中に発症したMPO-ANCA関連腎炎の1症例(会議録/症例報告) ：高根 裕史(水戸赤十字病院), 佐藤 敦久, 鴫原 寿一, 佐々木 誠一： 日本腎臓学会誌 (0385-2385)42巻6号 Page551(2000.09)

珪肺症症例におけるMPO-ANCAの検討(会議録) ：藤井 亜砂美(杏林大学医 第1内科), 有村 義宏, 丸茂 朋史, 小路 仁, 白矢 勝子, 中林 公正, 長澤 俊彦 , 植木 絢子： 日本臨床免疫学会会誌 (0911-4300)23巻 4号Page406(2000.08)

珪肺症経過中に発症した抗好中球細胞質抗体(MPO-ANCA)関連疾患の2症例(原著論文/症例報告) ：小浦方 啓代(長岡赤十字病院), 佐伯 敬子, 宮村 祥二, 鈴木 栄一, 中野 正明, 下条 文武, 荒川 正昭： リウマチ (0300-9157)39巻6号 Page841-846(2000.01)

珪肺症にP-ANCA陽性の急速進行性糸球体腎炎を伴った1例(会議録/症例報告) ：中川 洋一(栃木県厚生農業協同組合連合会下都賀総合病院), 轡田 達也,風間 順一郎, 上野 光博, 今井 直史, 大澤 豊, 荒川 正昭, 下条 文武, 高宮 治生： 日本腎臓学会誌 (0385-2385)41巻6号 Page624(1999.09)

肺胞出血合併P-ANCA関連腎炎を呈した珪肺症の1例(会議録/症例報告) ：中島 英明(関西労災病院), 宮崎 睦雄, 山本 茂生, 今井 信行, 横川 朋子： 日本腎臓学会誌 (0385-2385)41巻6号 Page544(1999.09)

珪肺症経過中に発症したp-ANCA関連疾患の2症例(原著論文/症例報告) ：小浦方 啓代(長岡赤十字病院), 佐藤 和弘, 佐伯 敬子, 宮村 祥二, 荒川 正昭： 中部リウマチ (0916-6033)30巻2号 Page167-168(1999.05)

珪酸粒子

反応性T細胞

制御性T細胞(CD4+25+FoxP3+)

Th17 細胞

慢性活性化

Fas/CD95

Fas/CD95

Fas/CD95

Fas/CD95 PD-1

CD25

CD25

FoxP3

可溶性Fas

DcR3

可溶性IL-2R

Fas/CD95 PD-1CD25

CD25

Fas/CD95CD25

反応性T細胞

制御性T細胞

?

従来の研究で，珪酸粒子の慢性曝露は，自己抗原も含む抗原に反応する反応性T細胞とともに，制御性T細胞の慢性活性化を誘導し，反応性T細胞はFas媒介のアポトーシスを中心とする細胞死から逃れ長期生存にいたり，制御性T細胞ではFas分子の過剰発現から早期の細胞死がもたらされ，このアンバランスに

よって，自己寛容の破綻に導かれると考えている。

珪酸は緩やかながら確実に末梢血T細胞を刺激

0

.01

.02

相対的PD-1遺伝子発現レベル

(gapdh発

現との比較

)CD4+CD25-

CD4+CD25+

CD4+CD25-

CD4+CD25+

健常人 珪肺症

珪肺症あるいは健常人のCD4+25-あるいはCD4+25+分画の活性化指標としてのPD-1の遺伝子発現

Fas/CD95 PD-1

CD25

可溶性Fas

DcR3

Soluble IL-2R

可溶性Fas (ng/ml, serum)健常人(n=30) 1.97±0.56珪肺症 (n=64) 2.61±0.79

(p<0.05)

可溶性/膜型（野生型） Fas mRNA 発現比（末梢血単核球）健常人(n=30) 0.48±0.16珪肺症 (n=64) 1.58±0.62

(p<0.01)

DcR3 mRNA発現比（末梢血単核球）健常人(n=30) 0.36±0.11珪肺症 (n=64) 0.41±0.12

(p<0.03)

可溶性 IL-2R (pg/ml, serum)健常人(n=30) 857±352

珪肺症 (n=64) 1,047±1,030(p=0.0506)

HDSIL

SSc

p=0.0018p=0.0506

可溶性

IL-2

R

自己免疫異常の度合い

反応性T細胞の変化

細胞死抵抗性

慢性活性化

自己寛容の破綻

制御性T細胞の機能・サイズの減弱 ?

