大型藻類からバイオエネルギー生産プラットフォームの構築

京都大学大学院農学研究科

応用生命科学専攻・生体高分子化学分野

教授 植田充美

1

藻類完全利用のための生物工学技術の集約

京都大学大学院農学研究科

教授 植田充美

2

藻類・水圏微生物の機能解明と制御によるバイオエネルギー創成のための基盤技術の創出 (CREST)

脂質・不飽和脂肪酸・核酸・

アミノ酸・ポリフェノール類・

レアメタル・レアアース

細胞質成分

①海洋性バイオマス(大型藻類)の採集と前処理・抽出

②各成分の変換反応とバイオリファイナリー(エネルギーや有用物質の生産)

バイオアルコール(エタノール・ブタノール)

乳酸・酢酸・酪酸

オリゴ糖

エネルギー

●セルロース●アルギン酸●フコイダン

褐藻類の細胞壁成分

大阪大学新規生体触媒の創製

大型藻類細胞壁溶解酵素の細胞表層提示

京都大学

●Clostridiumゲノム情報

●海洋メタゲノム情報

三重大学

早稲田大学

Clostridium

藻類の機能改変支援 京・九･三重大

成長制御へのマニピュレーション

京都大学

三重大学成分の抽出

大型藻類褐藻・紅藻・緑藻

非食用アラメ属・カジメ属褐藻類の養殖・採集・分取

九州大学三重大学

アラメ、カジメ、クロメ、サガラメ、ツルアラメ

＋

電気エネルギー

京都大学

プロトプラスト(等張条件下)

P-3

Eckol (MW: 372)

