Egészségkárosító kémiai hatások és megelőzésük

Genotoxikológiai vizsgálati módszerek ismertetése

Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna

Országos Kémiai Biztonsági IntézetBudapest, Nagyvárad tér 2.

Helyszín: ELTE, TTK 2009. 11. 14

A sejtmagban tárolt információ összessége a genom.

Az emberi genom a két szülőtől származó,apai és anyai eredetű, DNS szálak közel azonos információkat tartalmaznak.

A sejtosztódás során a DNS szálak fénymikroszkóposan látható kromoszómává tömörülnek.

Kromoszómaalak (morfológia)

testvérkromatid

centroméra

hosszú kar

rövid kar

• Kariogram: egy sejt/szervezet rendezett kromoszómakészlete

• Kariotípus: a fajra jellemző kariogram

A genotioxikológia az emberrel közvetlenül kapcsolatba kerülő anyagok mutagén hatását vizsgálja.

Genotoxikus anyagok a DNS-ben tárolt genetikai információt örökletes módon megváltoztatják.

Mutáció: Egy tulajdonság egy nemzedéken belül ugrásszerűen, és öröklődő módon megváltozik.pl. enzimhiány, anyagcserezavarok, molekuláris megbetegedések

Mutációk csoportosítása eredetük szerintMutációk csoportosítása eredetük szerint *spontán mutáció: természetes körülmények közt

minden fajra jellemző gyakorisággal lép fel. Prokariótáknál nagyobb, mint az eukariótáknál, a mitokondriális genomban nagyobb, mint a nukleáris genomban.

*indukált mutáció: környezeti hatásra létrejövő ill. kísérleti körülmények között kiváltott mutációk.

Mutációk csoportosítása az érintett sejtvonal szerint:* szomatikus *germinális

Mutációk csoportosítás a hatópont szerint:*gén- v. pontmutációk: *kromoszóma mutációk:

MUTAGÉN TÉNYEZŐKsugárzás (röntgen, ultraibolya, radioizotópok)molekulákat gerjesztik és ionizálják.

kémiai anyagok: hatásmechanizmusok alapján

lehetnek:bázisanalógokinterkaláló vegyületekalkiláló vegyületekN-nitróz vegyületekszabadgyököt képező vegyületeknehézfémekDNS-szintézis inhibitorok

Környezeti mutagén anyagok

élelmiszeradalékok: nitritek,

nitrátok nátriumbisziulfitciklohexamin

kozmetikumok:hajfesték (nitrofenilén-diamin)H2O2femnilén-diamindiaminotoluoldiaminoanizol

gyógyszerek:citosztatikumok, altató és nyugtató szer antiallergiás gyógyszerek Meclizinfertőtlenítőszerek (formaldehid, H2O2)

növényvédőszerek, herbicidek, insecticidek:

klórozott szénhidrogénekszerves-foszforsav észterekkarbamidok, karbamátok, ftálamidok, szerves higanyvegyületek

Vegyiparban használt köztes és végtermékek:epoxidoketilén-iminekacetaldehidakrilaldehidpropán szulfondimetil szulfát dietil szulféátdimetil-nitrózaminhidrazinokuretánetilén kloridvinil klorid

Levegőszennyezés: policiklikus aromás szénhidrogének

Szervetlen mikroszennyezők:nehézfémekazbeszt

Szerves mikroszennyezők:gomba és baktériumok által termelt toxinok

KROMOSZÓMA ABERRÁCIÓ TÍPUSAI:

Strukturális kromoszóma aberráció:delécióinszerciótranszlokáció

Numerikus kromoszóma aberráció:poliploidiaaneuploidia

Deléció kromoszóma szegmentek elvesztése

Különböző humán betegségek delécióra vezethetőek vissza.

A kis deléciók tolerálhatóak.

A nagy deléciók nem tolerálhatóak, letalitáshoz vezetnek.

Egyes gének kiesésével a homológ kromoszómán hemizigóta állapot alakul ki. Egy recesszív tulajdonság felszínre jut.Ennek következménye, hogy a recesszív gén is megjelenhet a fenotípusban. Ezt a fenotípust pseudodominánsnak nevezzük.

Deléció citológiai detektálása

Az 5-ös kromoszóma rövid karján deléciója

születéskori gyakoriság:

1/50,000

Macska nyávogásos betegségSzellemi visszamaradottság4 év alatti halál

DUPLIKÁCIÓ

DUPLIKÁCIÓ:Kromoszóma szegmensek megkettőződése.

Jó példa a duplikációra a Drosophila Bar mutációja.

Az X kromoszóma 16A régiójának kópia száma különböző

A gének evolúciójában fontos a duplikáció.

Ha a gén fontos a szervezet számára nem változhat.

De ha a génből több kópia van a képződő proteinek módosulhatnak és új funkciókat láthatnak el.

Duplikációval keletkezett gén családok hasonló proteineket készítenek.

Jó példa erre a globin gének, amelyekről α és β globin láncok szintetizálódnak, a hemoglobin szerkezeti alegységei.

Inverzió:Egy kromoszóma szakasz 180 fokos megfordulásának

az eredménye.

pericentrikus inverzió magába foglalja centromertparacentrikus inverzió a centromert nem érinti,

csak a kromoszóma egyik v. másik karját

TRANSZLOKÁCIÓ:intrakromoszómális transzlokáció:

Egy kromoszóma szakasz áthelyeződéseugyanabba a kromoszómába.

interkromoszómális transzlokáció: Nem homológ kromoszómák

közötti transzlokáció.

