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efeito microbio

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efeito microbio

Text of efeito microbio

  • UNIVERSIDADE DE SO PAULO

    FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE BAURU

    PAULO MAURCIO BATISTA DA SILVA

    Efeito antimicrobiano das solues desinfetantes sobre biofilmes de C.

    albicans em resinas acrlicas termopolimerizveis

    Bauru

    2009

  • PAULO MAURCIO BATISTA DA SILVA

    Efeito antimicrobiano das solues desinfetantes sobre biofilmes de C.

    albicans em resinas acrlicas termopolimerizveis

    Dissertao apresentada Faculdade de

    Odontologia de Bauru, da Universidade de So

    Paulo, como parte dos requisitos necessrios para

    obteno do ttulo de Mestre em Odontologia.

    rea de concentrao: Reabilitao Oral.

    Orientador: Prof. Dr. Vincius Carvalho Porto

    Bauru

    2009

  • Silva, Paulo Maurcio Batista da Si38e Efeito antimicrobiano das solues desinfetantes

    sobre biofilmes de C. albicans em resinas acrlicas termopolimerizveis / Paulo Maurcio Batista da Silva. -- Bauru, 2009.

    140 p.:il.; 31cm. Dissertao. (Mestrado) -- Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de So Paulo. Orientador: Prof. Dr. Vincius Carvalho Porto

    Autorizo, exclusivamente para fins acadmicos e cientficos, a reproduo total ou parcial desta dissertao/tese, por processos fotocopiadores e outros meios eletrnicos. Assinatura:________________________________ Data:_______/_______/_______

  • DDeeddiiccaattrriiaa

    Aos meus pais, Adelino e Valda, meus eternos e maiores incentivadores. Ao

    meu Pai, por uma lio de vida de profissionalismo e dedicao no s para mim,

    mas para todos que tiveram o privilgio de sua companhia. minha Me, por todo

    seu imenso amor e estmulo em todos os momentos da minha vida. E a ambos pela

    abdicao dos seus sonhos para que os meus pudessem ser realizados, porm hoje

    acho que consegui realizar um sonho em comum. Sem vocs, eu no conseguiria

    concretizar a metade dos meus sonhos e ambies. Sem vocs, esse momento

    seria simplesmente impossvel!

    Aos Meus irmos, Andr e Cludia, pelo carinho, confiana e apoio que

    sempre me foram concedidos em at hoje.

    Aos meus sobrinhos, Fernanda, Felipe e Bia, por me oferecerem momentos

    de imensa alegria sempre que estamos juntos.

    Patrcia Calderon, por contribuir diretamente com sua inteligncia e

    objetividade na concretizao desta pesquisa, e, principalmente, por me

    proporcionar diariamente amor, amizade e confiana.

  • AAggrraaddeecciimmeennttooss EEssppeecciiaaiiss

    Ao Prof. Dr. Vincius Carvalho Porto, pela confiana em meu trabalho e

    pacincia com meus tropeos; pela prontido em me atender e entusiasmo em me

    ensinar; pela tranqilidade que transmitiu nos momentos de ansiedade encontrados

    na pesquisa e pelo papel importante que assumiu nesta jornada.

    Profa. Dra. Denise Madalena Palomari Spolidorio, por todas as vezes que

    interrompeu suas atividades e respondeu minhas dvidas, fazendo com que, deste

    modo, eu adquirisse conhecimentos na rea de Microbiologia, at ento quase

    desconhecida por mim.

    Aos tambm diretos colaboradores deste trabalho, Marcelo Milanda e Mrcia

    Graef, pela competncia, companheirismo, ajuda e conhecimentos compartilhados.

  • AAggrraaddeecciimmeennttooss

    Aos colegas de Mestrado, Ana Carolina Morandini, Cintia Lumi, Daniel

    Hiramatsu, David Garcia, Fbio Lorenzoni, Fbio Xang, Felipe Ferreira, Gustavo

    Pimentel, Jos Luiz Gos, Joo Paulo Cenizo, Marcelo Ramos, Marcos Rodrigues,

    Oswaldo Alarcon, Priscila Hildenberg e Rosalyn, pela companhia quase diria, pelas

    trocas de experincia e amizade.

    Aline Dantas, que atravs de seu jeito cativante, alegre, espontneo e

    carinhoso, se tornou digna da minha amizade e do meu mais profundo respeito.

    Tenho certeza que nossa amizade especial e se estender alm dos muros da

    FOB.

    Aos colegas do Doutorado em Reabilitao Oral, Murilo Auller, Eduardo

    Meira, Romo Mansano, Jefferson Buda, Thiago Pegoraro, Renata, Eduardo

    Figueira, Pedro Acoesta, Leandro Martins, Andria Joaquim e Mrcio Taga, pela

    amizade e valiosa ajuda durante o mestrado.

    Aos colegas de linha de pesquisa, Luciana Rezende, Flora Tvora e

    Matheus Jacobina, pela ajuda em momentos essenciais, conversas e sugestes que

    foram fundamentais durante a realizao deste trabalho. Em especial, ao Emlio

    Rodriguez, grande companheiro, que me ajudou ativamente neste projeto, fazendo

    com que este trabalho se tornasse menos rduo.

    Aos colegas de outras reas de Ps-graduao da FOB, Luciana Mendona

    e Ricardo Vigolino, pela ajuda e momentos de descontrao, e, tambm, Thas

    Gasparotto e a Ronald Ordinola, pelos pertinentes e relevantes conselhos sobre a

    metodologia desta pesquisa.

  • Faculdade de Odontologia de Bauru USP, representada por seu Diretor

    Prof. Dr. Luiz Fernando Pegoraro, e sua Comisso de Ps-Graduao,

    representada pela Profa. Dra. Maria Aparecida de Andrade Moreira Machado.

    Aos Professores do Departamento de Prtese, Prof. Dr. Acccio Lins do

    Valle, Prof. Dr. Carlos Dos Reis Pereira de Arajo, Prof. Dr. Gerson Bonfante, Prof.

    Dr. Jos Henrique Rubo, Profa. Dra. Lucimar Falavinha, Prof. Dr. Luiz Fernando

    Pegoraro, Prof. Dr. Milton Carlos Salvador, Prof. Dr. Paulo Csar Rodrigues Conti,

    Prof. Dr. Paulo Martins Ferreira, Prof. Dr. Pedro Csar Garcia e Prof. Dr. Wellington

    Cardoso Bonachela e, pelos seus ensinamentos enriquecedores.

    Ao Prof. Dr. Rumio Taga, pelo emprstimo do tetrxido de smio, til na

    anlise dos corpos-de-prova no MEV.

    Ao Prof. Dr. Jos Roberto Pereira Lauris pela colaborao na anlise

    estatstica deste trabalho.

    Aos funcionrios do Departamento de Prtese Dentria, Marcelo Giatti,

    Reivanildo, Walquria, Cludia e Dbora, pela solicitude e disponibilidade.

    funcionria do Centro Integrado de Pesquisa (CIP), Dona Neusa, pela

    pacincia e prestatividade.

    funcionria da Clnica de Ps-graduao, Hebe, por seu bom humor e

    carinho com todos os ps-graduandos.

    Ao funcionrio do Departamento de Endodontia, Edimauro de Andrade, pela

    importante ajuda na aquisio das imagens no MEV.

    ACECIL, pela colaborao na esterilizao dos corpos-de-prova utilizados

    nesta pesquisa.

    Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES)

    pelo auxlio financeiro concedido, fundamental para concluso deste curso.

  • RESUMO

    As solues desinfetantes tm sido empregadas como um dos principais

    mtodos no controle de biofilmes microbianos, tais como os formados sobre a

    superfcie de prteses totais. O objetivo desta pesquisa foi analisar o efeito

    antimicrobiano das solues desinfetantes sobre biofilmes de C. albicans em resina

    acrlica termopolimerizvel, por meio de microscopia confocal de varredura a laser,

    de cultura microbiolgica e de microscopia eletrnica de varredura (MEV). Sessenta

    corpos-de-prova (5 x 5 x 1 mm) foram confeccionados, esterilizados e inoculados

    individualmente com C. albicans (1.107 cel/mL), aguardando-se 24 horas a 37C

    para a formao do biofilme. A seguir, 24 corpos-de-prova foram divididos

    aleatoriamente em 4 grupos (n=6), de acordo com as solues testadas: G1

    (controle) gua destilada por 10 minutos; G2 gluconato de clorexidina a 4% por

    10 minutos; G3 hipoclorito de sdio a 1% por 10 minutos; G4 hipoclorito de sdio

    a 2% por 5 minutos. Aps a desinfeco, os biofilmes remanescentes sobre os

    corpos-de-prova foram corados atravs dos fluorocromos SYTO-9 e iodeto de

    propdeo para anlise no microscpio confocal. Ademais, 24 novos corpos-de-prova

    foram submetidos ao mesmo processo de desinfeco e destinados anlise

    atravs de cultura microbiolgica. Aps 48 horas de incubao, foi feita a contagem

    das unidades formadoras de colnia (UFC). Ainda, o mesmo processo de

    desinfeco foi utilizado para 12 novos corpos-de-prova para anlise em MEV. Os

    dados foram analisados atravs do teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste

    Student-Newman-Keuls, considerando um nvel de significncia de 5%. Os

    resultados obtidos pelo microscpio confocal demonstraram que todas as solues

    desinfetantes promoveram a morte de todas as clulas fngicas remanescentes

    sobre os corpos-de-prova. Resultado semelhante foi obtido atravs da anlise por

    meio de cultura microbiolgica, pois todas as solues desinfetantes foram capazes

    de impedir o crescimento fngico em cultura. Atravs da anlise em microscpio

    confocal e em MEV, no foi observada remoo das clulas do biofilme fngico

    sobre os corpos-de-prova pela soluo de gluconato de clorexidina a 4%. Por outro

    lado, as solues de hipoclorito a 1% e 2% promoveram uma remoo quase

    completa do biofilme fngico da superfcie dos corpos-de-prova. Alm disso, atravs

    do MEV, alteraes morfolgicas foram observadas nas poucas clulas fngicas

  • remanescentes da desinfeco atravs de hipoclorito de sdio a 1%. Desse modo, a

    partir das condies experimentais deste estudo, pode-se considerar que as

    solues de hipoclorito de sdio a 1% e 2% apresentaram um efeito antimicrobiano

    superior, quando comparados com a soluo de gluconato de clorexidina a 4%.

    Palavras-chave: Desinfeco. Prtese Total. Estomatite sob Prtese. Microscopia Confocal. Candida albicans.

  • ABSTRACT

    Antimicrobial effect of disinfectant solutions on C. albicans biofilms on heat-polymerized acrylic resins

    Disinfectant solutions have been used as one of the principal methods to

    control microbial biofilms such as those formed on the complete denture surface. The

    aim of this study was to analyze the antimicrobial effect of disinfectant solutions on C.

    albicans biofilms on heat-polymerized acrylic resin by microbiological culture

    analysis, confocal laser scanning microscopy (CLSM) and scanning electron

    microscopy (SEM). Sixty specimens (5 x 5 x 1 mm) were fabricated, sterilized and

    individually inoculated with C. albicans (1.107 cells/mL) during 24 hours at 37C to

    allow the biofilm formation. After that, these 24 specimens were randomly divided

    into 4 groups (n=6) according to the disinfection solutions tested: G1 (control)

    distilled water for 10 minutes; G2 4% chlorhexidine gluconate for 10 minutes; G3

    1% sodium hypochlorite for 10 minutes; G4 2% sodium hypochlorite for 5 minutes.