制御性T細胞CD4+25+Foxp3+

珪酸T responderCD4+25-

活性化T細胞CD4+25+

CD95/Fas 高発現

Fas媒介アポトーシスに高感受性

PD-1

PD-1

慢性活性化

Fas

慢性活性化

PD-1 高発現

制御性T細胞の喪失

CD25CD25

制御性Ｔ細胞 活性化Ｔ細胞

sIL2R (CD25) ↑

珪肺例CD4+CD25+分画における活性化Ｔ細胞の混入の可能性

珪肺症例

健常人

3H

-TdR

取り込み比

(%)

1:0 1:1/8 1:1/4 1:1/2 1:1 0:1CD4+25-：CD4+25+

細胞混合比率

p=.0407

p=.0009

0

20

40

60

80

100

120

珪肺症例 5例 男性岡山県備前市耐火煉瓦工場従業員

年齢 67.00±5.57健常人 4例男:女=2：2，年齢 35.50±5.45

Documented informed consent (+)

アロ抗原 + + + ++ +

珪肺症例CD4+25+細胞機能解析

http://scienceandtechnology.jp/archives/28303

CD95－

6.9

CD95－(CD95)－

6.9

Fas

CD95－

59.9

CD95－(CD95)－

59.9

Fas

Foxp3

CD4－

FoxP3

－

3.6

CD4－

FoxP3

－

CD4－

FoxP

3－

3.6

健常人

制御性T細胞

反応性T細胞

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900 *

平均蛍光強度

CD95

健常人

珪肺症

健常人

珪肺症

CD95/Fasは反応性T細胞より制御性T細胞で高発現

CD95/Fas膜表面発現は制御性T細胞分画で珪肺症例が有意に高い

0

5

10

15

20

25

30

35

40

ＨＤ Ｓｉｌ ＨＤ Ｓｉｌ

4＋25- 4＋25-

6hr 12hr

CD4+CD25-

Fasに関連した細胞死

(%)

HDSil SilHD

6hr 12hr

0

5

10

15

20

25

30

35

40

ＨＤ Ｓｉｌ ＨＤ Ｓｉｌ

4＋25＋ 4＋25＋

6hr 12hr

Fasに関連した細胞死

(%)

CD4+CD25+

*

HDSil SilHD

6hr 12hr

健常人

PBMC

FACS sorting

CD4+CD25+

CD4+CD25-

CD95 agonistic Ab (CH11)

Annexin V

PI

HD:健常人Sil:珪肺症

珪肺症由来の制御性T細胞は，健常人由来制御性T細胞よりもCD95媒介アポトーシスに感受性が高い

珪肺症

珪酸:25~50 μg/ml24 平底フラスコ

末梢血単核球:1×106/ml

FACS 解析

末梢血単核球

Day 4

CD4+Foxp3+

0

1

2

3

4

5

0.5 1 1.5 2 2.5

none silica

Day 4

CD4+Foxp3+

none 珪酸day 4

細胞割合（％）

*

Foxp3+/25+

0

1

0.5 1 1.5 2 2.5

none silica

Day 4

Foxp3+ / CD25+

none 珪酸day 4

Ratio

*

CD25：活性化T細胞を含む

健常人

Foxp3+/CD25+

0

1

0.5 1 1.5 2 2.5

Day1 ,Day4

silica

Foxp3+ / CD25+

day1 day 4 珪酸

Ratio

CD4+CD25+

0

2

4

6

8

10

12

14

0.5 1 1.5 2 2.5

Day1, Day4silica

CD4+CD25+

day1 day 4 珪酸

細胞割合（％）

*CD4+Foxp3+

細胞割合（％）

0

1

2

3

4

5

0.5 1 1.5 2 2.5

day1 day 4 珪酸

末梢血単核球への in vitroでの珪酸曝露はFoxP3陽性の制御性T細

胞を喪失させる

（CD25+）-(Foxp3+)

