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10xgenomics.com/cn/spatial-gene-expression
走进 Visium 空间技术技术介绍和样本制备指南
Visium空间基因表达解决方案将高通量且无偏好的总mRNA分析融入到带有形态背景的完整组织切片上，提供了一个之前难以实现的组织生物学视角。Visium空间基因表达玻片将这两种研究组织的互补方法合二为一。
不仅仅是一张组织切片利用新的空间条形码技术和poly A开展文库制备，对玻片上复杂的组织样品进行空间基因表达定位。
对新鲜冷冻的组织进行切片，并将其放置在带有数千个条形码斑点（spot）的玻片上，每个斑点所包含的数百万条捕获寡核苷酸均带有斑点特异性的空间条形码（图1）。对组织切片进行固定、染色和透化处理后，它们释放出的mRNA与组织相应位置附近的捕获寡核苷酸相结合，并开始进行
双重力量: 基因表达的检测和定位
图1. 此图展示了Visium空间基因表达玻片的组成。每张玻片包含4个捕获区域，每个捕获区域含有约5000个带有条形码的斑点，而每个斑点又包含数百万条带有空间条形码的捕获寡核苷酸。组织mRNA在释放后与带有条形码的寡核苷酸相结合，可实现基因表达信息的捕获。
图2. 这是一张叠加了空间基因表达信息的小鼠冠状脑切片。这些斑点与Selenow和Hpca的mRNA相对应，已知这两个基因在小鼠海马体中有显著表达。
Selenow ExpressionSelenow UMI
5004003002001000
300
200
100
0
Hpca ExpressionHpca UMI
逆转录反应（此时组织保持在原位），生成了带有空间条形码并保留空间信息的cDNA文库。带有条形码的cDNA文库可映射回捕获区域的特定斑点。随后将这种基因表达数据与组织切片的高分辨率显微镜图像相叠加（图2），从而能够以空间分辨率的方式观察组织形态背景下任一条mRNA或多条mRNA组合的表达。
10x Genomics | Visium | 空间基因表达
Visium空间基因表达解决方案可在现有的实验室基本设施环境下轻松开展，使用标准的实验室方法和工具进行组织分析。空间基因表达文库构建的整个过程只需要一天，您也可以在关键步骤暂停，以便之后继续进行实验。
文库构建步骤指南 对新鲜冷冻的组织样品进行切片，并将其放置在Visium空间基因表达玻片上的4个捕获区域内。
采用标准的固定和染色技术，包括苏木精和伊红（H&E）染色，即可观察玻片上的组织切片。显微镜推荐详见最后一页的“实验室准备指南”。
之后对组织进行透化处理，以释放出细胞中的mRNA。 mRNA与斑点上带有空间条形码的寡核苷酸相结合。通过逆转录反应从捕获的mRNA中生成cDNA。随后合成cDNA 的第二条链，并使其变性。请注意，如果您是第一次在此组织上使用Visium解决方案，那么您需要事先进行组织优化。
文库构建: 工作原理
图3. 该图概述了如何使用Visium空间基因表达解决方案构建测序文库。
走进Visium空间技术
将带有条形码的cDNA混合，进行下游处理和文库制备，并扩增cDNA。采用后续步骤对cDNA进行片段化和处理，获得立即可测序的文库。最后是样品index PCR。
Visium空间基因表达文库采用标准的短读长测序仪进行测序，并使用10x Genomics的软件Space Ranger Analysis Pipelines 和 Loupe Browser对数据进行分析处理和可视化。
成像系统和规格参数
显微镜 任何具有以下等效功能的系统都可以用于成像。
Nikon Nikon Eclipse Ti2，带有明场和荧光功能（TRITC）
Molecular Devices ImageXpress Nano Automated Cell Imaging System
显微镜参数
物镜
• 4X (Plan APO λ; NA 0.20)
• 10X (Plan APO λ; NA 0.45)
• 20X (Plan APO λ; NA 0.75)
扫描台 显微镜tile扫描功能是必需的，以便对Visium空间玻片上捕获区域内的组织切片进行成像。
明场参数
• 彩色相机（3 x 8 bit，2424 x 2424像素分辨率）
• 白平衡功能
• 最小捕获分辨率 2.18 μm/像素
• 曝光时间 2-10毫秒
荧光参数*
*仅在Visium空间组织优化操作和验证Visium空间成像测试玻片时需要
• 波长范围为380-680 nm的光源（或等效光源）
• 单色相机（14 bit，2424 x 2424像素分辨率）
• TRITC滤光块（激发波长542/20，发射波长620/52）（仅在组织优化操作时需要）
• 最小捕获分辨率 2.18 μm/像素
• 曝光时间 100毫秒-2秒
其他参数
图像格式 以jpeg或tiff格式保存图像
计算机 计算机有足够能力处理大图像（0.5-5 GB）
软件 图像拼接软件 （显微镜自带的软件或类似软件，如Image J）
10x Genomics致力于使您和您的研究团队尽可能轻松高效地采用Visium空间表达解决方案。以下是显微镜方面的一些考虑因素，可帮助您无缝过渡到Visium解决方案。
实验室准备指南
© 2019 10X Genomics, Inc. FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.LIT000060-CN Rev B Inside Visium Spatial Technology Brochure
联系我们 support.10xgenomics.com | [email protected]
关于所需试剂的完整列表，请参阅用户指南。
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