    After disinfection, the remaining biofilms on the specimens were stained with

    fluorochromes SYTO-9 and propidium iodide to be analyzed by CLSM. Furthermore,

    the same disinfection process was applied to another 24 specimens which were

    submitted to microbiological culture analysis. After 48 hours of incubation,

    quantification of colony-forming units (CFU/mL) was performed. Also, the same

    disinfection process was applied to the remaining 12 specimens for the SEM

    analysis. The data were statistically analyzed using the Kruskal-Wallis and Student-

    Newman-Keuls tests, considering a significance level of 5%. The data obtained by

    CLSM revealed that all disinfectant solutions killed all remaining fungal cells on the

    specimens. Similar results were obtained by microbiological culture analysis, where

    all disinfectant solutions were able to avoid fungal growth in culture. CLSM and SEM

    analyses of specimens indicated that the 4% chlorhexidine gluconate solution did not

    remove the C. albicans cells from the resin acrylic surface. On the other hand, the

    1% and 2% sodium hypochlorite solutions provided an almost complete biofilm

    removal from the acrylic surface. Furthermore, by SEM examination, morphologic

    damages became evident in the few residual Candida cells after 1% sodium

  • hypochlorite disinfection. Thus, such findings suggest that, under the experimental

    conditions of this study, the 1% and 2% sodium hypochlorite solutions showed

    superior antimicrobials effect when compared with the 4% chlorhexidine gluconate

    solution.

    Keywords: Disinfection. Complete Dentures. Denture Stomatitis. Confocal Microscopy. Candida albicans.

  • LISTA DE ILUSTRAES

    Figura 1 Representao esquemtica da formao de biofilme de C. albicans em lmina de polimetilmetacrilato (PMMA)..............

    27

    Figura 2 Confeco dos padres de silicona........................................

    49

    Figura 3 Incluso dos padres de silicona em mufla............................

    51

    Figura 4 Preenchimento dos moldes, termopolimerizao e acabamento dos bastes de resina acrlica...........................

    53

    Figura 5 Lixamento dos bastes de resina acrlica, avaliao da rugosidade superficial, seccionamento e esterilizao dos

    corpos-de-prova......................................................................

    55

    Figura 6 Microrganismos e condies de crescimento.........................

    57

    Figura 7 Formao do biofilme.............................................................

    58

    Figura 8 Desinfeco dos corpos-de-prova..........................................

    60

    Figura 9

    Processamento dos corpos-de-prova para microscopia

    confocal..................................................................................

    61

    Figura 10

    Seqncia padro de anlise dos 6 campos dos corpos-de-

    prova no microscpio confocal..............................................

    61

    Figura 11

    Processamento dos corpos-de-prova para cultura

    microbiolgica.........................................................................

    64

  • Figura 12

    Processamento dos corpos-de-prova para MEV....................

    66

    Figura 13

    Imagens do biofilme de C. albicans sobre resina acrlica

    termopolimerizvel tratado com gua destilada por 10

    minutos (grupo controle) atravs do microscpio confocal....

    72

    Figura 14 Imagens do biofilme de C. albicans sobre resina acrlica termopolimerizvel tratado com gua destilada por 10

    minutos (grupo controle) atravs do MEV..............................

    72

    Figura 15

    Imagens do biofilme de C. albicans sobre resina acrlica

    termopolimerizvel aps a desinfeco com soluo de

    gluconato de clorexidina a 4% por 10 minutos atravs do

    microscpio confocal..............................................................

    73

    Figura 16

    Imagens do biofilme de C. albicans sobre resina acrlica

    termopolimerizvel aps a desinfeco com soluo de

    gluconato de clorexidina a 4% por 10 minutos atravs do

    MEV........................................................................................

    74

    Figura 17

    Imagens do biofilme de C. albicans sobre resina acrlica

    termopolimerizvel aps a desinfeco com soluo de

    hipoclorito de sdio a 1% por 10 minutos atravs do

    microscpio confocal.............................................................

    75

    Figura 18 Imagens do biofilme de C. albicans sobre resina acrlica termopolimerizvel aps a desinfeco com soluo de

    hipoclorito de sdio a 1% por 10 minutos atravs do

    MEV.......................................................................................

    75

  • Figura 19

    Imagens do biofilme de C. albicans sobre resina acrlica

    termopolimerizvel aps a desinfeco com soluo de

    hipoclorito de sdio a 2% por 5 minutos atravs do

    microscpio confocal..............................................................

    76

    Figura 20

    Imagens do biofilme de C. albicans sobre resina acrlica

    termopolimerizvel aps a desinfeco com soluo de

    hipoclorito de sdio a 2% por 5 minutos atravs do

    MEV........................................................................................

    77

  • LISTA DE TABELAS

    Tabela 1 Distribuio dos corpos-de-prova de acordo com a soluo desinfetante utilizada...............................................................

    59

    Tabela 2 Mdia e desvio-padro de clulas viveis, no viveis e total de clulas remanescentes para os grupos avaliados e

    nmero de corpos-de-prova por grupo....................................

    78

    Tabela 3 Comparaes entre as mdias de clulas viveis para os diferentes grupos avaliados e significncia estatstica............

    79

    Tabela 4 Comparaes entre as mdias de clulas no viveis para os diferentes grupos avaliados e significncia estatstica.......

    80

    Tabela 5 Comparaes entre as mdias do nmero total de clulas remanescentes para os diferentes grupos avaliados e

    significncia estatstica............................................................

    81

    Tabela 6 Mdias e desvio padro de UFC/mL para os diferentes grupos testados e nmero de corpos-de-prova por grupo......

    82

    Tabela 7 Comparaes entre as mdias de UFC/mL para os diferentes grupos avaliados e significncia estatstica............

    83

  • LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

    C. albicans = Candida albicans

    et al = e colaboradores

    m = micrometro

    mm = milmetros

    % = por cento

    NaOCl = hipoclorito de sdio

    pH = potencial hidrogeninico

    SH = grupamento sulfidrila

    NH = grupamento amina

    DNA = do ingls deoxyribonucleic Acid traduzido como cido

    desoxirribonucleico

    ATPase = adenosinase trifosfatase

    mg/L = miligramas por litro

    ATP = adenosina trifosfato

    C = Celsius

    = graus

    cm2 = centmetro quadrado

    MEV = microscopia eletrnica de varredura

    W = watt

    mm2 = milmetro quadrado

    RAM = reduo da atividade metablica

    g/mL = micrograma por mililitro

    n = nmero de corpos-de-prova da amostra

    G = grupos

    C. glabrata = Candida glabrata

    C. tropicalis = Candida tropicalis

    mL = mililitro

    C. kefyr = Candida kefyr

    C. famata = Candida famata

    rlu = unidade de luminescncia relativa

    cm = centmetro

  • ATCC = The American Type Culture Collections

    S. mutans = Streptococcus mutans

    E. coli = Escherichia coli

    S. aureus = Streptococcus aureus

    B. subtilis = Bacillus subtilis

    Cel/mL =clula por mililitro

    UFC = unidade formadora de colnia

    kg =quilograma

    n = nmero

    kgf = quilograma-fora

    g = gramas

    Ra = unidade de medida de rugosidade superficial

    mm/s = milmetros por segundo

    TSB = do ingls Trypic Soy Broth traduzido como caldo de soja trpico

    PBS = do ingls phosphate buffer solution traduzido como soluo de

    tampo fosfato

    rpm = rotaes por minuto

    nm = nanometro

    M = micromolar

    L = microlitro

    NAP/MEPA = Ncleo de Apoio Pesquisa/ Microscopia Eletrnica

    Aplicada Pesquisa Agropecuria

    p = nvel de significncia

    ufc/mL = unidades formadoras de colnias por mililitro

    DP = desvio padro

  • SUMRIO

    1 INTRODUO E SNTESE BIBLIOGRFICA........................................ 21

    1.1 Estomatite por prtese total............................................................... 23

    1.2 Formao do biofilme sobre prtese total........................................ 25

    1.3 Controle do biofilme sobre prtese total.......................................... 28

    1.3.1 Hipoclorito de sdio................................................................................... 31

    1.3.2 Clorexidina...............................................................................................

    33

    1.4 Tcnicas empregadas na anlise dos efeitos dos agentes antimicrobianos sobre os biofilmes..........................................................

    35

    1.5 Estudos relacionados eficcia antimicrobiana das solues de hipoclorito de sdio e clorexidina no controle do biofilme sobre prteses totais.............................................................................................

    37

    2 PROPOSIO........................................................................................

    43

    3 MATERIAL E MTODOS........................................................................ 47

    3.1 Confeco dos corpos-de-prova....................................................... 49

    3.1.1 Confeco dos padres de silicona............................................................... 49

    3.1.2 Incluso dos padres de silicona em mufla..................................................... 50

    3.1.3 Preenchimento dos moldes, termopolimerizao e acabamento dos bastes de

    resina acrlica.....................................................................................................

    52

    3.1.4 Lixamento dos bastes de resina acrlica, avaliao da rugosidade superficial,

    seccionamento e esterilizao dos corpos-de-prova...................................................

    54

    3.2 Inoculao dos corpos-de-prova....................................................... 56

    3.2.1 Microrganismos e condies de crescimento................................................... 56

    3.2.2 Formao do biofilme.................................................................................

    57

  • 3.3 Anlise do efeito das solues desinfetantes na viabilidade de C. albicans presentes em biofilmes sobre resina acrlica termopolimerizvel.....................................................................................

    58

    3.3.1 Anlise do efeito das solues desinfetantes na viabilidade de C. albicans atravs

    de microscopia confocal....................................................................................... 58

    3.3.1.1 Desinfeco dos corpos-de-prova.............................................................. 58

    3.3.1.2 Processamento dos corpos-de-prova para microscopia confocal...................... 60

    3.3.1.3 Anlise dos corpos-de-prova no microscpio confocal.................................... 61

    3.3.2 Anlise do efeito das solues desinfetantes na viabilidade de C. albicans atravs

    de cultura microbiolgica....................................................................................... 62

    3.3.2.1 Desinfeco dos corpos-de-prova................................................................ 63

    3.3.2.2 Processamento dos corpos-de-prova para cultura microbiolgica.......................... 63

    3.4 Anlise do efeito das solues desinfetantes sobre as C. albicans presentes em biofilmes sobre resina acrlica termopolimerizvel atravs do microscpio confocal e do MEV............