OHHO

O

OH

OH

O

O

OH

HO

有用物質

レアメタル

バイオディーゼル 京都大学

有用フェノール化合物 三重大学

ファインケミカル

三重大学飼料や肥料などの栄養成分

京都大学

有用金属資源として回収 京都大学

京都大学

生成への支援

糖類

燃料電池による電気化学変換

アノード カソード

分離膜酸化 還元

燃料物質

大型藻類活用研究チーム構成

3

高機能エキスパート細胞触媒の創製

フェノール化合物

・セルロース系バイオマス

・水圏バイオマス

非可食バイオマスからの新プラットフォーム形成によるバイオリファイナリー

セルロース利用微生物、海洋メタゲノムの遺伝子資源

代謝工学、システム生物学：各種酵素

細胞表層工学によるアーミング技術

生物工学技術の融合・集積

藻類バイオリファイナリーの確立

オイルリファイナリーからシュガー・フェノールプラットフォームを基にした有用物質生産への技術転換

4

クロメに含まれる成分と完全利用

抽出し直接利用

燃料電池の材料として利用 アーミング酵母による回収

養殖クロメ

セルロース（7.3%）Endoglucanase、Cellobiohydrolase、β-glucosidaseにより直接利用可能

ヘミセルロース（6.1%）Xylanase、Xylosidase、Xlose-isomerase、Xylulokinaseにより直接利用可能

アルギン酸（23.5%）Alginate lyase、DEH transporter、DEH代謝酵素により直接利用可能

マンニトール（11.3%）Saccharomyces paradoxus

Pichia angorophoraeがエタノール変換可能

ラミナラン（1.4%）β-1, 3-glucanase、β-1, 6-glucanaseにより直接利用可能

フロロタンニン類（約5%）市場価格：25,000円（kg）

脂質（約0.2%）

灰分（約20%）

タンパク質（約10%）

フコース（2.3%）

その他の成分

アーミング酵母によるエネルギー生産

5

大型藻類活用の総合評価

6

排他的経済水域面積(日本)：447万km2 （国土面積の10倍以上）

養殖可能な漁場域：30万km2 （藻場数（漁場)1000箇所以上可能）

想定大型藻類収穫量：72億ton

バイオエタノール換算の生産量（石油換算）：2億kL（石油換算1.2億kL）

（北洋のコンブのみからの査定で、北洋以外の広大な温暖海域のクロメやアラメを入れると、この数値の3-4倍になり、石油の年間消費量をまかなえる試算になる。）

雇用人数（予測）：｛200 ｘ 藻場数（漁場）｝人

想定される燃料生産コスト：50円以下/L

想定されるGHG排出削減率：63％ （EcoShift Consutingより）

産業化への道筋の可能性：インフラや規制の整備ー経産省、国土省、総務省資金ーＪＳＴ－ＡＣＣＥＬ

農水省ー「知」の集積ー三菱ＨＤ、日経の推薦

報道

7

2015年10月19日日本経済新聞

農産物 森林 海藻（大型藻類）

原料 糖澱粉質系（１Ｇ） 木質系（２Ｇ） 海藻類（３Ｇ）

年間生産回数 １－２回／年 １回／年 １－２回／年

単位面積当たりＣＯ２吸収量（トン／Ｈａ）

５－１０ ４．６ ３６．７

単位面積当たり原料生産量（トン／Ｈａ）

１８０ ９ ５６５

バイオマスエネルギー生産工程

シンプル 複雑（リグニン除去）

シンプル

（アルギン酸多糖類の活用のカギ）

問題点 食糧と競合 陸地を利用 養殖場拡大

生産条件 日光、ＣＯ２、淡水、陸地、肥料、農薬

日光、ＣＯ２、淡水、陸地、肥料、農薬

日光、ＣＯ２、海水

『大型藻類』の優位性 （陸上バイオマスとの比較）

http://hokusui.fish.hokudai.ac.jp/pdf/300-all.pdf

『大型藻類』の優位性（生産効率）

陸地の利用や食糧との競合が問題になる

理論値

9

取り組んだ課題

10

１．資源の確保と調査 （陸上バイオマスの轍を踏まないために）

２．柔軟な生体触媒を創製（各種の藻類に対応できる）

３．完全利用のための戦略ー副生産物の活用

４．将来の産業化への道筋

５つの基本戦略

１．非可食大型藻類の養殖支援と調査ー天草漁協、東南アジア海域

２．セルロース分解最強微生物ゲノム保持特許－アメリカＤＯＥプロジェクトに対抗

３．自然に学ぶー大型藻類絶滅現象

４．細胞表層工学ーアーミング技術

５．独自開発モノリスカラムによるワンショットプロテオームシステム

11

アラメ属・カジメ属褐藻類のメリット

12

天然藻体を確保しやすい

多年生の大型褐藻類アラメ（藻長：1～2 m，寿命：4～6 年）サガラメ（藻長：1～2 m，寿命：7～8年）カジメ（藻長： 2～3 m，寿命：3～4 年）

全国（北海道，東北の一部を除く）に分布している

群落を構成するため，個体密度が高い（生産量が高い）

食用の用途と競合しない

養殖技術が確立されている

約10ヶ月で藻長2 mの藻体を確保出来る

洗浄，乾燥，粉砕の工程でコストがかからない

研究対象種

アラメ属褐藻類：アラメ・サガラメカジメ属褐藻類：カジメ・クロメ

ツルアラメ

稀少な有用メタボライトを持つ

フロロタンニン類（海藻ポリフェノール類）を持つ

フロロタンニン類を含む細胞その他の褐藻類にはない

フロロタンニン抽出液の市場価格：25,000円（kg）

藻類バイオリファイナリーの原料に適している

多糖類

セルロース

ヘミセルロース

アルギン酸（M/G比）*

フコイダン（フコース）

ラミナラン

糖アルコール

マンニトール

フロロタンニン類（海藻ポリフェノール）

タンパク質

脂質

灰分（無機質）

その他の成分

合計 （％）**

クロメ（養殖・天草）

7.3

6.1

23.5

(1.58)

2.3

1.1

11.3

3.0

7.1

1.4

25.8

11.1

100

クロメ（天然・福岡）

5.7

3.9

26.0

(1.27)

1.0

1.9

11.2

4.0

8.2

1.5

26.1

10.5

100

8.1

3.8

24.0

(1.74)

1.3

0.7

7.3

0.2

5.8

1.4

28.9

18.5

100

S. mcclurei

10.8

5.3

23.0

(0.88)

1.0

N.D.

