ELEKTRONSKI MIKROSKOP U ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJABIOLOGIJI ĆELIJABIOLOGIJI ĆELIJABIOLOGIJI ĆELIJA

Matthias Jakob Schleiden Theodor Schwann Rudolf Virchow

ćelijska teorija1838-39.

Početak biologije ćelija

Matthias Jakob Schleiden (1804-1881)

botaničar

Theodor Schwann (1810-1882)

fiziolog, citolog i histolog

Rudolf Virchow (1821-1902)

lekar

1. Svi organizmi se sastoje od jedne ili više ćelija.

2. Ćelije su osnovne strukturne jedinice svih organizama.

3. Ćelija može nastati samo od prethodno postojeće (omnis cellula e cellula) (1858)

- Sva živa bića izgrađena su od ćelija- Ćelija je strukturna i funkcionalna jedinica svih živih bića- Ćelija može nastati samo od prethodno postojeće, deobom. Spontana generacija nije moguća- Ćelije sadrže nasledne informacije koje se prenose sa ćelije na ćeliju tokomdeobe- Sve ćelije u osnovi imaju isti hemijski sastav- Svi metabolički i biohemijski procesi značajni za održavanje života odvijaju se u ćelijama

Razvoj elektronske mikroskopijeu svetu

1929. Ruska publikuje prvi naučni rad koji se bavi uticajem magnetnog polja na kretanje elektrona

1931. Ruska i Knoll konstruišu prvi elektronski mikroskop kojije uveličavao samo 17 x.

1933. Prvi put se pomoću elektronskog mikroskopa dobija boljadefinicija objekata nego pomoću svetlosnog mikroskopa, uz uveličanje od 12 000 x (E. Ruska, doktorska teza)

Ernst Ruska(1906-1988)

Max Knoll(1897–1969)

Helmut Ruska(1908-1973)

Ernst RuskaThe development of the electron microscope and of electron microscopyNobel lecture, December 1986.Nobel lecture, December 1986.

1939. Isporučen prvi serijski proizvedeni mikroskop Siemens Super Microscope, uveličavao do 30 000 x.

Porter, Claude and Fullam: A study of tissue culture cells by electron microscopy. Journal of Experimental Medicine, March 1945.

Fibroblast embriona pileta gajen u kulturi, fiksiran u OsO4, ispran i osušen; uveličanje 1600 x.

1948. Pease i Baker razvijaju metod pravljenja preseka biološkog materijala debljine 0.1-0.2 µm

1952. Palade, Porter i Sjöstrand usavršavaju postupak fiksiranja i sečenja biološkog materijala

1956. Glauert i saradnici uvode Araldite kao medijum za kalupljenje

1963. Sabatini, Bensch i Barrnett uvode glutar-aldehid, praćen 1963. Sabatini, Bensch i Barrnett uvode glutar-aldehid, praćen OsO4, kao metod fiksacije

kasnije se uvode i usavršavaju tehnike za trodimenzionalnu rekonstrukciju objekata viđenih elektronskim mikroskopom ifiksiranje materijala zamrzavanjem

30

Srčana muskulatura - miš Interkalarni disk

Kontraktilni filamenti

Dobitnici Nobelove nagrade za fiziologiju ili medicinu 1974. godine

George Emil Palade(1912-2008)

Albert Claude(1899-1983)

Christian de Duve(1917-2013)

Razvoj elektronske mikroskopijekod nas

1954. Prvi jugoslovenski model elektronskog mikroskopa –diplomski rad Nedeljka Košute iz Zagreba

“Iskra” iz Kranja je kratko vreme bila važan domaći proizvođač elektronskih mikroskopa

1956-58. U Beogradu počinje sa radom Univerzitetska laboratorija za elektronsku mikroskopiju, u prostorijama Medicinskog fakulteta

Prvi EM proizveden u našoj zemlji –LEM “Iskra” Kranj

1962. Na kongresu u Pragu predstavljena prva elektronska mikrografija maligne ćelije

1979. Osnovano Društvo za elektronsku mikroskopiju Srbije

Srbija ima oko 20 laboratorija za elektronsku mikroskopiju i preko 20 elektronskih mikroskopa. Centri: Beograd, Novi Sad, Niš