    65

    3.4.1 Desinfeco dos corpos-de-prova para anlise em MEV................................... 65

    3.4.2 Processamento dos corpos-de-prova para MEV.............................................. 65

    3.4.3 Anlise dos corpos-de-prova atravs do MEV................................................. 66

    3.5 Anlise estatstica...............................................................................

    67

    4 RESULTADOS......................................................................................... 69

    4.1 Anlise do efeito das solues desinfetantes nas C. albicans presentes em biofilmes sobre resina acrlica termopolimerizvel atravs do microscpio confocal e do MEV..............................................

    71

    4.1.1 Grupo controle......................................................................................... 71

    4.1.2 Soluo de gluconato de clorexidina a 4%...................................................... 73

    4.1.3 Soluo de hipoclorito de sdio a 1%............................................................ 74

    4.1.4 Soluo de hipoclorito de sdio a 2%............................................................ 76

  • 4.2 Anlise do efeito das solues desinfetantes na viabilidade de C. albicans presentes em biofilmes sobre resina acrlica termopolimerizvel atravs do microscpio confocal.............................

    77

    4.3 Anlise do efeito das solues desinfetantes na viabilidade de C. albicans presentes em biofilmes sobre resina acrlica termopolimerizvel atravs de cultura microbiolgica............................

    81

    5 DISCUSSO...........................................................................................

    85

    5.1 Da metodologia................................................................................... 87

    5.2 Dos resultados................................................................................... 92

    5.2.1 Dos resultados obtidos atravs do microscpio confocal e do MEV...................... 92

    5.2.2 Dos resultados obtidos atravs de cultura microbiolgica................................... 95

    6 CONCLUSO.........................................................................................

    99

    7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................................

    103

    APNDICES................................................................................................... 117

  • 16

    11 IInnttrroodduuoo ee

    SSnntteessee BBiibblliiooggrrffiiccaa

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa 23

    1 INTRODUO E SNTESE BIBLIOGRFICA 1.1 Estomatite por prtese total

    A candidose uma entidade clnica bem conhecida no meio odontolgico,

    sendo Langenback, o primeiro pesquisador a isolar o seu agente em 1839. Trata-se

    da uma infeco fngica mais corriqueira na boca, sendo a Candida albicans a

    espcie mais freqentemente encontrada (WILLIAMS et al., 1997). A C. albicans

    um fungo dimrfico, que pode se apresentar sob forma de levedura (incua) ou hifa

    (patognica) (BUNETEL e BONNAURE-MALLET, 1996). comumente notada em

    pacientes portadores de prteses totais, pacientes imunodeprimidos, que se

    submeteram a antibioticoterapia ou usurios de medicamentos que induzam

    xerostomia (BIRMAN, 2002).

    No que tange aos portadores de prtese total, observa-se uma grande

    ocorrncia desta patologia nestes indivduos, recebendo, nestes casos, a

    denominao de estomatite por prtese total. A literatura reporta uma grande

    variedade de terminologias para se referir a esta doena: estomatite por dentadura

    ou estomatite prottica (CROCKETT, O'GRADY e READE, 1992; KULAK-OZKAN,

    KAZAZOGLU e ARIKAN, 2002), candidase eritematosa (CROCKETT, O'GRADY e

    READE, 1992), boca irritada por dentadura (denture sore mouth) (BUDTZ-

    JORGENSEN, 1978), estomatite por dentadura associada Candida (MAZA et al.,

    2002), estomatite induzida por dentadura (NIKAWA, HAMADA e YAMAMOTO,

    1998), candidose oral associada ao uso de dentadura (BUDTZ-JORGENSEN et al.,

    2000), candidase atrfica crnica (BUDTZ-JORGENSEN, 1978) e estomatite

    relacionada dentadura (BARBEAU et al., 2003). Entretanto, optamos por utilizar o

    termo estomatite por prtese total por ser o mais utilizado (ARENDORF e WALKER,

    1987).

    Esta patologia consiste em uma leso que acomete entre 11% a 60% dos

    portadores de prtese total maxilar (BUDTZ-JORGENSEN, 1974). Sua presena

    mais acentuada em mulheres do que em homens e a freqncia aumenta com a

    idade (DAVENPORT, 1970). observada na mucosa palatina que serve de suporte

    para as prteses totais (WEBB et al., 1998b), sendo rara a sua manifestao no arco

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa24

    mandibular. Geralmente assintomtica, podendo apresentar sintomatologia rara,

    como dor, halitose, prurido e queimao (FIGUEIRAL et al., 2007).

    A etiologia da estomatite por prtese total mostra-se extremamente varivel,

    conceitualmente classificada como uma doena multifatorial, podendo estar

    associada alergia ao monmero residual, ao acmulo de placa microbiana,

    trauma causado pela prtese total, hipossalivao e infeco por C. albicans

    (ALLEGRA e GENNARI, 2000). Entre esses fatores, a maioria dos estudos afirma

    que a C. albicans representa o principal agente etiolgico para essa patologia

    (ARENDORF e WALKER, 1987; NIKAWA, HAMADA e YAMAMOTO, 1998).

    Porm, a ocorrncia isolada destes fatores no assegura o surgimento desta

    infeco, sendo necessria a associao entre estes. Como exemplo, vale ressaltar

    o estudo de Barbeau et al. (2003) a respeito da controversa relao entre a Candida

    sp. e os traumatismos protticos, como agentes etiolgicos desta patologia. Estes

    reavaliaram a classificao clssica das estomatites por prteses totais descritas por

    Newton (1962), a qual se baseia na severidade do eritema na mucosa do palato

    bucal. Segundo a nova classificao proposta por estes autores, na estomatite por

    prteses totais do Tipo 1 no h evidncias de inflamao da mucosa do palato

    bucal (sem estomatite), na do Tipo 2 h apenas a presena de petquias dispersas

    atravs de toda ou uma restrita parte da mucosa palatal em contato com a prtese

    total (Newton 1), na do Tipo 3 h uma difuso do eritema pelo palato, porm sem

    hiperplasia papilar (Newton 2) e na do tipo 4 h uma difuso do eritema pelo palato

    com hiperplasia papilar (Newton 3). Como concluso, os autores afirmaram que no

    estgio inicial (Tipo 2), a inflamao local causada pela presena da dentadura, no

    proveniente de infeces microbianas, pois a quantidade e nmero de colnias de

    leveduras e de placa microbiana na dentadura, baixa. Alm disso, estes autores

    afirmaram que a presena de Candida sp. em estomatite por prtese total,

    provavelmente ligada a inflamaes extensas, evidenciadas nos estgios mais

    avanados (Tipo 3 e 4). Os autores levantaram a hiptese que a colonizao das

    dentaduras ou da mucosa bucal por Candida sp., pode ser secundria ao processo

    de inflamao, onde fatores inflamatrios no conhecidos favoreceriam o

    estabelecimento inicial deste fungo.

    Ademais, segundo Arendorf e Walker (1979), outro fator que favorece a

    presena C. albicans na cavidade bucal e, por conseguinte, o desenvolvimento de

    estomatite por dentadura, trata-se do uso ininterrupto de prteses totais. De acordo

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa 25

    com Compagnoni et al. (2007), a identificao de colnias de C. albicans mostraram-

    se mais intensas nos indivduos que apresentaram o hbito de dormir com suas

    prteses totais.

    1.2 Formao do biofilme sobre prtese total

    semelhana de outros microrganismos presentes na cavidade bucal, a C.

    albicans possui a habilidade da adeso s resinas das prteses totais, quer seja

    diretamente ou atravs de uma intermediria camada formada por placa bacteriana

    (CHANDRA et al., 2001b).

    Aps a adeso superfcie, inicia-se o processo de formao do biofilme.

    Em contraste a vasta descrio dos biofilmes bacterianos, pouca ateno tem sido

    prestada, do ponto de vista mdico, aos biofilmes formados por fungos. Porm, na

    odontologia, devido s respostas inflamatrias que podem ocorrer nas mucosas

    bucais, decorrente do contato com as prteses totais, os biofilmes tm sido o alvo do

    interesse de diversos autores (HAWSER e DOUGLAS, 1994; CHANDRA et al.,

    2001b; DONLAN e COSTERTON, 2002; KUHN et al., 2002; CHANDRA, ZHOU e

    GHANNOUM, 2005). De acordo com Donlan e Costerton (2002), os biofilmes so conceituados

    como uma comunidade sssil caracterizada por clulas que formam microcolnias, e

    que esto irreversivelmente aderidas a um substrato, a uma interface, ou ainda uma

    s outras, embebidas numa complexa matriz extracelular de substncias polimricas, exibindo um fentipo alterado no que diz respeito a taxa de crescimento

    microbiano e transcrio gentica. Os biofilmes representam o tipo de crescimento

    microbiano predominante na natureza, e so cruciais no desenvolvimento de

    infeces, uma vez que servem de nicho aos agentes patognicos e esto

    associados a altos nveis de resistncia a agentes antimicrobianos (DONLAN, 2001;

    KUHN et al., 2002).

    Neste sentido, Chandra et al. (2001b), avaliaram a suscetibilidade

    antifngica da C. albicans frente clorexidina e nistatina. Os resultados mostraram

    50% de reduo da atividade metablica (RAM) de C. albicans desenvolvida em

    biofilmes s concentraes de 16 g/mL para nistatina e 128 g/mL para clorexidina;

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa26

    e 50% de RAM de C. albicans desenvolvida em meio de cultura s concentraes de

    1,0 g/ml para nistatina e 4,0 g/ml para clorexidina. Esses achados confirmam a

    hiptese de que microrganismos desenvolvidos em biofilmes so bem mais

    resistentes ao desses produtos do que aqueles desenvolvidos isoladamente em

    meios de cultura.

    Em outro estudo, Chandra et al. (2001a) descreveram com detalhes a

    formao do biofilme de C. albicans em lminas de polimetilmetacrilato. Neste

    material ocorrem basicamente em trs fases distintas: a) fase inicial (0 a 11 horas);

    b) fase intermediria (aproximadamente 12 a 30 horas); c) fase de maturao

    (aproximadamente 38 horas a 72 horas). Inicialmente, as clulas leveduriformes de

    C. albicans aderem-se superfcie da lmina, formando posteriormente

    microcolnias. Nas primeiras 11 horas, as comunidades de C. albicans aparecem

    como uma camada de clulas, devido ao crescimento e agregao das colnias. O

    desenvolvimento da fase intermediria caracterizado pela emergncia e

    predominncia de substncia no celular (polimrica), a qual se assemelha a uma

    nvoa que forma um filme e cobre as microclonias do fungo. Durante a fase de

    maturao, a quantidade de substncia polimrica extracelular aumenta com o

    tempo de incubao e as comunidades de C. albicans so completamente cobertas

    por essa substncia (Figura 1).

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa 27

    Figura 1: Representao esquemtica da formao de biofilme de C. albicans em lmina de polimetilmetacrilato (PMMA). Vista superior do biofilme (A). Vista lateral do biofilme (B). EPS (substncia polimrica extracelular). Fonte: Chandra et al. (2001), com modificaes.

