PRAKTIKUM I : Efek Komposisi Media Terhadap Kinetika Pertumbuhan Eschericia coli

A. TUJUAN

Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa dapat mempelajari pertumbuhan bakteri dalam

kultur, efek dari pemberian sumber karbon dan medium terhadap pertumbuhan.

B. TINJAUAN PUSTAKA

Setiap organisme membutuhkan semua senyawa yang dibutuhkan untuk memproduksi

energi dan biosintesis seluler yang didapatkan dari lingkungannya. Elemen dan senyawa kimia dari

lingkungan hidup yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri dikenal dengan nutrient atau

kebutuhan makanan. Di laboratorium, bacteria tumbuh di media kultur yang didesain untuk

menyediakan semua nutrient essensial dalam larutan untuk pertumbuhan bakteri.

Pada tingkat yang paling dasar, kebutuhan nutrisi bakteri misalnya Escherichia coli

ditunjukkan dari elemen penyusun sel yang terdiri dari C, H, O, N, S. P, K, Mg, Fe, Ca, Mn, juga

sedikit Zn, Co, Cu, dan Mo. Elemen ini dapat ditemukan dalam bentuk air, ion inorganic, molekul

kecil, dan makromolekul yang sesuai antara structural dan fungsionalnya di dalam sel.

Fungsi fisiologis dari elemen-elemen ditunjukkan pada table di bawah ini:

Tabel 1. Elemen utama, sumber dan fungsinya pada sel bakteri

Element% dari berat

keringSumber Fungsi

Karbon 50Kompenen organic

atau CO2

Penyusun utama dari material

seluler

Oksigen 20H2O, komponen

organik, CO2, dan O2

Penyususn material sel dan cairan

sel; O2 merupakan akseptor

electron pada respirasi aerob

Nitrogen 14NH3, NO3, komponen

organik, N2

Constituent of amino acids,

nucleic acids nucleotides, and

coenzymes

Hidrogen 8H2O, komponen

organik, H2

Penyusun utama komponen

organik dan cairan sel

Fosfor 3inorganic phosphates

(PO4)

Penyusun asam nukleat,

nukleotida, fosfolipid, LPS, asam

teikoat

Sulfur 1

SO4, H2S, So,

komponen sulfur

organik

Penyusun sisteine, methionine,

glutathione, beberapa coenzymes

Potassium 1 Garam PotassiumKation inorganic seluler utama

dan kofaktor untuk enzim tertentu

Magnesium 0.5 Garam Magnesium

Kation inorganic seluler dan

kofaktor untuk reaksi enzimatik

tertentu

Kalsium 0.5 Garam Kalsium

Kation inorganic seluler, kofaktor

untuk enzim tertentu dan

komponen endospora

Besi 0.2 Garam Besi

Komponen sitokrom dan protein

besi non-heme tertentu dan

kofaktor untuk beberapa reaksi

enzimatik

Trace elements adalah ion metal yang dibutuhkan sel tertentu dalam jumlah kecil yang

sangat sulit ditentukan kadarnya, dan tidak diperlukan untuk ditambahkan pada media kultur seperti

nutrient. Trace elements dibutuhkan dalam jumlah kecil dan sebagai “kontaminan” air atau

komponen penyusun media. Trace elements berperan sebeagi kofaktor untuk reaksi enzimatik

essensial dalam sel. Contoh trace elements adalah Mn, Co, Zn, Cu dan Mo.

Untuk tumbuh di alam atau di laboratorium, bakteri harus mempunyai sumber energi,

sumber karbon dan nutrient lain dan kondisi yang memenuhi syarat seperti konsentrasi O2, suhu dan

pH. Bakteri hidup individu atau berkoloni berdasarkan pertumbuhan di bawah kondisi fisik dan

kimia yang berbeda. Contohnya fototrop merupakan organisme yang menggunakan cahaya sebagai

sumber energi; anaerob merupakan organisme yang tumbuh tanpa oksigen; termofil adalah

organisme yang dapat tumbuh pada suhu yang tinggi.