11.3

0.1

5.6

1.6

33.1

8.2

100

S. olygocystum

14.7

8.4

18.0

(0.54)

2.8

1.5

N.D

0.2

5.8

1.5

22.6

24.5

100

S. polycystum

5.3

3.8

16.8

(1.33)

1.1

6.7

10.7

4.5

9.8

1.5

24.7

15.1

100

アラメ（天然・福岡）

ベトナム・ホンダワラ類

* M/G比：マンヌロン酸とグルロン酸の量的比率

褐藻類を構成する成分の分析

** 乾物あたりのデータ

13

5.1Mb

Cellulosome

Complete genome analysis of

C. cellulovorans

14

Clostridium cellulovorans

15

C. cellulovorans

Non-cellulosomal cellulases and

hemicellulases :123

Cellulosomal proteins :55

Glycoside Hydrolases (GHs)

Polysaccharide Lyases (PLs)

Carbohydrate Esterases (CEs)

Scaffolding proteinsDockerin domain

C. cellulovorans

5.1Mb

生命オミックス解析の全貌

ゲノムはあくまで設計図にすぎず、生体内では、転写、翻訳と進み、実際に生命現象を担っているのは、酵素や転写因子などタンパク質であり、その反応結果である代謝物が、実際に生命の表現系を担っている。

この２つの解析デジタル化

ボトルネック

KEGG代謝予測ソフト

プロテオーム解析の手順

③データ解析①サンプルの調製 ②計測(in mass spectrometry)

対象生物を育種(コントロールが重要)

場合によっては細胞分画タンパク質の抽出タンパク質のプレ精製(脱塩やaffinity等)

場合によってはタンパク質分離(affinityでfocus等)

⇒最終的に酵素消化し、ペプチド混合物にする (要チェック)

(shotgun methodの場合)

基本(shotgun method)の場合は、LC/MSによるペプチドの質量測定⇒LC(クロマト分離)とMS(質量分析)

それぞれの基礎理解が重要試料の濃度、複雑さ、目的(定性or

定量)に応じて、methodの最適化

⇒最終的にペプチド混合物の質量データマトリックスを得る。

Peak picking

質量データからタンパク質データへの変換定性は同定algorismが鍵

(mascotとsequest等)

定量はラベル化法が主流⇒目的に合わせ閾値の設

定が重要解析系(soft)の発展速度

は著しく、これに伴い①②の最適化も必要

タンパク質データの解析data mining

多変量解析等

良い分離⇒ クリアな測定結果⇒ スムーズな測定システム構築が重要

史上最高の分離達成

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 12

13 14

15

16

9

10

0 100 200 300 400 500 600Time (min)

3.0

4.0

mV

olt

326 328 330 332

Time (min)

(b) L = 1238 cm

t0=2.5h, N = 1.23×106

N = 1.22×106

N = 1.08×106

N = 1.00×106 (k=2.4)

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

Time (min)

mV

olt

200 300100 400 500 6000

34

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 12

13 14

15

16

9

10

0 100 200 300 400 500 600Time (min)

3.0

4.0

mV

olt

326 328 330 332

Time (min)

(b) L = 1238 cm

t0=2.5h, N = 1.23×106

N = 1.22×106

N = 1.08×106

N = 1.00×106 (k=2.4)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 12

13 14

15

16

9

10

0 100 200 300 400 500 600Time (min)

3.0

4.0

mV

olt

326 328 330 332

Time (min)

(b) L = 1238 cm

t0=2.5h, N = 1.23×106

N = 1.22×106

N = 1.08×106

N = 1.00×106 (k=2.4)

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

Time (min)

mV

olt

200 300100 400 500 6000

34

1, naphthalene, 2, acenaphthylene, 3, fluorene, 4, acenaphthene, 5, phenanthrene, 6, anthracene,

7, fluoranthene, 8, pyrene, 9, chrysene, 10, benz(a)anthracene, 11, benzo(b)fluoranthene,

12, benzo(k)fluoranthene, 13, benzo(a)pyrene, 14, dibenz(a,h)anthracene, 15, indeno(1,2,3-cd)pyrene,

16, benzo(g,h,i)perylene.

