食肉中に残留する抗菌性物質の微生物学的簡易検査法

誌名誌名 食品衛生学雑誌

ISSNISSN 00156426

著者著者

堀江, 正一小林, 晴美石井, 里枝井部, 明広藤田, 和弘丹野, 憲二中澤, 裕之

巻/号巻/号 49巻3号

掲載ページ掲載ページ p. 168-176

発行年月発行年月 2008年6月

農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波産学連携支援センターTsukuba Business-Academia Cooperation Support Center, Agriculture, Forestry and Fisheries Research CouncilSecretariat

168 食衛誌 Vol. 49. NO.3

報文

食肉中に残留する抗菌性物質の微生物学的簡易検査法

(平成 20年 1月 19日受理)

堀江正一1.* 小 林晴 美l 石井里枝l 井部明広2

藤田 和弘3 丹野憲 二3 中津裕之4

Simple and Rapid Microbiological Method for Determination of

Residual Antibacterials in Meat

Masakazu HORIE'. *. Harumi KOBAYASHI'. Rie ISHI!'. Akihiro IBE2• Kazuhiro FUJITA3• Kenji TANN03 and Hiroyuki NAKAZAWA4

(' Saitama Prefectural Institute of Public Health: 639-1 Kamiokubo. Saitama. Sakura-ku. Saitama 338-0824. Japan; 2 Tokyo Metropolitan Institute of Public Health: 3-24-1 Hyakunin-cho.

Shinjuku-ku. Tokyo 169-0073. Japan; 3 Japan Food Research Laboratories: 52-1 Motoyoyogi-cho. Shibuya-ku. Tokyo 151-0062. Japan; 4 Department of Analytical Chemistry. Hoshi University: 2-4-41 Ebara. Shinagawa-ku，

Tokyo 142-8501， Japan; * Corresponding author

A simple and rapid screening method using bioassay for the simultaneous analysis of antibacterials (penicillins， cephalosporins， macrolides. tetracyclines. quinolones， etc.) in meat has been developed. A 5 g sample was homogenized with 5 mL of methanol， and the homogenate was centrifuged for 10 min with 3.000 rpm. The pulp disk method with Bacillus subtilis BGA (Anti-biotic Medium 5 (pH 8) and 8 (pH 6))， Micrococcus luteus A TCC 9341 and Geobacillus stearothermo-philus as test organisms was employed for the assay of the antibacterials. Typical antibacterials (penicillin G. ampicillin. cefapirin， cefalexin. erythromycin， spiramycin， oxytetracycline. chlortetra-cycline， streptomycin， dihydrostreptomycin. enroftoxacin and oxolinic acid) were detected at levels of ca. 0.005-2.5μg/g in meat. Therefore. we recommend this proposed screening method for routine analysis of residual antibacterials in livestock products.

(Received January 19，2008)

Key words: 抗菌性物質 anti bacterials;残留分析 residualanalysis;食肉 meat;微生物学的試験法bioassay

緒 言

畜水産動物の疾病予防および治療を目的に数多くの抗菌

性物質が使用され，畜水産物の生産性向上に大きく寄与し

ている. しかし， 一方ではこれら薬物の畜水産物中への残

留が食品衛生上懸念されおり '1.21 残留の有無を確認する

簡易かっ迅速な試験法の確立が必要とされている.残留抗

菌性物質の試験法は，微生物学的試験法と理化学的試験法

に大別される.このうち，微生物学的試験法とは，抗菌性

*連絡先

l埼玉県衛生研究所;干338-0824さいたま 市桜区上大久保639-1

2 東京都健康安全研究センタ ー:干161-0073東京都新宿区百人町 3-24ーl

3 (財)日本食品分析センター 〒151-0062東京都渋谷区元代木々町52-1

4 星薬科大学薬品分析化学教室:干142-8501東京都品川区江原 2-4-41

物質が有する微生物の増殖を抑制する作用 (抗菌作用)を

指標とした試験法であり，形成された阻止円の大きさを測

定することにより，試料中の抗菌性物質の量を求めること

ができる.抗生物質をはじめとする抗菌性物質の残留分析

には，従来から微生物学的試験法が汎用されてきた3ト 111

現在，日常検査には平成 6年に厚生省か ら示された 「畜

水産食品中の残留抗生物質簡易検査法 (改訂)J31が汎用 さ

れている. しかし本検査法は，試料 5gをクエ ン酸・ア

セトン緩衝液 20mLでホモ ジナイズ抽出し，その上清を

試験溶液としている.すなわち，試料中の抗菌性物質を 5

倍希釈する結果となり，検出感度の面で改善の余地があ

る.そこで今回，畜産食品中に残留する可能性が高いペニ

シリン系抗生物質，セフ ァロスポリン系抗生物質，テ卜ラ

サイクリン系抗生物質，マクロライド系抗生物質，キノロ

ン系抗菌剤なと‘を中心とした，より多くの抗菌性物質の残

留の有無をより簡易かっ迅速にスクリーニ ングできる実用

June 2008 食肉中に残留する抗菌性物質の微生物学的簡易検査法 169

的な残留試験法の構築を試みた.併せて，検査用試験菌と

して市販されている芽胞菌液の適用性を検討した.