Sumber Karbon dan Energi untuk Pertumbuhan Bakteri

Semua organisme membutuhkan sumber energi. Organisme yang menggunakan energi

radiant (cahaya) disebut fototrof. Organisme yang menggunakan (oksidasi) komponen organic

disebut heterotrof or kemo(hetero)trof. Organisme yang mengoksidasi komponen inorganic disebut

lithotrof.

Kebutuhan karbon organisme dipenuhi dengan karbon organic (komponen kimia denag

ikatan karbon-hidrogen) atau dengan CO2. Organisme yang menggunakan karbon organic disebut

heterotrof dan organisne yang menggunakan CO2 sebagai sumber karbon disebut autotrof.

Table 2. Nutrisi Utama Tipe Prokariot

Tipe Sumber Energi Sumber Karbon Contoh

Fotoautotrof Cahaya CO2 Cyanobacteria, beberapa

Purple dan Green Bacteria

fotoheterotrof Cahaya Komponen

organik

Beberapa Purple dan

Green Bacteria

Kemoautotrof atau

Lithotrof

(Lithoautotrof)

komponen inorganik,

seperti H2, NH3, NO2,

H2S

CO2 Sedikit Bacteria and

banyak Archaea

Kemoheterotrof atau

Heterotrofs

Komponen organik Komponen

organik

Hampir semua Bacteria,

beberapa Archaea

(Todar, 2008)

C. ALAT DAN BAHAN

Alat :

a. Labu erlenmeyer

b. Mikro pipet

c. Tabung reaksi

d. Ph meter digital

e. Turbidimeter

Bahan :

a. Inokulum bakteri yang sudah ditumbuhkan semalam pada suhu 37o C dalam shaker

b. Media:

1. M9 minimal + 0.5% Glukosa

2. M9 minimal + 0.5% Glukosa & 0.5% Laktosa

3. M9 minimal + 1% Glukosa

4. M9 minimal + 0.5% Laktosa

5. M9 minimal + 1% Laktosa

c. M9 minimal media (defined media)

Ke dalam 750 mL aquadest tambahkan :

5X garam M9 200 mL

1 M MgSO4 2 mL

20% larutan sumber karbon 20 mL (filtered sterilized)

0,1 M CaCl2 1 mL

Thiamine 0,02% w/v 1 mL (filtered sterilized)

Buat larutan sampai volume akhir 1000 mL

d. 5X garam M9

NH4Cl 5 g/L

Na2HPO4 64 g/L

KH2PO4 15 g/L

NaCl 2,5 g/L

Larutan garam dibuat dalam aliquot 200 mL disterilisasi dalam autoklaf oC selama 15

menit.

D. CARA KERJA

Siapkan dan sterilkan alat dan bahan yang diperlukan

Tambahkan jumlah glukosa(20%) dan laktosa(20%) dalam media kultur (Vakhir = 200 ml)

Inokulasikan E. coli sebanyak 5 ml, ambil sampel pada menit 0, ukur pH

Ukur OD670 sampel dalam kuvet bundar dengan Turbidimeter

Sampling tiap 20 menit sebanyak 20 ml, ukur OD670, hingga 6 kali pengambilan

Ukur pH nya dengan pHmeter digital pada suhu ruang

Catat dan share data dengan kelompok lain

E. DATA DAN PERHITUNGAN

a. Pengambilan stok untuk media, Stok Glukosa 20 % dan Laktosa 20 %

Menggunakan formula M1 V1 = M2 V2

V1 : Volume Media V2 : Volume Stok yang dibutuhkan

M1 : Konsentrasi dalam media M2 : konsentrasi stok

1. M9 minimal + 0.5% Glukosa

0.5 % x 200 ml = 20 % x V2

V2 = 5 ml

2. M9 minimal + 0.5% Glukosa & 0.5 % Laktosa

0.5 % x 200ml = 20 % x V2

V2 = 5 ml Laktosa dan 5 ml Glukosa

3. M9 minimal + 1 % Glukosa

1 % x 200 ml = 20 % x V2

V2 = 10 ml

4. M9 minimal + 0.5 % Laktosa

0.5 % x 200 ml = 20 % x V2

V2 = 5 ml

5. M9 minimal + 1 % Laktosa

1 % x 200ml = 20 % x V2

V2 = 10 ml

b. Data OD670

t (menit)