    Segundo Vasilas et al. (1992), um fator que pode beneficiar a proliferao

    de biofilmes de C. albicans na superfcie da prtese total, diz respeito s

    irregularidades presentes nesta superfcie. Quando a resina acrlica apresenta

    rugosidade superficial acima de 0,02 m, sua superfcie torna-se passvel de

    colonizao (BOLLEN, LAMBRECHTS e QUIRYNEN, 1997), pois o crescimento em

    forma micelial da Candida sp. permite que esse fungo se desenvolva e se aloje no

    interior das ranhuras formadas, onde estar livre de foras externas de remoo,

    como o efeito autolimpante da saliva e da escovao, proporcionando um

    reservatrio de fungos para uma futura reinfeco (SAMARANAYAKE, MCCOURTIE

    e MACFARLANE, 1980). Alm disso, segundo Quirynen e Bollen (1995), as

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa28

    superfcies rugosas proporcionam uma colonizao e maturao mais veloz da placa

    microbiana sobre a prtese.

    Neste cenrio, parece lgico afirmar que a rugosidade superficial

    extremamente crtica s prteses totais visto que, segundo Phillips (1986), a

    superfcie externa vestibular e lingual da prtese total so as regies que devem ser

    polidas, porm a superfcie interna ou rea basal convencionalmente no sofre

    processos de acabamento e polimento. Desta maneira, esta regio deve apresentar

    valores de rugosidade superficial bem superiores a 0,02 m, tornando-se passvel de

    adeso microbiana (BOLLEN, LAMBRECHTS e QUIRYNEN, 1997). Como

    agravante, de acordo com Davenport (1972), a abraso provocada pela higienizao

    atravs de escova dental, os ajustes clnicos peridicos com fresas e a deteriorao

    do acrlico por substncias (gua e solues higienizadoras) com o decorrer do

    tempo, so fatores que proporcionam a formao de irregularidades na resina

    acrlica de prteses totais compatveis com o dimetro de 1 m dos cocos e 5 m

    dos fungos (VAN REENEN, 1973), favorecendo o acmulo e a penetrao deste

    patgenos no interior da prtese. Neste sentido, estudos (THEILADE e BUDTZ-

    JORGENSEN, 1980; CATALAN, HERRERA e MARTINEZ, 1987) a respeito da

    composio e a formao do biofilme microbiano em bases de prteses de

    pacientes sadios e portadores de estomatite por uso de dentadura, constataram que

    alguns microrganismos poderiam estar presentes tanto na superfcie externa da

    base da prtese, quanto na interna, onde, de acordo com Chau et al. (1995), a

    penetrao destes microrganismos na resina acrlica pode alcanar at 3 mm. Deste

    modo, passam a ter maior relevncia os cuidados de higienizao realizados sobre

    as superfcies da prtese.

    1.3 Controle do biofilme sobre prtese total

    Cabe ao cirurgio dentista orientar o paciente de forma clara quanto aos

    cuidados de higienizao adequados e quanto s tcnicas a serem usadas de forma

    que compensem as limitaes de cada paciente, conscientizando-o da necessidade

    de conservao e limpeza de suas prteses totais (PARANHOS et al., 2000).

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa 29

    A limpeza da prtese total fator primordial na manuteno da sade bucal

    dos pacientes edntulos (KULAK-OZKAN, KAZAZOGLU e ARIKAN, 2002). A

    higienizao inadequada da prtese total produz alteraes inflamatrias nos tecidos

    de sustentao e odor desagradvel (LIMA et al., 2006). Ainda em decorrncia de

    uma higienizao inadequada, comum encontrarmos resduos alimentares,

    pigmentos, clculos dentrios e placa microbiana aderidos prtese (LIMA et al.,

    2006). No que tange a placa bacteriana, esta freqentemente est associada ao

    maior agente etiolgico da estomatite por prtese total, a C. albicans (NIKAWA,

    HAMADA e YAMAMOTO, 1998).

    Na teraputica da estomatite por prtese total, intil apenas a eliminao

    de seus patgenos presentes na cavidade bucal atravs de antifngicos locais ou

    sistmicos, se os tecidos bucais forem inoculados repetitivamente por uma prtese

    contaminada. De acordo com Webb et al. (1998c), a estomatite por prtese total est

    associada ao crescimento de Candida no biofilme sobre a prtese, e no na mucosa

    do palato. Por isso, o tratamento deveria ser direcionado prtese, e no mucosa.

    Fundamentados nessa premissa, vrios estudos (BUDTZ-JORGENSEN,

    1979; RUDD et al., 1984; MOLINARI e RUNNELLS, 1991; KULAK et al., 1997; LIN

    et al., 1999; SILVA et al., 2006) tm sido realizados com intuito de se verificar qual

    mtodo o mais eficaz no controle do biofilme sobre a prtese total. Clinicamente,

    observa-se que para tal, o mtodo mais comumente utilizado (60% a 90% dos

    usurios) a escovao com gua e sabo ou dentifrcio (ABELSON, 1985;

    JAGGER e HARRISON, 1995). Porm, h indivduos, como os idosos, que se

    tornam incapacitados de promover a higienizao adequada de suas prteses totais

    atravs deste mtodo, em virtude da reduo da acuidade visual e da destreza

    manual (KULAK et al., 1997; LIMA et al., 2006). Nestes casos, a imerso da prtese

    em solues qumicas a melhor opo (BUDTZ-JORGENSEN, 1979). Reforando

    esta premissa, Dills et al. (1988), evidenciaram que estas substncias apresentam

    atividade antimicrobiana mais efetiva do que a escovao com dentifrcio.

    O objetivo da imerso das dentaduras em solues desinfetantes a

    obteno da descontaminao das prteses (ASAD, WATKINSON e HUGGETT,

    1992). Desta forma, atuam no tratamento e na preveno da estomatite por prtese

    total. Alm disso, visto que as prteses totais ficam expostas a microrganismos

    patognicos orais e no-orais, que incluem bactrias, vrus e fungos, as solues

    desinfetantes recebem uma importncia adicional, pois quando usadas aps a

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa30

    retirada e antes da insero da prtese na boca, representam um mtodo

    recomendado no controle da infeco cruzada no consultrio odontolgico e no

    laboratrio de prtese (BRACE e PLUMMER, 1993; LIN et al., 1999).

    Quanto ao mecanismo de ao das solues desinfetantes, vale a pena

    ressaltar o fato que, em linhas gerais, todas as substncias que possuem uma ou

    mais zonas ativas capazes de estabelecer interaes com componentes celulares

    em stios-alvo especficos das clulas microbianas so consideradas agentes

    antimicrobianos. De uma forma mais pragmtica, pode-se tambm definir substncia

    antimicrobiana como sendo uma substncia que desempenha um efeito adverso na

    viabilidade (microbiocida) ou no crescimento e reproduo (microbioesttico) de

    microrganismos. Geralmente, a concentrao da substncia qumica

    antimicrobiana que determina a natureza da ao: se a concentrao baixa para

    as caractersticas do sistema onde aplicado, ento o efeito de carter

    bioesttico; se a concentrao suficientemente elevada o agente atuar numa

    estrutura vital das clulas e a sua ao classificar-se- como biocida (PAULUS,

    1993).

    Algumas substncias antimicrobianas tambm possuem a capacidade de

    remoo da massa do biofilme. Estas so geralmente baseadas em produtos com

    propriedades dispersantes, quelantes, tensoativas, etc., cujos mecanismos de ao

    passam essencialmente pela fragilizao da matriz polimrica dos biofilmes, pelo

    enfraquecimento das interaes biofilme-superfcie de adeso e pela disperso de

    depsitos biolgicos ou, idealmente, pela preveno da formao de biofilmes

    (CLAUS e MULLER, 1996). Ao dispersarem as populaes microbianas e/ou as

    substncias polimricas incorporadas no biofilme para o meio lquido, estas

    substncias favorecem o processo de controle dos biofilmes, pois tornam os

    microrganismos mais susceptveis ao dos agentes antimicrobianos (CLOETE,

    JACOBS e BROZEL, 1998).

    Idealmente, a remoo do biofilme somada reduo da viabilidade dos

    microrganismos que o formam sempre pretendida no controle do biofilme sobre a

    prtese total, pois um biofilme residual composto por clulas mortas pode ainda

    atuar como uma fonte de endotoxinas, permitindo a sua rpida recolonizao e

    provendo proteo para novos patgenos (MEILLER et al., 1999; CHEN e

    STEWART, 2000; LIAQAT e SABRI, 2008).

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa 31

    Atualmente, ainda h muitas discusses entre os pesquisadores da rea a

    respeito do melhor agente desinfetante, assim como do perodo necessrio para a

    desinfeco das prteses totais. A seleo da soluo desinfetante deve ser sempre

    fundamentada na eficcia da desinfeco e na compatibilidade com os tecidos

    bucais, devido ao extenso nmero de porosidades na superfcie das dentaduras que

    provocam um efeito residual (PAVARINA et al., 2003).

    1.3.1 Hipoclorito de sdio

    O hipoclorito de sdio amplamente utilizado no campo da desinfeco

    qumica em odontologia, pois apresenta uma srie de propriedades, tais como:

    atividade antimicrobiana, baixo custo, fcil manuseio, desodorizante e baixa tenso

    superficial. Entretanto, deve ser utilizado com cautela por ser corrosivo a certos

    metais, sobretudo o alumnio (FUKUZAKI, 2006).

    O hipoclorito de sdio unicamente existe em soluo aquosa. Neste estado

    ele origina o hidrxido de sdio (base forte) e o cido hipoloroso (cido fraco)

    (LOPES, SIQUEIRA JUNIOR e ELIAS, 1999). Assim sendo, em soluo aquosa o

    hipoclorito de sdio exibe um equilbrio dinmico de acordo com a reao:

    NaOCl + H2O NaOH + HOCL

    Diversos estudos demonstraram que o hipoclorito de sdio apresenta

    excelente atividade antimicrobiana. No entanto, o mecanismo exato pelo qual esta

    substncia destri microrganismos ainda no foi bem elucidado. Alguns autores

    acreditavam que o efeito antimicrobiano do hipoclorito de sdio dava-se pela

    liberao de oxignio nascente por parte do cido hipocloroso, o qual,

    Hipoclorito de Sdio

    gua Hidrxido de Sdio

    cido Hipocloroso

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa32

    supostamente, destruiria o microrganismo, pela formao de radicais oxigenados

    txicos. Esta teoria parece infundada, uma vez que outros compostos que liberam

    uma quantidade muito maior de oxignio nascente, como a gua oxigenada, no

    destroem o microrganismo to rapidamente quanto os compostos clorados (LOPES,

    SIQUEIRA JUNIOR e ELIAS, 1999).

    Deste modo, sabe-se que a ao desinfetante de substncias cloradas deve-

    se liberao de cloro. Apesar de o hidrxido de sdio gerado pela reao do

    hipoclorito com a gua tambm apresentar eficcia antimicrobiana, sabe-se que a

    formao de compostos contendo cloro ativo, como o cido hipocloroso e o on

    hipoclorito, a principal responsvel pela excelente atividade antimicrobiana da

    soluo clorada (LOPES, SIQUEIRA JUNIOR e ELIAS, 1999).