Prvi EM u Srbiji – ELMI – D2, Carl Zeiss, Jena

Elektronski mikroskop –dizajn i primena

Philips CM 12

Transmisioni elektronski mikroskop

Skening elektronski mikroskop

Tipovi elektronskog mikroskopa

Skening elektronski mikroskop

Visokovoltažni elektronski mikroskop

Ljudsko oko 0.2 mmSM 0.2 �mSEM 2.5 nmSM 0.2 �mSEM 2.5 nmTEM – teor. 0.05 nmTEM - prakt. 1 nmAFM 50 pm

Mogućnosti elektronskog mikroskopa u poređenju sa svetlosnim

Biljna ćelija (tkivo korena luka) posmatrana pomoću svetlosnog i elektronskog mikroskopa; uveličanje 1000 x.

Transmission Electron Microscope TEM demo sessionhttps://www.youtube.com/watch?v=zkr3JmhjKbg&list=PLhn3D8Mrx2LIqoO1Z2HzO9qGdhcowwu7Y

Priprema uzoraka za posmatranje pod elektronskim mikroskopom

- fiksacija- fiksacija- ispiranje, dehidratacija i kalupljenje- sečenje- kontrastiranje

� glavni ograničavajući faktor za dobijanje detaljnijih i pouzdanijih informacija je preparacija uzorka

� elektronska mikrografija je slika uzorka izmenjenog preparativnom procedurom

Fiksacija

Cilj fiksacije

Očuvati strukturu ćelije uz minimalne izmene zapremine, morfologije i prostornih odnosaorganela i makromolekulaorganela i makromolekula

Minimalizovati gubitak konstituenata

Maksimalno zaštiti uzorak od budućih postupaka

Jednako očuvati sve konstituente ćelije

Koagulantni i nekoagulantni fiksativi

Koagulantni (neaditivni) fiksativi ETANOLgranularni/retikularni čvrst materijal suspendovan u tečnosti

Nekoagulantni (aditivni) fiksativi GA, FA, OsO4transparentni gel – stabilizacija proteina, lipida

Uticaj na transparentnost citoplazme

Uticaj na zapreminu tkiva –parenhim, stroma, lumeni

Faktori koji utiču na kvalitet fiksacije

fiziološko stanje ćelije u trenutku fiksacije

veličina uzorka

toničnost, jonski sastav i pH rastvora fiksativa(pufer)

koncentracija fiksativa, temperatura i dužina fiksacije

Fiziološko stanje ćelije u trenutku fiksacije

Primer

- GA u STH-ćelijama miša u ponoć i u podne(mali, jasno definisan/hipertrofisan)(mali, jasno definisan/hipertrofisan)

- struktura membrana EPR u jetri tokom 24h; regionalne razlike u zastupljenosti gl- i gr-ER

- mitohondrije – nabubrele vs. kondenzovane(nestimulisani vs. stimulisani nervni završeci)

Veličina uzorka tkiva

~ 60 µm od površine

dublji sloj tkiva

Izbor pufera i recept za pravljenje Sörensen-ovog fosfatnog pufera

• fosfatni pufer• kakodilatni pufer (arsen)• veronal-acetatni pufer (pH 4,2-5,2)

0.2 M stok rastvori:

Rastvor A:

Na2HPO4 x 2H2O 35.61 g

ili Na2HPO4 x 7H2O 53.65 g

ili Na2HPO4 x 12H2O 71.64 g

Rastvor B:

NaH2PO4 x H2O 27.6 g

ili NaH2PO4 x 2H2O 31.21 g

Destilovane vode do 1000 ml Destilovane vode do 1000 ml

0.1 M fosfatni pufer : pomeša se x ml rastvora A sa y ml rastvora B

pH (na 250C) x ml A y ml B

5.8 4.0 46.0

6.0 6.15 43.85

6.2 9.25 40.75

6.4 13.25 36.756.4 13.25 36.75

6.6 18.75 31.25

6.8 24.5 25.5

7.0 30.5 19.5

7.2 36.0 14.0

7.4 40.5 9.5

7.6 43.5 6.5

7.8 45.75 4.25

8.0 47.35 2.65

Dodati dH2O do 100 ml

Osobine GA kao fiksativa za EM

- komercijalno se proizvodi kao 25% rastvor- lako se rastvara u vodi- blago do umereno toksičan- fiksira brzo, efikasno i ireverzibilno- fiksira brzo, efikasno i ireverzibilno- minimalno menja strukturu tkiva- preporučuje se fiksacija 2 h na 4°C, 1.5-4%