HD SIL

(CD25+)-(Foxp3+)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

細胞割合

(%)

*

HD:健常人 Sil:珪肺症

珪肺症例ではその末梢血に活性化した反応性T細胞を健常人より多く含む

珪肺症における多様な自己抗体の検出

B細胞/

形質細胞への影響

珪酸粒子

•ANA•Scl-70-Ab•CENP-B Ab•ANCA•Fas-Ab•Caspase-8 Ab•Desmoglein-Ab

B細胞/形質細胞

珪肺症

珪肺症/肺線維化の進行

肺障害

自己免疫疾患

珪酸粒子 B細胞/形質細胞樹状細胞

膜貫通ドメイン

活性化

CD95

CD95/Fas

CD95/Fas

過剰発現：CD95

不均衡

CD69

可溶性IL-2受容体

Fas選択的スプライシング・バリアント

DcR3

活性化指標

PD-1

可溶性Fas

Th17細胞

Fas媒介アポトーシスの抑制

炎症と線維化

4-1BB (CD137)

Wnt/β-catenin

IL-1β/IL-17

MyD88

MARCO(受容体)

慢性活性化

慢性活性化

自己免疫疾患の萌芽を確実に捉える！

自己免疫疾患発症前に何が起きている？

珪肺症患者で自己免疫疾患が頻発することに注目

特願2017-192501

方法健常人 １９名

（男性８名、女性１１名、平均年齢４４．８４±８．５８歳）

珪肺症例 ２０名 （自己免疫疾患未発症）（男性１９名、女性１名、平均年齢７４．８５±５．３５歳）

血漿中サイトカインおよび自己抗体の測定はELISAで測定。統計ソフトSPSS ver.22(IBM)の自動線形モデリングで解析

重回帰分析SPSS(IBM) 回帰−自動線形モデリングによるcondition 予測式

• 目標：condition (HVを１、Silを２）

• 予測変数：１９因子

DcR3 IL2Ra IL10 IL1alpha IL6sR IL6 TGFb1 GCSF IgG I

gA IgE IgM IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 BAFF LAG3 sFAS

condition= ( a x sFAS ) + ( b x IgG4 ) + ( c x IL-6 ) + d

特願2017-192501

condition IL6 FAS(1/1000) IgG4欠損値除外

predicted result

HV

1 1.02389378 9.03673 0.089893761 1.294337671 1.136850118AVERAGE

1 0.732424654 8.46033 0.14355708 1.265593501 0.140651078STDEV

1 0.551738343 9.31505 0.0416057 1.248270371

1 3.878104179 7.46422

1 1.98870353 5.7208 0.309556049 1.190166788

1 0.125321306 7.04711 0.174471913 1.094463691

1 0.466661905 7.15978 0.056913158 1.003045559

1 2.045487041 5.83721

1 0.249499121 7.49615 0.083965363 1.059017479

1 0.431821074 6.463 0.084269521 0.947152944

1 0.133067222 5.8206 0.334793807 1.119388183

1 0.798369419 8.88153

1 0.862514455 6.16783 0.049443644 0.900418716

1 2.073279721 6.5935 0.237900566 1.222838305

1 1.945315995 7.24009 0.031888241 1.073241554

1 2.850401659 5.9367

1 0.559495333 6.5283 0.122123839 1.002695565

1 0.863004562 9.69947 0.107132743 1.382036305

1 1.723783205 6.25004 0.321380215 1.250085137

Sil

2 1.780425667 6.62606 0.421898841 1.405024722 1.858470052AVERAGE

2 5.643076747 10.64291 0.410295213 2.098591629 0.357683542STDEV

2 3.977437504 11.93063 0.191985279 1.921494134

2 8.761391992 8.09892 0.205056534 1.761668703

2 2.458017269 8.41333 0.192106446 1.413418441

2 2.336985508 11.69275 0.307343858 1.919025916

2 1.602645627 8.6167 0.569392462 1.788207579

2 1.582612349 10.15768 0.097752377 1.469048825