⊿P = 47 MPa

N = 1,000,000

既存品を凌駕する高性能(理論段数)を実現

新規分離媒体ー革新的分離材料モノリス

Particle

Large through-pore → Low pressure

Small skeleton → High performance

(Conventional medium)

Monolithic column

Monolith

Phase Separation

and Gelation

Aging and solvent exchange

Drying Heat

(300 ℃)

Si(OMe)4, MeSi(OMe)3

CH3COOHaq

Urea

Poly(ethyleneglycol)

Starting

Sol

Mesopore

(10～50 nm)

Through-pore(0.5～10 mm)

モノリス型キャピラリーカラムの作製方法

バイオマス分解活用戦略をプロテオーム解析（定性･定量）で解明

21

Cellulosomal Non-cellulosomal

EngGH9M(EngM) alpha-arabinofuranosidase1

XynGH11A(XynA) pectate lyase L1

pectate lyase E1

Pectate lyase/Amb allergen

exopolygalacturonate lyase 1

Basic

大型海藻直接分解のための酵素ベストミックス判明

Cellulosomal Non-cellulosomalEngGH9Z(EngZ) XynGH10B(XynB) glycosidase PH1107-related1

EngGH44A CSPA alpha-xylosidase1

EngGH9A CSPB Beta-glycosidase

EngGH9B PeeA Beta-galactosidase1

EngGH5A CpiB Endoglucanase

EngGH5F CpiC alpha amylase catalytic sub domain

EngGH5B(EngB) MegB alpha-arabinofuranosidase1

EngGH5E(EngE) Hyp1 lipase/esterase

EngGH9H(EngH) Hyp9 pectate lyase L1

EngGH9L(EngL) CbpA Glycosyl transferase

EngGH9M(EngM) HbpA Peptidoglycan glycosyltransferase

ManGH2A(ManA) ArfA

ManGH26B(ManB)

E. kurome specialist

22

酵母細胞表層ディスプレイシステム(α-アグルチニン)