OD670

1 2 3 4 50’ 21.6 17.1 23.1 22.9 16.120’ 19 19.5 16.4 23.8 28.540’ 17.1 20.7 24.5 25.3 2560’ 23.7 27.5 23.6 22.5 33.380’ 22.4 23.5 25.9 38.6 43.1100’ 27.5 27.7 32.9 39.5 43.4

120’ 30.9 24.4 36.2 47.1 44.1

waktu (t)

ph media1 2 3 4 5

0' 7.41 7.38 7.40 7.39 7.3620' 7.41 7.38 7.40 7.39 7.3640' 7.38 7.39 7.40 7.38 7.3560' 7.39 7.37 7.38 7.35 7.3880' 7.39 7.37 7.39 7.36 7.36

100' 7.39 7.37 7.39 7.38 7.35120' 7.39 7.37 7.38 7.38 7.38

c. Perhitungan jumlah sel

Formula yang digunakan:

N = Jumlah sel

1. Data perhitungan jumlah sel (N)

t (menit) 1 2 3 4 5

0’ 34560000 27360000 36960000 36640000 25760000

20’ 30400000 31200000 26240000 38080000 45600000

40’ 27360000 33120000 39200000 40480000 40000000

60’ 37920000 44000000 37760000 36000000 53280000

80’ 35840000 37600000 41440000 61760000 68960000

100’ 44000000 44320000 52640000 63200000 69440000

120’ 49440000 39040000 57920000 75360000 70560000

2. DataPerhitungan Log N

t (menit) 1 2 3 4 50’ 7.539 7.437 7.568 7.564 7.41120’ 7.483 7.494 7.419 7.581 7.65940’ 7.437 7.520 7.607 7.607 7.60260’ 7.579 7.643 7.556 7.556 7.72780’ 7.554 7.575 7.791 7.791 7.839100’ 7.643 7.647 7.801 7.801 7.842120’ 7.694 7.592 7.877 7.877 7.849

3. Kurva logaritmik pertumbuhan mikroba (Log N) vs (waktu)

N = (OD670 sampel - OD670 blanko) x (1.6 x106)

Kurva kelompok 1

Kurva kelompok 2

Kurva kelompok 3

Kurva kelompok 4

Kurva kelompok 5

Berdasarkan data-data di atas, dapat dilakukan perhitungan laju pertumbuhan spesifik (μ)

dan doubling time (tg).

d. Laju pertumbuhan spesifik (μ)

Laju pertumbuhan spesifik mikroba dapat diperhitungkan dengan menggunakan formula

μ : Laju pertumbuhan spesifik ( /menit)

N : jumlah sel setelah waktu tertentu

No : jumlah sel saat menit 0

to : waktu awal

t : waktu yang dihitung

μ = (2.303 (Log N – Log No)) / (t-to)

t (menit) 1 2 3 4 50’ - - - - -20’ -0.0064 0.0066 -0.0172 0.0020 0.0286

40’ -0.0059 0.0048 0.0022 0.0025 0.0110

60’ 0.0015 0.0079 -0.0005 -0.0003 0.0121

80’ 0.0004 0.0040 0.0064 0.0065 0.0123

100’ 0.0024 0.0048 0.0054 0.0055 0.0099

120’ 0.0030 0.0030 0.0060 0.0060 0.0084

e. Perhitungan Doubling time (tg)

Doubling time dapat dihitung dengan menggunakan formula

tg = 0.693 / μ

tg = Doubling time (menit)

μ = konstanta kecepatan pertumbuhan spesifik ( /menit)

t (menit) 1 2 3 4 50’ - - - - -20’ -108.2813 105 -40.2907 346.5 24.230840’ -117.4576 144.375 315 277.2 6360’ 462 87.7215 -1386 -2310 57.272780’ 1732.5 173.25 108.2813 106.6154 56.3415100’ 288.0844 144.375 128.3333 126 70120’ 231 231 115.5 115.5 82.5

F. PEMBAHASAN

Percobaan kali ini bertujuan untuk mempelajari pertumbuhan bakteri dalam suatu kultur,

efek dari pemberian sumber karbon dan medium terhadap pertumbuhan. Bakteri yang digunakan

dalam percobaan ini yaitu Escherichia coli. E. coli merupakan jenis bakteri yang termasuk dalam

enterobakteri karena E. coli hidup di dalam usus manusia dan hewan.

