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ELISA KORENBLUM

ESTRUTURA DA COMUNIDADE BACTERIANA PRESENTE EM SISTEMAS DE

PRODUÇÃO DE PETRÓLEO

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de

Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos

requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências

Biológicas (Microbiologia).

Orientador: Profa. Dra. Lucy Seldin

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF PAULO DE GÓES

RIO DE JANEIRO

DEZEMBRO DE 2008

Livros Grátis

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Elisa Korenblum 2008

[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] i

KORENBLUM, ELISA

ESTRUTURA DA COMUNIDADE BACTERIANA PRESENTE EM

SISTEMAS DE PRODUÇÃO DE PETRÓLEO/ Elisa Korenblum – Rio de Janeiro,

2008

xvi,106

Tese [Doutorado em Ciências (Microbiologia)]

Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Microbiologia Prof. Paulo

de Góes, 2008.

Orientador: Lucy Seldin

Referências bibliográficas: 206

1. Microbiologia do petróleo 2. Rocha petrolífera 3. Bactéria redutora de

sulfato 4. Acidulação biogênica 5. Corrosão 6. Biocidas 7. Substâncias

antimicrobianas produzidas por Bacillus

Korenblum, Elisa

UFRJ, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Doutorado em Ciências

(Microbiologia).


[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] ii

"A mente que se abre a uma nova idéia

jamais voltará ao seu tamanho original.”

Albert Einstein

“Toda dissertação tem uma história. Esta história é

construída a partir de mil definições do objeto, das

mudanças de perspectivas, das indecisões, dos cenários

novos, das inseguranças sobre tudo que não foi lido, da

paranóia sobre a “qualidade” do escrito, das vontades de

rasgar tudo e recomeçar, dos ataques de inspiração e da

falta dela. Uma tese exige, além de conhecimentos gerais e

específicos, uma enorme paciência e disponibilidade

psicológica para expor-se, errar, experimentar, recomeçar,

observar e ousar”.

Autor desconhecido


[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] iii

Dedico não apenas este trabalho, mas todas as conquistas

da minha vida, à minha família,

em especial aos meus pais, Helio e Angela,

que sempre me apoiaram.


[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] iv

Elisa Korenblum

ESTRUTURA DA COMUNIDADE BACTERIANA PRESENTE EM SISTEMAS

DE PRODUÇÃO DE PETRÓLEO

Rio de Janeiro, 10 de dezembro de 2008.

(Profa. Dra. Lucy Seldin, IMPPG/UFRJ)

(Prof. Dr. Andrew Macrae, IMPPG/UFRJ)

(Profa. Dra. Valéria Maia de Oliveira, UNICAMP)

(Dr. Bias Marçal de Faria, CENPES/Petrobras)

(Porf. Dr. Alexandre Soares Rosado, IMPPG/UFRJ)


[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] v

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Genética Microbiana,

Departamento de Microbiologia Geral, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes,

Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob

orientação da Dra. Lucy Seldin.


[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] vi

Agradecimentos

Agradeço à minha orientadora, Professora Lucy, por me orientar em mais uma etapa

importante da minha formação acadêmica, pela confiança creditada, ensinamentos e

conversas fundamentais para a realização dessa dissertação. Sobretudo pelo exemplo de

pessoa e de profissional dedicado, sempre oferecendo o melhor para seus alunos.

A Universidade Federal do Rio de Janeiro, em especial à Coordenação do Programa

de Pós-graduação em Ciências (Microbiologia), pela oportunidade e formação de

qualidade. Agradeço à direção do Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes pelas

facilidades oferecidas.

Aos meus pais, minha vida. Quem os conhece sabe a dedicação que têm comigo e

com meu irmão, são meu presente de D’s, meus melhores amigos. Agradeço pelo carinho,

pela atenção, pelo colo, pelos ensinamentos, pelo apoio incondicional, por me aceitarem,

por respeitarem e apoiarem minhas decisões e meus sonhos. Nesta reta final, como sempre,

a presença e apoio foram fundamentais.

Ao meu maninho querido Andre, por se portar como irmão mais velho, me

protegendo, me aconselhando, por ser um grande amigo sempre, pelas brincadeiras, pela

confidencia que temos um com outro. Final de ano difícil para nós dois, não é mesmo?!

Muito trabalho que nos trará bons frutos. O Meza Bar fará sucesso e os cariocas vão adorar!

Agradeço à Luiza, minha futura cunhada, pela amizade e carinho.

À minha avó amada e idolatrada, pelo exemplo de garra, de alegria de vida, pelo

carinho, por ser simplesmente a melhor avó do mundo.

À minha família que amo tanto, pelo incentivo, pelo amor, pela amizade, pelos

conselhos, pelos valiosos e alegres momentos juntos. Agradeço em especial ao mais novo

membro da família, a mais linda e perfeita, minha fofinha “sobrinha-prima” Julinha,

obrigada por fazer a nossa família ainda mais feliz.

Aos professores do Departamento de Microbiologia Geral, em especial aos

professores Alexandre Rosado, Andrew Macrae, Celuta Sales Alviano, Eliana Bergter,

Rosalie Reed Coelho, Thaïs Souto-Padrón e Ulysses Lins por estarem sempre com seus

laboratórios de portas abertas e prontos a ajudar, pelos ensinamentos e disponibilidade para

discussões e esclarecimentos.

Ao Prof. Alexandre Rosado, por aceitar fazer a revisão desta tese, mesmo numa


[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] vii

época que se encontra tão atarefado: fechando grandes projetos, terminado a correção de

artigos, ministrando aulas, participando de reuniões, de organizações de congressos,

preparando mais uma palestra, dando mais uma entrevista, ainda assim teve tempo de

revisar minha tese. Obrigada!

Aos membros da banca examinadora, Prof. Dr. Andrew Macrae, Prof. Dra. Valéria

Maia de Oliveira, Dr. Bias Marçal de Faria, por aceitarem fazer parte da banca.

Ao CENPES-Petrobras, pelos projetos GENOPETRO e CORROSÃO. Em especial,

agradeço às pesquisadoras Gina Vazquez Sebastián e Mônica Penna.

À Prof. Maria Antonia Malajovich, pelo exemplo, confiança e apoio desde o curso

de ensino fundamental, no Instituto de Tecnologia ORT.

Aos valiosos amigos do Laboratório de Genética Microbiana, que sempre estiveram

dispostos a ajudar, discutir resultados e melhorar o desempenho da equipe como um todo.

Não posso deixar de agradecer pelas festas e churrascos que deram o tempero todo especial.

Obrigada, Renata, Vanessa, Luciano, Silvia, Diju, Diobs, Sicotta, Joana, Juliana, Si

Siqueira e Natália.

À Janinha, pela dedicação e carinho indispensáveis e muito preciosos.

Aos meus estimados co-orientandos Diju, Diobs, Raquel, Joana e Vinicius.

Ao Prof. Brent M. Peyton, que me recebeu de braços abertos em seu laboratório, por

confiar em meu trabalho e por estar sempre pronto a ajudar. Aos colegas do Peyton’s lab

Abbie, Storm, Mike, John, James, Catherine e especialmente a minha amiga Sutapa. Aos

colegas do CBE-MSU Betsey, Lynne e John Neuman.

Aos amigos internacionais que conheci em Bozeman, Priscila, Andreas, Brent,

Thiru, Markus, Purcie, Dibyendu, Kathy, Magnólia, Silvina. Vocês foram minha família

em Montana.

À minha vizinha de bairro, minha amiga querida e minha irmã científica Marcinha,

pelo carinho, pelas conversas sobre amenidades e seriedades do dia a dia, mas

principalmente pelo apoio que me deu na pesquisa, nos ensinamentos e nas dicas

fundamentais.

À minha amiga de todas as horas, Erikita, sempre pronta pra tudo mesmo! Seja no

trabalho ou a qualquer hora do dia no samba! Agradeço a Petrobras por muitas coisas, mas

nunca vou esquecer esse presente! Uma amizade dessas, pra vida toda!


[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] viii

Às minhas muito queridas amigas Iba, Quel, Juliana e Júlia. Por serem minhas

amigas “espelho”. Me espelho em vocês. Porque vocês são lindas... E guerreiras,

trabalhadoras, decididas, focadas. Mas, especialmente, por nossas conversas e chopes

essenciais.

Aos amigos da “Micro” Raquel Peixoto, Felipe Dias, Patrícia Hodos, Claudia

Cunha, Prof. André Santos, Prof. Walter Oelemann, Prof. Marco Miguel.

Às minhas amigas do curso de “Micro” desde a graduação, Dani e Rachel.

Agradeço às minhas grandes amigas Trica, Dani, Aline, Flávia, Tathi, Carina, Fabs,

Robertinha, Karen, Helena, Bianca pela amizade de longa data e pelas conversas e boas

gargalhadas de sempre. Adoro muito vocês! Vamos envelhecer juntas.

À Fernanda, ou melhor Nana e Jonas, pela amizade e por me dar um “sobrinho”

lindo.

À Flavia e Arthur, amizades que vieram definitivamente ficar na minha vida.

Obrigada por tudo!

À Dorinha, pela carinho e pelas guloseimas deliciosas.

À American Society for Microbiology que me concedeu o prêmio ASM Fellowship

for Latin Amerincan Students.

Ao CNPq pelo fomento de bolsa de estudo.

A todos que de alguma forma contribuíram para realização desse trabalho.

À D’s, agradeço a beleza da vida.


[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] ix

RESUMO

Elisa Korenblum

ESTRUTURA DA COMUNIDADE BACTERIANA PRESENTE EM SISTEMAS

DE PRODUÇÃO DE PETRÓLEO

Orientador: Lucy Seldin

Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade

Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título

de Doutor em Ciências (Microbiologia).

O monitoramento dos processos perniciosos da indústria de petróleo e a

investigação de avanços tecnológicos na área de controle de riscos são atividades de rotina

da Petrobras. O procedimento de amostragem neste trabalho foi realizado durante as

operações de testemunhagem realizadas pela Petrobras, através de técnicas pioneiras de

exploração de campos offshore. Quatro amostras do core de rocha foram obtidos de campo

ainda não explorado em uma profundidade de 2.822 a 2.828 m abaixo do fundo do mar.

Para estudar as comunidades bacterianas presentes nestas amostras, foram construídas

bibliotecas de clones baseadas nos genes rrs e aprA (87 clones). A diversidade bacteriana

encontrada foi homogênea nas quatro amostras, apresentando majoritariamente seqüências

relacionadas ao filo Proteobacteria, e em menor número, aos grupos Firmicutes e

Actinobacteria. Utilizando o gene aprA, também foi possível detectar a presença de

bactérias redutoras de sulfato (BRS) em uma das amostras de rocha, onde predominou o

gênero Desulfovibrio. Pela primeira vez, a comunidade bacteriana de rocha petrolífera foi

analisada em tal profundidade.

No Brasil, a recuperação secundária de petróleo lança mão da injeção de água do

mar, que passa por um sistema de tratamento para redução da biomassa bacteriana. A

diversidade das bactérias presentes no sistema de injeção de água do mar de três

plataformas de produção de óleo foi avaliada neste trabalho utilizando bibliotecas de clones


[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] x

baseadas no gene rrs. A classe Gammaproteobacteria foi a principal classe encontrada em

duas plataformas, predominando os gêneros Marinobacter (47,5%) na A e Colwellia

(40,6%) e Achromobacter (21,1%) na plataforma B. Na plataforma C, 100% dos clones

apresentaram no primeiro hit do blastn (≥98% de similaridade) seqüências relacionadas a

não cultiváveis. Destes clones da plataforma C, 21% das seqüências apresentaram algum hit

com organismos cultiváveis, sendo identificadas como pertencentes à classe

Alphaproteobacteria (<98% de similaridade). A análise estatística do componente principal

mostrou que o tempo de operação de cada plataforma foi o fator que mais influenciou a

diversidade da comunidade bacteriana.

Ainda neste trabalho, foi testada a atividade de uma substância antimicrobiana

(SAM), previamente caracterizada, produzida pela estirpe Bacillus firmus H2O-1 contra

biofilmes formados por BRS. O biofilme de BRS foi previamente formado em um sistema

dinâmico por 5 dias sobre superfície de vidro e, em seguida, o biocoupon foi tratado com a

SAM. Foi observada a redução de 10% das células aderidas após 24 horas de contato com a

SAM através de NMP. Através da microscopia confocal usando o corante de viabilidade

LIVE/DEAD BacLight kit, foi observada uma redução de 94% da intensidade de

fluorescência total (células marcadas com BacLight) no biofilme tratado, quando

comparado ao biofilme não tratado. Além disso, na parte mais externa do biofilme tratado,

houve a predominância de células vermelhas (mortas), enquanto no controle só foram

observadas células vivas (coradas em verde pelo SYTO 9). Este resultado de atividade

inibitória sobre a formação de biofilmes formados por BRS sugere que esta nova SAM

produzida pela estirpe H2O-1 seja uma possível alternativa ao uso de biocidas para o

controle e/ou remoção de biofilmes na indústria de petróleo.

Palavras-chave: Microbiologia do petróleo, rocha petrolífera, bactérias redutoras de

sulfato, acidulação biogênica, corrosão, biocidas, substâncias antimicrobianas produzidas

por Bacillus.


[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] xi

ABSTRACT

Elisa Korenblum

STRUCTURE OF BACTERIAL COMMUNITIES IN SYSTEMS OF OILFIELD

PRODUCTION

Supervisor: Lucy Seldin

Abstract of the doctoral thesis submitted to the post-graduation program for Science

(Microbiology), Institute of Microbiology Prof. Paulo de Góes, Federal University of Rio

de Janeiro, this is a requisite to acquire the certificate of PhD in Science (Microbiology).

Monitoring pernicious processes in the oil industry and the search for technological

advances in controlling risks are routine activities in Petrobras. Facilities developed by

Petrobras for accessing deep subsurface oil reservoirs were used to obtain four rock

samples at 2,822-2,828 m below the ocean floor surface from a virgin field located in the

Atlantic Ocean, Rio de Janeiro. To address the bacterial diversity of these rock samples,

clone libraries based on rrs and aprA genes were generated (87 clones). The phylogenetic

analyses of the DNAr 16S clone libraries showed a wide distribution of types in the

Domain B

acteria in the four core samples, and the majority of the clones were identified as

belonging to Proteobacteria. The sulfate-reducing bacteria community could only be

amplified by PCR in one sample, and all clones were identified as belonging to

Desulfovibrio genus. For the first time, the bacterial community was assessed in such a

deep subsurface environment.

In Brazil, secondary oil recovery makes use of seawater which is subjected to

treatments, in order to reduce bacterial contamination, prior to water injection. The

bacterial diversity was assessed in different water injection systems of three offshore oil

platforms to study the community that was retained after different water treatments.

Phylogenetic analyses of the DNAr 16S clone libraries showed that the bacterial

communities in the different platforms were taxonomically different. A predominance of


[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] xii

clones affiliated with Gammaproteobacteria, mostly belonging to the genera Marinobacter

(47.5%), was observed in platform A samples. Clones from platform B were mainly related

to the genera Colwellia and Achromobacter, representing 40.6% and 21.1% of the clones

obtained, respectively. All the clones were closely related to uncultured bacteria in platform

C samples considering 98% of similarity or higher. Taking into account blastn similarities

lower than 98%, 21% of these clones could be related to Alphaproteobacteria. Statistical

analyses were applied to compare the results from the three platforms. Principal component

analysis showed that the main factor affecting the bacterial community was the operating

time of each platform.

In a previous study, an oil reservoir Bacillus strain H2O-1 was shown to produce

antimicrobial substance (AMS) active against different Bacillus strains and a consortium of

sulfate-reducing bacteria (SRB) on solid medium. Here we report that the application of

AMS produced by H2O-1 reduced the viability and attachment of the SRB consortium

biofilm by one order of magnitude, when MPN technique was applied. Using confocal

scanning laser microscopy and LIVE/DEAD BacLight fluorescent kit, it was observed that

the pre-established SRB biofilm was drastically reduced (94%) using the H2O-1 AMS.

Moreover, it was observed the predominance of reddish dead cells in the treated biofilm.

Our results suggest that the AMS produced by Bacillus strain H2O-1 may have a potential

for pipeline cleaning technologies to inhibit biofilm formation and consequently reduce

biocorrosion.

Keywords: Petroleum microbiology, Sulfate reducing bacteria, biogenic souring,

biocorrosion, biocides, antimicrobial substances produced by Bacillus.