実験 方法

1. 試料および試薬

試料:埼玉県内で市販されていた抗菌性物質が残留して

いない牛，豚，鶏の筋肉部および肝臓を用いた.

標準抗菌性物質:ペニシリン系抗生物質 10種，セファ

ロスポリン系抗生物質8種，マクロライド系抗生物質 12

種，アミノグリコシド系抗生物質 10種，テトラサイクリ

ン系抗生物質4種，ポリペプチド系抗生物質9種，ポリ

エーテル系抗生物質6種，クロラムフェニコールなど，

抗生物質 69種 (Table4). サルファ剤 22種，キノロン剤

17種，フロルフェニコールなど，合成抗菌剤 53種

(Table 5). 合計 122種類の抗菌性物質を用いた.標準品

は，いずれも常用標準品，残留動物用医薬品標準品あるい

は純度表記のあるものを用いた.

標準溶液:それぞれの標準品約 10mgを正確に量り，

アミノグリコシド系抗生物質は精製水 50mL，その他の

標準品はメタノール 50mLに溶解して，標準原液を調製

し，適宜， 10% メタノールで希釈して標準溶液とした.

なお，メタノールに溶解しにくいオキソリン酸，ナリジク

ス酸などのキノロン剤にあっては 0.02moljL NaOH溶液

5mLで，ナイカルパジンにあっては 5mLのジメチルス

ルホキシド (DMSO)を用いて溶解後，メタノーノレに溶解

した.また，標準原液は 300

C冷凍保存とし，標準溶液

は用時調製とした.

実試料を用いた簡易検査法の検討には，代表的な抗菌性

物質として，ペニ シリン系抗生物質のアンピシリン

(ABPC)，ベンジルペニシリン (PCG)，セファロスポリン

系抗生物質のセファピリン (CEPR)，セフ ァレキシン

(CEX)，マ クロライド系抗生物質のエリスロマイシン

(EM)，スピラマイシン (SPM)，アミノグリコシド系抗生

物質のストレプトマイシン (SM)，ゲンタマイシン (GM)，

テトラサイクリン系抗生物質のオキシテトラサイクリン

(OTC)，クロルテトラサイクリン (CTC)，キ ノロン剤のエ

ンロフロキサシン (ERFX)，オキソリン酸 (OXA)，計 12

種を用いた.

2. 器材および装置

ペトリ皿(シャーレ):合成樹脂製で，内径 90mmの

滅菌したものを用いた.

パルプディスク :アドパンテック東洋(株)製の直径 10

mm，厚さ1.1mm (吸水量 0.07-0.08 mL)の厚手のパ

ルプディスクを 1210C，15分間高圧滅菌後，十分乾燥さ

せてから用いた.

ホモジナイザー: (株)マイクロテック ・ニチオン製のヒ

スコトロン NS-50型を用いた.

3. 微生物学的試験法

供試試験菌:試験菌として Bcacillussubtilis A TCC

6633 (B.s A TCC 6633)， Bacillus mycoides A TCC 11778

(B. m ATCC 11778)， Micrococcus luteus A TCC 9341

(M.l ATCC 9341;最近 Kocuriarhizoρhila A TCC 9341

と名称が変更された)， Bcacillus subtilis BGA (B. s

BGA:市販芽胞菌液 Merck社製)， Bacillus stearother-

mophilus var. calidolactis C-953 (calidolactis C-953)お

よび Geobacillusstearothermophilus (G. stearothermo-

philus:市販芽胞菌液 Merck社製)を用いた.B.s

ATCC 6633，M.l ATCC 9341，B.m ATCC 11778および

calidolactis C-953試験菌液は，通知試験法等3).12)に準拠

して調製した.