Bakteri memiliki kemampuan untuk menggandakan diri secara eksponensial dikarenakan

sistem reproduksinya adalah pembelahan biner melintang, dimana tidap sel membelah diri menjadi

dua sel. Selang waktiu yang dibutuhkan sel untuk membelah diri disebut dengan waktu generasi.

Tiap spesies bakteri memiliki waktu generasi yang berbeda-beda, seperti Escherichia coli, bakteri

umum yang dijumpai di saluran pencernaan dan di tempat lain, memiliki waktu generasi 15-20

menit. Hal ini artinya bakteri E. coli dalam waktu 15-20 menit mampu menggandakan selnya

menjadi dua kali lipat.

Apabila satu bakteri tunggal (seperti E. coli di atas) diinokulasikan pada suatu medium dan

memperbanyak diri dengan laju yang konstan/tetap, maka pada suatu waktu pertumbuhannya akan

berhenti dikarenakan sokongan nutrisi pada lingkungan sudah tidak memadai lagi, sehingga

akhirnya terjadi kemerosotan jumlah sel akibat banyak sel yang sudah tidak mendapatkan nutrisi

lagi. Hingga akhirnya pada titik ekstrim menyebabkan terjadinya kematian total bakteri. Kejadian di

atas apabila digambarkan dalam bentuk kurva adalah sebagaimana di bawah.

             Gambar 4 : Kurva Pertumbuhan Bakteri

Kurva di atas disebut sebagai kurva pertumbuhan bakteri. Ada enam fase pada pertumbuhan bakteri

sebagaimana tampak pada kurva, yaitu :

1. Fase adaptasi

Pada awal ditempatkan di suatu medium, bakteri akan membutuhkan waktu untuk

menyesuaikan diri dengan lingkungannya. Faktor-faktor yang mempengaruhi fase ini adalah

medium dan lingkungan pertumbuhan. Semakin mirip dengan keadaan sebelumnya, waktu

adaptasinya akan semakin singkat. Selain itu yang mempengaruhi adalah jumlah inokulumnya.

Sel dalam jumlah besar akan dapat beradaptasi lebih cepat.

2. Fase lag

Tidak ada pertumbuhan populasi karena sel mengalami perubahan komposisi kimiawi dan

ukuran serta bertambahnya substansi intraseluler sehingga siap untuk membelah diri.

3. Fase logaritma atau eksponensial

Mikroba pada fase ini membela diri dengan laju yang konstan, massa menjadi dua kali lipat

sehingga membutuhkan energi yang besar dan keadaan pertumbuhan seimbang. Pada fase ini

kultur paling sensitif dengan keadaan lingkungan.

4. Fase perlambatan

Pada fase ini pertumbuhan mikroba melambat yang disebabkan oleh nutrien yang tersedia

semakin menipis dan terjadinya penumpukan racun akibat metabolisme sel, akibatnya terjadi

kompetisi nutrisi sehingga beberapa sel mati

5. Fase tetap (stationary)

Pada fase ini walaupun beberapa sel telah mati akibat kompetisi nutrisi, tetapi terdapat sel

yang masih dapat tumbuh. Sehingga jumlah sel menjadi konstan

6. Fase kematian

Sel menjadi mati akibat penumpukan racun dan habisnya nutrisi, menyebabkan jumlah sel

yang mati lebih banyak sehingga mengalami penurunan jumlah sel secara eksponensial.

Pengetahuan akan kurva pertumbuhan bakteri sangat penting untuk menggambarkan

karakteristik pertumbuhan bakteri, sehingga akan mempermudah di dalam kultivasi

(menumbuhkan) bakteri ke dalam suatu media, penyimpanan kultivasi dan penggantian media

(Rachdi, 2006).