    Dois efeitos antimicrobianos tm sido atribudos ao cloro: inibio enzimtica

    e formao de cloraminas, aps reao com componentes do citoplasma

    microbiano. Muitas enzimas microbianas contm o aminocido cistena, tendo assim

    cadeias laterais terminando em grupamentos sulfidrila (SH). Tais enzimas apenas

    exercem suas funes, se o grupamento SH estiver livre e reduzido. O cloro um

    forte agente oxidante, que promove a oxidao irreversvel de grupamentos

    sulfidrilas (SH) de aminocidos e protenas microbianas para a forma de sulfetos

    (S-S). Evidentemente, tal efeito se d tanto em protenas associadas membrana

    quanto sobre as protenas presentes no citoplasma. Uma vez que as enzimas so

    protenas especializadas, e como as protenas so oxidadas pelo cloro, importantes

    reaes metablicas passam a ser interrompidas, originando a morte celular (WEBB

    et al., 1995; LOPES, SIQUEIRA JUNIOR e ELIAS, 1999; ESTRELA et al., 2002). O

    cloro tambm pode reagir com o grupamento amina (NH) de protenas

    citoplasmticas, formando cloraminas, compostos de reconhecida toxicidade, os

    quais interferem com o metabolismo celular. Todavia, como o efeito microbicida do

    cloro se d rapidamente, mesmo em baixas concentraes, as reaes de oxidao

    enzimticas parecem preceder o acmulo de cloraminas no citoplasma microbiano,

    sendo, por esta razo, o principal mecanismo envolvido na destruio da clula

    microbiana (LOPES, SIQUEIRA JUNIOR e ELIAS, 1999; ESTRELA et al., 2002).

    Alm desses efeitos, o hipoclorito de sdio tambm causa danos parede e

    membrana celular (FUKUZAKI, 2006), assim como ao DNA (LOPES, SIQUEIRA

    JUNIOR e ELIAS, 1999).

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa 33

    Considerando essas propriedades, os hipocloritos alcalinos podem ser

    utilizados na desinfeco de prteses totais, pois removem manchas, dissolvem a

    mucina e outras substncias orgnicas e so bactericidas e fungicidas. Alm disso,

    estes no dissolvem clculos, mas podem inibir sua formao em prteses por

    dissolver a matriz orgnica do biofilme (BUDTZ-JORGENSEN, 1979; LIMA et al.,

    2006).

    1.3.2 Clorexidina

    Devido preencher quase todos os pr-requisitos de uma soluo

    desinfetante ideal, no campo da prtese dentria, a clorexidina tem sido empregada

    na desinfeco de prteses removveis. A clorexidina um detergente catinico,

    uma Bis-biguanida no txica que preparada sob a forma de diversos sais, entre

    eles o acetato, cloridrato e o gluconato de clorexidina (FLOTRA, 1973). Seu efeito

    antimicrobiano de amplo espectro, incluindo C. albicans, efeito residual por vrias

    horas depois da aplicao (WHITE, HAYS e JANER, 1997), e citotoxicidade mais

    baixa que do hipoclorito de sdio (FARDAL e TURNBULL, 1986) so predicados que

    ajudam a difundir seu uso.

    A clorexidina foi introduzida na medicina em 1950, como desinfetante de

    amplo espectro bacteriano e, em 1954 iniciou o seu emprego de forma rotineira no

    tratamento de feridas na pele (FIDEL, MARQUES e ANTONIAZZI, 1995). Os

    primeiros estudos realizados na odontologia utilizaram a clorexidina na desinfeco

    de campos operatrios (CAWSON e CURSON, 1961). Na dentstica tem sido

    largamente utilizada, demonstrando excelentes resultados no controle da crie pela

    reduo de Streptococcus mutans e espcies de Lactobacillus (FERRAZ et al.,

    2001). Na periodontia atua como auxiliar no tratamento controlando o crescimento

    de microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos (FERRAZ et al., 2001) e na

    preveno da formao da placa bacteriana pela capacidade de aderir a substratos

    aninicos como hidroxiapatita, pelculas, glicoprotenas salivares e bactrias, e pela

    sua lenta liberao dos stios de reteno (GREENSTEIN, BERMAN e JAFFIN,

    1986).

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa34

    Segundo Lopes, Siqueira Junior e Elias (1999), em baixas concentraes, a

    clorexidina bacteriosttica, enquanto que, em concentraes mais elevadas, ela

    bactericida. Por ser uma molcula catinica, a clorexidina atrada e adsorvida

    superfcie microbiana, na qual carregada negativamente. Esta adsoro d-se,

    principalmente, em componentes contendo fosfato. Na seqncia do processo de

    lise do microrganismo, a clorexidina atrada para a membrana citoplasmtica, na

    qual promove uma ruptura, permitindo a liberao de componentes citoplasmticos

    de baixo peso molecular, como, por exemplo, ons potssio. Alm disso, em nvel de

    membrana, a clorexidina pode inibir a atividade de determinadas enzimas, como a

    adenosinase trifosfatase (ATPase). Se o efeito da clorexidina, devido baixa

    concentrao, pra nesse ponto, a substncia tem um efeito bacteriosttico.

    O efeito bactericida da clorexidina observado em concentraes mais

    altas, quando se verifica que o dano membrana citoplasmtica mais severo,

    levando ao extravasamento de contedo citoplasmtico de maior peso molecular,

    como cidos nuclicos. Quando a concentrao da substncia suficientemente

    elevada (100 a 500 mg/L), no h mais extravasamento do contedo citoplasmtico

    microbiano, visto que este se torna precipitado, como resultado da reao da

    clorexidina com compostos fosfatados, como ATP (adenosina trifosfato) e cidos

    nuclicos, formando complexos. Neste ltimo caso, o efeito bactericida

    extremamente rpido. A maioria das solues de clorexidina usadas na clnica

    odontolgica possui efeito bactericida (LOPES, SIQUEIRA JUNIOR e ELIAS, 1999).

    A clorexidina utilizada na rotina odontolgica comercializada em pH neutro,

    pois, nesta situao, a molcula de clorexidina rapidamente adsorvida aos ons

    presentes na superfcie dos microrganismos, facilitando, assim, a sua penetrao na

    clula. Por outro lado, em condies cidas, h uma supresso dos ons nesta

    superfcie, o que ocasiona uma menor atrao desta molcula pelos microrganismos

    e, por conseguinte, torna mais difcil a sua penetrao na clula. Portanto, a

    clorexidina em pH neutro apresenta maior efeito biocida do que em concentraes

    cidas (BONESVOLL et al., 1974).

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa 35

    1.4 Tcnicas empregadas na anlise de biofilmes

    Tradicionalmente, a microscopia eletrnica de varredura (MEV) tem sido o

    mtodo de escolha para anlise dos biofilmes devido sua alta resoluo. Esta

    tcnica permite a observao da presena e da morfologia dos microrganismos,

    assim como da formao de biofilme e das diferentes associaes microbianas na

    superfcie de materiais polimricos. Alm disso, possibilita a anlise minuciosa dos

    efeitos causados pelas solues desinfetantes sobre microrganismos em biofilmes,

    como a remoo destes da superfcie do material e alteraes na sua morfologia. No

    entanto, esta tcnica requer, como pr-requisito, que o biofilme deva ser submetido

    aos processos de desidratao e de fixao, portanto, esta no apropriada para o

    estudo de caractersticas funcionais de microrganismos em biofilmes, como a

    viabilidade celular (WOOD et al., 2000).

    A microscopia de fluorescncia tem se revelado um mtodo mais sensvel na

    caracterizao da viabilidade de microrganismos. A determinao da viabilidade por

    meio desta tcnica ocorre atravs do uso de marcadores fluorescentes,

    denominados fluorocromos, que possibilitam a avaliao de aspectos funcionais e

    estruturais das clulas. O fluorforo a parte presente no fluorocromo responsvel

    pela produo de fluorescncia. A fluorescncia ocorre por um fenmeno onde

    eltrons do fluorforo absorvem ftons provindos de uma fonte (lmpada ou feixe

    laser) e passam de um estado fundamental de energia mais baixa para um estado

    excitado de energia mais elevada. Nesse estado, o fluorforo passa por uma

    mudana em sua conformao e pode interagir com uma srie de molculas ao seu

    redor. Com isso a energia deste estado excitado dissipada em forma de fton e o

    eltron retorna novamente para o estado de menor energia. A tcnica de

    microscopia de fluorescncia consiste justamente em captar este fton que emitido

    e atravs dele gerar uma imagem (ALBERTS, 2004).

    Entre as tcnicas de microscopia de fluorescncia, a microscopia confocal

    de varredura a laser, associada aplicao de fluorocromos especficos amostra a

    ser analisada, proporciona a anlise de biofilmes sem o preparo dos espcimes,

    dispensando procedimentos como a desidratao, a embebio e a fixao

    (ZAURA-ARITE, VAN MARLE e TEN CATE, 2001). Deste modo, a arquitetura e

    organizao interna do biofilme so mantidas, alm de outras caractersticas, como

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa36

    a espessura e a viabilidade celular (WOOD et al., 2000). Outra vantagem do

    microscpio confocal para o estudo do biofilme sua capacidade de captar imagens

    em diferentes profundidades de foco, facilitando a visualizao de espcimes

    irregulares, densos e espessos de maneira tridimensional (KUBINOVA e JANACEK,

    2001).

    Quanto s tcnicas de anlise da viabilidade das clulas fngicas, a

    identificao de clulas viveis atravs da contagem de unidades formadoras de

    colnias (UFC) demorada e no relata com confiana a capacidade metablica de

    clulas apresentando crescimento lento ou no estado de no diviso (MILLARD et

    al., 1997). Isso fundamental, visto que diante de alteraes ambientais,

    microrganismos, entre eles a C. albicans, podem alterar seu estado fisiolgico,

    interrompendo a diviso celular, mas mantendo suas atividades metablicas. Por

    conseguinte, a determinao da viabilidade microbiana deve abranger outros

    aspectos alm da proliferao celular (WEIGER et al., 2002). Mtodos de contagem

    direta, os quais tipicamente envolvem pigmentao vital com indicadores, tais como

    o azul de metileno ou o sal de tretazolium, so utilizados para acessar a atividade de

    oxi-reduo dos fungos. Embora esta anlise seja simples para ser realizada, ela

    demonstra no ser fidedigna em fungos, devido haver inconsistncia na reteno

    dos indicadores nestas clulas, assim como as superfcies destas clulas no serem

    especficas para estes indicadores (MILLARD et al., 1997).

    Em relao utilizao de fluorocromos na anlise da viabilidade de clulas

    fngicas presentes em biofilmes, a literatura demonstra a freqente utilizao do

    fluorocromo FUN-1 com esse propsito. Atravs deste marcador, as clulas fngicas

    metabolicamente no ativas (no viveis) emitem uma colorao fluorescente difusa

    verde-amarelada, enquanto que nas clulas metabolicamente ativas (viveis), o

    FUN-1 convertido em estruturas cilndricas intravacuolares de colorao laranja-

    avermelhada, fazendo com que estas clulas emitam esta mesma colorao.