検査用平板:Difco社製の AntibioticMedium 8 (AM8

培地)， Antibiotic Medium 5 (AM5培地)および Merck

社製の残留薬剤テスト用寒天培地を使用した.これらの培

地を 1210

C，15分間高圧滅菌後，約 500

Cに保温し，こ

れに B.sA TCC 6633 (AM 5培地使用)， B.m ATCC

11778 (AM8培地使用)， B.s BGA (AM5および AM8

の2種類使用)および G.stearothermoμzilus (残留薬剤

テスト用寒天培地使用)は，培地の 1/100量の芽胞菌液

を，M.l ATCC 9341 (AM5培地)および calidolαctisC-

953 (残留薬剤テスト用寒天培地)はそれぞれ培養菌液を

培地の 1/10量加え，十分に混合した後，その 8mLをペ

トリ皿に注入して検査用平板培地を作製した.

試験法:パルプディスクを試験溶液に浸漬し，検査用平

板培地上に置いた.それらの平板培地は，約 40Cで 30分

間放置した後，B.s ATCC 6633， B.m ATCC 11778， M.l

ATCC 9341およびB.sBGA は300Cで 18時間，G. stear-

othermophilusおよび calidolactisC-953は， 500Cで6時

間培養した.パルプディスク周辺に出現した阻止円の直径

をノギスで測定して，直径 12mm以上のものを陽性とし

た.

4. 検出下限値

0.001-50μg/mLの範囲で各抗菌性物質について，阻

止円が形成される前後の適切な数段階濃度の標準溶液を調

製し，微生物学的試験法に供した.各抗菌性物質につい

て，阻止円Cl2mm以上)が観測された最小濃度を検出

下限値とした.

5. 簡易検査法試験溶液の調製

試料 5gを50mLポリプロピレン製遠心チューブに採

り，メタノール 5mLを加えて 1分間ホモジナイズし，

10oC， 3，000 rpmで 10分間遠心分離後，その上清を試験

溶液とした.

結果および考察

1. 公定法試験菌および市賑芽胞菌の感受性の比較

B.s A TCC 6633は，抗菌性物質の残留試験法に最も汎

用されている試験菌であり，日本でも汎用されてい

る3)-5) 一方，B.s BGAはEUで汎用されている試験菌で

あり 8)，9)，調製された芽胞菌液が市販されている.そこで，

代表的な抗生物質，合成抗菌剤 12種に対する B.sATCC

6633および B.sBGAの感受性の比較を行ったところ，

170 食衛誌 Vol. 49， NO.3

Table J. Comparison of test organisms for limit of detection of antibacterials

Detection Iimit (μg/mL)

Antibacterial B.s A TCC 6633 B.s BGA (AM 5) (AM 5)

Ampicillin 0.05 0.05 Penicillins

Benzylpenicillin 0.1 0.1

Cephalosporins Cephapirin 0.5 0.5 Cephalexin 5 5

Macrolides Erythromycin 。目l 0.1 Spiramycin

Aminoglycosides Streptomycin 0.5 Gentamycin 0.5

Tetracyclines Oxytetracycline 5 10 Chlortetracycline 0.1 0.5

Quinolones Enrofloxacin 0.25 0.25 Oxolinic acid 0.5 0.5

The detection limit is the smallest concentration that forms an inhibition zone (> 12 mm)

Table 2. Comparison of test organisms for limit of detection of antibacterials

An ti bacterial

Penicillins

Cephalosporins

Macrolides

Aminoglycosides

Tetracyclines

Quinolones

Ampicillin Benzylpenicillin

Cephapirin Cephalexin

Erythromycin Spiramycin

Streptomycin Gentamycin

Oxytetracycline Chlortetracycli ne

Enrofloxacin Oxolinic acid

Detection limit (μg/mL)

calidolactis G. stearothe門nophilus

C-953

0.0005 0.001 0.001 0.001

0.002 0.002 0.01 0.01

5 5

5 5 0.5

0.25 0.1 0.25 0.5

0.5 5 5

The detection limit is the smallest concentration that forms an inhibition zone (> 12 mm).

ほぼ同等の感受性を示した (Table1).

次に.calidolactis C・953であるが， βーラクタム系抗生

物質を感度良く検出できることから国際酪農連盟 (IDF)ス

タンダー ド12)として用いられてきた.そこで.calidolac-

tis C・953および芽胞菌液として市販されている G.stear-

othermoρhilusの代表的な抗生物質，合成抗菌剤 12種に

対する感受性の比較を行ったところ，ほぼ同等の感受性が

得られた (Table2).

今回，公定法試験菌の代替菌として，市販されている芽

胞菌液の適用性の検討を行った結果，市販芽胞曹の感受性

は公定法試験菌とほぼ同等であり，代替菌として用いるこ

とが可能であった.