Pertumbuhan mikroba dapat merupakan suatu rangkaian reaksi kimia yang mengendalikan

sintesis penyusun biomassa yang diperoleh pada akhir kultur secara global. Proses ini mengikuti

prinsip kekekalan massa. Oleh karena itu, pertumbuhan mikroba dapat dinyatakan dalam reaksi

kimia sebagai berikut :

Substrat mikroba + produk

Sumber karbon metabolit

Nitrogen CO2

Oksigen H2O

Fosfor enzim

Belerang

Mineral

Berdasarkan reaksi di atas terjadi suatu pemecahan substrat oleh mikroba untuk

menghasilkan produk yang berguna untuk proses pertumbuhannya. Substrat akan dipecah menjadi

molekul – molekul yang lebih kecil dan proses ini memerlukan bantuan suatu enzim tertentu,

misalnya hidrolisis pati menjadi glukosa yang dikatalisis oeh enzim amilase. Pada medium yang

mengandung lebih dari satu macam substrat, mikroba mampu memproduksi semua enzim yang

diperlukan untuk mencerna berbagai substrat tersebut. Tetapi sel mikroba hanya akan memproduksi

enzim yang diperlukan untuk mencerna substrat yang lebih sesuai atau lebih disukai terlebih dahulu,

yang biasanya adalah glukosa. Substrat yang lebih disukai ini disebut substrat primer. Jika substrat

primer dalam medium tidak tersedia lagi, mikroba akan mensintesa enzim yang diperlukan untuk

mencerna substrat sekunder.

Selama perang dunia kedua, Monod menguji efek kombinasi obat sebagai sumber nutrient

untuk E. coli. Dia menemukan bahwa pertumbuhan bakteri dengan dua gula yang berbeda sering

menunjukkan dua fase pertumbuhan. Contoh, jika glukosa dan laktosa tersedia, glukosa akan

dimetabolisme pertama kali (fase pertumbuhan I, liat gambar) baru kemudian laktosa (fase

pertumbuhan II. Fenomena ini disebut ‘diauksik’ (Anonim, 2009)

Gambar: Kurva pertumbuhan diauksik

Pada percoabaan ini E. coli dikultur pada lima macam media yang berbeda yaitu :

1. M9 minimal + 0.5% glukosa

2. M9 minimal + 0.5% glukosa dan 0.5% laktosa

3. M9 minimal + 1% glukosa

4. M9 minimal + 0.5% laktosa

5. M9 minimal + 1% laktosa

Setelah bakteri dikultur kemudian dihitung jumlah bakteri yang ada dalam kultur tersebut.

Cara menghitung jumlah sel dalam kultur dapat dilakukan dengan beberapa metode, yaitu:

A. Pengukuran jumlah sel

Perhitungan mikroskopis langsung (hemositometer).

Perhitungan cawan (menghitung hanya jumlah sel yang hidup saja).

Perhitungan sel secara otomatis.

B. Pengukuran massa sel

o Pengukuran berat kering.

o Kekeruhan.

o Volume sel yang dipadatkan.

C. Pendugaan massa sel secara tidak langsung

Pengukuran konsumsi nutrien.

Pengukuran komponen sel.

Pengukuran produk yang terbentuk.

Pengukuran panas yang terbentuk.

Perubahan viscositas.

Pada perecobaan kali ini digunakan metode pengukuran massa sel dengan cara mengukur

kekeruhan media kultur. Metode ini merupakan metode yang paling banyak digunakan untuk

perhitungan pertumbuhan bakteri atau khamir. Dimana OD (optical density) berbanding lurus

dengan konsentrasi sel. OD merupakan fungsi negatif dari log % transmitan (T).

OD = - log % T

OD = - log (T/100)

= log 200 – log T

= 2 – log T

Pengukuran kekeruhan biasanya dilakukan pada anatara 600 – 700 nm (biasanya 660 nm).

Satu unit absorbans yang diukur pada antara 600 – 700 nm setara dengan 1.5 g/L berat kering sel.

Dengan perbandingan tersebut dapat diketahui berat kering sel yang ada.

Dari hasil pembacaan absorbans tersebut didapatkan harga OD dalam satuan NFU

(Nephelometer Turbidity Unit), dimana 1 NFU = 1.6 x 106 CFU (Colony Forming Unit). Sehingga

dari pengukuran turbiditas media kultur ini akan dapat diketahui jumlah sel dalam kultur setiap

waktu pengamatan.