[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] xiii

Índice:

RESUMO ...................................................................................................................................... ix ABSTRACT .................................................................................................................................. xi Índice: .......................................................................................................................................... xiii LISTA DE FIGURAS E TABELAS ........................................................................................... xiv LISTA DE ABREVEATURAS ................................................................................................... xv 1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 1

1.1 O petróleo ............................................................................................................... 1 1.2 Microbiologia do Petróleo: processos perniciosos ................................................. 6 1.3 Biofilmes bacterianos ........................................................................................... 22 1.4 Controle do crescimento de BRS e da produção de Sulfeto ................................ 32 1.5 Produção de substância antimicrobiana (SAM) em biofilme .............................. 34 1.6 Bactérias do gênero Bacillus produtoras de SAM ............................................... 34

2 JUSTIFICATIVA DO TRABALHO ........................................................................................ 38 3 OBJETIVOS .............................................................................................................................. 40 4 ETAPAS DESENVOLVIDAS .................................................................................................. 41

4.1 Primeira etapa: Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em rocha de subsuperfície localizada em reservatório petrolífero offshore de águas profundas. ........................................................................................................... 41

4.2 Segunda etapa: Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em sistemas de água de injeção. ............................................................................... 41

4.3 Terceira etapa: Ação antimicrobiana da substância produzida pela estirpe de Bacillus isolada de reservatório de petróleo contra biofilmes formados por bactérias redutoras de sulfato. ............................................................................ 42

5 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................................... 43 5.1 Primeira etapa: Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em

rocha de subsuperfície localizada em reservatório petrolífero offshore de águas profundas. ........................................................................................................... 43

5.2 Segunda etapa: Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em sistemas de água de injeção. ............................................................................... 51

5.3 Terceira etapa: Ação antimicrobiana da substância produzida pela estirpe de Bacillus isolada de reservatório de petróleo contra biofilmes formados por bactérias redutoras de sulfato. ............................................................................ 55

5.4 Meios de cultura, Tampões e Soluções ................................................................ 58 6 RESULTADOS ......................................................................................................................... 62

6.1 Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em rocha de subsuperfície localizada em reservatório petrolífero offshore de águas profundas. ........................................................................................................... 62

6.2 Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em sistemas de água de injeção. ........................................................................................................... 71

6.3 Ação antimicrobiana da substância produzida pela estirpe de Bacillus isolada de reservatório de petróleo contra biofilmes formados por bactérias redutoras de sulfato. ................................................................................................................ 82

7 DISCUSSÃO ............................................................................................................................. 85 8 CONCLUSÕES FINAIS ........................................................................................................... 96 9 BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................... 97


[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] xiv

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1: Desenho esquemático de uma coroa, broca usada na perfuração de testemunhagem. ...................................................................................................................... 3 Figura 2: Desenho esquemático da injeção de água em campos petrolíferos.. ..................... 4 Figura 3: Esquema de tratamento de água de injeção ........................................................... 5 Figura 4: Árvore filogenética baseada no gene rrs de espécies de BRS descritas. ............. 9 Figura 5: Via metabólica da redução do sulfato dissimilatória. .......................................... 11 Figura 6: Formação de pites por CIM ................................................................................. 17 Figura 7: Representação esquemática da estrutura do biofilme bacteriano. ....................... 27 Figura 8: Diagrama ilustrativo da coagregação de bactérias e formação do biofilme ........ 29 Figura 9: Representação esquemática da plataforma offshore ............................................ 44 Figura 10: Representação esquemática de um sistema de injeção de água na recuperação secundária do petróleo. ......................................................................................................... 52 Figura 11: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones e de seqüências de Betaproteobacteria provenientes do GenBank ........................... 68 Figura 12: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones e de seqüências de Alphaproteobacteria provenientes do GenBank. ....................... 68 Figura 13: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones e de seqüências de Gammaproteobacteria provenientes do GenBank. .................... 69 Figura 14: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones e de seqüências de Firmicutes provenientes do GenBank. ....................................... 70 Figura 15: Abundância relativa dos gêneros bacterianos em cada plataforma ................... 74 Figura 16: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones procedentes da plataforma A e de seqüências provenientes do GenBank ................ 77 Figura 17: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones procedentes da plataforma B e de seqüências provenientes do GenBank ................. 78 Figura 18: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones procedentes da plataforma C e de seqüências provenientes do GenBank ................. 79 Figura 19: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones procedentes das três plataformas, não relacionados a organismos previamente descritos, e de seqüências provenientes do GenBank........................................................... 80 Figura 20: Gráfico de ordenação das comunidades bacterianas das plataformas A e B ..... 81 Figura 21: Análise do biofilme da T6-lab por microscopia confocal a laser ...................... 84 Tabela 1: Número de clones das amostras de rocha. ........................................................... 62 Tabela 2: Identificação das seqüências do gene aprA. ........................................................ 65 Tabela 3: Número de clones das amostras do sistema de tratamento de água de injeção da Plataforma A. ........................................................................................................................ 72 Tabela 4: Número de clones das amostras do sistema de tratamento de água de injeção da Plataforma B. ........................................................................................................................ 72


[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] xv

LISTA DE ABREVIATURAS

DNAr 16S – Fragmento oriundo da amplificação por PCR do gene que codifica a

subunidade menor do ribossomo bacteriano

RNAr 16S – Subunidade menor do RNA ribossomal bacteriano

APS – adenosina fosfosulfato

BRS – Bactéria redutora de sulfato

BSA – do inglês bovie serum albumine (albumina de soro bovino)

CIM – Corrosão influenciada por microrganismos

DAPI – Di-hidrocloreto de 4’,6-diamino-2-fenilindol

DCA – do inglês detrended correspondence analysis (análise de correspondência

distendida)

DNA – ácido desoxirribonucléico

dNTP – deoxinucleotideo trifosfato

EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético

EOR – do inglês enhanced oil recovery (Métodos especiais de recuperação terciária

de óleo)

ex. – Por exemplo

FAD – flavina adenina dinucleotídeo

FHWA – do inglês Federal Highway Administration (Administração federal de

rodovias – EUA)

GC – nucleotídeos Guanina e Citosina

IP – Iodeto de propídeo

IPTG – Isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo

LA – Laranja de acridina

MEV – Microscopia eletrônica de varredura

mRNA – RNA mensageiro

NACE – do inglês National Association of Corrosion Engineers (Associação

nacional de engenheiros de corrosão – EUA)

NCBI – do inglês National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional

de Informação Biotecnológica, banco de dados americano)

NMP – Número mais que provável


[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] xvi

OTU – do inglês operational taxonomic unit (unidade taxonômica orperacional)

pb – Pares de bases

PBS – do inglês Phosphate Buffer Saline (Tampão fosfato salino)

PCA – do ingles principal component analysis (análise de componente principal)

PCR – do inglês Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase)

PROCAP – Programa de Capacitação Tecnológica em Águas Profundas

PVP – Polivinil pirrolidona

QAT – Amônio quaternário

RDA – do inglês redundancy analysis (análise de redundância)

RDP – Ribosomal Database Project

RNA – Ácido ribonucléico

RNAr – RNA ribossômico

SAM – Substância antimicrobiana

SAM H2O-1 – Substância antimicrobiana produzida pela estirpe de Bacillus firmus

H2O-1

SDS – Dodecil sulfato de sódio

SPE – Substâncias poliméricas extracelulares

TE – Tampão Tris/EDTA

TEB – Tampão Tris/EDTA/H3BO3

THPS – do inglês Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium Sulfate (sulfato de

tetraquishidroximetilfosfônio)

Tris – Tris (hidroxi-metil-amino-metano)

UV – Ultra-violeta

X-gal – 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo


[ D i g i t e o e n d e r e ç o d a e m p r e s a ] 1

1 INTRODUÇÃO

1.1 O petróleo

Petróleo (do latim petra = rocha e oleum = óleo) é o nome dado às misturas naturais

de hidrocarbonetos que podem ser encontrados no estado sólido, líquido ou gasoso,

dependendo das condições de pressão e temperatura a que estejam submetidas. O petróleo

no estado líquido é uma substância oleosa, inflamável, menos densa que a água, com cheiro

característico e cor variando entre o negro e o castanho-claro. Sua presença pode ocorrer

tanto em uma única fase como pode se apresentar em mais de uma fase em equilíbrio.

Assim, o petróleo é um termo para designar tanto o óleo como o gás natural (THOMAS,

2004; ROSA, CARVALHO & XAVIER, 2006).

Os principais compostos químicos da mistura que constitui o petróleo são os

hidrocarbonetos, saturados e aromáticos; as resinas; e os asfaltenos. Os constituintes do

petróleo considerados como impurezas são compostos orgânicos que contêm outros

elementos além do carbono e hidrogênio, os mais comuns são enxofre, nitrogênio e

oxigênio. A infinita variedade de composições das misturas de hidrocarbonetos, aliada às

variações de tipos de impurezas, faz com que praticamente todas as misturas tenham

características diferentes. Cor, viscosidade, massa específica podem diferir bastante de uma

jazida para outra. (THOMAS, 2004).

1.1.1 Geologia do Petróleo

O petróleo é originado a partir da matéria orgânica depositada junto com os

sedimentos em ambientes aquáticos que migra através de aqüíferos e fica aprisionado em

reservatórios. A matéria orgânica é basicamente originada de microrganismos marinhos e

algas. A matéria orgânica proveniente de vegetais também pode dar origem à formação do

petróleo. O tipo de hidrocarboneto gerado é determinado pela constituição da matéria

orgânica original e pela intensidade do processo térmico atuante sobre ela (THOMAS,

2004, ROSA, CARVALHO & XAVIER, 2006).

O petróleo, após ser gerado, na rocha geradora, migra para regiões de menor pressão

através de espaços, poros vazios de arenitos e calcários. Tendo em vista que o óleo é mais



leve que do que a água de formação1, ele tende a fluir para cima, se separando da água. O

petróleo preenche os poros permeáveis da rocha petrolífera, com a qual permanece

intimamente ligado. Eventualmente, este pode ser armazenado em uma matriz rochosa

denominada rocha-reservatório, quando encontra uma armadilha, ou trapa, constituindo

verdadeiras bolsas que variam de tamanho e de conformação, o que possibilita sua

acumulação (CORRÊA, 2003).

1.1.2 Testemunhagem

A amostragem de rocha ou testemunhagem é definida como o processo de obtenção

de uma amostra real de rocha de subsuperfície cilíndrica, saturada com petróleo, com

alterações mínimas nas propriedades naturais da rocha. As amostras provenientes deste

procedimento são denominadas testemunhos. Com a análise deste testemunho se obtêm

informações confiáveis de dados geológicos, de engenharia de reservatórios, de

completação e de perfuração das rochas que se encontram em subsuperfície, tais como

textura, porosidade, permeabilidade, litologia, saturação de óleo e de água da rocha

(THOMAS, 2004).

A testemunhagem pode ser feita pelo método de testemunhagem com barrilete

convencional. Este procedimento consiste na descida de uma broca vazada, conhecida

como coroa, e ainda dois barriletes, um externo e outro interno (aonde irá se alojar o

testemunho). Os testemunhos recuperados pelo barrilete são cortados entre determinadas

profundidades e trazidos à superfície. Coroas diamantadas são empregadas para diminuir o

tempo de exposição do testemunho à ação da lama de perfuração2 e também causar menor

distúrbio ao testemunho, devido ao mecanismo de corte que é realizado por raspagem, em

vez de cisalhamento. Utiliza-se também um barrilete revestido no seu interior por um tubo

de fibra de vidro ou liner, cuja função principal é diminuir a desagregação do testemunho

durante a operação de testemunhagem (THOMAS, 2004). A Figura 1 ilustra o equipamento

utilizado na perfuração de testemunhagem.

1 Água de formação: água encontrada associada ao petróleo na rocha-reservatório. 2 Lama de Perfuração: fluido especial utlizado para evitar desmoronamentos durante a perfuração da

rocha e trazer o cascalho – material perfurado – do fundo do poço para a superfície.



1.1.3 Métodos de recuperação do petróleo

O petróleo, encontrado tanto na forma líquida como semi-sólida, flui da jazida

através da perfuração de poços petrolíferos, cujas profundidades são variáveis (alguns

metros até mais de 4 mil metros). A extração do petróleo é denominada primária quando a

sua liberação da rocha-reservatório ocorre devido à pressão natural inicial do reservatório

para deslocar o produto. A pressão do reservatório declina, reduzindo também a produção

de petróleo, permitindo a liberação de apenas 8% a 30% do petróleo ali existente. Assim,

técnicas convencionais são aplicadas para estimular e aumentar a produtividade de um poço

produtor de petróleo (THOMAS, 2004; PLANCKAERT, 2005). Essas técnicas são

conhecidas como recuperação secundária, ou métodos convencionais de recuperação.

Normalmente, a recuperação secundária é feita pela injeção de água pressurizada na

rocha-reservatório, para elevar a pressão do reservatório e empurrar o petróleo ainda

remanescente. Esta técnica, que consiste essencialmente na injeção de água do mar ou doce,

gás ou vapor para o interior do reservatório, a fim de permitir o deslocamento do petróleo,

se usada com eficiência e sucesso permite extrair de 15 a 60% do petróleo original. Ao se

Figura 1: Desenho esquemático de uma coroa, broca usada

na perfuração de testemunhagem. Adaptado de FIGUEIREDO &

BREHME, 2000.



injetar um fluido em um reservatório com a finalidade única de deslocar o óleo para fora

dos poros da rocha se busca um comportamento puramente mecânico. Isto é, a água

injetada deve empurrar o óleo para fora dos poros da rocha e ao mesmo tempo ocupar o

espaço deixado à medida que este é expulso (THOMAS, 2004; PLANCKAERT, 2005). A

Figura 2 ilustra o mecanismo de empuxo de injeção de água para recuperação secundária do

petróleo.

A injeção de água é, geralmente, o método de recuperação secundária aplicado em

reservatórios e seus custos operacionais são menores do que os outros métodos

convencionais de recuperação. A água de injeção considerada ideal deve minimizar a

possibilidade de contaminação do sistema de produção de óleo como um todo. Assim, antes

da injeção no reservatório, a água deve ser tratada previamente para remoção de oxigênio e

microrganismos. O sistema de tratamento de água é escolhido de acordo com a origem da

Figura 2: Desenho esquemático da injeção de água em campos

petrolíferos. Adaptado do site do KANSAS GEOLOGICAL SURVEY

(http://www.kgs.ku.edu/index.html).



água, são empregados geralmente tratamentos físicos e químicos (MCINERNEY &

SUBLETTE, 2002). No Brasil, a recuperação secundária do petróleo é feita pela injeção de

água do mar, que é tratada para redução da carga bacteriana, antes de chegar aos poços

injetores3 que irão pressionar a entrada de água no reservatório.

Na indústria de óleo, o sistema de tratamento da água de injeção é constituído por

filtros, cloração, desaeração4 e adição de biocidas (Figura 3). O tratamento de biocida pode

ser utilizado continuamente, ou por aplicações em batelada de duas a três vezes por semana.

Geralmente, dois biocidas devem ser escolhidos (um contínuo e outro para batelada) para

evitar o declínio da eficiência do tratamento (PLANCKAERT, 2005). A estratégia de

escolha do biocida depende principalmente das leis locais de proteção ambiental e da

população bacteriana presente na água (LARSEN, SANDERS & TALBOT, 2000). Os

biocidas utilizados para controle microbiano na indústria de petróleo serão abordados no

item 1.5 - Controle do crescimento de biofilmes através do uso de biocidas.

Figura 3: Esquema de tratamento de água de injeção

Existe ainda a recuperação terciária do petróleo, ou métodos especiais de

recuperação, que são métodos mais sofisticados de extração, chamados de EOR (do inglês,

enhaced oil recovery). Nessa abordagem são empregadas técnicas utilizando-se processos

térmicos, químicos e microbianos (PLANCKAERT, 2005).

3 Poços injetores: são destinados a injetar fluidos dentro do reservatório, para estimular a produção de

petróleo. 4 Desaeração: em razão de controle de corrosão dos dutos pela presença de oxigênio, assim a água do

mar é tratada com produtos químicos (antiespumante, inibidores de encrustamento e químicos que reagem

com o oxigênio dissolvido, como os íons sulfeto e bisulfeto que combinam com o oxigênio para formar

sulfato).



1.1.4 Fluidos produzidos

Durante o processo de injeção, a água injetada também é extraída com o óleo e,

então, os dois fluidos são separados na superfície, a quantidade de óleo remanescente é

removida e a água é reinjetada ou tratada para descarte. Um comportamento padrão

esperado para um reservatório de petróleo é a produção tanto de óleo, como de gás natural e

água. O tempo de chegada da água de mar usada na injeção nos poços produtores5 é

conhecido como o tempo da frente de deslocamento (breakthrough) da água de injeção.

Este tempo de deslocamento da água de injeção no reservatório determina o aumento da

proporção de fluido injetado no fluido produzido (THOMAS, 2004; PLANCKAERT,

2005).

1.2 Microbiologia do Petróleo: processos perniciosos

Reservatórios de petróleo, localizados em subsuperfície profunda, são ainda hoje

pouco estudados. Isto se deve à problemática econômica e tecnológica de amostragem deste

ambiente. Como descrito anteriormente, a testemunhagem é uma técnica especializada de

perfuração e retirada do core da rocha. Além disso, os custos empregados nessa técnica são

altos, limitando o número de amostras que podem ser obtidas. Assim, o estudo da

população microbiana em grandes profundidades se torna tecnicamente difícil (HURST et

al., 1997). A Petrobras, por intermédio de seu Programa de Capacitação Tecnológica em

Águas Profundas – PROCAP – criado em 1986, tem trilhado um caminho de inúmeras

descobertas, que proporcionou à instituição o título de líder internacional em tecnologia de

exploração de petróleo em águas profundas. Ainda, como pioneira em perfurar rochas

profundas em campos offshore6 em águas profundas, também desenvolveu a técnica de

amostragem de rocha neste tipo de campo (PATENTE US5192167A, DA SILVA et al.,

2003).

A extração de petróleo, desde o início da comercialização pela indústria petrolífera,

enfrenta problemas causados por microrganismos. O grupo de bactérias redutoras de sulfato

(BRS) foi desde então reconhecido como o responsável pela produção de sulfeto (S2-), em

5 Poço produtor: conduto para o fluxo dos fluidos das formações para a superfície. 6 Offshore: exploração do petróleo em alto mar.



reservatórios e instalações industriais em superfície (BASTIN, 1926; apud MAGOT,

OLLIVER & PATEL, 2000). O primeiro estudo de microbiologia de reservatórios de

petróleo foi realizado em 1926 onde Bastin descreveu a ampla presença de BRS em poços

produtores de óleo (MAGOT, OLLIVER & PATEL, 2000, APUD). Neste mesmo trabalho,

Bastin já questionava se as bactérias encontradas no reservatório eram de origem autóctone

ou alóctone. Atualmente, já se sabe que existe uma ampla diversidade bacteriana presente

em ambientes de subsuperfície profundos (TOFFIN et al., 2004; TESKE, 2005).

Os microrganismos que conseguem sobreviver em ambientes petrolíferos são

selecionados pelas características e composição química deste ecossistema. A temperatura é

o principal fator limitante para o crescimento de bactérias em reservatórios de petróleo. A

cada 100 m de profundidade, a temperatura aumenta 3ºC, podendo alcançar 130-150ºC. No

entanto, muitos trabalhos sugerem que somente em temperaturas até aproximadamente

80ºC é possível detectar bactérias indígenas de campos petrolíferos (FISHER, 1987;

BARTH, 1991; BERNARD, CONNAN & MAGOT, 1992). A salinidade, pH e pressão

também podem limitar o crescimento bacteriano ou influenciar as propriedades fisiológicas

destes organismos. A salinidade geralmente está em concentrações de saturação, enquanto

que o pH in situ varia de 3-7, pois é influenciado pela dissolução de gases sob alta pressão

(≅ 500 atm). A disponibilidade de doadores e aceptores de elétrons determina o tipo de

metabolismo bacteriano nestes ambientes. Como os campos de petróleo são ambientes de

subsuperfície profundos, o potencial redox detectado é muito baixo, favorecendo

principalmente a redução do sulfato. Estes fatores são decisivos para a ocorrência dos

principais processos metabólicos em tais ecossistemas (MAGOT, OLLIVER & PATEL,

2000).