Table 3. Comparison of test organisms for limit of detec-tion of tetracyclines

Detection limit (μg/mL)

Tetracycline B.s BGA B.m ATCC (AM 8) 11778 (AM 8)

Oxytetracycline 0.25 0.1 Chlortetracycline 0.05 0.05 Tetracycline 0.25 0.1 Doxycycline 0.05 0.05

The detection limit is the smallest conc巴ntrationthat forms an inhibition zone (> 12 mm).

June 2008 食肉中に残留する抗菌性物質の微生物学的簡易検査法 171

Table 4. Detection limits of antibiotics

Detection limit (μg/mL)

Antibiotic B.s BGA B.s BGA M.l ATCC G. stearother-(AM8) (AM 5) 9341 mothilus

Penicillins Amoxicillin 0.25 0.1 0.025 0.001 Ampicillin 0.05 0.05 0.01 0.001 Aspoxicillin 2.5 0.5 0.001 Benzylpenicillin 0.05 0.1 0.01 0.001

Cloxacillin 0.25 2.5 2.5 0.001

Dic10xacillin 0.25 0.002 Mecillinum >5 >5 >5 0.1 Nafcillin 0.5 2.5 0.05 。目01

Oxacillin 0.1 2.5 0.25 。目01

Penicillin V 0.01 0.1 0.05 0.001

Cephalosporins Cefoperazone 2 >50 0.5 0.001

Cefuroxime 0.25 >50 0.5 0.001 Cephapirin 0.01 0.5 0.1 0.002 Cephalonium 0.25 5 0.005 Cephalexin 0.5 5 0.5 。目01

Cefquinome 2.5 0.25 0.1 Ceftiofur 0.05 2.5 0.1 。目0005

Cephazolin 5 10 10 0.002

Macrolides Erythromycin 0.5 0.1 0.05 Oleandomycin 5 0.5 0.25 25 Kitasamycin 2.5 0.5 0.25 2.5

Josamycin 2.5 0.25 2目5

Spiramycin 10 0.5 5

Neospiramycin 1 10 2.5 0.5 5 Tylosin 2.5 0.5 0.5 。目25

Tilmicosin 2.5 0.5 。目5 0.5 Tulathromycin >50 0.5 0.5 25

Mirosamicin 2.5 2.5 0.5 0.1 Sedecamycin >50 >50 2.5 5 Terdecamycin >50 >50 50

Aminoglycosides Apramycin 10 2.5 10 5

Dihydrostreptomycin 10 0.5 2.5 2.5

Paromomycin 10 0.5 10 5 Neomycin 2.5 2.5 2.5 (Fradiomycin) Gentamycin 0.5 5 0.5 Hygromycin B >50 25 10 50 Kanamycin 2 5 5 Spectinomycin >10 12.5 10 5 Streptom ycin 5 0.5 2.5 5

Kasugamycin >50 >50 >50 >50

Tetracyclines Oxytetracyc1ine 0.25 5 10 0.1

Chlortetracyc1ine 0.05 0.5 10 0.5 Tetracyc1ine 0.25 5 10 0.1 Doxycyc1ine 0.05 0.1 0.1

Polypeptides Enramycin 2.5 2.5 5 0.1

Colistin >50 >50 >50 25

Thiopeptin 0.5 0.5 0.1

Nosiheptide 5 2.5 0.1 0.05 Virginiamycin 2.5 5 0.1 0.1 Bacitracin > 10 > 10 0.4 0.5 Polymyxin B >50 >50 >50 10

Avoparcin 2.5 2.5 10 Fla vophospholipol 2.5 >50 >50

Polyethers Lasalocid 2.5 10 50

Monensin 10 10 50 Salinomycin 10 50 0.25

172 食衛誌 Vol. 49. NO.3

Table 4. continued

Detection limit (ug/mL)

Antibiotic B.s BGA B.s BGA M.l ATCC G. stearother-(AM 8) (A恥15) 9341 mophilus

Maduramicin 2.5 25 >50 Narasin 10 >50 0.1 Semd uram ici n 25 >50 >50 5

Others Chloramphenicol 10 10 5 5 Avilamycin 10 10 2.5 Tiamulin fumarate >50 50 0.25 0.5 Lincomycin >50 10 0.5 0.25 Bicozamycin >50 >50 >50 50 Novobiocin 0.5 10 10 0.1 Efrotom ycin 50 >50 >50 0.5 Nanafrocin 2.5 10 50 0.25 Pirlimycin 0.5 0.1 0.1 0.25 Valnemulin 50 10 2.5 0.05