分泌シグナル配列

プロモーター

目的タンパク質の配列a-アグルチニンのC末領域

GPIアンカー付着シグナル

細胞壁

細胞膜

a-アグルチニン

ディスプレイされるタンパク質

PI-PLCによる切断

GPIアンカー

エキソサイトーシス

小胞体輸送小胞

GPIアンカー構造NH2

CH2

CH2

O-O P=O

O

R1-2Mana1-2Mana1-6

エタノールアミンリン酸ブリッジ

グリコシル転移

Mana1-4GlcNH2a1

R2

PI-PLCによる切断

イノシトール

CH2-CH-CH2

HO

O

OH

OH

OH

O

P=O

O

-O

6

GPIアンカー構造NH2

CH2

CH2

O-O P=O

O

R1-2Mana1-2Mana1-6

エタノールアミンリン酸ブリッジ

グリコシル転移

Mana1-4GlcNH2a1

R2

PI-PLCによる切断

イノシトール

CH2-CH-CH2

HO

O

OH

OH

OH

O

P=O

O

-O

6

アーミング酵母

陸上植物藻類

オリゴ糖フェノール類

グルコースキシルロース，ウロン酸

グルコースキシルロース、ウロン酸

エタノール

エタノール（エネルギー）

<共役反応>

<連続反応>

エンドグルカナーゼキシラナーゼ

セロビオヒドロラーゼキシロシダーゼ

β-グルコシダーゼ

キシロースイソメラーゼ変換酵素

α-アグルチニン

新規生理活性物質

24

細胞触媒創製戦略

季節変動の激しい多糖類

1. マンニトール発酵

Saccharomyces paradoxus

Pichia angophoraeで可能

2. ラミナラン発酵

Saccharomyces cerevisiae

Ethanol

Laminarin

ラミナラン分解酵素提示酵母

Glucose

25

DOE Joint Genome Institute

Saccharophagus degradansのゲノムデータベース活用

・1980年代にカリフォルニア湾の大型藻類絶滅させた微生物（アルギン酸資化性バクテリア）・アルギン酸を単糖まで分解する

- 5gアルギン酸と7.5gバクトアガーを300mLのイオン交換水に溶かす-オーバーナイトで撹拌- 18.7gのDifcoマリンブロスを200mLのイオン交換水に溶かす- 2つの混合溶液を混ぜる-オートクレーブし、プレートに散布

プレートアッセイ

26

Protein type Functions log2-fold change FDR-adjusted P-value

Degradative enzyme putative alginate lyase -3.44 1.42E-10 Sde_3284

putative polysaccharide lyase -3.39 2.34E-11 Sde_3285

putative polysaccharide lyase -3.16 4.51E-10 Sde_3275

putative polysaccharide lyase -2.44 9.92E-11 Sde_3274

putative alginate lyase -2.37 2.10E-08 Sde_2478

putative polysaccharide lyase -2.27 1.75E-09 Sde_2839

Uronic acid metabolism

2-keto-3-deoxygluconate kinase(KdgK)

-3.44 1.82E-08 Sde_3280

TonB-dependent receptor associated

TonB-dependent receptor -3.57 3.14E-11 Sde_1508

TonB-dependent receptor -3.26 2.90E-11 Sde_2991

TonB-dependent receptor -3.17 1.63E-06 Sde_1386

Other fructose-bisphosphate aldolase -4.12 1.66E-08 Sde_3279

short-chain dehydrogenase/reductase SDR

-3.68 4.55E-07Sde_3281

Cupin 2, conserved barrel -3.27 7.75E-09 Sde_3283

major facilitator superfamily MFS_1（Transporter）

-3.24 1.16E-05Sde_3282

VCBS domain protein -2.89 6.44E-10 Sde_2801

mucin-associated surface protein -2.72 4.04E-04 Sde_2234

MotA/TolQ/ExbB proton channel -2.68 2.48E-06 Sde_2957

Tetratricopeptide TPR_2 -2.36 8.50E-07 Sde_2960

hypothetical protein -2.44 6.07E-10 Sde_2833

hypothetical protein -2.25 5.11E-04 Sde_2508

hypothetical protein -2.19 4.51E-10 Sde_3276

アルギン酸特異的に生産されたタンパク質一覧

27

STEP 1: Degradation

STEP 2: Transport

STEP 3: Metabolism

STEP 1

STEP 2STEP 3

クロメ23.5%含有

アルギン酸からのエタノール発酵

28

共役系の稼動ーアルギン酸とマン二トールの同時資化 （酸化・還元インバランスの解消）

ビッグデータ

データ解析測定システム

分離システム

モノリスカラム

データ信頼性

多変量解析

研究対象

環境への活用ー地球環境保全

マルチオミクス解析

ＡＩ解析

ＡＩの導入へ

宿主の機能向上

31

Scientific Reports誌、京都大学ＨＰ、日経新聞（第１面）掲載

➢ The reconstructed CDC25 point mutants based on the parental strain

acquired thermotolerance without any growth defects.

➢ The reconstructed CDC25 mutants retained ethanol fermentation rates

even at 39oC.