    Entretanto, o FUN-1 pode provocar a formao de mltiplas estruturas cilndricas

    intravacuolares nas clulas metabolicamente ativas na forma de hifas, possibilitando

    a superestimao do nmero de clulas viveis quando a densidade celular

    elevada no biofilme. Logo, o FUN-1 no ideal para a avaliao da viabilidade

    celular de biofilmes fngicos (JIN et al., 2005).

    Na busca de um fluorocromo que suprisse a limitao do FUN-1, Jin et al

    (2005) obtiveram xito na determinao da viabilidade de C. albicans em biofilmes,

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa 37

    atravs da utilizao do Live/Dead BacLight Kit (Molecular Probes, Burlington,

    ON, Canada), embora este seja comumente utilizado na anlise de viabilidade

    bacteriana. Este Kit composto de dois fluorocromos de afinidade pelos cidos

    nuclicos, o SYTO-9 e o iodeto de propdeo.

    Atravs da colorao atribuda por esses fluorocromos, possvel se

    determinar a viabilidade microbiana tendo como parmetro a integridade da

    membrana citoplasmtica que imprescindvel para manuteno da viabilidade

    celular. Quando usado sozinho, o fluorocromo SYTO-9 penetra tanto em clulas

    vivas, quanto em clulas mortas. Em contraste, o iodeto de propdeo penetra

    somente em microrganismos mortos, com membrana comprometida. Quando

    utilizados simultaneamente, o iodeto de propdeo reduz o SYTO-9 no interior das

    clulas mortas. Deste modo, microrganismos vivos, com membrana citoplasmtica

    intacta, demonstram fluorescncia verde, enquanto microrganismos mortos, com

    membrana comprometida, apresentam fluorescncia vermelha (JIN et al., 2005).

    1.5 Estudos relacionados eficcia antimicrobiana das solues de hipoclorito de sdio e de clorexidina no controle do biofilme sobre prteses totais

    A literatura vasta no que diz respeito utilizao do hipoclorito de sdio na

    desinfeco de prteses totais. Entre esses estudos, grande parte analisou a

    eficcia do hipoclorito de sdio em concentraes mais elevadas, como em 5,25%

    (GHALICHEBAF, GRASER e ZANDER, 1982; MOORE, SMITH e KENNY, 1984;

    RUDD et al., 1984; BELL et al., 1989; CHAU et al., 1995; YILMAZ et al., 2005). Em

    linhas gerais, os autores observaram que a imerso, em mdia durante 5 minutos,

    das prteses totais em hipoclorito de sdio nesta concentrao um mtodo rpido,

    seguro e eficaz para desinfeco das prteses. Ademais, segundo MEILLER et al.

    (1999), aps a desinfeco, o hipoclorito de sdio a 5,25% garantiu uma supresso

    das bactrias do biofilme por um perodo superior quando comparado ao

    glutaraldedo a 3%. Entretanto, estes autores chamam ateno para um possvel

    efeito branqueador nas prteses totais ocasionado por esta soluo concentrada.

    Na tentativa de se minimizar os efeitos deletrios sobre as resinas acrlicas

    das prteses totais, o emprego do hipoclorito de sdio em baixas concentraes

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa38

    tambm foi testado. De acordo com Webb et al. (1995), em concentraes abaixo da

    concentrao mnina inibitria, o hipoclorito de sdio funciona como um produto anti-

    adeso para as espcies de Candida, porm no afeta as outros fatores

    relacionados sua patogenicidade, tais como: adeso s superfcies e s clulas

    epiteliais bucais, co-agregao com biofilmes de outras espcies, produo de hifas,

    de proteinases e de protenas constituintes da parede celular. A imerso das

    prteses por 8 horas em hipoclorito de sdio nas concentraes de 0,02 e 0,0125%

    eliminou o crescimento de C. albicans e reduziu o crescimento de Streptococcus

    gordonii, removendo parte dos microrganismos das superfcies das amostras de

    resina acrlica (WEBB et al., 1998a). Na concentrao de 0,05% associada

    escovao das prteses com sabo de coco, provocou uma reduo dos sinais

    clnicos da estomatite prottica, apesar de no ter reduzido a viabilidade de C.

    albicans e Streptococcus mutans (BARNABE et al., 2004). J o hipoclorito de sdio

    a 0,5% somente conseguiu 100% de eliminao para C. albicans aps 20 minutos

    de atuao (DA SILVA et al., 2004).

    Atualmente, tem-se optado pela utilizao do hipoclorito de sdio em

    concentraes intermedirias na desinfeco de prteses totais, variando entre 1% a

    2%, pois, desta maneira, alia-se a sua elevada performance antimicrobiana ao seu

    rpido tempo de ao.

    Buergers et al. (2008) realizaram um estudo com o intuito de classificar 10

    mtodos de desinfeco amplamente utilizados de acordo com a sua eficcia em

    reduzir a colonizao de C. albicans em material reembasador do tipo resiliente de

    dentaduras. Atravs dos resultados, foi observado que os nicos mtodos de

    desinfeco eficazes na reduo de colnias de C. albicans no material testado foi o

    produto comercial limpador efervescente (Blend-a-dent tabs) por 10 minutos, a

    imerso em hipoclorito de sdio a 1% por 10 minutos e a irradiao de microondas

    com imerso em gua (800 W, por 6 minutos). J na concentrao a 2%, o

    hipoclorito de sdio promoveu uma reduo relativamente maior no nmero de

    microrganismos em um material reembasador resiliente, quando comparado com o

    tratamento por microondas (BAYSAN, WHILEY e WRIGHT, 1998).

    A clorexidina pode ser empregada na desinfeco de prteses totais tanto

    na forma de enxaguatrios ou anti-spticos, em concentraes mais baixas, como

    na forma de solues desinfetantes, apresentando concentraes mais elevadas.

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa 39

    Na forma de enxaguatrio, MacNeill et al. (1997) avaliaram os efeitos da

    tetraciclina tetraclorada e do digluconato de clorexidina a 0,12% no crescimento e

    viabilidade de C. albicans. A tetraciclina tetraclorada, mesmo em altas

    concentraes, no conteve o crescimento de C. albicans, enquanto que o

    digluconato de clorexina a 0,12% inibiu o seu crescimento e replicao. Alm disso,

    por meio de microscopia, o digluconato de clorexidina a 0,12% promoveu profundas

    mudanas na morfologia destes microrganismos.

    Zaura-Arite, Van Marle e Ten Cate (2001) verificaram pela primeira vez o

    comportamento do biofilme oral aps exposio a uma soluo de clorexidina 0,2%,

    utilizando a microscopia confocal. A anlise em camadas mostrou que a camada

    mais externa do biofilme apresentou, estatisticamente, menor viabilidade bacteriana

    que a camada mais interna, tanto em 24 quanto em 48 horas, deixando clara a

    ineficcia da clorexidina nas camadas mais internas de biofilme com mais de 24

    horas de formao. Ainda atravs de microscopia confocal, Auschill et al. (2005)

    observaram que a clorexidina a 0,2% com 7% de lcool apresentou propriedades

    antibacterianas e anti-placa contra biofilmes formados em dispositivos de acrlico

    intra-orais, pois proporcionou uma reduo na espessura e na viabilidade dos

    biofilmes, quando comparados com o grupo controle.

    Na forma de anti-sptico, Theraud et al. (2004) avaliaram a eficcia de

    biocidas e de radiao contra vrias espcies de microrganismos em suspenso e

    em biofilmes, ambos formados por culturas puras ou mistas. Neste estudo foram

    testados 5 anti-spticos (Betadine iodopovidona a 10%, Dermacide lauril sulfato

    de sdio a 2%, Clorexidina digluconato de clorexidina a 0,5%, Dosisepsine

    digluconato de clorexidina a 0,05% e perxido de hidrognio a 3%), 6 tratamentos

    desinfetantes (hipoclorito de sdio a 1,2%, lcool 70 e Ecodiol a 0,25% e 0,5% e

    Ecodiol a 0,5% seguido de hipoclorito de sdio a 1,2%) e a radiao UV. Alm disso,

    foram utilizados 3 isolados de fungos de origem clnica (C. albicans, Cryptococcus

    neoformans em Rhodotorulla rubra) e 2 de origem ambiental (C. albicans e

    Cryptococcus uniguttulatus). A Clorexidina (digluconato de clorexidina a 0,5%) foi o

    nico agente fungicida eficaz contra todos os microrganismos testados neste estudo,

    tanto em suspenso quanto em biofilmes.

    Porm, semelhana da desinfeco atravs dos hipocloritos de sdio,

    atualmente, tambm se tem optado pelo emprego de solues de clorexidina em

    maiores concentraes, com a inteno de garantir uma desinfeco eficaz e mais

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa40

    rpida. DePaola et al. (1984) testaram a atividade antimicrobiana de 14 produtos

    disponveis no mercado (Kleenite, Efferdent, Polident, Mersene, gluconato de

    clorexidina a 1%, Clorassptico, Listerine, Greene Mint, Signal, Scope, Lavoris,

    Cepacol, Betadine Mouthrinse Gargle) contra microrganismos patognicos (P.

    aeruginosa, Kleibiela pneumoniae, Enterobacter cloacae, E. coli, E. aureus, C.

    albicans e T.glabrata) em 16 pacientes cancergenos imunodeprimidos. Os melhores

    agentes com atividade inibitria e bactericida foram o Kleenite, Efferdent, Polident,

    Listerine, Clorassptico e gluconato de clorexidina a 1%.

    Sesma et al. (1999) se propuseram a avaliar a eficcia de 3 mtodos

    caseiros de higienizao de prteses atravs da anlise em MEV. Constatou-se que

    o uso de escova e dentifrcio no foi eficiente na remoo de placa bacteriana, e que

    embora a associao com o produto efervescente consiga melhorar as condies de

    higiene das prteses, a combinao do mtodo mecnico com a clorexidina a 2% foi

    mais efetiva na supresso dos microrganismos. Ainda nesta concentrao, a

    clorexidina associada ao fluconazol no tratamento da estomatite por prtese total

    implicou em uma significante melhora da inflamao generalizada do palato e

    diminuio da colonizao por C. albicans, quando comparados com o tratamento

    isolado, atravs do fluconazol ou atravs de novas prteses (KULAK, ARIKAN e

    DELIBALTA, 1994).

    Atravs de um estudo in vitro, Lamfon et al. (2005) avaliaram a composio

    do biofilme das prteses e a susceptibilidade de Candida spp. a agentes

    antifngicos. O digluconato de clorexidina no foi eficaz quando empregado na

    concentrao at 0,3%. Na concentrao de 1,25%, reduziu o crescimento de

    Candida ssp., entretanto, no foi notado crescimento fngico na concentrao de

    2,5%.

    Neste contexto, pesquisas comparativas sobre a eficcia da desinfeco de

    prtese totais entre as solues de hipoclorito de sdio e clorexidina tambm foram

    realizadas.