Table 5. Detection limits of synthetic antibacterials

Detection limit (ug/mL)

Antibiotic B.s BGA B.s BGA Aよ1ATCC G. stearother-(AM 8) (AM 5) 9341 mophilus

Sulfa drugs Sulfadiazin巴 >50 >50 >50 >50 Sulfadim巴thoxine >50 50 >50 >50 Sulfadimidine >50 >50 >50 >50 Sulfadoxine >50 >50 >50 >50 Sulfamethoxazole >50 >50 >50 >50 Sulfamethoxypyridazine >50 >50 >50 >50 Sulfamerazine >50 >50 >50 >50 Sulfamonomethoxine >50 50 >50 >50 Sulfaquinoxaline >50 50 >50 >50 Sulfathiazole >50 >50 >50 >50 Sulfanitran >50 50 >50 >50 Sulfabromomethazine >50 50 >50 >50 Sulfanilamide >50 50 >50 >50 Sulfamoyldapson巴 >50 50 >50 >50 Sulfisozole >50 50 >50 >50 Sulfatroxazole >50 >50 >50 >50 Sulfaguanidine >50 50 >50 >50 Sulfachlorpyridazine >50 50 >50 >50 Sulfadimidine >50 50 >50 >50 Sulfacetamide >50 50 >50 >50 Sulfapyridine >50 50 >50 >50 Sulfabenzamide >50 50 >50 >50

Quinolones Danofloxacin 0.1 2 2

Difloxacin 0.5 0.05 >50 2.5 En rofloxaci n 0.5 0.25 10 0.5 Enoxacin 2.5 2.5 > 10 Flumequine 2.5 >50 >50 Marbofloxacin 0.1 5 恥1iloxacin 0.5 2.5 >50 50 Nalidixic acid 10 >50 >50 Norfloxacin l 0.5 >50 Ofloxacin 0.5 0.25 10 0.5 Orbifloxacin 0.5 0.25 25 2.5 Oxolinic acid 0.5 >50 5 Sarafloxacin 0.5 0.25 50 0.5 Sparfloxacin 0.5 0.1 5 Vebufloxacin 2.5 0.5 25 2.5 Piromidic acid I 10 >50 >50 Ci profloxaci n 0.5 0.25 5

June 2008 食肉中に残留する抗菌性物質の微生物学的簡易検査法 173

Table 5. continued

Antibiotic

Others Olaquindox Nicarbazin Thiamphenicol Florfenicol Amprolium Ethopabate Ormethoprim Clopidol Trimethoprim Pyrimethamine Decoquinate Diaveridine Dinitolmide Malachite green oxalate

2. テトラサイクリン系抗生物質の検出

「畜水産食品中の残留抗生物質簡易検査法(改訂)j31で

は，試験菌として B.sATCC 6633， M.l ATCC 9341およ

びB.mATCC 11778の3試験菌を採用している. 3試験

菌の中で，特に B.mATCC 11778はテ卜ラサイクリン系

抗生物質を感度良く検出する目的で採用されている61 し

かし，試験菌B.mATCC 11778は，試験菌液の調製が煩

雑な面がある.そこで，試験菌B.m A TCC 11778の代わ

りに B.sBGAを使用することが可能か検討した TCs

は，弱酸性領域で安定であることから，抽出溶液および培

地の pHとも弱酸性領域 (pH4.5および 6.5)が用いられて

いる.そこで，B.s BGAを試験菌に用い，培地のpHを

弱酸性 (pH5.9)に調整済みの AM8を採用したところ，

B.m ATCC 11778に比べ，幾分劣るもののテ トラサイク

リン系抗生物質を感度良く検出することが可能であった

(Table 3).

3. 抗菌性物質の試験菌に対する抗菌活性

4種類の平板培地 B.sBGA (AM8， AM5培地)， M.l

ATCC 9341および G.stearothenπophilusに対する各抗

菌性物質の抗菌活性を調べたところ，多くの薬物がこれら

のいずれかに高い抗菌活性を示すことが分かっ た (Table

4，5).

βーラクタム系，ポリペプチド系およびポリエーテル系抗

生物質等は，G. stearothermoρhilusに，マクロライド系

抗生物質は，M.l ATCC 9341に，アミノグリコシド系抗

生物質およびキノロン剤は， pHが高い B.sBGA (AM5)

に強い抗菌活性を示した.テトラサイクリン系抗生物質

は，培地の pHが低い B.sBGA (AM8)により強い抗菌活

性を示した. したがって， 3試験菌， 4種類の培地に対す

る感受性のバターンから，残留する抗菌性物質を系統別に

推定することが可能であると考える.