Assim, estudos de ecologia microbiana de reservatórios são de grande interesse para

a indústria, já que os microrganismos têm um papel importante na mediação de processos

biogeoquímicos com graves efeitos econômicos e tecnológicos negativos. Sérios problemas

na linha de produção são causados pela presença de BRS. Diversos grupos bacterianos,

além das BRS, estão envolvidos em processos perniciosos, contribuindo para a falha em

operações de recuperação secundária e terciária de petróleo, causando o plugueamento de

poços, redução da produção de óleo, degradação de polímeros de deslocamento usados em

EOR. O metabólito da respiração da BRS, o sulfeto de hidrogênio, é capaz de reduzir a



qualidade do óleo, promover corrosão dos materiais metálicos e ameaçar a saúde dos

trabalhadores (BEECH & GAYLARDE, 1999; MAGOT, OLLIVER & PATEL, 2000).

1.2.1 Bactérias redutoras de sulfato

Devido aos seus efeitos deletérios na indústria petrolífera, as bactérias redutoras de

sulfato (BRS) têm sido o grupo bacteriano mais estudado nesta área. As BRS foram

descritas pela primeira vez em 1895 por Beijerinck (apud POSTGATE, 1984) e constituem

um grupo taxonomicamente diverso de bactérias anaeróbias estritas, que utilizam

preferencialmente o sulfato (SO42-) (ou outros oxiânions como o sulfito e o tiosulfato) como

aceptor final de elétrons (POSTGATE, 1984; GIBSON, 1990; BARTON & TOMEI, 1995;

HAMILTON, 1998).

As BRS estão amplamente distribuídas em ambientes aquáticos e terrestres que se

tornam anóxicos, onde podem usar o sulfato como aceptor final de elétrons para a

degradação de matéria orgânica, resultando na produção de sulfeto (MADIGAN,

MARTINKO & PARKER, 1997; MUYZER & STAMS, 2008). JØRGENSEN (1992)

estimou que 50 % da mineralização da matéria orgânica em sedimentos marinhos se devem

ao metabolismo da redução de sulfato. Morfologicamente as BRS variam

consideravelmente (vibrios, cocos, bastonetes, bastonetes curvos) (BARTON & TOMEI,

1995). Além disso, as BRS formam um grupo fisiologicamente complexo. Esta diversidade

fisiológica permitiu que fossem classificadas em dois subgrupos, baseado nas

características fisiológicas (oxidação de compostos orgânicos, temperatura ótima de

crescimento, constituição da parede celular) (MADIGAN, MARTINKO, & PARKER,

1997; CASTRO, WILLIAMS & OGRAM, 2000; MADIGAN & MARTINKO, 2006;

MUYZER & STAMS, 2008):

• BRS mesofílicas Gram-negativas que promovem a degradação incompleta

de compostos orgânicos até acetato. Ex. Desulfovibrio spp.

• BRS termofílicas Gram-positivas que promovem a degradação completa de

compostos orgânicos até dióxido de carbono. Ex. Desulfotomaculum spp.

Atualmente, as BRS também podem ser subdivididas em sete subgrupos

filogenéticos, baseados na análise comparativa de seqüências de DNAr 16S. Os 32 gêneros

que abrigam as BRS estão organizados em cinco subgrupos pertencentes ao domínio



Bacteria e dois subgrupos ao domínio Archaea (Figura 4). A maioria se encontra no

subgrupo 1, constituído por 23 gêneros da classe Deltaproteobacteria (CASTRO,

WILLIAMS & OGRAM, 2000; MUYZER & STAMS, 2008).

Figura 4: Árvore filogenética baseada no gene rrs de espécies de BRS descritas. Os sete grupos

de BRS estão destacados em diferentes cores, 5 grupos pertencentes ao domínio Bacteria e 2 ao domínio

Archaea. O número indicado nos balões indica o número de espécies naquele grupo específico. A barra

de escala indica 10% de diferença entre as seqüências (MUYZER & STAMS, 2008).

O gênero mais conhecido é o Desulfovibrio, que é comum em ambientes aquáticos e

solos alagados contendo bastante material orgânico e níveis suficientes de sulfato. As

bactérias pertencentes ao gênero Desulfotomaculum são encontradas principalmente no solo



e são formadas por bastonetes capazes de formar endósporos. Esse gênero possui uma

espécie termofílica. Os outros gêneros de BRS são indígenas de ambientes anóxicos de

água doce ou marinho (MADIGAN, MARTINKO & PARKER, 1997).

A redução de sulfato ocorre intracelularmente, logo após sua ativação pela reação

com ATP, dando origem à adenosina fosfosulfato (APS). Desta forma, o sulfato deve ser

transportado através da membrana citoplasmática, convertido em APS, para então ser

reduzido a sulfito, em uma transferência de dois elétrons (APS + 2 e- → SO32- + AMP, Eo =

-60mV), e este reduzido a sulfeto (SO32- + 6 e- + 8 H+ → H2S + 6 H2O, Eo = -116mV)

(HANSEN, 1994; HAMILTON, 1998). Uma pequena quantidade de enxofre reduzido é

assimilada pela BRS, mas potencialmente tudo é liberado para o meio ambiente como íons

sulfeto, normalmente, sulfeto de hidrogênio (H2S) (POSTGATE, 1984). As BRS

necessitam de uma baixa diferença de potencial redox no meio para sua sobrevivência e

como uma conseqüência direta desses valores relativamente baixos, existe uma

disponibilidade limitada de energia produzida quando ocorre a oxidação do substrato

(HAMILTON, 1998). As enzimas envolvidas na redução metabólica dissimilatória de

sulfato são a ATP sulfurilase, adenosina 5’-fosfosulfato (APS) redutase e a sulfito redutase

dissimilatória (HIPP et al., 1997). A Figura 5 representa a via metabólica da redução do

sulfato, destacando as enzimas importantes para cada etapa de redução.

Além da utilização de sulfato como aceptor de elétrons, muitas BRS podem crescer

usando nitrato (NO3-) como aceptor final, reduzindo NO3

- a amônia (NH3), ou podem usar

certos compostos orgânicos para produção de energia por vias fermentativas na ausência de

sulfato ou outros aceptores finais de elétrons. O composto fermentável mais comum é o

piruvato, que é convertido a acetato, CO2 e H2. Com lactato ou etanol, a energia produzida

não é suficiente para fermentação e, nesse caso, o sulfato é necessário. A importância do

sulfato como aceptor de elétrons foi demonstrada em um estudo comparativo do

crescimento de BRS em piruvato com e sem sulfato. Na presença do sulfato o crescimento

é maior, considerando a maior quantidade de energia disponível quando a utilização do

piruvato está acoplada com a redução do sulfato (MADIGAN,



Figura 5: Via metabólica dissimilatória da redução do sulfato.



MARTINKO, & PARKER, 1997).

As BRS podem oxidar diferentes compostos e a maioria deles se constitui de

produtos típicos de fermentação e produtos que não foram completamente quebrados, tais

como certos aminoácidos, glicerol e ácidos graxos. Entretanto, essas bactérias podem

utilizar outros compostos como fonte de energia, dentre eles podemos citar: hidrogênio

molecular (reação catalisada por hidrogenases de superfície), álcoois, aldeídos, açúcares,

gás carbônico e até hidrocarbonetos (GIBSON, 1990; HANSEN, 1994). Elas também

necessitam de outros nutrientes complementares como nitrogênio, fósforo e ferro para seu

crescimento.

A anaerobiose obrigatória das BRS e sua nutrição relativamente restrita asseguram

que sejam sempre encontradas como membros de uma comunidade ou consórcio

microbiano. Esses consórcios são, freqüentemente, encontrados na forma de biofilmes (ver

item 1.3 - Biofilmes bacterianos), em interfaces ou sobre substratos sólidos, e permitem a

criação de microambientes anaeróbios dentro de um ambiente aeróbio (HAMILTON, 1985,

1998).

Apesar de serem anaeróbias, as BRS podem circular (provavelmente em um estado

latente) em águas aeradas, incluindo aquelas tratadas com cloro e outros agentes oxidantes,

até encontrarem um local apropriado para sobrevivência. Existem algumas evidências de

que algumas cepas de BRS podem tolerar baixos níveis de oxigênio (TATNALL, 1993;

HAMILTON, 1998). As BRS podem, também, crescer em grandes variações de

temperatura (da psicrofilia à hipertermofilia) e de osmolaridade (da água doce às águas

hipersalinas) (HANSEN, 1994).

1.2.2 Acidulação Biogênica - Souring

A acidulação, também comumente chamada por souring (do inglês), é caracterizada

pelo aumento do gás H2S em reservatórios de petróleo. Este aumento de sulfeto se deve à

produção deste gás diretamente pelas BRS que liberam para o ambiente como um

subproduto da respiração anaeróbica. A injeção de água do mar na recuperação secundária

do petróleo também é um fator importante para o avanço do souring (MCINERNEY &

SUBLETTE, 2002; HUBERT et al., 2005).

Este método convencional de extração de óleo, a recuperação secundária pela

injeção de água do mar, é realizada para manter a pressão interna. Juntamente à injeção de



água do mar são introduzidas concentrações altas de sulfato e microrganismos de origem

marinha, mesmo depois do emprego de tratamentos como o uso de biocidas e filtragem. Ao

chegar ao interior do reservatório, a água do mar tratada resfria o ambiente, resultando em

condições ideais para a proliferação de BRS, e conseqüentemente também acarretando a

biogênese do sulfeto. A disponibilidade de carbono e sulfato determina o crescimento de

BRS em condições ambientais extremas, podendo haver a redução ou o aumento da

atividade destas bactérias. A salinidade, a temperatura e a pressão também influenciam o

desenvolvimento da comunidade de BRS presente no interior do reservatório de petróleo

(MCINERNEY & SUBLETTE, 2002; HUBERT et al., 2005).

Os reservatórios de petróleo geralmente iniciam o processo de souring após longo

período de atividade extrativa. As conseqüências do souring são muitas: (i) corrosão nos

poços de injeção e de produção; (ii) plugueamento dos poços de injeção por produtos de

corrosão; (iii) toxicidade da água e odor característico de H2S; (iv) riscos de segurança aos

trabalhadores por ser volátil e tóxico (inibidor respiratório); (v) aumento dos custos para

remoção de H2S do gás natural antes de entrar nas tubulações de gás; e (vi) aumento do

conteúdo de enxofre no óleo tornando seu refinamento mais complicado, diminuindo a

qualidade dos combustíveis, e assim reduzindo o valor do produto (MCINERNEY &

SUBLETTE, 2002; HUBERT et al., 2005; KJELLERUP et al., 2005).

A acidulação em instalações petrolíferas implica em custos adicionais para o

controle da exposição dos operadores ao H2S tóxico, para o controle de fluidos com alta

quantidade de água, para a gestão de sulfetos ferrosos sólidos que interferem na limpeza da

água produzida para re-injeção e para descarte, para a gestão do acúmulo de sulfetos

ferrosos sólidos que se depositam e promovem corrosão e danos a equipamentos. Os custos

de prevenção da acidulação também são altíssimos, abrangendo os tratamentos químicos

para remoção do H2S produzido, o transporte e estocagem do material para tratamento da

acidulação em plataformas offshore e, principalmente, o uso de biocidas em altas doses nos

tratamentos em batelada. Desde a análise do potencial de souring do reservatório até o

controle dos fluidos produzidos, a produção de H2S pelas BRS acarreta em problemas

logísticos e econômicos para as indústrias petrolíferas (VANCE & THRASHER, 2005).



1.2.3 Corrosão influenciada por microrganismos (CIM)

A corrosão é uma das principais causas de falha em tubulações e dos custos de

operação e manutenção em muitas indústrias (JAYARAMAN, HALLOCK & CARSON,

1999; ZHU, LUBECK & KILBANE, 2003). Quando a corrosão é provocada ou acelerada

pela presença de microrganismos é denominada corrosão influenciada por microrganismos

(CIM). A CIM ou biocorrosão é qualquer processo de corrosão localizada causado por

modificação microbiana da química em um ponto de uma superfície, tanto em meios

aerados, como em meios desaerados. A formação de biofilmes (ver item 1.3 - Biofilmes

bacterianos) sobre superfícies metálicas confere um gradiente de concentração de oxigênio

e formação de células de aeração diferencial, o que pode contribuir no processo de CIM

(TILLER, 1983; JAYARAMAN et al., 1997; ANGELL, 1999). Quando a CIM se dá sob

condições de anaerobiose em pH neutro é geralmente atribuída à ação das BRS

(CAVALCANTI, 2001). Segundo revisão sobre o tema, AGUIAR (1991) sugeriu que a

participação das BRS nos mecanismos de corrosão se dá por 3 vias. A primeira via,

considerada direta, ocorre por uma necessidade metabólica das bactérias, visto que suas

hidrogenases de superfície consomem o filme de H2 que se forma na região catódica como

conseqüência da reação de elétrons (e-) derivados do metal com íons H+ resultantes da

dissociação iônica da água. Esse consumo de H2 desloca a reação de dissociação iônica da

água atraindo mais e- que regeneram a formação de H2, liberando mais Fe2+ na região

anódica (perda de massa). A segunda via, também direta, ocorre pelos produtos

metabólicos das BRS, que colocam em solução o H2S. Este, por sua vez, reage com Fe2+

formando sulfeto de ferro, gerando mais ions H+, que aceleram o consumo de elétrons na

região catódica. A terceira via é considerada indireta e acontece devido à formação de

zonas de aeração diferencial sobre o metal, com a deposição de elementos de matriz

extracelular e a formação irregular do biofilme. Desta forma, todos os fenômenos

observados de CIM são reações comuns de corrosão (SASAKI, 1997).

As BRS têm sido o principal foco da maioria das investigações sobre corrosão

microbiológica e van Wolzogen Kuhr e van der Vlugt (1934) (apud LEE et al., 1995)

sugeriram as seguintes reações eletroquímicas para o processo de CIM:



4Fe 4 Fe+2 + 8e- (reação anódica)

8H2O 8 H+ + 8 OH- (dissociação da água)

8H+ + 8e- 8 H (adsorvido) (reação catódica)

SO4-2 + 8H S-2 + 4 H2O (via ação bacteriana)

Fe+2 + S-2 FeS (produtos de corrosão)

_________________________________________________

4Fe + SO4-2 + 4H2O 3 Fe(OH)2 + FeS + 2OH (reação global)

Essa reação global foi descrita como despolarização catódica, baseado na teoria que

as BRS removem o hidrogênio que se acumula sobre a superfície do ferro. O resultado do

consumo do hidrogênio é a retirada do elétron resulta em uma despolarização catódica e,

assim, promove maior dissolução do ferro na região catódica da superfície metálica.

A corrosão relacionada às BRS está, invariavelmente, associada com a formação de

biofilmes (ver item 1.3 - Biofilmes bacterianos) em superfícies metálicas, sendo que

condições anaeróbicas locais favoráveis ao crescimento dessas bactérias podem surgir na

forma de consórcios microbianos mistos em sistemas industriais (LEE et al., 1995). O

padrão de corrosão característico da ação das BRS sobre o aço é a corrosão localizada

denominada pitting, com os pites (buracos - Figura 6) sendo formados e preenchidos por

produtos de corrosão de cor negra na forma de sulfetos de ferro (HAMILTON, 1985). A

taxa e a extensão dos processos de CIM são criticamente afetadas pela natureza química e

física dos produtos de corrosão precipitados (sulfetos de ferro), e pelo acesso de oxigênio

ao sistema (HAMILTON, 1998). Essas taxas de corrosão não parecem estar diretamente

relacionadas com a biomassa total e/ou com o número de espécies microbianas (CHEUNG

& BEECH, 1996), mas se devem às espécies envolvidas e às fontes de carbono e de metal

usadas como descrito por Pedersen (1988) (apud CAVALCANTI, 2001). As substâncias

poliméricas extracelulares (SPE) sintetizadas por diferentes cepas de BRS podem contribuir

para o processo de corrosão, não somente por facilitar a adesão celular irreversível e

conseqüente colonização de superfícies metálicas, como também por suas características de

ligação a íons metálicos (BEECH & CHEUNG, 1995).



A produção de H2S pelas BRS pode gerar impactos ambientais e econômicos

(HAMILTON, 1998), pois, como já abordado, este composto é corrosivo para o aço

(MORRIS et al., 1995). Nesse sentido, o estudo da prevenção do desenvolvimento de BRS

é de grande interesse para as indústrias de petróleo, no que diz respeito aos problemas

causados pela biocorrosão de estruturas metálicas de plataformas marinhas, dutos de

transporte, assim como aos problemas causados pela acidificação de reservatórios de

petróleo (GIBSON, 1990).

Apesar das BRS serem o tipo de bactéria comumente associado a processos

corrosivos em campos de petróleo por constituir biofilmes (ver item 1.3 - Biofilmes

bacterianos) e gerar produtos metabólicos corrosivos como o H2S, outros grupos

bacterianos também devem ser considerados, por contribuir direta ou indiretamente para a

corrosão dos materiais, como por exemplo, o das bactérias produtoras de ácido

(CAVALCANTI, 2001). A atuação das bactérias sob a forma de consórcio microbiano

tende a exercer um processo sinérgico que potencializa a corrosão. Sabe-se, também, que a

capacidade das BRS gerarem quantidades significantes de H2S influencia toda a atividade

metabólica e diversidade total de espécies desses consórcios (HAMILTON, 1998).

Algumas espécies produtoras de ácidos têm a característica de formar ácidos orgânicos a

partir da oxidação de hidrocarbonetos, que são nutrientes para as BRS e corrosivos ao aço.