    No estudo de Kulak et al. (1997), foi realizada a comparao entre a

    efetividade da escovao com da imerso em solues efervescentes (Corega,

    Dentpur e Fittydent), solues desinfetantes (hipoclorito de sdio a 5% e clorexidina

    a 1%) e um enxaguatrio bucal (Ipanol). A efetividade das solues foi avaliada por

    meio do MEV. As imagens demonstraram que todos os mtodos de limpeza

    removeram os microrganismos das superfcies das amostras. No entanto, as

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa 41

    solues de hipoclorito de sdio a 5% e de clorexidina a 1% (Savlon) foram

    significativamente mais efetivas. As solues efervescentes (Corega, Dentpur e

    Fittydent) e a escovao foram similares entre si e superiores imerso em Ipanol.

    De acordo com os autores, a escovao no reduziu eficientemente os

    contaminantes superficiais das amostras em conseqncia das irregularidades da

    resina acrlica.

    Pavarina et al. (2003) analisaram a eficcia de um protocolo de limpeza e

    desinfeco de prteses totais, atravs da imerso por 10 minutos em cada uma das

    seguintes solues desinfetantes: gluconato de clorexidina a 4%, hipoclorito de

    sdio a 1%, Biocide (iodforo) e Amosan (perxido alcalino). Como resultado, todas

    as soluo desinfetantes foram capazes de reduzir o crescimento dos

    microrganismos, exceto Biocide (iodforo), o qual no foi to efetivo quanto s

    outras solues na inativao dos microrganismos.

    A eficcia antimicrobiana de 6 desinfetantes e seus efeitos na rugosidade

    superficial de resina acrlica quimicamente polimerizada foram analisadas por Da

    Silva et al. (2008). De acordo com os resultados, as solues desinfetantes de maior

    eficcia foram o hipoclorito de sdio a 1%, o glutaraldedo a 2% e a clorexidina a

    2%, seguidos pelo vinagre a 100% e o perborato de sdio a 3.8% com eficcia

    intermediria. Por outro lado, as tiras de perborato de sdio no foram consideradas

    como uma alternativa vlida para a desinfeco de resina acrlica. Alm disso, os

    testes de rugosidade superficial demonstraram que houve diferena estatstica na

    rugosidade superficial somente para a clorexidina a 2%, com a qual a rugosidade

    diminuiu e para o perborato de sdio a 3.8%, para o qual a rugosidade aumentou.

    Diante da vasta literatura a respeito da eficcia antimicrobiana de solues

    qumicas na desinfeco de bases de prteses totais, Nikawa et al. (1999)

    realizaram uma reviso literatura sobre este assunto. Como resultados, observaram

    uma grande variao dos resultados entre os estudos, os quais so dependentes

    dos mtodos aplicados na avaliao da eficcia das substncias higienizadoras, ou

    seja, algumas substncias higienizadoras in vivo no foram to eficazes quando em

    experimentos laboratoriais. Os autores constataram tambm a total ausncia de

    padronizao nas metodologias dos estudos sobre este assunto. Por fim, na

    tentativa de minimizar este conflito, os autores estabeleceram que para que uma

    soluo higienizadora possa ser considerada significantemente efetiva, esta deveria

    apresentar algumas propriedades, entre elas uma taxa de remoo maior que 90%

  • 11 IInnttrroodduuoo ee SS nntteessee BBiibb ll iiooggrrff ii ccaa42

    do biofilme e o impedimento subseqente do crescimento da placa microbiana sobre

    a superfcie dos materiais testados.

  • 22 PPrrooppoossiioo

  • 22 PPrrooppooss iioo 45

    2 PROPOSIO

    Considerando o efeito antimicrobiano das solues de gluconato de

    clorexidina a 4% e hipoclorito de sdio a 1% e 2%, este trabalho teve como objetivo:

    Analisar o efeito destas solues desinfetantes na viabilidade, na remoo e

    na morfologia de C. albicans presentes em biofilmes sobre resinas acrlicas

    termopolimerizveis atravs de microscopia confocal, de cultura microbiolgica e de

    MEV.

  • 33 MMaatteerriiaall ee MMttooddooss

  • 33 MMaatteerr iiaa ll ee MMttooddooss49

    3 MATERIAL E MTODOS

    3.1 Confeco dos corpos-de-prova

    3.1.1 Confeco dos padres de silicona Para confeco dos padres de silicona, foi utilizada uma matriz metlica, de

    forma retangular, medindo 30 x 5 x 5 mm. Cada matriz foi preenchida com silicona

    de condensao de uso laboratorial Zetalabor (Hard 85 shore-A, Zhermack, Italy) e

    prensada entre duas placas de vidro (JON Com de produtos odontolgicos LTDA,

    So Paulo, SP) previamente isoladas com vaselina slida (Hemafarma Com. e Ind.

    farmacutica LTDA, So Gonalo, RJ), sob peso de 5 kg, por aproximadamente 10

    minutos. Em seguida, o padro de silicone foi removido da matriz e os excessos

    foram cortados com auxlio de uma lmina de bisturi (Figura 2).

    Figura 2: Confeco dos padres de silicona. Matriz metlica utilizada na confeco dos padres de silicona (A). Preenchimento da matriz metlica com silicona de condensao Zetalabor (B). Aps preenchimento da matriz, a silicona foi prensada entre duas placas de vidro com um peso de 5 kg por

    10 minutos (C D). Os excessos de silicona dos padres foram removidos atravs de lmina de bisturi (E). Forma final dos padres de silicona (F).

    A B C

    D E F

  • 33 MMaatteerr iiaa ll ee MMttooddooss50

    3.1.2 Incluso dos padres de silicona em mufla

    Os padres de silicona foram includos em muflas de lato polido com pino

    n 6 (Mac Artigos odontolgicos e prtese Ind. e Com. LTDA, So Paulo, SP),

    anteriormente isoladas com vaselina slida. Posteriormente, as muflas metlicas

    foram preenchidas com gesso pedra tipo III (Gesso Pedra Herodent, Vigodent S/A

    Ind. e Com., Rio de Janeiro, RJ), manipulado e espatulado conforme orientaes do

    fabricante, em cuba de borracha (Dentalbrand Comercial, So Paulo, SP) com

    esptula para gesso (Indusbello Ind. de Instr. Odontolgicos, Londrina, PR), sob

    vibrao.

    Aps a presa, os padres de silicona foram colocados sobre o gesso e uma

    nova camada deste foi colocada entre eles, a fim de fix-los na mufla. Esperado o

    tempo de presa da segunda camada, em seguida, foi aplicado o isolante Cel-Lac

    (S.S. White Artigos Dentrios, Rio de Janeiro, RJ) em toda superfcie. A contra-mufla

    tambm recebeu uma camada de vaselina slida nas suas superfcies internas e,

    posteriormente, foi posicionada e devidamente preenchida com gesso pedra tipo III,

    conforme condies tcnicas descritas anteriormente.

    As muflas permaneceram na prensa hidrulica (VH Equipamentos mdicos

    Odont. Acess. LTDA., Araraquara, SP) com 0,5 kgf de presso, por uma hora, e, em

    seguida, foram abertas para a remoo das matrizes de silicone e realizao do

    exame do molde no gesso, a fim de verificar a presena de bolhas.

    As etapas supracitadas esto ilustradas a seguir na Figura 3.

  • 33 MMaatteerr iiaa ll ee MMttooddooss51

    Figura 3: Incluso dos padres de silicona em mufla. Vaselinamento da mufla metlica previamente a colocao do gesso (A). Aps a presa do gesso, os bastes de silicone foram distribudos e fixados na mufla com uma segunda camada de gesso (B D). Aguardado o tempo de presa da segunda camada, foi aplicado isolante Cel-Lac em toda superfcie do gesso (E). Preenchimento da contra-mufla com gesso (F G) e colocao da tampa metlica (H). Em seguida, foi realizada a prensagem da mufla, com 0,5 kgf de presso, por uma hora (I J). Aps 1 hora, a mufla foi reaberta para ser realizada a remoo dos padres de silicona (L M).

    A B C

    D E F

    G H I

    J L M

  • 33 MMaatteerr iiaa ll ee MMttooddooss52

    3.1.3 Preenchimento dos moldes, termopolimerizao e acabamento dos bastes de resina acrlica

    Para prensagem, foi utilizada a resina acrlica incolor termopolimerizvel

    Lucitone 550 (Dentsply International INC., Chicago, IL, USA), homogeneizada com

    auxlio de uma esptula n 31 (SS White Art. Dentrios LTDA, Rio de Janeiro, RJ)

    em recipiente de vidro (Paladon, Pr. Ind. e Comrcio de produtos odontolgicos,

    Florianpolis, SC), utilizando-se a proporo de 21 g de p para 10 mL de lquido,

    conforme orientaes do fabricante. O interior dos moldes de gesso foi isolado com

    isolante Cel Lac, com auxlio de um pincel de plo de marta (Condor, n456,

    Condor S.A., So Bento do Sul, SC) e preenchido com a resina acrlica na fase

    plstica. A superfcie do gesso na contra-mufla foi vaselinada e, em seguida,

    adaptada a sua respectiva poro inferior para serem prensadas em prensa

    hidrulica sob presso inicial de 0,5 kgf. No momento em que o ponteiro da prensa

    hidrulica apresentou-se estvel, a presso foi aumentada para 1 kgf e por fim, at

    atingir 1,5 kgf. Aps a estabilizao do ponteiro em 1,5 kgf e escoamento completo

    do excesso da resina acrlica, a mufla foi novamente aberta e a pelcula de resina

    acrlica excedente eliminada com o auxlio de uma esptula Lecron (S.S. White Art.

    Dentrios LTDA, Rio de Janeiro, RJ). A mufla foi novamente fechada e levada para

    prensa hidrulica sob presso de 1,5 kgf durante 30 minutos. Decorrido esse perodo, a mufla foi colocada em uma prensa de ao

    inoxidvel (Metal Vander Aparelhos para Ortodontia, Piracicaba, SP), passvel de ser

    utilizada em polimerizadoras digitais, e levada, em gua, polimerizadora

    microprocessada digital, modelo Banho Maria (Solab, Piracicaba, SP), para que se

    processe a termopolimerizao com a seguinte programao: a temperatura da

    gua se elevou at 73C e se estabilizou durante 90 minutos, em seguida, tornou a

    subir at atingir 100C, que foram mantidos por mais 30 minutos

    Ao final da demuflagem, foram obtidos bastes de resina acrlica, nos quais

    foi dado o acabamento com o auxlio de fresa de tungstnio em baixa velocidade

    (SARTORI et al., 2006).

    As etapas supracitadas esto ilustradas a seguir na Figura 4.

  • 33 MMaatteerr iiaa ll ee MMttooddooss53

    Figura 4: Preenchimento dos moldes, termopolimerizao e acabamento dos bastes de resina

    acrlica. A resina Lucitone 550 (A) foi manipulada conforme a proporo de 21 g de p para 10 mL de lquido (B C), conforme orientaes do fabricante. A seguir, foi realizado o preenchimento dos moldes com a resina na fase plstica (D). Primeiramente, a resina foi prensada com presso de 0,5 kgf (E F), a seguir, a presso foi aumentada para 1 kgf (G) e por fim, at atingir 1,5 kgf (H). Mufla em prensa de ao inoxidvel na polimerizadora microprocessada digital (I). Demuflagem para remoo dos bastes de reina (J L). Acabamento dos bastes de resina com fresa de tungstnio (M).