一方，サルファ剤は，いずれの菌に対しでも，ほとんど

抗菌活性を示さなかった (Table5).なお，微生物学的試

Detection limit (μgjmL)

B.s BGA B.s BGA M.l ATCC G. slearolher-(AM 8) (AM 5) 9341 moPhilus

>50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 10 25 25 2.5 2.5 2.5 5 l

>50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 50 10 50 50

>50 >50 >50 >50 25 2.5 25 50

>50 50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 10 10 5 >50 >50 >50 >50

5 25

験法で感度良くサルファ剤を検出するには， トリメトプリ

ム添加培地の使用が知られている6)，13)

4. 簡易検査法の検討

現在用いられている微生物学的簡易検査法は，試料 5g

をクエン酸 ・アセトン緩衝液 20mLでホモジナイズ抽出

し，その上清を試験溶液としている3) すなわち，試料中

の抗菌性物質を 5倍希釈する結果となり，検出感度の面

で改善の余地がある.そこで，固相抽出法等の前処理を用

いずに，試料中の抗菌性物質の希釈倍率を極力少なくする

方法を検討した.抽出溶媒としてまず，メタノール，アセ

トニトリル， 20%含水メタノールおよび 20%含水アセ

トニトリル各 5mLを用いて検討した.アセトニトリルに

比べ，メタノ ールのほうが全体的に抽出効率が優れてい

た.また，メタノール，アセト子トリルとも水を 20%以

上含むと除タンバクが不十分となり，コントロールでも阻

止円が形成される場合が時々観測された.そこで，抽出溶

媒にはメタノール 5mLを用いることにした.本法による

豚肉，豚肝臓に対する代表的抗菌性物質の検出限界は，

Table 6， 7に示すとおり，ペニシ リン系， セフェム系抗

生物質が 0.005-0.01μg/g，マク ロライド系，テトラサ

イクリン系抗生物質，ニューキノロン剤が 0.1-2.5μg/g

であった. 一方，アミノグリコシド系抗生物質のストレプ

トマイシン，ゲンタマイシンはメタノール抽出では抽出効

率が十分でなく ，検出限界は 5μg/g以上であっ た.鶏

肉，牛肉，鶏肝臓，牛肝臓に対する代表的抗菌性物質の検

出感度は，豚肉，豚肝臓とほぼ同じであ った.

水溶性が極めて高いアミノグリコシド系抗生物質は，メ

タノールでは抽出率が極めて低いと考えられる.そこで，

水溶性および除タンパク効果を考慮して，メタノールにメ

タリン酸を混合した溶液を用いて検出感度に及ぼす影響を

調べた.メタリン酸を含まない水ーメタノール系では，前

述のとおり水の含量が 20%以上になるとコントロールで

も阻止円が形成される場合が時々観測された.そこで，メ

174 食衛誌 Vol. 49， NO.3

Table 6. Detection limit in swine muscle

Antibacterial B.s BGA (AM8)

Ampicillin 0.25 Penicillins

Benzylpenicillin 0.1

Cephapirin 0.05 Cephalosporins

Cephalexin 0.5

Erythromycin 5 Macrolides

Spiramycin >10

Streptomycin > 10 Aminoglycosides

Gentamycin > 10

Oxytetracycline 0.5 Tetracyclines

Chlortetracycline 0.1

Enrofloxacin 。目5Quinolones

Oxolinic acid

Detection limit (μg/g)

B.s BGA M.l ATCC (AM 5) 9341

0.25 0.05

0.25 0.05

0.5

5

0.5 0.25

10 2目5

5 10

> 10 > 10

5 10

0.5 5

0.25 10

2.5 > 10

G. stearother-

moPhilus

0.05

。目005

0.005

0.01

0.5

10

>10

>10

0.5

0.5

0.5

>10

MRL for muscle

(J.tg/g)

0.06

0.05

0.05

0.2

0.6*

0.1

0.2帥

0.05

九 MRLsfor dihydrostreptomycin and streptomycin are established for the sum of residues of dihydrostreptomycin and streptomycin

判 MRLsfor oxytetracycline， chlortetracycline， and tetracycline are established for the sum of residues of oxytetracyclihe， chlortetracycline， and tetracycline.