Outros grupos (bactérias facultativas) criam condições adequadas ao desenvolvimento das

espécies anaeróbias (BRS, por exemplo) à medida que consomem o oxigênio do meio

durante o seu metabolismo.

1.2.4 A CIM na indústria do petróleo

Como já descrito, a recuperação secundária do petróleo pode ser aplicada com a

injeção de água do mar para fornecer a força adicional necessária para a recuperação do

óleo. À água de injeção soma-se a água de formação residual existente no próprio poço. O

ambiente formado por esse processo favorece o crescimento bacteriano, em particular das

BRS, oferecendo condições de anaerobiose com sulfato e nutrientes, assim como o

substrato metálico (a liga da tubulação) para a adesão bacteriana. Esse é o problema mais

importante de biocorrosão na indústria do petróleo, embora não seja o único. Na indústria

do petróleo existem muitos pontos em que a CIM é um problema, provocando neste setor a

deterioração de estruturas de aço, cabos submersos em água, sistemas de água de injeção,



oleodutos, tanques de estocagem de óleo e sistemas de resfriamento (HAMILTON, 1985).

A biocorrosão de metais tem conseqüências econômicas importantes, sendo as

bactérias redutoras de sulfato (BRS) responsáveis por 50% dos casos dos processos

corrosivos em sistemas de perfuração, recuperação, transporte e armazenamento de petróleo

(HAMILTON, 1985). Com intuito de demonstrar a escala do problema, muitos trabalhos

mostraram a estimativa dos custos da corrosão, por exemplo, o custo pela perda dos

oleodutos e equipamentos danificados pela corrosão. Entretanto, é quase impossível sugerir

algo além de cifras e números aproximados. Para o Reino Unido em 1985, os gastos para a

indústria do petróleo devidos à corrosão microbiana já eram de 300 a 500 milhões de libras

esterlinas por ano (TILLER, 1983; HAMILTON, 1985). Desde 1949, os EUA estudam o

problema da corrosão por uma ótica econômica. Uma pesquisa detalhada realizada nos

EUA, feita pela National Bureau of Standards em 1978, indicou que a biocorrosão

especificamente custava à indústria daquele país entre 16 e 18 bilhões de dólares por ano

Figura 6: Formação de pites por CIM (extraído e adaptado de CHARACKLIS &

MARSHALL, 1990). Colonização não uniforme do biofilme resulta na formação de células

de aeração diferenciada. Diferentes concentrações de oxigênio, em dois locais sobre um

metal, causam uma diferença de potencial e, conseqüentemente, corrente elétrica, levando à

corrosão. Sob condições aeróbicas, as áreas colonizadas por microrganismos aeróbios se

tornam anódicas e a região ao redor, catódica.



(HAMILTON, 1985). Em 2001, a C.C. Technologies Laboratories, a Nace International,

conhecida como a Sociedade da Corrosão, e o Federal Highway Administration (FHWA),

que administra as rodovias norte-americanas, conduziram um estudo mais completo sobre o

impacto da corrosão na economia dos EUA. A conclusão só reforçou a suspeita de que a

corrosão é um dos maiores problemas enfrentados pela indústria. Só naquele país os gastos

associados à corrosão consumiam, há dez anos, cerca de 3% PIB, algo próximo de US$ 400

bilhões, em valores atuais.

De uma forma geral, os estudos em diferentes países têm chegado a conclusões

parecidas, estimando custos variáveis entre 1% e 5% do PIB. Acredita-se que no Brasil os

gastos com a corrosão correspondem 3,5% do PIB e nas indústrias mais sujeitas às ações

corrosivas, como o setor químico e petroquímico, por exemplo, o percentual pode ser ainda

maior (REVISTA MULTILOGÍSTICA ONLINE, 24 de julho de 2008). Na indústria

petrolífera brasileira, os gastos podem chegar a cerca de US$ 10 bilhões. Somente os

sistemas de injeção de água para recuperação secundária de petróleo das plataformas da

Bacia de Campos, o custo anual médio com biocidas está em torno de 6,5 milhões de

dólares. Nas grandes estruturas navais utilizadas pelas companhias de petróleo, a corrosão

é uma das principais responsáveis pelos desastres ambientais que são os derramamentos de

óleo no mar. Quando não são causados por falha humana, esses desastres fatalmente são

obra de estruturas comprometidas pela corrosão. Por isso, essa é uma das maiores

preocupações atuais das companhias de petróleo (REVISTA MULTILOGÍSTICA

ONLINE, 24 de julho de 2008).

Os impactos ambientais causados indiretamente pela corrosão também pode levar a

grandes prejuízos financeiros. Os dados acima não incluem o custo da poluição ao meio

ambiente. A corrosão provocada por BRS é localizada (pites), sendo de difícil previsão e,

no caso de vazamento de óleo por perfurações na tubulação, além da conseqüente perda de

óleo produzido, pode resultar em danos ambientais devido à contaminação com compostos

xenobióticos. Um dos grandes vazamentos de óleo causados pelo rompimento de

tubulações da Petrobras na Baía de Guanabara-RJ (1,3 milhões de litros de óleo em janeiro

de 1999) retratou bem esse caso. O prejuízo ecológico foi enorme, sendo previstos vários

anos para a recuperação da área afetada (CAVALCANTI, 2001). A British Petroleum, por

exemplo, no primeiro trimestre do ano passado apresentou queda de 17% no seu lucro, na



comparação com o primeiro trimestre de 2006, por causa da suspensão da exploração no

campo de Prudhoe, no Alasca, após derramamentos ocorridos devido a problemas de

corrosão. Com a intensificação dos estudos sobre o assunto, a cada ano têm surgido novas

técnicas para prever e evitar tais danos. Com esse conhecimento, é possível desenvolver

técnicas para se predizer por quanto tempo e sob quais condições essas ligas metálicas

resistirão (REVISTA MULTILOGÍSTICA ONLINE, 24 de julho de 2008).

1.2.5 Análise molecular da comunidade bacteriana presente em ambiente

petrolífero

As técnicas clássicas de observação, detecção, identificação e classificação de

microrganismos provenientes de amostras ambientais são realizadas geralmente através de

plaqueamento e cultivo em meios de cultura. Porém, os meios de cultura são seletivos para

determinados grupos de microrganismos, dificultando o isolamento de outras populações

microbianas. Estima-se que ao redor de 90% a 99% das bactérias que habitam o ambiente

não foi cultivada em meios de cultura (HUGENHOLTZ & PACE, 1996). Com o advento

das técnicas baseadas na PCR, reação em cadeia da polimerase (ou do inglês, PCR,

polymerase chain reaction), juntamente a outros grandes desenvolvimentos tecnológicos

baseados em seqüenciamento de ácidos nucléicos para a identificação de grupos

filogenéticos presentes em populações mistas, houve uma mudança na perspectiva da

microbiologia ambiental, estabelecendo assim o estado da arte da microbiologia ambiental,

referida como Ecologia Microbiana Molecular (AKKERMANS, VAN ELSAS & DE

BRUIJN, 1995; ROSADO et al., 1997; OREMLAND et al., 2005). Estas técnicas podem

ajudar a compreender melhor a composição da comunidade microbiana presente em

ambientes diversos (ROSADO et al., 1997). Todavia, a obtenção de culturas puras

representativas dos processos importantes na área de geomicrobiologia7, especificamente na

microbiologia de ambientes petrolíferos, é ainda uma etapa crítica para elucidar quais são

os microrganismos presentes neste ambiente. As técnicas de cultivo utilizadas para isolar

microrganismos de reservatórios de petróleo geralmente implicam em conferir condições

7 Geomicrobiologia: ciência que estuda as relações entre a evolução geológica e físico-química da

Terra e a evolução e adaptação microbiana.



extremas para o crescimento microbiano (alta temperatura, pressão, concentrações de

micronutrientes), dificultando ou mesmo impossibilitando o isolamento destes organismos.

Desta forma, as técnicas moleculares então são muitas vezes usadas como abordagem única

na definição de misturas complexas ou guildas8 de microrganismos não-cultivados ou

muito diversos presentes em comunidades naturais. E ainda, essas técnicas podem ser

adaptadas, gerando conhecimento para otimizar o isolamento de organismos previamente

conhecidos como “não-cultiváveis”.

Extração de DNA da comunidade microbiana predominante

A análise molecular da diversidade microbiana de comunidades complexas do

ambiente requer procedimentos eficientes e sem interferentes de extração de DNA. A

extração de ácidos nucléicos pode ser realizada diretamente das amostras ambientais por

métodos mecânicos ou químicos; ou indiretamente, onde há o fracionamento da amostra,

empregando técnicas para a separação das células do restante do material, e posteriormente

é feita a lise celular para a extração do DNA. Diversas metodologias e protocolos já foram

descritos para a extração de ácidos nucléicos do ambiente. E ainda, atualmente, muitos

estudos lançam mão de “kits” de extração de DNA de amostras ambientais rápidos e

eficientes (OGRAM, SAYLER, & BARKAY, 1987; SMALLA et al., 1993;

AKKERMANS, VAN ELSAS & DE BRUIJN, 1995; VAN ELSAS, WELLINGTON &

TREVORS, 1997; WEBSTER et al., 2003).

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase (“Polymerse Chain Reaction”)

A PCR é uma técnica que consiste em fazer cópias de DNA in vitro, usando os

elementos básicos do processo de replicação natural do DNA, muito utilizada em estudos

moleculares de diversidade e ecologia microbiana. A PCR amplifica seqüências alvo de

DNA por meio de iniciadores (ou em inglês primers) que são oligonucleotídeos que

delimitam uma determinada região ou domínio do DNA que deverá ser amplificada (SAIKI

et al., 1988). A técnica de PCR tem inúmeras aplicações, podendo utilizar iniciadores que

podem ter como alvo a população predominante de Bacterias, Archaeas, como no caso de

iniciadores universais. Além disso, se podem empregar iniciadores específicos para um

8 Guildas: Um grupo de espécies diversas que ocupam um mesmo nicho e caracteriza-se pela

utilização dos mesmos recursos ambientais.



determinado grupo (ex.: bactérias redutoras de sulfato) ou sintetizar novos iniciadores para

determinados microrganismos que desejarmos estudar, bem como para genes funcionais

dos mesmos.

Iniciadores universais: Gene rrs

Os genes rrs, rrl e rrf codificam os RNAr 16S, 23S e 5S, respectivamente. As

moléculas de RNAr apresentam regiões extremamente conservadas estruturalmente e

funcionalmente entre todos os organismos, pois a taxa de mutações ao longo do processo

evolutivo é extremamente baixa, se comparada a outros genes. Além disso, também

apresenta regiões altamente variáveis, sendo que o grau de variação nestas regiões pode

variar de um táxon para outro. Esta característica variável de regiões dos genes que

codificam RNAr proporciona o desenho de iniciadores reino-específicas, gênero-

específicas e até espécie-específicas (WOESE, 1987; ROSADO et al., 1996).

A primeira tentativa em caracterizar a comunidade microbiana de amostras

ambientais por métodos independente de cultivo utilizou o gene rrf (RNAr 5S). Entretanto,

devido ao seu tamanho (aproximadamente 120 nucleotídeos), a informação gerada foi

pequena, insuficiente para análises filogenéticas, sendo somente aplicável para

comunidades pouco diversas (PACE et al., 1986). O gene rrs (RNAr 16S) têm sido

preferencialmente escolhido porque além de estar presente em todos os organismos

procariotos, este gene apresenta um tamanho (número de pares de bases) adequado para as

análises filogenéticas subseqüentes (HILLIS, MORITZ & MABEL, 1996).

O uso do RNAr 16S em diversos trabalhos como ferramenta de estudo de

diversidade bacteriana trouxe a conveniência de se armazenar informações de seqüências

deste gene em grande número. Isto é, uma vez obtidas, as seqüências podem ser

depositadas em banco de dados especializados (RDP, GenBank e EMBL), ficando

disponíveis para estudos posteriores. Atualmente, o GenBank possui um total de 832.000

seqüências de rrs (data de consulta: 25 de outubro de 2008). O RNAr 16S foi a molécula

pioneira nos estudos de seqüências e por isso hoje possui o maior número de seqüências

disponíveis em bancos de dados, facilitando muito os estudos comparativos. Deste modo, a

análise das seqüências dos ácidos nucléicos vem contribuindo para a expansão do

conhecimento acerca da filogenia e da evolução microbiana (WOESE, 1987; OLSEN,

WOESE, OVERBEEK, 1994).



Iniciadores específicos: Gene aprA

A APS redutase bacteriana é um heterodímero formado por uma subunidade alfa

(75–80 kDa) com uma FAD (flavina adenina dinucleotídeo) e uma subunidade beta (18–23

kDa) com dois centros [4Fe–4S], que são codificados pelo gene aprBA (MEYER &

KUEVER, 2008). Ambas as subunidades AprA e AprB são altamente conservadas entre as

BRS, devido a suas propriedades fisicoquímicas estáveis. Assim, o gene que codifica esta

enzima (aprBA) tem sido usado para análises filogenéticas de BRS (HIPP et al., 1997;

FRIEDRICH, 2002). A AprA, a maior subunidade da APS redutase, contem o local de

ligação de substrato APS, uma região que é conservada em todas as APS redutases

(SPEICH et al., 1994). FRIEDRICH (2002) comparou o uso do gene rrs com o gene aprA

como ferramenta de estudo de filogenia de BRS, que indicou relativa similaridade na

topologia das árvores filogenéticas obtidas a partir destes genes, pois detectou a formação

dos mesmos clusters da maioria das espécies analisadas. As diferenças encontradas nas

árvores construídas com o gene rrs e com o gene aprA foram atribuídas à transferência

lateral do gene aprA entre certas BRS. Ainda neste mesmo estudo de FRIEDRICH (2002),

foi sugerida a existência de uma única cópia do gene para em casa uma das estirpes.

1.3 Biofilmes bacterianos

As bactérias são geralmente vistas como organismos simples quando comparadas

aos organismos superiores. Entretanto, o estudo do desenvolvimento bacteriano tem

mostrado que estes microrganismos são capazes de diferenciações e comportamentos

complexos. Uma característica extraordinária das bactérias é sua capacidade de crescimento

rápido em condições ambientais apropriadas e quando há disponibilidade de nutrientes.

Ainda mais extraordinária é a capacidade desses microrganismos permanecerem viáveis em

condições adversas. Muitas bactérias desenvolveram mecanismos altamente sofisticados

que lhes permitem manter a viabilidade celular durante períodos de escassez de nutrientes,

voltando a crescer rapidamente quando estes se tornam disponíveis. Um exemplo destes

mecanismos é a formação de esporos por espécies do gênero Bacillus, cuja célula

vegetativa capta sinais externos e internos para desencadear a síntese de uma nova estrutura

morfológica que se adapta para a sobrevivência em ambientes adversos (BROWN &

WILLIAMS, 1985; COSTERTON et al., 1995; O’TOOLE, KAPLAN & KOLTER, 2000).

Outras células bacterianas também podem formar corpos de frutificação e agregados



celulares em resposta à falta de nutrientes (SIEGELE & KOLTER, 1992). Pode-se dizer

que as bactérias constituem a forma de vida de maior sucesso na Terra, em termos de

biomassa total e em relação à variedade e extensão de habitats colonizados. Isso se deve

principalmente à plasticidade fenotípica, ou seja, à habilidade dos diferentes grupos

bacterianos em responder distintamente a estímulos ambientais. Uma importante estratégia

fenotípica que vem sendo extensivamente estudada é a organização das bactérias sob a

forma de biofilmes (BROWN &WILLIAMS, 1985; COSTERTON ET AL., 1995).

As bactérias podem ser encontradas livremente em suspensão (existência

planctônica) ou aderidas a um substrato (existência séssil) em ambientes onde se faz

presente uma fase líquida. A superfície para adesão de bactérias e formação de biofilmes

pode ser abiótica (lentes de contato, tubulações industriais, etc.) ou biótica (tecidos animais

e vegetais) (DUNNE, 2002; FLEMMING, 2002). Organizações complexas de várias

espécies e até gêneros diferentes podem ocorrer dentro de comunidades bacterianas

planctônicas e sésseis. As condições ambientais, em grande parte, ditam se os organismos

irão existir em um estado planctônico ou séssil (GEESEY, 1993).

A propensão das bactérias em colonizar superfícies é vantajosa, do ponto de vista

ecológico, porque permite a proteção destas células contra agentes antimicrobianos, e a

existência de relações simbióticas entre diferentes bactérias e destas com células

eucarióticas (DUNNE, 2002). Estas relações são abundantes na natureza como, por

exemplo, a colonização de bactérias fixadoras de nitrogênio nas raízes de leguminosas. A

tendência das bactérias em se aderir é ubíqua em diversos ecossistemas e confere vantagem

seletiva sobre as bactérias planctônicas (encontradas livremente em solução). Uma das

razões possíveis para a adaptação de muitos microrganismos para a formação estratégica de

biofilme é a concentração de nutrientes sobre superfícies sólidas em ambientes aquáticos.

Além disso, as bactérias que se encontram organizadas na forma de biofilmes são capazes

de se envolver em relações sintróficas, podendo até facilitar o aparecimento de novas

características por transferência gênica (DAVEY & O’TOOLE, 2000).

As bactérias aderidas a superfícies sólidas formam uma camada lodosa

escorregadia, constituindo os biofilmes bacterianos. Esses biofilmes estão presentes na

maioria das superfícies molhadas ou úmidas, encontradas na natureza, e também em

ambientes industriais e médicos (CARPENTIER & CERF, 1993; ELDER, STAPLETON &



DART, 1995). COSTERTON, STEWART & GREENBERG (1999) definem biofilme

como “uma comunidade estruturada de células bacterianas cercadas por uma matriz

polimérica produzida pelas próprias bactérias, aderida a uma superfície inerte ou viva”. Os

biofilmes bacterianos atingem dimensões compatíveis para observação a olho nu e,

possivelmente, essas comunidades microbianas tenham sido as primeiras a serem estudadas

na área da microbiologia (COSTERTON, 1999).