Media 3 adalah media M9 yang ditambahkan dengan 1% glukosa. Glukosa merupakan sumber

karbon organik untuk pertumbuhan E.coli. Sedangkan media 1 adalah media M9 yang ditambahkan

dengan 0,5% glukosa. Glukosa merupakan sumber karbon organik untuk pertumbuhan E.coli.

Secara teoritis konsentrasi gula yang berbeda memberikan laju pertumbuhan yang berbeda.

Konsentrasi glukosa yang tinggi akan memberikan sumber karbon yang lebih besar untuk

pertumbuhan bakteri E.coli sehingga diperoleh laju kecepatan pertumbuhan yang lebih tinggi.

Pada media 2 terdapat penggunaan dua sumber karbon yaitu glukosa dan laktosa dalam

suatu media pertumbuhan akan memberikan kurva pertumbuhan yang bifase (diaxie), dimana akan

terjadi dua kali fase logaritmik. Hal ini berbeda jika dalam media hanya digunakan glukosa atau

laktosa saja sebagai sumber karbon. Escherichia coli akan tumbuh lebih cepat dalam waktu singkat

dan maksimal pada media yang mengandung glukosa dibanding laktosa. Tetapi pada media yang

mengandung laktosa (seperti pada media 5 dan 4) pertumbuhan Escherichia coli berlangsung

dalam waktu yang lebih panjang.

Dari data dan perhitungan laju pertumbuhan spesifik, doubling time, dan kurva

pertumbuhannya, dapat dilihat bahwa pada media 5 yang ditambahkan 1% laktosa memiliki

doubling time dan laju pertumbuhan spesifik paling besar. Hal ini berbanding terbalik dengan

teoritisnya dimana pertumbuhan E.coli dengan media laktosa akan tumbuh dalam waktu yng lebih

lama.

Dari hasil percobaan juga diperoleh OD yang naik turun. Hal ini mungkin disebabkan oleh

pengesetan alat turbidimeter yang tidak tepat yaitu pengesetan rentang sensitivitas, sehingga nilai

yang kecil tisak terbaca tepat. Hal ini baru diketahui di akhir praktikum sehingga tidak dapat

dilakukan pengulangan karena masalah waktu.

Pada akhir percobaan juga dilakukan pengukuran pH media. Dari hasil pengukuran

didapatkan hasil bahwa pH media mengalami perubahan menjadi lebih asam walau hanya sedikit

perubahan. Hal ini sesui dari teori yang ada. Karena adanya produk–produk metabolisme dari sel

yang diekskresikan keluar sel ke dalam medium, misalnya asam laktat ataupun etanol.

G. KESIMPULAN

1. Pemberian sumber karbon yang berbeda pada media mempengaruhi laju

pertumbuhan sel bakteri, hal ini terkait keberadaan enzim pemetabolisme sumber karbon

tersebut untuk dikonversi ke bentuk energi.

2. Pemberian sumber karbon yang berbeda menyebabkan terjadinya dua kali fase

pertumbuhan.

3. Dari hasil percobaan diperoleh media 5 (1% laktosa) memiliki laju pertumbuhan

yang tinggi, hal ini tidak sesuai teori dimana pada media 3 (1% glukosa) seharusnya memiliki

laju pertumbuhan yang paling tinggi

H. DAFTAR PUSTAKA

Fardiaz, S., 1987, Fisiologi Fermentasi, Pusat Antar Universitas Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Hill, Mc Graw. 1961. Fundamental Principle of Bacteriology. Book Company, Inc, New York.

Huge, W.B., 1987, Pharmaceutical Microbiology, 4th edition, Blackwell Scientific Publications,

London

Rachman, A., 1989, Pengantar Teknologi Fermentasi, Departemen Pendidikan dan Kebudayaan

Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi Institut

Pertanian Bogor, Bogor.

Sa’id, Gumbira E., 1987,Bioindustri, Penerapan Teknologi Fermentasi, PT. Mediyatama Sarana

Perkasa, Jakarta