Table 7. Detection limit in swine liver

Detection limitωg/g) MRL for Antibacterial B.s BGA B.s BGA M.l ATCC G. stearother- muscle

(AM 8) (AM 5) 9341 moPhilus (J.tg/g)

Ampicillin 0.1 0.25 0.05 0.005 0.06 Penicillins

Benzylpenicillin 0.05 0.25 0.1 0.005 0.05

Cephapirin 0.05 0.5 0.5 0.01 Cephalosporins

Cephalexin 10 0.05

Erythromycin 5 0.5 0.25 0.5 0.05 Macrolides

Spiramycin >10 10 2.5 1 o 0.6

Streptomycin >10 >10 >10 >10 0.6事Aminoglycosides

Gentamycin >10 >10 >10 >10 2

Oxytetracycline 2.5 10 >10 Tetracyclines 0.6榊

Chlortetracycline 0.5 5 >10

Enrofloxacin 0.5 > 10 0.1 Quinolones

Oxolinic acid 2.5 >10 >10

*: MRLs for dihydrostreptomycin and streptomycin are established for the sum of residues of dihydrostreptomycin and streptomycin

本*:MRLs for oxytetracycline， chlortetracycline， and tetracycline are established for the sum of residues of oxytetracycline， chlortetracycline， and tetracycline.

タリン酸濃度 (0.5，1， 2， 5および 10%)およびメタ リン

酸ーメタノール混液の混合比を変えて阻止円形成に及ぼす

影響を検討した.メタリン酸濃度およびメタリン酸溶液の

割合が高くなるに従い，コントロールでも阻止円が形成さ

れた.また，メタリン酸濃度およびメタリン酸溶液の混合

比が高くなるに従い，酸性条件下で不安定なマク ロライド

系抗生物質の検出感度は低下した総合的に評価すると

1% メタリン酸ーメタノール (3:7)混液が最も良好な検出

感度を与えた.しかし，アミノ グリ コシド系抗生物質の検

出感度に改善が見られたが，酸に不安定なマクロライド系

June 2008 食肉中に残留する抗菌性物質の微生物学的簡易検査法 175

抗生物質および一部のペニシリン系抗生物質には検出感度

の低下が見られた.操作の簡便性と総合的な検出感度を考

慮するとメタノールのみによる抽出法が最も好ましいと評

価した.

要 約

畜水産食品中に残留する抗菌性物質の検査に数多くの試

験菌および培地が採用されている 14) しかし，個々の抗菌

性物質に対して好ましい試験菌および培地を採用すること

は，試験操作が非常に煩雑となり，結果を得るまでに長時

間を必要とする.そこで，比較的多くの抗菌性物質に対し

て感受性を示す試験菌として公定法で採用されている B.s

ATCC 6633， B.m ATCC 11778， M.l ATCC 9341および

calidolactis C・953の4種，並びに芽胞菌液として市販さ

れている B.sBGAおよび G.stearothermothilus，合計 6

試験菌を用いて抗菌性物質に対する感受性を比較検討し

た.

その結果，公定法で採用されている B.sA TCC 6633お

よび calidolactisC・953の代替菌として，市販芽胞菌液

B.s BGA (培地 AM5を利用)， G. stearothermoρhilusの

使用が可能であった.また，B.m ATCC 11778の代替菌

として，B.s BGA (培地 AM 8を利用)を採用すること

が可能であると評価した.以上の結果から，簡易かっ迅速

な試験法として， 3試験菌 (M.lATCC 9341および市販

芽胞菌 B.sBGA， G. stearothermothilus)を用いること

とした.市販されている調製済み芽胞菌液を積極的に採用

することにより，より簡易かっ迅速な検査が可能となっ

た.

食品に残留する農薬等に関するポジティブリスト制度の

施行により，畜水産食品中に含まれる抗菌性物質の検出感

度としては，残留基準値(暫定基準値を含む)を満足する

検出感度が要求される.抗菌性物質の牛，豚，鶏等の筋肉

可食部，肝臓および魚介類に対する残留基準値(暫定基準

値を含む)は，ペニシリン系抗生物質，セファロスポリン

系抗生物質では 0.005-2.0ppm，マクロライド系抗生物

質は 0.05-2ppm，アミノグリコシド系抗生物質は 0.04

-2.0 ppm，テトラサイクリン系抗生物質は 0.05-0.6

ppm，キノロン剤は， 0.01-2 ppmの範囲である.抗菌

性物質および対象食品により，残留基準値は大きく異なる

が，望まれる検出感度は残留基準値以下であることをスク

リーニングできる検出感度である.