Em 1684, Antonie van Leeuwenhoek raspou a placa bacteriana de seus dentes e

observou, com seu microscópio primitivo, a presença dos agregados de “animalcules”. Suas

observações foram confirmadas por outros pesquisadores, mas a compreensão da natureza e

da importância desses minúsculos organismos demorou a ser esclarecida. A partir do século

XIX, o químico francês Louis Pasteur provou que a vida não era fruto da geração

espontânea e desenvolveu métodos para controlar o crescimento microbiano. Já o físico

alemão Robert Koch criou critérios experimentais que serviram como base para o estudo de

microrganismos patogênicos e desenvolveu o primeiro método para o crescimento de

culturas puras de microrganismos (COSTERTON, 1999). Porém, a teoria da predominância

da existência séssil das bactérias sob a forma de biofilme foi somente promulgada em 1978.

Esta teoria sugere que a maioria das bactérias cresce em comunidades aderidas a superfícies

em ecossistemas aquáticos, sob a forma de biofilmes, sendo este o maior componente da

biomassa bacteriana (GEESEY et al., 1977; DONLAN & COSTERTON, 2002). Estudos

vêm demonstrando que a adesão bacteriana ocorre de uma forma bastante organizada

obedecendo a princípios de especificidade e sinalização celular (COSTERTON,

STEWART & GREENBERG, 1999). A predominância de biofilmes foi estabelecida em

praticamente todos os ecossistemas. Observações microscópicas e técnicas quantitativas

diretas mostram que mais de 99,9% das bactérias crescem em biofilme em uma variedade

de superfícies (DONLAN & COSTERTON, 2002).

A formação de biofilmes sobre superfícies é uma estratégia bacteriana universal

para sobrevivência e posicionamento favorável em relação aos nutrientes disponíveis

(COSTERTON et al., 1987). Constitui, também, uma proteção que permite a sobrevivência

das bactérias em ambientes hostis (COSTERTON et al., 1995).

1.3.1 Estrutura e fisiologia de biofilmes bacterianos

Os biofilmes bacterianos são estruturas constituídas por comunidades de bactérias



aderentes entre si e/ou a superfícies, envolvidas por matriz extracelular altamente hidratada

(COSTERTON et al., 1994, 1995). Os biofilmes podem compreender uma única ou várias

espécies bacterianas. Apesar dos biofilmes mistos predominarem na maioria dos ambientes,

biofilmes formados por uma espécie ocorrem em diversas infecções e na superfície de

implantes médicos (O’TOOLE, KAPLAN & KOLTER, 2000). Estudos nesta área têm

mostrado que a coagregação de bactérias sésseis geralmente ocorre entre organismos

distantes taxonomicamente e, ocasionalmente, entre estirpes pertencentes à mesma espécie

(RICKARD et al., 2003a). A superfície do biofilme é bastante adsortiva devido a sua

natureza polieletrolítica, capaz de reter quantidades significantes de compostos orgânicos e

inorgânicos do meio (CHARACKLIS, 1981; NIVENS, PALMER & WHITE, 1995).

Estudos da arquitetura do biofilme têm mostrado que a microcolônia é a unidade básica

desta estrutura (COSTERTON, 1999). As microcolônias são compostas por populações de

uma única espécie e o conjunto de microcolônias forma o biofilme. Vários parâmetros

podem afetar a estrutura do biofilme, como as propriedades da superfície de adesão e da

interface sólido-líquido, disponibilidade de nutrientes, composição da comunidade

microbiana e hidrodinâmica (DAVEY & O’TOOLE, 2000).

A microcolônia pode ser composta por 10-25% de células e 75-90% de matriz

composta por substâncias poliméricas extracelulares (SPE), dependendo das espécies

envolvidas (COSTERTON, 1999). Aproximadamente 80% - 90% da massa total dos

biofilmes é constituída por água. As bactérias representam cerca de 70% do peso seco,

enquanto o restante é atribuído aos elementos de matriz extracelular (MARSH &

BRADSHAW, 1995).

Nos estágios iniciais de formação do biofilme, as bactérias sésseis encontram-se

justapostas, podendo formar biofilmes simples ou mistos (COSTERTON et al., 1995). O

ambiente interno de cada microcolônia é condicionado pelos elementos de matriz

extracelular e pela atividade metabólica de suas células. Os biofilmes possuem um alto grau

de organização, onde as bactérias se beneficiam da justaposição estável e da cooperação

fisiológica para constituir uma comunidade coordenada funcionalmente (COSTERTON et

al., 1987, 1995; FERRIS et al., 1989).

Análises estruturais do biofilme revelaram que a arquitetura dos biofilmes é

formada por estruturas cônicas simples e por outras em forma de cogumelo (Figura 7).



Essas estruturas formam poros e/ou canais de água que se intercalam entre as microcolônias

formadas pelas bactérias sésseis. Por entre estes poros podem circular nutrientes, oxigênio e

substratos até nas partes mais internas do biofilme, o que facilita a troca de subprodutos

metabólicos com a fase líquida (DE BEER, SRINIVASAN & STEWART, 1994;

COSTERTON, 1995; COSTERTON et al., 1995; COSTERTON, 1999; STOODLEY et al.,

1999; DAVEY & O’TOOLE, 2000; TOLKER-NIELSEN & MOLIN, 2000; DONLAN &

COSTERTON, 2002). Quando um biofilme é composto por diferentes espécies, os

subprodutos metabólicos de um organismo podem servir de suporte para o crescimento de

outro, enquanto que a adesão de uma espécie confere ligantes para anexar outros (Figura 8).

Porém, a competição por nutrientes e o acúmulo de subprodutos tóxicos podem limitar a

diversidade no biofilme (DUNNE, 2002). Desta forma, a arquitetura do biofilme é

influenciada tanto pela microbiologia quanto pelas condições ambientais (DAVEY &

O’TOOLE, 2000).

1.3.2 Adesão bacteriana e componentes da matriz extracelular

As bactérias aderem a um substrato sólido através das SPE, sintetizadas, secretadas

e orientadas pela célula, que se estendem desde a superfície dos microrganismos para

formar uma matriz extracelular emaranhada altamente hidratada (COSTERTON et al.,

1987, 1995). A matriz extracelular pode atuar como uma resina de troca iônica, extraindo

moléculas orgânicas e íons inorgânicos do meio ambiente e produzindo uma concentração

de nutrientes favorável dentro do biofilme (COSTERTON et al., 1987).

As SPE são os principais componentes do glicocálice bacteriano, ou camada limosa,

que se encontra intimamente associado à parede celular. Elas são também encontradas nos

espaços extracelular e intercelular. As SPE são predominantemente constituídas por água.

Quimicamente, são polímeros altamente heterogêneos, constituídos por polissacarídeos,

proteínas, ácidos nucléicos e lipídeos, dos quais muitos são espécie-específicos.

Polissacarídeos de SPE são geralmente carregados negativamente, mas também podem ser

neutros ou, raramente, apresentar cargas positivas. As células presas na matriz de SPE não

apresentam movimento Browniano. A composição das SPE determina a característica

hidrofílica ou hidrofóbica da matriz extracelular. A hidrofobicidade apresenta um papel

importante para a adesão de certas bactérias em determinados substratos. As SPE

encontram-se densamente concentradas ao redor das microcolônias bacterianas e são



responsáveis por imobilizá-las na superfície, assim como por facilitar o arranjo espacial e a

comunicação entre esses grupos bacterianos através dos canais de água formados por elas

(SUTHERLAND, 1985; WHITFIELD, 1988; NEU & PORALLA, 1990; BAYER &

BAYER, 1994; MARSHALL, 1997; ALLISON, 1998; BEECH & GAYLARDE, 1999;

DUNNE, 2002).

Figura 7: Representação esquemática da estrutura do biofilme bacteriano.

O modelo contempla aspectos estruturais e fisiológicos de um biofilme bacteriano aderido a

uma superfície sólida. A Figura mostra estruturas cônicas e em forma de cogumelo, perfuradas em

sua extremidade inferior por canais, pelos quais circulam o fluido e os nutrientes. As bactérias

organizam-se em microcolônias imersas em grande quantidade de matriz extracelular. Porções

mais superficiais do biofilme se desprendem, com conseqüente limitação do crescimento do biofilme

e colonização de novas regiões da superfície.



1.3.3 Formação e organização de biofilmes bacterianos

A partir do momento em que um material inerte é imerso em um ambiente líquido,

sua superfície sofre grandes mudanças, a começar pela adsorção de compostos químicos

inorgânicos. Em ambientes biologicamente ativos, há aderência de moléculas orgânicas

(camada condicionante – Figura 8) e de bactérias, dando início ao processo de formação do

biofilme bacteriano. O biofilme bacteriano pode atingir dimensões macroscópicas através

da aderência de outros microrganismos (algas, fungos e protozoários) e/ou de

macrorganismos (cracas, mexilhões) adquirindo a denominação de biofouling. O termo

fouling (incrustação, acumulação de resíduos, depósitos, sujeira, etc.) está relacionado à

formação indesejável de depósitos orgânicos e/ou inorgânicos em superfícies, podendo

causar problemas como, por exemplo, diminuição do fluxo de calor através de uma

superfície e o aumento de sua taxa de corrosão (CHARACKLIS, 1981).

O processo de formação de biofilme parece ser iniciado quando as células

bacterianas captam certos sinais do ambiente que desencadeiam a transição de crescimento

de vida planctônica para vida séssil aderida a substratos sólidos (DAVEY & O’TOOLE,

2000). O desenvolvimento do biofilme procede como uma sucessão de eventos de adesão e

multiplicação (Figura 8). As bactérias em ambientes naturais e artificiais encontram uma

ampla variedade de superfícies sólidas que podem alterar seu comportamento fisiológico e

ecológico. As bactérias alcançam aleatoriamente uma distância próxima à superfície, ou por

quimiotaxia ou por mobilidade. Estas células podem ser consideradas partículas coloidais

vivas. Uma vez aderidas a superfícies, estão sujeitas a várias forças de atração e repulsão.

Estas forças podem levar a uma adesão rápida, porém passiva, ou podem acarretar uma

adesão lenta, mas ativa. O processo de adesão envolve uma fase intermediária reversível,

seguida de respostas fisiológicas induzidas nas bactérias ao primeiro contato com a

superfície. Neste ponto, as bactérias consolidam o processo de adesão pela produção de

SPE, e se tornam aderidas irreversivelmente (MARSHALL, 1997; DUNNE, 2002;

RICKARD et al., 2003b).

O processo de formação de um biofilme bacteriano pode ser subdividido em vários

estágios, obedecendo à seguinte ordem (GEESEY, 1993; ALLISON et al., 1999): (1)

Formação da camada condicionante por moléculas orgânicas que se transferem do líquido

para a superfície sólida; (2) Colonização ou adesão da superfície por bactérias planctônicas



Figura 8: Diagrama ilustrativo da coagregação de bactérias e formação do biofilme

(extraído e adaptado de Rickard et al., 2003b).

a) Colonização primária do substrato sobre camada condicionante.

b) Crescimento celular e produção de SPE, que ancoram as células à superfície de

uma forma geralmente irreversível.

c) Co-agregação de células no biofilme. Nesta fase, o biofilme aumenta de

espessura e as condições em sua base são alteradas.

d) Biofilme Maduro.



e começo da existência séssil pela excreção de produtos de matriz extracelular, que

ancoram as células à superfície de uma forma geralmente irreversível; (3) Multiplicação de

diferentes espécies de bactérias sésseis sobre a superfície do metal; (4) Crescimento das

microcolônias e eventual estabelecimento de relações próximas entre si na superfície. Nesta

fase, o biofilme aumenta em espessura e as condições em sua base são alteradas; (5)

Desprendimento de porções do biofilme; (6) Recolonização de áreas adjacentes e expostas

da superfície por bactérias planctônicas ou por bactérias sésseis.

Durante os primeiros estágios de desenvolvimento, um biofilme é composto das

espécies bacterianas pioneiras que se aderem à camada de condicionamento adsorvida à

superfície e essas bactérias encontram-se distribuídas como células individuais de forma

heterogênea. A natureza e a extensão da adesão dependem das propriedades físico-químicas

do substrato, da origem das moléculas da camada condicionante, inicialmente substratos

orgânicos e posteriormente SPE, e dos organismos envolvidos (RICKARD et al., 2003b).

Em questão de minutos, algumas das espécies aderidas produzem SPE que

envolvem as células e se estendem da superfície celular até o substrato em contato com o

meio. Neste estágio do desenvolvimento, o biofilme costuma ser menor que 10 μm em

espessura e costuma apresentar uma matriz descontínua de exopolímeros intercalada com

células. Como as células sésseis do biofilme continuam multiplicando e excretando mais

SPE, o biofilme forma uma camada confluente de espessura crescente sobre a superfície.

Com o passar do tempo, espécies de bactérias planctônicas e partículas inorgânicas

entranham-se no biofilme e contribuem para o crescimento de uma comunidade de grande

complexidade. Nesse estágio, o biofilme é considerado maduro. Sua morfologia e

consistência variam dependendo dos tipos de bactérias presentes e das condições do meio

que o envolve. O tempo necessário para a formação de um biofilme maduro pode variar de

alguns dias até várias semanas. Com o aumento da espessura do biofilme, fica prejudicada a

difusão de gases dissolvidos e outros nutrientes vindos do meio para o substrato. Nesse

caso, as condições podem se tornar inóspitas para as bactérias localizadas na base do

biofilme e que se encontram distantes dos canais de água e, como conseqüência, essas

bactérias acabam morrendo. As células em diferentes regiões de um biofilme exibem

diferentes padrões de expressão gênica (DAVIES et al., 1998). A competição por nutrientes

também faz com que sejam perdidas muitas das vantagens da vida protegida dentro dos



biofilmes. As células tendem a se desprender não só para colonizar novas áreas, mas

também para buscar nutrientes. O deslocamento das bactérias para novas áreas também

serve para dispersar a população e, portanto, para expandir a diversidade genética. Com a

necessidade nutricional e com a base do biofilme abalada devido à morte de bactérias, o

estresse causado pelo fluxo do meio e mecanismos de sinalização celular denominado

quorum sensing (sensibilidade ao quorum) atuam em conjunto para que ocorra o

desprendimento de partes do biofilme, expondo áreas descobertas na superfície (FUQUA,

WINANS & GREENBERG, 1994). O quorum sensing é causado por um acúmulo de

substâncias de baixo peso molecular em uma concentração limiar crítica, permitindo que

células individuais "sintam" que uma unidade populacional bacteriana mínima foi atingida

e assim deve ser iniciada uma resposta coordenada pela população. ALLISON e

colaboradores, em 1998, mostraram que as N-acil homoserina lactonas têm participado do

processo de desprendimento de células por quorum sensing em biofilmes formados por P.

fluorescens. As áreas que se tornam expostas após o desprendimento são,

subseqüentemente, recolonizadas e novas bactérias e suas SPE dão continuidade ao

biofilme existente. Esse fenômeno cíclico (adesão, formação do biofilme e seguinte

desprendimento das células) ocorre mesmo quando as condições físicas no líquido

permanecem constantes.

1.3.4 Métodos microscópicos para estudo de biofilmes

O conhecimento sobre os biofilmes tem sido adquirido através de observações

microscópicas e por análises bioquímicas e taxonômicas destrutivas, ou seja, que alteram

sua estrutura. Um aspecto fundamental do estudo da adesão bacteriana a superfícies é a

necessidade de métodos confiáveis para quantificação de células aderidas. Muitos métodos

de contagem bacteriana incluem metodologias de contagem direta por microscopia óptica e

microscopia eletrônica de varredura (MEV). A microscopia óptica convencional pode

fornecer informações sobre a distribuição e atividade fisiológica dos microrganismos, bem

como extensão da superfície colonizada. Entretanto, seu uso é limitado quando se estuda

biofilmes maduros, onde a natureza tridimensional da comunidade mascara a observação

dos microrganismos constituintes destes biofilmes (AN & FRIEDMAN, 1997;

CAVALCANTI, 2001).

Um grande avanço na instrumentação microscópica com potencial para estudo de



biofilmes bacterianos é o microscópio óptico confocal de varredura a laser (COSTERTON

et al., 1995). O confocal é um microscópio de epifluorescência de alta tecnologia que

permite a realização de cortes ópticos (~3μm) horizontais e verticais, onde são excluídos

aqueles que se encontram fora de foco. Através do confocal podemos documentar a

morfologia e a fisiologia de biofilmes intactos sob condições in situ, permitindo a melhor

compreensão sobre a sua organização espacial (PALMER & STERNBERG, 1999). As

informações que podem ser obtidas a partir desta técnica incluem quantificação, medição

do biofilme, identificação de espécies no complexo, assim como de estruturas na superfície

celular, em termos de espessura, área de superfície colonizada, densidade bacteriana e

tempo de colonização do substrato sólido. Além disso, a organização tridimensional do

biofilme pode ser estudada correlacionando-a com o estado fisiológico das bactérias. A

observação direta de populações microbianas e da atividade biológica é necessária para

fornecer uma informação exata sobre a dinâmica de agregação celular, os processos

metabólicos, a resistência a agentes microbianos ou sobre os predadores dentro de uma

estrutura de biofilme funcional. As análises de biofilmes microbianos podem ser realizadas

através da utilização de uma grande variedade de sondas fluorescentes, sendo possível

distinguir células viáveis das não-viáveis usando colorações vitais.

Os fluoróforos comumente usados são o DAPI (dihidrocloreto 4´,6-diamino-2-

fenilindol), iodeto de propídio (IP) e laranja de acridina (LA). O DAPI é um composto que

se liga a DNA e fluoresce em azul quando excitado por luz UV; portanto, é útil para

visualizar bactérias totais em uma amostra. O IP é freqüentemente usado para corar células

desestabilizadas. Este composto se intercala entre as bases de DNA e, quando excitado por

lâmpadas de mercúrio ou xenônio, emite fluorescência em vermelho. A LA emite

fluorescência em verde quando ligado a DNA dupla fita e em laranja quando ligado a

ácidos nucléicos de fita simples, como mRNA.