2 7.594224121 14.76203 0.12012021 2.395428576

2 7.561689183 11.39434 0.040910039 1.908553493

2 4.147211814 10.53707 0.432138901 2.020960478

2 22.26995655 8.02002 0.357028917 2.710831556

2 2.220291839 10.79384

2 4.446563963 11.18474 0.401116245 2.082717902

2 1.721608806 9.33047 0.059421696 1.338066113

2 1.102202027 12.01965 0.171416813 1.740584342

2 4.286066446 11.06469 0.478067253 2.14076152

2 1.982742276 10.97452 0.106443735 1.599099364

2 3.116806753 15.90491

2 2.257299524 11.33452 0.182492087 1.73897764

HV=15, SIL=18

重回帰分析 SPSS(IBM) 回帰−自動線形モデリングによる

特願2017-192501

予測値からのROC解析

感度−(1-特異）の値が最も大きい値がカットオフ値

感度94.4%カットオフ値1.3935

欠損値省く

より大きいか、等しい場合に正 感度 1 - 特異

-0.0996 1 1 0

0.9238 1 0.933 0.067

0.9749 1 0.867 0.133

1.0029 1 0.8 0.2

1.031 1 0.733 0.267

1.0661 1 0.667 0.333

1.0839 1 0.6 0.4

1.1069 1 0.533 0.467

1.1548 1 0.467 0.533

1.2065 1 0.4 0.6

1.2356 1 0.333 0.667

1.2492 1 0.267 0.733

1.2578 1 0.2 0.8

1.28 1 0.133 0.867

1.3162 1 0.067 0.933

1.3601 0.944 0.067 0.877

1.3935 0.944 0 0.944

1.4092 0.889 0 0.889

1.4412 0.833 0 0.833

1.5341 0.778 0 0.778

1.669 0.722 0 0.722

1.7398 0.667 0 0.667

1.7511 0.611 0 0.611

1.7749 0.556 0 0.556

1.8484 0.5 0 0.5

1.9138 0.444 0 0.444

1.9203 0.389 0 0.389

1.9712 0.333 0 0.333

2.0518 0.278 0 0.278

2.0907 0.222 0 0.222

2.1197 0.167 0 0.167

2.2681 0.111 0 0.111

2.5531 0.056 0 0.056

3.7108 0 0 0

特願2017-192501

ROC解析により感度94.4%、カットオフ値1.3935

cut off=1.3935

偽陽性 0

偽陰性 1

predicted result Psuedo signal

HV

1.294337671

偽陽性なし＞1.3935

1.265593501

1.248270371

1.190166788

1.094463691

1.003045559

1.059017479

0.947152944

1.119388183

0.900418716

1.222838305

1.073241554

1.002695565

1.382036305

1.250085137

Sil

1.405024722

偽陰性１検体＜1.3935

2.098591629

1.921494134

1.761668703

1.413418441

1.919025916

1.788207579

1.469048825

2.395428576

1.908553493

2.020960478

2.710831556

2.082717902

1.338066113

1.740584342

2.14076152

1.599099364

1.73897764

特願2017-192501

• 自己免疫疾患の未発症の状態を捉えるツールは現状無い。

• 自己免疫疾患そのものは、末梢血中の自己抗体の出現などで判断でき

る。しかし、それは発症後であり、未発症の状態を捉えたものではな

い。

• 本発明の優れた点は、自己抗体ではない血中因子の変動、しかもたっ

た３つの項目（sFAS、IgG4、IL-6）で自己免疫疾患の萌芽を捉える

ことが可能になる点である。

• 本技術の適用としては、珪肺症に代表される、塵肺患者、様々な化学

物質に曝露される人々の健康診断項目や、自己免疫疾患が頻発する若

年層女性などの一般健康診断項目に加えることを想定している。

• 自己免疫疾患とは無縁と考え、早期診断の機会を失う人々を救うこと

が出来るようになる。

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