本法は，固相抽出法等の前処理を用いずに，試料中の抗

菌性物質の希釈倍率を極力少なくする方法として試料 5g

をメタノール 5mLで抽出する方法とした.また，現公定

法で採用されている試験菌の代替菌として市販芽胞菌を用

いることが可能であることを明らかにした.従来の簡易検

査法に比べ7).15)，操作性に優れ，かっ検出感度も数倍向上

した.なかでも，ペニシリン系抗生物質，セファロスポリ

ン系抗生物質各 2剤については，試験菌に G.stearother-

mothilusを用いることにより数十倍感度良く検出するこ

とが可能とな った. しかし，感度的に残留基準値レベルの

残留の有無の判定に用いるには問題のある抗菌性物質も見

られた.今回検討した薬剤は，ペニシリン系抗生物質，セ

ファロスポリン系抗生物質，テトラサイクリン系抗生物

質，マクロライド系抗生物質，キノロン系抗菌剤など，各

グループ 2剤のみであるが，各クーループの抗菌活性は同

様のパターンを示すことから (Table4， 5)，畜水産食品中

に残留する可能性の高いこれら抗菌性物質を簡易かっ迅速

に検出することが可能であると考える.高価な分析機器の

ない検査機関でも畜水産食品の安全性を確保する自主検査

法として有用であると考える.また，機器分析で検出され

た抗菌性物質のクロスチェ ック法としても日常検査に応用

が可能であると期待される.

謝 辞

本研究は，平成 19年度厚生労働科学研究費補助金(食

品の安心 ・安全確保推進事業)により実施したものであ

る.関係各位に深謝いたします.

文献

1) Gremmels， J. F.， Miert， A. S. P. A. M. Veterinary drugs:

Disposition， biotransformation and risk evaluation

Analyst， 119， 2521-2528 (1994)ー

2) Horie， M.， Nakazawa， H. Current legal regulations of

veterinary rugs and their residual analysis. Shokuhin

Eiseigaku Zasshi (1. Food Hyg. Soc. Japan)， 36， 329-

343 (1995).

3) 厚生労働省監修，食品衛生検査指針「動物用医薬品 ・飼料

添加物編J，(社)日本食品衛生協会， 2003， p. 10-25.

4) Horwitz， W.， Ed. Official Methods of Analysis of AOAC

International 17th Edition. AOAC International， 2000.

5) Microbiology Guidebook 3rd Edition. (1998) USDA/

FSIS.

6) Jinbo， K.， Monma， C.， Maruyama， T.， Matsumoto， M.

Simplified classification method for residual antibac-

terial agents in meat by microbiological assay. Shoku-

hin Eiseigaku Zasshi (1. Food Hyg. Soc目 Japan)，32，

86-92 (1991).

7) Jinbo， K.， Kataoka， 1.， Kokubo， Y.， Konuma， H.， Kondo，

F. Sensitivity of microbiological simplified method to

residual antibiotics in meat and marine products. Sho-

kuhin Eiseigaku Zasshi (1. Food Hyg. Soc. Japan)， 36，

525-531 (1995)

8) Chang， C. S.， Tai， T. F.， Li， H. P. Evaluating the applica-

bility of the modified four-plate test on the determina-

tion of antimicrobial agent residues in pork. J. Food

Drug Anal.， 8， 25-34 (2000).

9) Bagaerts， R.， Wolf， F. A standardised method forthe de-

tection of residues of antibacterial substances in fresh

meat. Fleischwirtschaft， 60， 672-673 (1980)

10) Salisbury， C. D. C. Evaluation of the swab test on pre-

mises for detection of antimicrobial residues in bovine

and procine kidneys. 1. AOAC Int.， 87， 1109-1114

(2004).

11) D巴y，B. P.， Thaker， N. H.， Bright， S. A.， Thaler， M. Fast

176

Antimicrobial Screen Test (F AST): Improved screen

test for detecting antimicrobial residues in meat

tissue. J. AOAC Int.， 88， 447-454 (2005).

12) 厚生労働省監修，食品衛生検査指針「理化学編J，(社)日

本食品衛生協会， 1991， p. 346-350.

13) Hussein， K目 Experimentaldesign for the microbiolog-

ical four-plate test for the detection of sulphadimidine

residues at the levels of concern. Bull. Vet. Inst

食衛誌 Vol. 49， NO.3

Pulawy， 48， 403-407 (2004).

14) 厚生省乳肉衛生課編，畜水産食品中の残留物質検査法.中

央法規出版， 1990.

15) Jinbo， K. Method of inspection for residual anti-

bacterial agents in livestocks farm products and

marine products by microbiological assay. Shokuhin

Eiseigaku Zasshi (J. Food Hyg. Soc. Japan)， 40， J-195-

J-202 (1999).