1.4 Controle do crescimento de BRS e da produção de Sulfeto

A medida mais comum contra o crescimento microbiano indesejado é o uso de

biocidas (FLEMMING, 2002). Os biocidas são capazes de eliminar ou inibir o crescimento

microbiano. Entre outros objetivos, os biocidas são usados para o controle de biofilmes

bacterianos, em especial daqueles ricos em BRS, causadores de CIM em superfícies



metálicas na indústria do petróleo. Um critério importante para seleção e aplicação de um

biocida deve incluir o cumprimento de leis de proteção ambiental. Os principais biocidas

usados na indústria do petróleo são sais de amônio quaternário, cloro, glutaraldeído e o

THPS (sulfato de tetraquishidroximetilfosfônio). Em geral, estas bases químicas ativas

apresentam problemas de toxicidade a formas de vida superior e de persistência de resíduos

tóxicos, podendo gerar impactos ambientais (DOWLING & GUEZENNEC, 1997;

JAYARAMAN, HALLOCK & CARSON, 1999; VIDELA, 2002).

A eficiência do biocida depende da natureza do microrganismo a ser eliminado e as

condições de operação do sistema a ser tratado (VIDELA, 2002). É importante reconhecer

que bactérias presentes em um biofilme maduro se comportam de forma diferente de

quando estão em sua forma planctônica. Como anteriormente comentado, bactérias

presentes em biofilmes são mais resistentes a agentes antimicrobianos do que aquelas em

suspensão. As SPE atuam como uma barreira de difusão entre as células e o meio e

funcionam como um fator de proteção das bactérias contra, por exemplo, o efeito letal de

biocidas, de antibióticos e de agentes surfactantes, ataque de bacteriófagos, entre outros

(COSTERTON et al., 1987, 1994, 1995; SUTHERLAND, SKILLMAN & HUGHES,

1999). A penetração e a reatividade dos agentes antimicrobianos variam com o tamanho da

malha e com as características químicas das SPE (COSTERTON et al., 1995;

SUTHERLAND, SKILLMAN & HUGHES, 1999).

Em alguns casos extremos, as concentrações de biocidas necessárias para se atingir

uma atividade bactericida contra organismos sésseis podem ser três a quatro vezes maior do

que as concentrações usadas para bactérias livres na fase líquida (DUNNE, 2002). A

resistência dos microrganismos presentes em biofilmes tem implicações econômicas e

ambientais muito sérias em vários setores industriais. Os mecanismos responsáveis pela

resistência aos biocidas podem ser: (1) difusão limitada do agente antimicrobiano através

da matriz do biofilme; (2) nível reduzido de atividade metabólica dos organismos do

biofilme; (3) estrutura do envelope celular; (4) interação do agente antimicrobiano com a

matriz do biofilme (células e polímeros); (5) resistência mediada por enzima; (6) bomba de

fluxo; (7) adaptação genética (DONLAN & COSTERTON, 2002; CLOETE, 2003).



1.5 Produção de substância antimicrobiana (SAM) em biofilme

Métodos convencionais de controle e remoção de biofilmes em um cenário

industrial nem sempre são eficientes. É comum aumentar a concentração usual de um

biocida na tentativa de melhorar sua eficiência, porém esta estratégia pode resultar em

impactos ambientais ainda mais graves. Uma alternativa vantajosa para controle de

biofilmes com menor impacto ambiental inclui a estimulação de organismos capazes de

produzir substâncias antimicrobianas (SAM) in situ (JAYARAMAN, MANSFELD &

WOOD,1999). Bactérias produzem importantes metabólitos, dentre estes compostos estão

as SAM. Alguns trabalhos mostram que bactérias produtoras de SAM encontram-se

majoritariamente no estado séssil (YAN et al., 2003). Os resultados obtidos por YAN,

BOYD & BURGUESS (2002) sugeriram que a formação de biofilme é um fator importante

na produção de compostos antimicrobianos pelas estirpes B. licheniformis EI-34-6 e B.

subtilis II-111-5 (YAN, BOYD & BURGESS, 2002; YAN et al., 2003). JAYARAMAN,

MANSFELD & WOOD (1999) observaram um decréscimo na população de uma espécie

de BRS (Desulfovibrio vulgaris) em um biofilme de B. subtilis expressando bactenecina,

tendo sido também detectada a inibição da corrosão induzida por BRS.

1.6 Bactérias do gênero Bacillus produtoras de SAM

Bactérias do gênero Bacillus habitam comunidades ecológicas complexas, como

solos e ambientes aquáticos, onde produzem uma variedade de compostos que parecem

aumentar sua capacidade de sobrevivência. Muitos destes compostos apresentam atividade

antimicrobiana, podendo ser produzidos em condições de estresse nutricional, sendo

comum observar o acúmulo destes produtos na fase estacionária do crescimento bacteriano

(ZUBER, NAKANO & MARAHIEL, 1993).

1.6.1 O gênero Bacillus

Bactérias do gênero Bacillus pertencem à família Bacillaceae e têm, como uma

característica taxonômica importante, a formação de endósporos, ocorrendo somente um

por célula. Como os esporos são resistentes ao calor, frio, radiação, dessecação e

desinfetantes podem permanecer viáveis por longo período de tempo (GORDON, 1977).

O gênero é composto por células que são encontradas no formato de bastonetes



retos ou quase retos. Bactérias pertencentes a este gênero são Gram-positivas, entretanto,

algumas espécies são consideradas Gram-variáveis por serem coradas de rosa, nos estágios

finais do crescimento (BEVERIDGE, 1990). Algumas espécies podem ser móveis,

apresentando geralmente flagelo peritríquio. Certas espécies são aeróbias estritas e outras

aeróbias facultativas; o oxigênio é, na maioria das vezes, o aceptor final de elétrons. A

morfologia e o tamanho das colônias são muito variáveis. Algumas estirpes de Bacillus

apresentam pigmentação em determinados meios de cultura. Devido ao grande número de

espécies pertencentes a este gênero, apresentando características fisiológicas diversas,

bactérias do gênero Bacillus são encontradas em diferentes ambientes, podendo ser desde

psicrófilas a termófilas, acidofílicas a alcalinofílicas, halotolerantes ou halofílicas. A

maioria das espécies produz catalase e pode ser oxidase positiva ou negativa. Algumas

espécies deste gênero são quimiorganotróficas, prototróficas a auxotróficas necessitando de

vários fatores de crescimento (CLAUS & BERKELEY, 1986).

Até a década de 90, as diferentes espécies de Bacillus eram identificadas usando

somente critérios morfológicos e bioquímicos. Em 1991, ASH e colaboradores, através da

análise da seqüência do gene que codifica o RNA ribossômico 16S, demonstraram a

heterogeneidade filogenética das espécies que compunham o gênero Bacillus. Com base

nesta análise detalhada, o gênero Bacillus foi dividido em 5 linhas filogenéticas distintas

altamente divergentes. Assim, novos gêneros do mesmo ramo filogenético de Bacillus

foram destacados, como por exemplo: Amphibacillus (NIMURA et al., 1990),

Paenibacillus (ASH, PRIEST & COLLINS, 1993), Alicyclobacillus (WIZOTZKEY et al.,

1992), Halobacillus (SPRING et al., 1996), Brevibacillus, Aneurinibacillus (SHIDA et al.,

1996), Virgibacillus (HEYNDRICKX et al., 1998), Gracilibacillus e Salibacillus (WAINO

et al., 1999), Thermobacillus (TOUZEL et al., 2000), Filobacillus (SCHLSNER et al.,

2001), Ureibacillus (FORTINA et al., 2001), Geobacillus (NAZINA et al., 2001),

Jeotgalibacillus (YOON et al., 2001), Oceanobacillus (LU, NOGI, & TAKAMI, 2001),

Paraliobacillus (ISHIKAWA et al., 2002), Pontibacillus (LIM et al., 2005),

Ornithinibacillus (MAYR et al., 2006) e Piscibacillus (TANASUPAWAT et al., 2007).

Espécies do gênero Bacillus são de grande importância prática, pois interagem de

diversas formas com as atividades humanas. A importância biotecnológica de certas

espécies, como B. subtilis, B. licheniformis e B. amyloliquefaciens é devida às várias



aplicações relacionadas à produção de enzimas, antibióticos, solventes e outras moléculas.

B. mycoides apresenta, por exemplo, atividade promotora de crescimento de planta

(DAFFONCHIO et al., 1998). A espécie B. thuringiensis também é amplamente usada na

agricultura para o biocontrole de insetos fitopatogênicos. Esta espécie é capaz de produzir

uma endotoxina, com atividade específica contra certas espécies de insetos, nematodos e

protozoários (DAFFONCHIO et al., 1998). Na área da saúde, outras espécies como B.

anthracis e B. cereus são de interesse médico, pois são responsáveis por causarem o antrax

e doenças de origem alimentar, respectivamente. Com maior importância na indústria de

alimentos, a espécie Geobacillus stearothermophilus pode causar problemas na linha de

produção, pois é altamente resistente a tratamentos térmicos, podendo causar problemas,

por exemplo, na conservação de leite e queijo por longos períodos (DAFFONCHIO et al.,

1998).

1.6.2 Produção de SAM por Bacillus

As SAM podem ser de natureza peptídica. Estas moléculas geralmente são pequenas

e estruturalmente diversas. Algumas contêm aminoácidos incomuns, como os D-

aminoácidos ou ácido α-amino isobutírico, lantionina, de-hidroalanina. Em geral, estas

moléculas não são passíveis de serem sintetizadas quimicamente (ZUBER, NAKANO &

MARAHIEL, 1993; VAN T’HOF et al., 2001).

Os metabólitos secundários produzidos por certas espécies e estirpes do gênero

Bacillus têm mostrado atividade antimicrobiana contra microrganismos patogênicos e

fitopatogênicos. É sugerido na literatura que estes compostos com atividade antimicrobiana

possam ser utilizados como um método alternativo ou suplementar ao uso de biocidas

químicos. Assim, espécies de Bacillus são candidatas ideais para o uso como agentes de

biocontrole em programas de tratamento de sementes contra patógenos originados do solo

(FÖLDES et al., 2000). Estes produtos têm atraído também interesse farmacêutico, como

agentes terapêuticos contra bactérias Gram-positivas e com importância na modificação da

microbiota intestinal em humanos (OSCÁRIZ, LASA & PISABARRO, 1999). A produção

de SAM por bactérias intestinais pode ser considerada como um tipo de defesa, pois estes

peptídeos matam microrganismos invasores que competem por nutrientes (NISSEN-

MEYER & NES, 1997). Já foi relatada também a atividade de SAM em rumem de animais

(PATTNAIK et al., 2001).



Dentre as substâncias com atividade antibacteriana produzidas por Bacillus,

incluem-se as bacteriocinas, que são geralmente peptídeos de baixa massa molecular

sintetizados pelo ribossomo. Na maioria das vezes, a atividade destas substâncias é espécie-

específica, entretanto algumas bacteriocinas apresentam um espectro de ação mais amplo

(HYRONIMUS, LE MARREC & URDACI, 1998).

Em 1995, YAKIMOV e colaboradores isolaram uma estirpe de B. licheniformis

(BAS50) de um reservatório de petróleo com profundidade de 1500 m. Esta estirpe é capaz

de produzir um composto surfactante chamado de liquenisina A, que apresenta atividade

antibacteriana. No entanto, sua atividade frente às bactérias testadas mostrou-se mais fraca

que a atividade inibitória de outro surfactante, a surfactina, produzida pela estirpe B.

subtilis ATCC 39307.



2 JUSTIFICATIVA DO TRABALHO

A exploração de petróleo e gás se justifica pela importância desses recursos para a

economia e a segurança nacional, como pelo papel que desempenham na impulsão para

uma série de indústrias. A imagem da mineração como uma atividade agressiva ao meio

ambiente e aos interesses do desenvolvimento sustentado tem suas raízes na intensa

demanda pelos bens minerais que vigorou no passado remoto, associada à falta de soluções

tecnológicas adequadas.

O monitoramento dos processos perniciosos da indústria de petróleo e a

investigação de avanços tecnológicos na área de controle de riscos são atividades de rotina

da Petrobras. Os processos perniciosos causados pela presença de microrganismos na linha

de produção de petróleo são a acidulação biogênica e a biocorrosão de superfícies

metálicas. A ocorrência de bactérias redutoras de sulfato (BRS) e da conseqüente produção

intensiva de H2S em reservatórios de petróleo são fatores que agravam os processos citados.

Assim, a acidulação biogênica e a corrosão influenciada por microrganismos tem se

tornado uns dos maiores problemas na indústria de petróleo. Isto se deve principalmente ao

aumento da atividade de injeção de água do mar, para aumentar a pressão interna do

reservatório, como meio de recuperação secundária de petróleo. Considerando os cenários

ambiental, econômico e de segurança associados ao crescimento de BRS presentes em

ambientes petrolíferos, é de grande interesse para as indústrias petrolíferas o conhecimento

abrangente da microbiologia de reservatório e das bactérias presentes em instalações

industriais, especialmente no sistema de injeção de água do mar que é uma das maiores

fontes de contaminação do sistema. A busca por novos agentes biocidas é também uma

constante nas pesquisas de ponta para controle microbiológico, a fim de melhorar o sistema

de tratamento de água de injeção atualmente aplicado. Este tratamento convencional utiliza

biocidas sintéticos que apresentam efeitos colaterais provenientes da alta dose de biocida

aplicada (problemas ambientais, custo elevado para sua aplicação).

O estudo da geomicrobiologia promete melhor entendimento da origem dos

microrganismos que ali habitam e que atuam em diferentes vias metabólicas. A percepção

de que os microrganismos encontrados em ambientes petrolíferos podem ser tanto de

origem autóctone quanto alóctone estimulou o interesse no estudo da microbiologia do

petróleo quanto à diversidade bacteriana em ambientes de subsuperfície profundos,



característico dos muitos reservatórios brasileiros. As informações provenientes da

comunidade natural ou contaminante neste ambiente podem facilitar a escolha de

procedimentos e tratamentos mais adequados e específicos para o controle microbiano.

O enfoque deste trabalho foi avaliar a diversidade bacteriana presente em rochas

petrolíferas de poços não injetados com água do mar no Bacia de Campos, Rio de Janeiro,

para o estudo da comunidade autóctone de reservatórios. Outro aspecto estudado foi a

diversidade bacteriana presente em sistemas de água de injeção em plataformas situadas no

campo de Marlim, localizado também na Bacia de Campos, a fim de compreender a

comunidade bacteriana com potencial para contaminar o reservatório.

E por fim, em 2005, na dissertação de mestrado intitulada “Formação de biofilmes

por estirpes de Bacillus produtoras de substâncias antimicrobianas e isoladas de ambiente

petrolífero” (KORENBLUM, 2005) foi mostrado que a substância antimicrobiana (SAM)

H2O-1 apresentou atividade inibitória contra BRS in vitro (KORENBLUM et al., 2005).

Sendo as BRS as principais responsáveis pela acidulação biogênica e corrosão

microbiológica, diversos esforços são realizados a fim de aplicar novos mecanismos de

controle destes processos. Devido à toxicidade e persistência dos biocidas comumente

usados para evitar o crescimento de BRS, foi avaliado também no presente estudo, a

atividade da SAM produzida pela estirpe Bacillus firmus H2O-1 sobre biofilmes formados

por BRS, buscando uma possível alternativa aos métodos convencionais de controle e

remoção de biofilmes formados em diversos sistemas na indústria petrolífera.



3 OBJETIVOS

Analisar a diversidade filogenética de bactérias totais e de bactérias redutoras de

sulfato presente em rocha petrolífera de subsuperfície profunda localizada no campo

petrolífero Marlim, Rio de Janeiro, utilizando o gene que codifica o RNAr 16S e o

gene aprA, respectivamente.

Analisar a diversidade filogenética de bactérias totais, utilizando o gene que codifica o

RNAr 16S, presentes em diferentes tratamentos do sistema de injeção de água em três

plataformas localizadas na Bacia de Campos, Rio de Janeiro. Comparar a composição

das populações encontradas em cada sistema de injeção de acordo com o tratamento

aplicado no controle microbiano.

Determinar a atividade inibitória da substância antimicrobiana (SAM) produzida pela

estirpe Bacillus firmus H2O-1 sobre o desenvolvimento de biofilmes de bactérias

redutoras de sulfato (BRS) em um biorreator CDC, caracterizando por microscopia

confocal de varredura a laser a adesão das BRS tratadas ou não tratadas com SAM.



4 ETAPAS DESENVOLVIDAS

4.1 Primeira etapa: Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente

em rocha de subsuperfície localizada em reservatório petrolífero offshore de águas

profundas.

Foram identificados os principais grupos de bactérias totais e de bactérias redutoras

de sulfato (BRS) presentes em rocha de subsuperfície localizada em reservatório petrolífero

offshore de águas profundas. Para tal, foi utilizado a abordagem molecular de PCR,

clonagem e seqüenciamento do gene que codifica o RNAr 16S e do gene aprA para

bactérias totais e BRS, respectivamente.

Extração de DNA a partir de quatro testemunhos de rocha reservatório do

campo de Marlim, coletados a uma profundidade de 2.822 – 2.828 m abaixo

da coluna de água do mar. Para tal, foi adaptada a metodologia de extração

de DNA para aumentar a eficiência de recuperação do DNA da comunidade

bacteriana presente nestas amostras.

Amplificação do DNA presente nas amostras de rocha por PCR, com base

em iniciadores universais para o gene que codifica o RNAr 16S e com base

em iniciadores grupo-específicos para o gene aprA.

Clonagem dos produtos de PCR para construção de bibliotecas.

Seqüenciamento de clones obtidos contendo os fragmentos esperados.

Identificação dos principais grupos taxonômicos presentes nos diferentes

testemunhos da rocha reservatório através de ferramentas de bioinformática.

4.2 Segunda etapa: Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente

em sistemas de água de injeção.

Foram identificados os principais grupos de bactérias totais presentes em diferentes

pontos do sistema de tratamento de água de injeção, que utiliza água do mar para aumentar

a pressão do reservatório, na recuperação secundária. Estes sistemas de injeção de água são

situados na Bacia de Campos, Rio de Janeiro. Para este fim, também foi utilizado a

abordagem molecular de PCR, clonagem e seqüenciamento do gene que codifica o RNAr

16S.



