ENCIMSKA KINETIKA

Matej Huš,november 2009

POMEN POZNAVANJA

nudi vpogled v mehanizem delovanja encima

nudi informacije o vlogi encima v celicah in odzivu na spremembe koncentracije metabolitov

pomaga razumeti, kako lahko encim kontroliramo

PRIDOBIVANJE PODATKOV

Iščemo hitrost tvorbe produkta ali izginevanja substrata.

Variiramo: koncentracijo substrata pH temperaturo koncentracijo ligandov

PRIDOBIVANJE PODATKOV

D-glukoza + ATP D-glukoza 6-fosfat + ADP

Diskontinuirna metoda Vzorčenje, ustavitev reakcije, meritev

koncentracije produkta (kromatografija)Kontinuirna metoda

D-glukoza 6-fosfat + NADP+ 6-fosfoglukonat + NADPH Merjenje absorpcije NADPH pri 340 nm Sklopljena reakcija ne sme biti počasna

PRIDOBIVANJE PODATKOV

Čistost vseh kemikalijBrez encimskih kontaminacijStabilnost encimovStabilnost pogojev (temperatura, pH)Hitrost reakcije v stacionarnem stanju

konstantna in sorazmerna koncentraciji encima

Meritev začetne hitrosti reakcije

POTEK KATALIZIRANE REAKCIJE

POTEK KATALIZIRANE REAKCIJE

POTEK KATALIZIRANE REAKCIJE

POTEK KATALIZIRANE REAKCIJE

REAKCIJE Z ENIM SUBSTRATOM

E + S ES E + P

1. obravnava (Henri 1902, Michaelis in Menten

1913): hitra vzpostavitev ravnotežja

2. obravnava (Briggs in Haldane 1925): predpostavka stacionarnega stanja

k1

k-1

k2

maxv Sv

K S

REAKCIJE Z ENIM SUBSTRATOM

maxv Sv

K S

LINEARIZACIJA PODATKOV

DIREKTNI LINEARNI GRAF

PORAZDELITEV NAPAK

PORAZDELITEV NAPAK

PORAZDELITEV NAPAK

PARAMETRI

catmax t

m

k E Sv Sv

K S K S

kcat katalitična konstanta, pretvorbeno

število (turnover number) [s-1]

Km konstanta afinitete [mol L-

1]

kcat / Km konstanta specifičnosti [M-1

s-1]

SPECIFIČNOST HEKSOKINAZ

IREVERZIBILNA INHIBICIJA

Inhibitor permanentno deaktivira encim.

E + I EI E’k1

k-1

k2

i

E I Ea EI IK

EI EI

i

Ea EI IEI

K

2

d

d i

V IEak EI

t K I

REVERZIBILNA INHIBICIJA

Kompetitivna inhibicija (competitive inhibition)

Nekompetitivna inhibicija (non-competitive inhibition)

Akompetitivna inhibicija (uncompetitive inhibition)

KOMPETITIVNA INHIBICIJA

Inhibitor se veže izključno z E v EI.

NEKOMPETITIVNA INHIBICIJA

Inhibitor se veže z E ali ES v EI oz. EIS.

AKOMPETITIVNA INHIBICIJA

Inhibitor se veže izključno z ES v EIS.

AKOMPETITIVNA INHIBICIJA

Inhibitor se veže izključno z ES v EIS.

INHIBICIJA S SUBSTRATOM

Neproduktivna vezava

Substratna inhibicija

Primer: 6-fosfofruktokinaza

ENCIMSKA AKTIVACIJA

VPLIV pH NA AKTIVNOST

Ena ionizirajoča skupina

Dve ionizirajoči skupini

E + H+ EH+Ka

VPLIV pH NA AKTIVNOST

Ena ionizirajoča skupina

Dve ionizirajoči skupini

VPLIV T NA AKTIVNOST

Pozitivna korelacija (Arrheniusova enačba)

Negativna korelacija (denaturacija)

aE

RTk Ae

E E’K

0 0

0 0 0lnH T S

RT

RT K G H T S

K e

VPLIV T NA AKTIVNOST

REAKCIJE Z 2 SUBSTRATOMA

Encimska substitucija (ping-pong)

Trojni kompleks nastane po urejeni poti nastane po naključju

REAKCIJE Z 2 SUBSTRATOMA

Encimska substitucija (ping-pong)

Trojni kompleks nastane po urejeni poti nastane po naključju

REAKCIJE Z 2 SUBSTRATOMA

REAKCIJE Z 2 SUBSTRATOMA

REAKCIJE Z 2 SUBSTRATOMA

MATEMATIČNA OBDELAVA

MATEMATIČNA OBDELAVA

Trojni kompleks - primarni graf (koncentracijo substrata B držimo konstantno)

MATEMATIČNA OBDELAVA

Trojni kompleks - sekundarni graf(koncentracijo substrata B držimo konstantno)

MATEMATIČNA OBDELAVA

Ping-pong mehanizem - primarni graf(koncentracijo substrata B držimo konstantno)

MATEMATIČNA OBDELAVA

Ping-pong mehanizem - sekundarni graf(koncentracijo substrata B držimo konstantno)

PREGLED

UREJENI ALI NAKLJUČNI TERCIARNI KOMPLEKS