    H

    A B C

    D E F

    G I

    J ML

  • 33 MMaatteerr iiaa ll ee MMttooddooss54

    3.1.4 Lixamento dos bastes de resina acrlica, avaliao da rugosidade superficial, seccionamento e esterilizao dos corpos-de-prova

    Cada basto de resina acrlica teve uma face escolhida, na qual foi realizado

    o lixamento manual, em forma de oito (VERRAN e MARYAN, 1997), por cerca de 30

    segundos, por meio de lixa dgua na granulao 120 (Norton Abrasivos, So Paulo,

    SP) em politriz circular (Dp-10, Struers-Panambra, So. Paulo, SP, Brasil), em baixa

    velocidade, sob refrigerao.

    Durante os ensaios iniciais desta pesquisa, foram realizadas leituras, por

    meio de rugosmetro, na superfcie mais crtica para higienizao das prteses

    totais, a superfcie interna. Os valores obtidos oscilaram entre 1 e 2 m. Baseado

    nisto, esta mesma mdia de rugosidade superficial foi determinada na face lixada

    dos bastes de resina, sendo mensurada atravs do aparelho rugosmetro Hommel

    Tester T 1000 basic (Hommelwerke GmbH, ref. # 240851, Schwenningen,

    Germany). A leitura considerada foi a mdia aritmtica (Ra) entre os picos e vales

    percorridos pela ponta ativa do aparelho, onde o percurso de medio foi de 4,8 mm,

    comprimento de onda limite 0,8 mm e velocidade de 0,5 mm/s. Foram efetuadas 6

    leituras na superfcie lixada de cada basto de resina acrlica (RAHAL et al., 2004).

    Paralelamente face rugosa de cada basto, por meio de um disco

    diamantado (Extec dia. wafer blade 4x.012 x high concen., Erios, So Paulo, SP -

    Brasil), foi obtida uma lmina de resina acrlica (30 x 5 x 1 mm). Cada lmina sofreu

    uma reduo no seu comprimento, atravs do seu seccionamento em 5 partes

    iguais, dando origem aos corpos-de-prova propriamente ditos, medindo 5 x 5 x 1 mm

    (LAMFON et al., 2003). Ao final, foram obtidos 60 corpos-de-prova.

    Em seguida, os corpos-de-prova foram submetidos limpeza em ultrassom

    (Ultrasonic Cleaner, Arotec, Odontobrs, So Paulo, Brasil) por 20 minutos

    (PEREIRA-CENCI et al., 2007) em gua destilada, para remoo de possveis debris

    na superfcie da resina.

    Posteriormente, os corpos-de-prova foram deixados em ar livre para sua

    secagem e, em seguida, embalados individualmente para esterilizao por meio de

    xido de etileno (Acecil Central de esterilizao comrcio e indstria, Campinas,

    SP) (SILVA et al., 2006; MIMA et al., 2008).

    As etapas supracitadas esto ilustradas a seguir na Figura 5.

  • 33 MMaatteerr iiaa ll ee MMttooddooss55

    Figura 5: Lixamento dos bastes de resina acrlica, avaliao da rugosidade superficial, seccionamento e esterilizao dos corpos-de-prova. Aps o acabamento dos bastes de resina acrlica (A), foi realizado o lixamento em politriz de uma face do basto, atravs de lixa dgua, na granulao 120 (B). A padronizao da rugosidade superficial mdia de cada basto foi averiguada atravs do aparelho rugosmetro (C). A seguir, em mquina de corte digital (D), foi realizado um corte de uma lmina com 1 mm de espessura, paralela face rugosa do basto (E G). Posteriormente, esta lmina foi seccionada em cinco partes iguais (H I), para que houvesse a obteno dos corpos-de-prova propriamente ditos (J). Por fim, os corpos-de-prova foram levados ao ultrassom (L) para remoo dos debris e, em seguida, foram embalados para serem submetidos esterilizao (M).

    B C

    D E F

    G H I

    J L

    A

    M

  • 33 MMaatteerr iiaa ll ee MMttooddooss56

    3.2 Inoculao dos corpos-de-prova

    3.2.1 Microrganismos e condies de crescimento

    Todos os ensaios microbiolgicos foram realizados no laboratrio de

    Microbiologia do Centro Integrado de Pesquisa-1 (CIP-1) da Faculdade de

    Odontologia de Bauru da Universidade de So Paulo, sempre em condies

    asspticas, em capela de fluxo laminar previamente desinfetada com lcool 70. C. albicans (ATCC 90028) foi reativada de sua cultura original contendo

    Tryptic Soy Broth (TSB) (Accumedia Manufacturers, Inc.Lansing, MI, USA) a -70C,

    em 10 mL de meio de cultura TSB (CAMPANHA et al., 2007) com cloranfenicol

    (Quemicetina Succinato/ Carlo Erba, Milano, MI, Itlia) (THERAUD et al., 2004), e

    incubada durante 24 horas a 37C em estufa (Orion, Fanem, So Paulo, SP), em

    condies aerbicas. Aps 24 horas, foi executada a centrifugao (Centrifuge

    5804R, Eppendorf) da suspenso por 10 minutos, com velocidade de 5.000 rpm, a

    22C, para separao dos microrganismos do sobrenadante. Os fungos isolados

    foram lavados 2 vezes em soluo salina fosfatada (PBS) para remoo de

    impurezas, e o pellet final foi resuspenso em PBS. A seguir, a suspenso foi agitada

    por 15 segundos e a turbidez ajustada espectrofotometricamente (Pharmacia

    Biotech, Ultraspec 100, New Jersey, USA), a 600 nm, at atingir absorbncia similar

    ao padro 0,5 da escala Mc Farland. Este procedimento assegurou a preparao de

    uma suspenso celular com uma concentrao final de 1.107 cel/mL (CHANDRA et

    al., 2001b) em TSB com cloranfenicol (Figura 6).

  • 33 MMaatteerr iiaa ll ee MMttooddooss57

    Figura 6: Microrganismos e condies de crescimento. Em fluxo laminar (A), foi retirada uma alquota do estoque congelado da cepa de C. albicans ATCC 90028 para sua reativao em caldo

    TSB em estufa por 24 horas (B C). Cessado este perodo, a suspenso fngica foi centrifugada para separao dos microrganismos do sobrenadante (D E). Aps o processo de lavagem em PBS, o pellet final foi resuspendido em PBS para ajuste da concentrao em espectrofotmetro (F).

    3.2.2 Formao do biofilme

    Utilizando uma pina estril (S.S. White Art. Dentrios LTDA, Rio de Janeiro,

    RJ), cada corpo-de-prova foi colocado em um poo de uma placa de cultura de

    tecidos de 24 poos (TPP, Switzerland), no qual foi dispensado 1 mL da suspenso

    celular, atravs de pipetas de preciso e ponteira descartveis, deixando os corpos-

    de-prova totalmente submersos. Inicialmente, todos os corpos-de-prova foram

    deixados em cultura com C. albicans por 90 minutos em estufa a 37C sob agitao

    (THEIN, SAMARANAYAKE e SAMARANAYAKE, 2007). Cessado este tempo, os

    corpos-de-prova foram individualmente e suavemente lavados 3 vezes em 2 mL de

    PBS (HAWSER e DOUGLAS, 1994) para garantir a remoo de clulas no

    aderidas ao substrato (KUHN et al., 2002). A seguir, os corpos-de-prova foram

    reinseridos em 1 mL de TSB com cloranfenicol e incubados em estufa a 37C sob

    agitao por 24 horas (KUMAMOTO, 2002; PEREIRA-CENCI et al., 2008) para o

    desenvolvimento do biofilme (Figura 7).

    A B

    D E F

    C

  • 33 MMaatteerr iiaa ll ee MMttooddooss58

    A B C

    Figura 7: Formao do biofilme. Imerso do corpo-de-prova, com a face rugosa voltada para cima, em um poo da placa de cultura, contendo 1 mL do inculo (A). Aps 90 minutos, foi realizada a lavagem do corpo-de-prova em 2 mL de PBS para a remoo das clulas no aderidas ao material

    (B). A seguir, o corpo-de-prova foi transferido para um novo poo com 1 mL de TSB com cloranfenicol, para que houvesse a formao do biofilme por 24 horas (C).

    3.3 Anlise do efeito das solues desinfetantes na viabilidade de C. albicans presentes em biofilmes sobre resina acrlica termopolimerizvel

    A anlise do efeito das solues desinfetantes utilizadas neste estudo sobre

    a viabilidade de C. albicans presentes em biofilme sobre os corpos-de-prova de

    resina acrlica termopolimerizvel foi realizada atravs do microscpio confocal Leica

    TCS SPE (Leica Microsystems GmbH, Mannheim, Germany) e de cultura

    microbiolgica.

    3.3.1 Anlise do efeito das solues desinfetantes na viabilidade de C. albicans atravs de microscopia confocal

    3.3.1.1 Desinfeco dos corpos-de-prova

    Inicialmente, procedeu-se a diviso aleatria de 24 corpos-de-prova

    contaminados com C. albicans em 4 grupos (n=6), em funo das solues testadas.

    Neste estudo foram selecionadas as solues de hipoclorito de sdio a 1% e 2% e

  • 33 MMaatteerr iiaa ll ee MMttooddooss59

    gluconato de clorexidina 4%. No grupo controle, os corpos-de-prova foram

    submetidos apenas a imerso em gua destilada estril (Tabela 1).

    Tabela 1 - Distribuio dos corpos-de-prova de acordo com a soluo desinfetante utilizada.

    Grupos Soluo desinfetante Tempo

    G1 (controle) gua destilada estril 10 minutos

    G2

    Hipoclorito de sdio a 1%*

    10 minutos

    G3

    Hipoclorito de sdio a 2%*

    5 minutos

    G4

    Gluconato de clorexidina a 4%*

    10 minutos

    * Manipuladas em farmcia de manipulao (Calndula Farma, Bauru, SP)

    Durante a desinfeco, os corpos-de-prova foram imersos, individualmente,

    em 2 mL da soluo desinfetante relativa ao seu grupo. Posteriormente, cada corpo-

    de-prova foi suavemente imerso 3 vezes consecutivas (THERAUD et al., 2004) em 3

    diferentes poos da placa de cultura, com 2 mL de PBS em cada poo, para a

    remoo da soluo desinfetante e das clulas desprendidas em funo destas

    solues (Figura 8).

  • 33 MMaatteerr iiaa ll ee MMttooddooss60

    A B C

    Figura 8: Desinfeco dos corpos-de-prova. Aps 24 horas de formao do biofilme (A), cada corpo-de-prova foi transferido para um novo poo, contendo 2 mL da soluo desinfetante, onde

    permaneceu pelo tempo especfico de cada grupo (B). Encerrado o tempo de desinfeco, foram realizadas 3 lavagens dos corpos-de-prova em 3 diferentes poos para remoo da soluo

    desinfetante e das clulas desprendidas em funo destas solues (C).

    3.3.1.2 Processamento dos corpos-de-prova para microscopia confocal

    Como a anlise no microscpio confocal no permite a observao de mais

    de