Extração de DNA a partir de água do mar coletada em diferentes pontos de

sistemas de tratamento de água de injeção de três plataformas.

Amplificação do DNA presente nas amostras de água por PCR, com base em

iniciadores universais para o gene que codifica o RNAr 16S.

Clonagem dos produtos de PCR para construção de bibliotecas.

Seqüenciamento de clones obtidos contendo os fragmentos esperados.

Identificação dos principais grupos taxonômicos presentes nas diferentes

amostras de água do sistema de tratamento de água de injeção através de

ferramentas de bioinformática.

Comparação dos tratamentos por métodos estatísticos de análise

multivariada utilizando análise de componente principal (PCA – do inglês:

principal component analysis).

4.3 Terceira etapa: Ação antimicrobiana da substância produzida pela estirpe

de Bacillus isolada de reservatório de petróleo contra biofilmes formados por

bactérias redutoras de sulfato.

Foram observadas alterações no padrão de colonização da superfície das estirpes de

BRS na presença da SAM H2O-1 sobre biofilmes simples previamente estabelecidos pelas

BRS sobre substrato de vidro. As alterações foram observadas utilizando microscopia

confocal de varredura a laser.

Preparação do sobrenadante da SAM H2O-1.

Formação de biofilmes por BRS em biorreator anaeróbico CDC.

Tratamento dos biofilmes com a SAM H2O-1.

Análise da redução de log do total de células, no biofilme controle não

tratado e no biofilme teste tratado com a SAM, pela técnica do número mais

que provável (NMP).

Processamento das amostras para microscopia de confocal de varredura a

laser com o corante fluorescente LIVE/DEAD BacLight (L-7007; Molecular

Probes).

Observação e captura de imagens das amostras por microscopia confocal de

varredura a laser.

Análise das imagens das células aderidas.



5 MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 Primeira etapa: Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente

em rocha de subsuperfície localizada em reservatório petrolífero offshore de águas

profundas.

5.1.1 Amostragem de campo

Os testemunhos da rocha usados neste estudo foram coletados de um campo de

petróleo virgem (antes de entrar na fase de produção de óleo), em uma base offshore no

campo de Marlim, na bacia de Campos, Rio de Janeiro (latitude sul -22o 38’; longitude

oeste -39o 59’). A amostragem foi totalmente realizada utilizando equipamentos e

tecnologia desenvolvida pelo Centro de Pesquisa da Petrobras (CENPES), possibilitando o

acesso ao reservatório de subsuperfície profunda. A amostragem em profundidade requer

tecnologia especializada para perfuração de cores intactos, chamada de testemunhagem

(como descrita na introdução, no item 1.1.2 Testemunhagem). Logo que o core, ou

testemunho, foi trazido à superfície, o liner (tubo de fibra de vidro) contendo a amostra de

rocha foi removido do barrilete. Foi feita a assepsia do liner com etanol 70%, e então foi

demarcada uma área de aproximadamente 20 cm para corte do liner. Após o corte do liner,

cada secção do testemunho foi cortada apenas com um impacto superficial, realizado com o

auxílio de uma talhadeira pré-desinfetada com álcool iodado (1g de iodo dissolvido em

etanol a 70%). Cada secção tinha 20 cm de comprimento e 15 cm de diâmetro. A secção de

testemunho protegida pelo liner foi revestida com parafilme e suas extremidades

imediatamente amparadas e recobertas por tampas plásticas estéreis. As amostras foram

transportadas para o laboratório preservadas em gelo seco. Os quatro cores foram coletados

numa faixa de profundidade de 2,822 a 2,828 m abaixo do fundo do mar (Figura 9). As

amostras foram denominadas T2-1/9, T2-2/9, T2-7/9 e T2-8/9.



Figura 9: (A) Representação esquemática da plataforma offshore. As secções foram obtidas em

profundidades entre 2.822 – 2.828 m a partir do fundo do mar; (B) liner contendo o core da rocha; (C)

amostrador estéril usado na sub-amostragem da rocha.



A temperatura do reservatório era de 60°C, a pressão variou de 23.830 a 26.477 KPa

e a salinidade era equivalente a 55 g/ l de NaCl. A coluna de água acima do fundo do mar

era de 1.717 m. A geologia local consiste em rocha sedimentar, composta principalmente

por arenito de coloração escura (grafite), com grãos finos a médios, consolidada.

No laboratório, a porção externa da rocha foi raspada usando uma espátula metálica

estéril (Figura 9B). A porção interna do core da rocha foi então sub-amostrada usando um

amostrador metálico esterilizado formado por dois cilindros. Um cilindro é vazado (10 cm

comprimento, 14 mm diâmetro externo, 12 mm diâmetro interno), e o outro, maciço (10 cm

comprimento, 11 mm diâmetro). Isto é, o cilindro vazado é introduzido na rocha, onde as

porções interiores do core são retidas, e em seguida, o cilindro maciço é utilizado para

empurrar a amostra do interior do cilindro vazado para um tubo falcon estéril (Figura 9C).

Neste trabalho, quatro secções foram amostradas, obtidas no intervalo de 2.822 e 2.828 m a

partir do fundo do mar em um reservatório de óleo offshore, no Brasil. Todas as amostras

foram mantidas em frascos esterilizados e preservadas a -70°C antes da etapa de extração

de DNA.

5.1.2 Extração de DNA das amostras de rocha

Todo o procedimento de extração de DNA foi realizado dentro de um fluxo laminar.

Foram utilizadas ponteiras com barreira (proteção a aerossol) para reduzir a chance de

contaminação. A extração foi conduzida usando 30 g de material de cada uma das quatro

sub-amostragens realizadas como descrito acima. As amostras foram misturadas com 150

ml de tampão Winogradsky, 15 g de polivinil pirrolidona (PVP) e 10 g de pérolas de vidro

de 2 mm. As misturas foram incubadas por 2 horas a 150 rpm a temperatura ambiente, a

fim de dissolver o material agregado das amostras. As amostras foram então centrifugadas a

4°C por 10 minutos a 750 x g. Os sobrenadantes foram mantidos a 4°C. Os pellets de

sedimento rochoso formados foram novamente homogeneizados manualmente com tampão

Winogradsky adicional (100 ml), e novamente centrifugados a 4°C por 10 minutos a 750 x

g. Este procedimento foi repetido mais 3 vezes. Os sobrenadantes provenientes de todas as

repetições do procedimento recém descrito foram então concentrados a 4°C por 20 minutos

a 10.000 x g, para que a fração bacteriana fosse recuperada. Os pellets contendo a fração

bacteriana foram lavados cuidadosamente com 200 ml tampão TE, centrifugando também a



4°C por 20 minutos a 10.000 x g, e suspensos em 10 ml do mesmo tampão. A seguir, a

suspensão de células foi dividida em dois tubos de poliestireno. A lise celular mecânica foi

feita pela adição de 3 g de pérolas de vidro (106 micras, lavagem ácida, Sigma) a cada tubo.

Estes tubos foram fechados hermeticamente e submetidos a ciclos (3 ciclos de 60 segundos

sob homogeneização, com intervalos de 10 segundos) no homogeneizador de células MSK

(Braun-Melsungen) a 4.000 rpm. As amostras de células rompidas foram imediatamente

colocadas em banho de gelo e 180 μl de SDS 20% foram adicionados a cada tubo. Em

seguida foi adicionado fenol (4 ml) em cada tubo, para a desnaturação de proteínas, e então

os tubos foram homogeneizados manualmente. O material protéico foi então precipitado

por centrifugação a 6.000 x g por 5 minutos. A fase aquosa foi transferida para outro tubo

de centrífuga de 50 ml, tratada com 4 ml de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) e

centrifugada a 6.000 x g por 20 minutos. Os ácidos nucléicos foram então precipitados com

0,5 ml de NaCl 5M e 2 volumes de etanol gelado e mantidos por 18 horas a -20ºC. Após

este tempo, os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 12.800 x g. O pellet de DNA foi

lavado com 5 ml de etanol 70% e centrifugado novamente por 10 minutos a 12.800 x g.

Dentro de um fluxo laminar, o pellet de DNA foi seco ao ar e então suspenso em 200 μl de

tampão TE, e solubilizado em banho-maria a 55ºC por 5 minutos. Em seguida, 0,1 g de

CsCl foi adicionado ao extrato bruto de DNA e o tubo foi mantido a temperatura ambiente

por 1 hora. A mistura contendo o DNA extraído foi transferido para um tubo eppendorf

novo, e foram adicionados 400 μl de água destilada e 300 μl de álcool isopropílico. A

mistura foi mantida a temperatura ambiente por 30 minutos, e então o DNA foi coletado

por centrifugação a 12.800 x g por 15 minutos. Dentro de um fluxo laminar, o DNA

purificado foi seco ao ar e então suspenso em 100 μl de tampão TE.

Para verificar a qualidade do DNA obtido na extração, uma alíquota de cada

amostra foi submetida à eletroforese horizontal em gel de agarose a 0,8% (p/v) a 80 V, em

tampão TEB por aproximadamente 2 horas à temperatura ambiente. As amostras foram

aplicadas no gel misturadas com 1/3 do volume da solução corante de corrida para

eletroforese de DNA em gel de agarose.

Após a corrida eletroforética, o gel foi corado com brometo de etídio (2 μg/ml) e o

DNA foi observado e fotografado sob luz UV em sistema de análise de imagem IMAGO

(B&L, Holanda).



5.1.3 Amplificação por PCR

Foi realizada a amplificação por PCR utilizando-se iniciadores universais para o

gene que codifica o RNAr 16S (gene rrs) e iniciadores específicos para a detecção de

bactérias pertencentes ao grupo das BRS (gene aprA).

Em cada reação de amplificação por PCR para o gene rrs foram utilizadas albumina

de soro bovino (BSA) e formamida para melhorar a eficiência da amplificação do DNA

alvo (KREADER, 1996; CHAKRABARTI & SCHUTT, 2001). Todas as reações de PCR

incluiram controles positivos (DNA extraído das estirpes Bacillus licheniformis T6-5 ou

Desulfovibrio alaskensis NCIMB 13491) e negativos apropriados (sem DNA).

Para verificar a eficiência das reações de amplificação por PCR, os produtos de PCR

foram submetidos à eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,4% (p/v) a 70 V em

tampão TEB por aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente. Cada produto de PCR

foi aplicado no gel misturado com 1/3 do volume de solução corante de corrida para

eletroforese de DNA em gel de agarose. O “1 Kb Plus DNA Ladder” (Invitrogen Life

Technologies) foi utilizado como padrão de tamanho de DNA linear.

Após a corrida eletroforética, o gel foi corado com brometo de etídio (2 μg/ml) e os

fragmentos de DNA foram observados e fotografados sob luz UV em sistema de análise de

imagem IMAGO (B&L, Holanda). O aparecimento de apenas uma banda do tamanho

esperado no gel de agarose foi considerado uma reação bem sucedida.

Amplificação por PCR do gene que codifica o RNAr 16S

Os iniciadores selecionados para esta análise foram o U968f (5’ AAC GCG AAG

AAC CTT AC 3’) e o L1401r (5' GCG TGT GTA CAA GAC CC 3’) (HEUER &

SMALLA, 1997). O iniciador U968f é homólogo à região 968-984 do gene que codifica o

RNAr 16S de Escherichia coli, enquanto que o iniciador L1401r é homólogo à região

1385-1401 deste mesmo gene. As reações foram realizadas como descrito por HEUER &

SMALLA (1997). Cada reação foi realizada em um volume de 50 μl com uma mistura de:

50 mM de KCl, 2.5 mM de MgCl2, 2 mM de cada deoxinucleotídeo trifosfato (dNTP), 0,2

μM de cada iniciador, 5 μg de BSA e 1% de formamida (v/v), 2,5 U Taq polimerase e 2 μl

de DNA. O programa de PCR utilizado foi de um ciclo de desnaturação das fitas de DNA

por 2 minutos a 94ºC, seguidos de 35 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1,5 minutos a 48ºC e 1,5

minutos a 72ºC, e da extensão a 72°C por 10 min.



Amplificação por PCR para o gene da APS redutase

A fim de detectar apenas a comunidade de bactérias redutoras de sulfato (BRS)

presentes nos testemunhos de rocha foram utilizados os iniciadores para uma região

conservada do gene da subnidade α da enzima APS redutase. Os iniciadores utilizados

foram F2 (5’ CCA GGG CCT GTC CGC CAT CAA TAC 3’) e R2 (5’ CCG GGC CGT

AAC CGT CCT TGA A 3’) descritos por ZINKEVICH & BEECH (2000), que

correspondem às regiões 969-992 e 1603-1624, respectivamente, da subunidade alfa da

enzima adenosina-5´-fosfosulfato redutase (aprA) da espécie Desulfovibrio vulgaris,

levando à amplificação de um fragmento de 658 pb. As reações de PCR foram realizadas

também de acordo com ZINKEVICH & BEECH (2000), em tubos contendo 50 μl da

mistura composta de 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 2 mM de

cada dNTP, 0,4 μM de cada iniciador, 2,5 U da enzima Taq polimerase e 2 μl de DNA. O

ciclo aplicado foi: um ciclo de desnaturação das fitas de DNA por 2 minutos a 95°C,

seguidos de 35 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 62ºC e 1 minuto a 72ºC, e da extensão

a 72°C por 10 min.

5.1.4 Biblioteca de clones

Os fragmentos obtidos pela amplificação por PCR foram purificados com a

utilização do kit de purificação comercial “WizardTM Rapid PCR Purification System”

(Promega). Em seguida, os produtos de PCR (3 μl) do gene rrs parcial (433 nt) e do gene

aprA (658 nt) das diferentes amostras foram clonados no vetor pGEM T-easy, a 4ºC

durante uma noite, de acordo com as instruções do fabricante (Promega). Em seguida, as

células competentes de Escherichia coli JM109 foram transformadas através de

eletroporação (choque de 1,8 kV, 200 Ω, 25 μF), utilizando 70 μl de células competentes e

3 μl da ligação em uma cubeta com espaçamento de 0,1 cm. Após a transformação as

células foram mantidas em meio LB por 1,5 horas a 37 ºC sob agitação. Uma quantidade de

100 μl de cada cultura foi semeada em placas contendo meio LB com ampicilina 100

μg/ml, nas quais foram previamente espalhados sobre a superfície 100 μl da solução de

IPTG 0,1M e 20 μl da solução de X-gal 50 mg/ml. Em seguida, as placas foram incubadas a

37ºC por 24 horas. Após este período, as colônias brancas (contendo os insertos de rrs ou

aprA) de cada amostra foram repicadas em meio LB com ampicilina 100 μg/ml.

Para a confirmação da presença do inserto nos clones, foi feita uma reação de PCR



diretamente da colônia, utilizando os iniciadores M13f (5′ GTA AAA CGA CGG CCA G

3′) e M13r (5’ CAG GAA ACA GCT ATG AC 3’). Após a confirmação, os DNAs

plasmidiais dos transformantes foram extraídos com auxílio do kit comercial “Wizard Plus

SV miniprep DNA purification system” (Promega). Os DNAs plasmidiais purificados

foram então submetidos à reação de PCR para seqüenciamento, utilizando os iniciadores

M13f e M13r, em seqüenciador automático ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, USA).

5.1.5 Análise filogenética

Primeiramente foi feita uma análise de todas as seqüências obtidas (forward e

reverse) utilizando o programa BioEdit 7.0 (HALL, 1999), e as seqüências que continham

bases ambíguas não foram consideradas para as análises seguintes. Em seguida, as bases

correspondentes à seqüência do vetor de clonagem foram detectadas utilizando a

ferramenta VecScreen, encontrada no site NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html) e retiradas manualmente

usando-se o programa BioEdit. As seqüências selecionadas para este estudo foram então

comparadas com as presentes no banco de dados GenBank utilizando-se a ferramenta blastn

(Basic Local Alignment Search Tool) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (ALTSHUL

et al., 1990) para identificação das seqüências de rrs e aprA mais próximas. As seqüências

relacionadas foram obtidas no banco de dados GenBank e alinhadas com as seqüências do

presente trabalho usando o programa Clustal-X (THOMPSON et al., 1997). Árvores

filogenéticas foram construídas baseadas nas seqüências parciais de DNAr 16S, usando o

método Neighbor-Joining, e foi usado o programa MEGA 3.1 (KUMAR, TAMURA &

NEI, 2004) para calcular os valores de distância p entre duas seqüências. A análise de

bootstrap foi realizada com 1000 repetições e somente os valores maiores que 50% foram

indicados nas árvores. As seqüências foram testadas quanto a possibilidade de

representarem estruturas quiméricas usando o aplicativo CHECK_CHIMERA do sítio

(http://rdp8.cme.msu.edu/cgis/chimera.cgi?su=SSU) presente no website do projeto RDP

(Ribosomal Database Project). As possíveis seqüências quimeras foram excluídas deste

estudo. Após a identificação das seqüências foram calculados os índices: (1) de cobertura

(C) das bibliotecas como descrito por CHELIUS & TRIPLETT (2001), C = 1 – n1/N x 100,

onde n1/N é a freqüência de clones que aparecem somente uma vez (n1) e N é o número



total de clones; (2) de dominância de Berger-Parker (d), d = N/Nmax (TATON et al., 2003),

onde N é o número total de clones e Nmax é o número de clones relacionados ao gênero

dominante na biblioteca.



5.2 Segunda etapa: Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em

sistemas de água de injeção.

5.2.1 Amostragem de campo

Nesta etapa, três sistemas de tratamento de água de injeção foram estudados. Estes

sistemas de tratamento são localizados em plataformas na Bacia de Campos, Rio de

Janeiro. As coordenadas da localização geográfica de cada plataforma analisada são:

plataforma A - 22º25'36 de latitude sul e 40º01'47'' de longitude oeste, plataforma B -

22º26'12 de latitude sul e 40º25'33 de longitude oeste e plataforma C - 22º26'07 de latitude

sul e 40º04'10 de longitude oeste. Essas três plataformas começaram a produzir óleo com

injeção de água nos anos 1983, 1994 e 1999, respectivamente para as plataformas A, B e C.