2.5% GA u fosfatnom puferu:0.2 M fosfatni pufer 50 ml25% GA u H2O 10 mldH2O dopuniti do 100 ml

Reakcije GA

• Sa proteinimareakcija sa NH2-grupama, naročito lizina

• Sa lipidimareakcija sa fosfolipidima koji imaju NH -grupereakcija sa fosfolipidima koji imaju NH2-grupeznačaj postfiksacije OsO4-om

• Sa nukleinskim kiselinamareakcije nisu do kraja poznate

• Sa ugljenim hidratimazadržava 40-65% glikogena

Ograničenja fiksacije GA-om

- ne kontrastira tkivo- menja morfologiju nekih struktura u ćeliji- ne čuva većinu lipida, može da dovede do formiranja

mijelinskih figuramijelinskih figura- inhibira aktivnost enzima, blokira antigene- ne sprečava sasvim ekstrakciju tkivnih konstituenata

- preporučuje se dvostruka fiksacija (OsO4)

hemijska fiksacija

fiksacijazamrzavanjem

Ispiranje, dehidratacija, kalupljenje

- Ispiranje u puferu

- Dehidratacija u alkoholu i propilen-oksiduNeželjeni efekti dehidratacije:Neželjeni efekti dehidratacije:- smanjenje uzorka- promena konformacije proteina- gubitak lipida

- Infiltracija i kalupljenje – smoleSmole su toksične i mogu da izazovu alergiju

Neželjeni efekti- smanjenje uzorka tokom polimerizacije

Reprezentativni protokol fiksacije i kalupljenja za EM

1. GA u puferu 2-4 h, 4°C2. Ispiranje u puferu 3x20'3. Postfiksacija u OsO4 1-4 h4. 50% etanol 15'5. 70% etanol 15'5. 70% etanol 15'6. 96% etanol 15'7. 100% etanol 15'8. 100% etanol:propilen-oksid 1:1 15'9. propilen-oksid 15'10. propilen-oksid:smola 2:1 20'11. propilen-oksid:smola 1:1 45'12. propilen-oksid:smola 1:2 60'13. smola 3x45', 45°C14. stavljanje u modle 72h, 56- 60°C

Sečenje

vrsta nožadebljina presekabrzina sečenjamrežice

30 nm30 nm

70 nm

100 nm

150 nm200 nm300 nm

Problemi pri sečenju

- kompresija- tragovi noža

http://sydney.edu.au/video/play.php?video=/ict/videos/introduction-to-microtomy.mp4&poster=/ict/images/videos/introduction-to-ultramicrotomy.jpg&widescreen=true&download=false

Kontrastiranje preseka

osmijumkontrastira lipide i proteine

uranil-acetatkontrastira nukleinske kiseline, proteine,kontrastira nukleinske kiseline, proteine,fosfolipide membrana

olovo-citratkontrastira ugljene hidrate, vezuje se zastrukture kontrastirane uranil-acetatom

Postupak

Nastanak slike na fluorescentnom ekranu

Rad u EM-laboratoriji -rizici, mere opreza i bezbednost pri

rukovanju reagensima

- toksičnost (kontakt, inhalacija)- toksičnost (kontakt, inhalacija)- zapaljivost- odlaganje otpada

Perspektive razvoja elektronske mikroskopije

kombinovanje sa metodima detekcije molekula

usavršavanje metoda fiksacije

udruživanje različitih metoda

Immunolabelling

SM

EM

Korelacija SM i EM

Correlative LM-airSEM microscopy

Scientific Reports 4: 5987, 2014

• 3D tomografija

Multi-lysosomal body (A.J. Koster and W.J.C. Geerts, Utrecht University)