耐熱性の向上育種ー環境適応育種の成功（発酵と生育の関係）

32

柔軟な生体触媒の標識化

多様な藻類

セルロース分解触媒

アルギン酸分解触媒

ヘミセルロース分解触媒

マンニトール分解触媒

エタノール生産

33

原料としての大型藻類からの試算

34

セルロース1kgから、現在最大エタノール0.48kg生産可能

ヘミセルロース1kgから、現在最大エタノール0.27kg生産可能

マン二トールとラミナラン1kgから、現在最大エタノール0.50kg生産可能

アルギン酸1kgから、現在最適強化中(エタノール0.52kg生産を予定）

クロメ1kgから約200gのエタノール生産可能か？

本プロジェクトとの連携波及効果

35

三重大学に日本初のマリンバイオテクノロジー講座誕生ー三重大学チームの柴田先生が独立した准教授に着任

アメリカDOEのJGIに連携している吉国氏が准教授待遇で採用

PACIFICHEM2015でセッション開催（２日間）Global Strategies for Algal Biomass for Bioenergy and Biorefinery(#407)

京都大学のグローバル戦略の思修館（５年制大学院）から大学院生派遣

三重にバイオベンチャー「エコバイオフル」起業ー農林水産廃棄物活用日本総研（三井物産戦略研）、寺島実郎氏と連携

植田が２０１５年度日本農芸化学会学会賞受賞

地域産学官共同研究拠点整備事業（JST）

京都バイオ計測センター（KIST-BIC)

ゲノムからメタボロームまで連携する分析・計測機器を一体整備

ゲノム

プロテオーム

トランスクリプト ー ム

メタボローム

事業化対応「培養・精製システム」を整備⇒試薬・キット開発への展開

地域産業への計測技術展開 バイオ産業を支える次世代の機器・装置

脂質・不飽和脂肪酸・核酸・

アミノ酸・ポリフェノール類・

レアメタル・レアアース

細胞質成分

①海洋性バイオマス(大型藻類)の採集と前処理・抽出

②各成分の変換反応とバイオリファイナリー(エネルギーや有用物質の生産)

バイオアルコール(エタノール・ブタノール)

乳酸・酢酸・酪酸

オリゴ糖

エネルギー

●セルロース●アルギン酸●フコイダン

褐藻類の細胞壁成分

大阪大学新規生体触媒の創製

大型藻類細胞壁溶解酵素の細胞表層提示

京都大学

●Clostridiumゲノム情報

●海洋メタゲノム情報

三重大学

早稲田大学

Clostridium

藻類の機能改変支援 京・九･三重大

成長制御へのマニピュレーション

京都大学

三重大学成分の抽出

大型藻類褐藻・紅藻・緑藻

非食用アラメ属・カジメ属褐藻類の養殖・採集・分取

九州大学三重大学

アラメ、カジメ、クロメ、サガラメ、ツルアラメ

＋

電気エネルギー

京都大学

プロトプラスト(等張条件下)

P-3

Eckol (MW: 372)

OHHO

O

OH

OH

O

O

OH

HO

有用物質

レアメタル

バイオディーゼル 京都大学

有用フェノール化合物 三重大学

ファインケミカル

三重大学飼料や肥料などの栄養成分

京都大学

有用金属資源として回収 京都大学

京都大学

生成への支援

糖類

燃料電池による電気化学変換

アノード カソード

分離膜酸化 還元

燃料物質

大型藻類活用から海洋資源の活用へ

38

企業への期待

•大型藻類を原料とするバイオエネルギー利用において、

海洋資源の開発のためのインフラ整備

遺伝子組み換え微生物の封じ込めプラント設備

未来型ものづくりのための細胞や酵素触媒の機能性向上

ゲノム解析とゲノム発現機能を直結するプロテオーム解析

プロテオーム解析に革新をもたらすモノリスーナノLC/MS技術

データサイエンスの実働に直結する新規バイオテテクノロジー

に関する技術およびノウハウの利用。

39

本技術に関する知的財産権

•本技術に直接関係する特許は取得していないが、数多くのノウハウを有しているので、コンサルティング等の実施が可能である。

40

お問合せ先

京都大学大学院農学研究科

応用生命科学専攻・生体高分子化学分野

教授 植田 充美（みつよし）

（京都バイオ計測センター代表、

JBA理事）

TEL:075-753-6110FAX:075-753-6112

E-mail:miueda@kais.kyoto-u.ac.jp

41