Transzlokáció során nincs genetikai anyag vesztés.A gének pozíciója azonban megváltozik.

Down szindróma:•14 és 21-es kromoszóma közötti Robertson transzlokáció. A 21-es krom. transzlokációja a 14-es krom.-ra eredményezi a familiáris Down syndromát.•21-es kromoszóma triszómiaAz anya életkorának előrehaladtával (40-45 év felett) az előfordulási gyakoriság exp. növekszik Születéskori gyakorisága nagy: 1/500-1/700

Myeloid leukémiaA 9-es és a 22-es kromoszómák közötti transzlokáció

eredménye a “Philadelphia kromoszóma”Az esetek 90%-ban krónikus myeloid leukemiát okoz.

Burkitt’s lymphoma

Az esetek 90% esetén a 8-as és 14-es kromoszómák közötti transzlokáció

következménye.

Transzlokáció következtében kialakuló pozíció effektus hatására kialakuló onkogének, sejtosztódást, rák

keletkezését okozhatják.

Genotoxikus és daganatkeltő hatások vizsgálatának alapelvei

1.a vizsgálati anyag in vitro teszt rendszerekben mutagén-e ?

2.a vizsgálati anyag mutagén-e in vivo emlős szomatikus vagy ivarsejtekben ?

Ajánlott teszt rendszerek:1. Egysejtűeken végzett tesztek2. Rovartesztek3. in vitro sejtkultúrákon végzett tesztek4. in vivo mutagenitási tesztek5. long term karcinogenitási állatkísérletek6. humán epidemiológiai vizsgálatok

Alternatív toxikológiaiin vitro vizsgálatok

előnyei: 1. in vitro körülmények között sejteken (élő állat alkalmazása nélkül ) 2. rövid idejű3. olcsóbb4. reprodukálható5. nem használ élő állatotAz esetleges hatás megállapításához több, különböző módszerrel végzett vizsgálat egybehangzó eredményére van szükség.

A WHO Nemzetközi Rákkutató Ügynöksége (IARC) 1. kategória: emberben bizonyítottan daganatkeltő hatású anyag

In vitro módszerKromoszóma aberráció in vitro vizsgálata emlős

sejteken

OECD TG 473Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet (OECD)

Célja: azon anyagok meghatározása, amelyek kromoszóma aberrációt okoznak emlősállat sejtekben.

Kr

MUTAGÉN HATÁS VIZSGÁLATA

A kromoszóma aberráció vizsgálati módszer:Sejtek

(Tud. történet: Sejttenyésztés kezdeti lépései: csirkeembrió/békaembrió, szövetdarab50-60 osztódás után öregedés jegyei.1940 egér L sejt fibroblaszt1951 méhnyakráksejt HeLa)

Alkalmazható sejtvonalak jellemzői:stabil permanens v. primer sejtkultúrák (pl. CHO, humán lymfocita)növekedési képesség stabilitás: megkettőződési idő stabil és rövid.kariotípus stabilitás, állandó krom. szám.Kromoszómák alaki változatossága és stabilitása.Spontán kromoszóma ab. gyak. megfelelő, nem túl magas.kínai hörcsög ovárium fibroblaszt sejt (CHO)

Tápfolyadékok, tenyésztési körülmények(Természetes sóoldat, tojás fehérje, nyirok , vérplazma)Mesterséges tápfolyadékok elterjedése (F12).

Vizsgálati anyag előkészítése:kémiai összetétel, szennyeződés, stabilitásoldószer kiválasztásahígítási sor készítésestabilitás vizsgálat (archiválás)

Előkísérlet: ctox vizsg. esetleg mitotikus index meghatározása.Ctox: MTT-assay (mitokondriális szukcinát dehidrogenáz enzim) MI: A metafázisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya.A populáció proliferációjának a mértékét jellemzi.

Dózisok:Legkevesebb három elemezhető dózis.Citotoxikus anyag: ctox >50% a legmagasabb dózis.Nem citotoxikus anyag: 5 mg/ml v. 0,01M

Metabolikus aktiválás: •S9 alkalmazásarákcsálók enziminducerrel (Aroclor 1254, v. fenobarbiturát és β-naftoflavon) kezelt májából előállított poszmitokondriális frakció (S9) •kofaktorokkal kiegészítve

(ADPH, glukóz-6-foszfát). •S9 végkoncentráció 1-10% közötti.•citokróm P450 enzim aktiválása.•Indirekt mutagének kimutatására alkalmas

Kontrollok:S9 nélkül: MMS, EMS, Mitomycin-C+ S9: CP, Benz(a)pirénoldószer

Kezelési idők:4 óra +S94 óra -S924 óra -S9 48 óra -S9

Kolhicinezés:Célja a metafázisos kromoszómák összegyűjtése

Őszi kikerics (Colchicum autumnale) hagymájából készült kivonat. Köszvény gyógyítására alkalmazták. A kolhicin sejtosztódás gátló, a mitózis metafázisában.Normál esetben a sejtek 2-5%-a osztódik, néhány órás kolhicinezés összegyűjti a sejteket a metafázisban, akár 40-50 %-uk is blokkolt metafázisban található. A kolhicin a magorsó mikrotubulusaihoz kötődik.

Kromoszóma preparálás

Fénymikroszkópos értékelés

kromatid típusú aberrációk: kromoszóma típusú aberrációk:deléció delécióexchange exchange