A Figura 10 mostra uma representação esquemática de um sistema de tratamento de injeção

de água. A água do mar usada no sistema de injeção é submetida, continuamente, ao

biocida amônio quaternário (QAT) 50% a uma dosagem de 10 ppmv. O tratamento com

THPS foi utilizado em batelada duas vezes por semana, numa dosagem de 300 ppmv de

uma solução de THPS 75% (Figura 10A). Os três sistemas foram tratados de modo similar,

com a exceção de um poço da plataforma A que foi tratado separadamente com 100 ppmv

de nitrato (nitrato de sódio 40%).

A plataforma A foi amostrada a jusante de 4 pontos do sistema, enquanto que as

plataformas B e C foram amostradas também a jusante de três pontos cada. A Figura 10B

resume os pontos de amostragem. As amostras foram mantidas congeladas até análises

subseqüentes. As amostras foram nomeadas de acordo com o nome da plataforma e o

número do ponto de amostragem: A1, A2, A3, A4, B1, B2, B3, C1, C2 e C3 (Figura 10B).

5.2.2 Extração de DNA das amostras de água de injeção

As células bacterianas foram concentradas por filtração (membrana de acetato de

celulose de 0,22 μm de porosidade) de um litro de água de cada ponto de amostragem

(Figura 10B). O filtro (membrana de acetato de celulose) foi cortado assepticamente usando

uma lâmina esterilizada. O DNA total das células retidas nos filtros foi extraído através do

método de lise direta seguindo-se o protocolo do fabricante do kit comercial FastDNA®

SPIN Kit for Soil, Bio Systems, Q Bio gene, USA.



Figu

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: A1,

A2,

A3,

A4,

B1,

B2,

B3,

C1,

C2

e C

3.



Para verificar a qualidade do DNA obtido na extração, uma alíquota de cada

amostra foi submetida à eletroforese horizontal em gel de agarose a 0,8% (p/v) a 80 V em

tampão TEB por aproximadamente 2 horas à temperatura ambiente. As amostras foram

aplicadas no gel misturadas com 1/3 do volume da solução corante de corrida para

eletroforese de DNA em gel de agarose. Após a corrida eletroforética, o gel foi corado com

brometo de etídio (2 μg/ml) e o DNA foi observado e fotografado sob luz UV em sistema

de análise de imagem IMAGO (B&L, Holanda).

5.2.3 Amplificação por PCR

As metodologias usadas para amplificação por PCR do gene que codifica o RNAr

16S foram idênticas às utilizadas no item 5.1.3.

5.2.4 Biblioteca de clones

A metodologia usada foi idêntica à utilizada no item 5.1.4.

5.2.5 Análise filogenética

A metodologia usada foi idêntica à utilizada no item 5.1.5.

5.2.6 Análise estatística

A análise de componente principal (PCA) foi realizada para agrupar os gêneros

bacterianos de cada plataforma de acordo com o tratamento aplicado em cada sistema de

injeção de água. Os dados físicos e químicos dos tratamentos da água (variáveis

ambientais) e as abundâncias relativas dos gêneros bacterianos em cada local (variáveis

biológicas) foram usados na PCA, utilizando o programa Canoco for Windows 4,5

(Microcomputer Power, Ithaca, NY).

As relações entre a diversidade bacteriana dos diferentes pontos de amostragem e os

tratamentos aplicados foram avaliadas usando técnicas de ordenação. A análise de

correspondência distendida (DCA) indicou que os dados apresentam uma resposta linear.

Sendo assim, foi utilizado método de ordenação linear. Os dados físicos e químicos dos

tratamentos da água e o tempo de operação de cada plataforma (variáveis ambientais) e as

abundâncias relativas dos gêneros bacterianos em cada local (variáveis biológicas) foram

usados na análise de redundância (RDA), utilizando o programa Canoco for Windows 4,5

(Microcomputer Power, Ithaca, NY). O tempo de operação dos sistemas de injeção de água



de cada plataforma foi usado de forma semi-quantitativa (ranques). Esta técnica identifica a

variabilidade das amostras de acordo com os tratamentos. O teste de permutação de Monte

Carlo baseado em randomização de 199 permutações foi usado para testar a hipótese nula

de que os perfis das comunidades bacterianas não são relacionados com os tratamentos

aplicados no sistema de injeção.

Baseado no alinhamento das seqüências dos clones obtidos de cada amostra usando

o programa Clustal-X (THOMPSON et al., 1997), as matrizes de distância foram

construídas usando o programa DNAdist do PHYLIP v.3,6 (FELSENSTEIN, 2005). Estas

matrizes foram usadas como dados de entrada para o programa DOTUR (SCHLOSS,

LARGET, & HANDELSMAN, 2004) para agrupar as seqüências em OTUs definidas em

similaridade de 0,05. A partir destes grupos de OTUs foram calculados os índices de

diversidade bacteriana em cada amostra (Shannon - H´).



5.3 Terceira etapa: Ação antimicrobiana da substância produzida pela estirpe

de Bacillus isolada de reservatório de petróleo contra biofilmes formados por

bactérias redutoras de sulfato.

5.3.1 Estirpes Bacterianas

Foi utilizada uma estirpe pertencente ao gênero Bacillus, previamente isolada e

identificada por Sebastián (1999) a partir de amostras obtidas durante prospecção de

reservatório marítimo de petróleo em águas ultraprofundas brasileiras (2.500 m de

profundidade de subsuperfície). A estirpe Bacillus firmus H2O-1 foi obtida da água de

formação. A estirpe foi mantida em meio LB-ágar inclinado acrescido de 1% de carbonato

de cálcio, pH 7,2, 30°C.

O consórcio contendo BRS chamado de T6-lab (Sébastian, 1999) foi usado como

cultura indicadora da produção de SAM, produzida pela estirpe H2O-1. A T6-lab foi

crescida a 30ºC em anaerobiose por 3 dias em frascos de penicilina (10 ml) contendo meio

VMNI, preparado sob purga de N2 para conferir anaerobiose.

5.3.2 Preparação do sobrenadante 10 vezes concentrado

O inóculo (5 ml) da estirpe produtora crescida por 24 horas em caldo LB foi

adicionado em um erlenmeyer de 1 litro (contendo 500 ml de caldo LB) e incubado a 30º C,

sob agitação por 4 dias. Então, a cultura bacteriana foi centrifugada (10.000 x g, 20

minutos) e o sobrenadante foi cuidadosamente removido e filtrado usando uma membrana

de filtro Millipore (0,45 µm). Em seguida, o filtrado foi colocado em frascos de penicilina,

mantido a -20oC por 24 horas e, então, liofilizado e suspenso em um total de 50 ml de caldo

LB, concentrando-se o sobrenadante 10 vezes.

5.3.3 Sistema dinâmico de formação de biofilmes de bactérias redutoras de

sulfato (Biorreator anaeróbico)

O biofilme de BRS foi crescido sobre coupons (amostradores) de vidro borosilicato

(12,7 mm diâmetro e 1,5 mm espessura - BioSurface Technologies Corporation, Bozeman,

MT). Vinte e quatro coupons foram lavados em etanol 70% por 30 minutos, e lavados com



água destilada. Antes de autoclavar, os coupons foram encaixados no biorreator de fluxo

contínuo (BioSurface Technologies Corporation, Bozeman, MT). Este biorretator foi usado

para crescer o consórcio T6-lab, formando um biofilme anaeróbico. O meio VMNI

esterilizado (400 ml) foi introduzido no reator e purgado por 3 horas com nitrogênio

(filtrado em 0,2 μm) para alcançar um meio anaeróbico. Em seguida, uma cultura (até a

fase log, aproximadamente 107 células/ml) da T6-lab foi usada para inocular o biorreator. O

sistema foi incubado em batelada por 20 horas a 30ºC. Após este período, o sistema foi

incubado em fluxo contínuo por 4 dias. Durante esses 4 dias, o meio VMNI esterilizado foi

adicionado em uma velocidade de 1 ml/min. O sistema foi purgado com nitrogênio

esterilizado por filtragem, aplicando um fluxo de 200 ml/h ao longo de todo o período de

incubação do biorreator, ou seja, durante a fase em batelada e a fase contínua de incubação.

Ao terminar o período de incubação, o biorreator foi colocado dentro de uma câmara de

anaerobiose, e então, os coupons foram transferidos e mantidos, assepticamente, em uma

placa de 24 poços.

5.3.4 Demonstração da atividade da SAM H2O-1 sobre o biofilme de BRS

Dentro da câmara de anaerobiose, metade dos coupons foi tratada com a SAM H2O-

1 e a outra metade foi usada como controle. Todo os coupons foram incubados por 24 horas

a temperatura ambiente dentro da câmera de anaerobiose. Após este tempo de contato com

a SAM, esta foi removida dos poços utilizando uma pipeta estéril, e todos os coupons

foram lavados três vezes com PBS estéril e purgado com nitrogênio, para remover as

células não aderidas. Seis coupons tratados e seis coupons controle foram corados com o

corante BacLight LIVE/DEAD e foram observados utilizando microscopia confocal de

varredura a laser e analisados como descrito a seguir. Os biofilmes estabelecidos nos

coupons restantes (tratados e controles) foram raspados assepticamente com uma espátula

estéril. O material raspado foi suspenso em 10 ml de PBS esterilizado e purgado com

nitrogênio. O número de células foi determinado pela técnica do NMP (HAMILTON,

1985).



5.3.5 Processamento das amostras para microscopia confocal de varredura a

laser

Os 12 coupons separados para análise microscópica foram corados com kit

fluorescente LIVE/DEAD BacLight (L-7007) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) por

30 minutos, no escuro, dentro da câmera de anaerobiose. Em seguida, os coupons foram

lavados três vezes com água destilada previamente purgada com nitrogênio e esterilizada

por autoclavação. Os biofilmes corados foram observados no microscópio confocal de

varredura a laser (Leica DMRXE, Leica Microsystems. Wetzlar GmbH, Germany)

equipado com uma lente objetiva 63x de imersão em água. Dois canais de laser foram

usados para coletar as imagens, Argônio (488 nm) e Criptônio (561 nm).



5.4 Meios de cultura, Tampões e Soluções usados em experimentos das três

etapas

5.4.1 Meios de cultura

Sempre que necessário, os meios de cultura foram solidificados pela adição de ágar

na concentração de 1,2%.

Após o preparo, os meios foram autoclavados a 121ºC por 20 minutos e estocados a

temperatura ambiente. Está indicado quando outros procedimentos foram realizados.

LB (LURIA-BERTANI BROTH, SCHLEIF & WENSINK, 1981) Triptona 10 gExtrato de levedura 5 gNaCl 5 gÁgua destilada 1000 ml q.s.p.

pH 7,2

VMN I (ZINKEVICH & BEECH, 2000) KH2PO4 0,5 g

NH4Cl 1 g

Na2SO4 4,5 g

NaCl 25 gCaCl2.2H2O 0,04 g

MgSO4.7H2O 0,06 g

Lactato de Sódio 6 gCitrato de Sódio 0,3 gCasamoniácido 2 gTriptona 2 gÁcido tioglicólico 0,1 gFeSO4.7H2O 0,5 g

Solução de ácido ascórbico 10% 1 mlElixir mineral Wolfe modificado 1 mlÁgua destilada 1000 ml q.s.p. pH 7,5

Durante o preparo do meio, a mistura deve ser purgada com nitrogênio por 30 minutos (200 ml/h). Após autoclavação, adicionou-se 1 ml da solução de vitaminas.



5.4.2 Tampoões

Após o preparo, os tampões foram autoclavados a 121ºC por 20 minutos e estocados

a temperatura ambiente.

Tampão Winogradsky K2HPO4 0,25 gMgSO4 .7H2O 0,25 gNaCl 0,125 gFe2(SO4) .3H2O 2,5 mgMnSO4 .4H2O 2,5 mgÁgua destilada 1000 ml q.s.p.

PBS (Phosphate buffer saline)

NaCl 150 mM

Tampão Fosfato 20 mM,

pH 8

Tampão TEB Tris (tris-hidroximetil metil-amino-metano) 89 mMEDTA (etilenodiaminotetraacetato de cálcio e dissódico) 2,5 mM

H3BO3 89 mM

pH 7,8

Tampão TE Tris 10 mMEDTA 1 mM

pH 8



5.4.3 Soluções

Após o preparo, os tampões foram autoclavados a 121ºC por 20 minutos e estocados

a temperatura ambiente.

Elixir Mineral Wolfe Modificado C6H9NO6 1,5 g

MgSO4.7H2O 3 g

MnSO4.H2O 5 g

NaCl 1 gFeSO4.7H2O 0,1 g

CoSO4.7H2O 0,1 g

NiCl2.6H2O 0,1 g

CaCl2.2H2O 0,1 g

ZnSO4.7H2O 0,1 g

CuSO4.5H2O 0,01 g

AlKSO4 0,01 g

H3BO3 0,01 g

Na2MoO4.2H2O 0,01 g

Na2SeO3 0,001 gÁgua destilada 1000 ml q.s.p.

Solução de Vitaminas Ácido nicotínico 0,5 g

Vitamina B1 0,6 g

Vitamina B12 0,05 gVitamina B2 0,2 gVitamina B5 0,6 gVitamina B6 0,6 gVitamina H 0,01 gApós o preparo da solução de vitaminas, esta foi esterilizada por filtração (0,22 μM) e estocada

a 4oC.



Solução de IPTG 0,1M IPTG 1,2 gÁgua destilada 50 ml q.s.p.Após o preparo da solução, esta foi esterilizada por filtração (0,45 μm).

Solução de X-gal 50mg/ml 5-bromo-4-cloro-3- indolil-β-D-galactosídio 100 mgN,N´- dimetil formamida 2 mlApós o preparo da solução, esta foi esterilizada por filtração (0,45 μm). O tubo foi coberto com

papel alumínio e estocado a -20ºC.

Solução estoque de Ampicilina 10 mg/ml Ampicilina 500 mgÁgua bidestilada estéril 50 ml q.s.p.

Solução corante de corrida para eletroforese de DNA em gel de agarose Glicerol 50%EDTA, pH 7,5 20mMAzul de bromofenol 0,05%Xileno cianol 0,05%



6 RESULTADOS

6.1 Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em rocha de

subsuperfície localizada em reservatório petrolífero offshore de águas profundas.

Quatro amostras de testemunho foram obtidas de um reservatório de petróleo, em

uma profundidade compreendida entre 2.822 a 2.828 m abaixo do fundo do mar, e usadas

para extração de DNA. As amostras foram denominadas T2-1/9, T2-2/9, T2-7/9 e T2-8/9

(Tabela 1). A metodologia de extração de DNA utilizada neste trabalho foi adaptada devido

à presença de óleo nas amostras e de uma densidade baixa de células. Assim, a quantidade

de rocha usada foi aumentada para 30 g e as quatro repetições das lavagens com o tampão

Winogradsky foi também determinada para conferir maior concentração de biomassa

celular. Entretanto, como conseqüência deste aumento, não só a biomassa foi concentrada

mas também o óleo presente. Para a remoção deste contaminante, foi também necessária

uma etapa adicional no procedimento para purificação do extrato bruto de DNA usando

CsCl. Após a extração e purificação do DNA das amostras, o DNA não foi visualizado em

gel de agarose 0,8%, sugerindo que a concentração de DNA estava menor que 0,5 ng/μl.

Contudo, a quantidade e a qualidade de DNA obtido foram suficientes para a amplificação

por PCR. Foram observados produtos de PCR nas quatro amostras utilizando-se iniciadores

para o gene que codifica o RNAr 16S. Entretanto, quando foram usados os iniciadores para

o gene aprA somente uma amostra (T2-8/9) apresentou produto de PCR após a

amplificação por PCR.

Tabela 1: Número de clones das amostras de rocha. Os clones foram identificados em nível

de classe ou filo, baseados no gene rrs. (n) número total de clones.

Amostras de rocha T2-1/9 T2-2/9 T2-7/9 T2-8/9 Total (n)

Alphaproteobacteria 8 6 1 2 17

Betaproteobacteria 7 11 10 8 36

Gammaproteobacteria 1 1 2 1 5

Firmicutes 1 1 5 2 9

Actinobacteria - - - 1 1

Total 17 19 18 14 68

Índice de Cobertura (C) 88 89 94 86

Índice de Berger-Parker 2,1 1,7 1,8 1,75



A diversidade bacteriana das amostras de rocha de subsuperfície em águas

profundas foi estudada através da análise filogenética das seqüências obtidas por PCR

baseadas no gene que codifica o RNAr 16S. Para tal quatro bibliotecas de clones foram

construídas com os produtos de PCR obtidos da amplificação do DNA extraídos das

amostras T2-1/9, T2-2/9, T2-7/9 e T2-8/9. As bibliotecas baseadas no gene rrs foram

formadas por 14 a 19 clones, totalizando 68 seqüências (Tabela 1). Para verificar se o

número de clones de cada biblioteca estava realmente refletindo a diversidade das amostras,

foi calculado o índice de cobertura de acordo com CHELIUS & TRIPLETT (2001). As

quatro bibliotecas obtidas neste estudo cobriram de 86 a 94% da diversidade total (Tabela

1), considerando a identificação feita pelo blastn. O índice de dominância de Berger-Parker

(TATON et al., 2003) indicou que a diversidade das quatro amostras apresentam um grupo

dominante, sugerindo baixa diversidade das amostras (Tabela 1).

A distribuição filogenética destes clones foi bastante homogênea predominando o

filo Proteobacteria nas quatro amostras. A maioria dos clones identificados neste estudo foi

relacionada à classe Betaproteobacteria (36 clones, Tabela 1). Dezessete clones foram

identificados como pertencentes à Alphaproteobacteria. O filo Firmicutes também foi

encontrado em todas as amostras, porém foi mais abundante nas amostras T2-7/9 e T2-8/9.

O número total de clones associados à classe Alphaproteobacteria foi mais baixo nas

amostras T2-7/9 e T2-8/9 do que nas amostras T2-1/9 e T2-2/9. O filo Actinobacteria foi

detectado em baixo número em uma única amostra (T2-8/9; Tabela 1).

As árvores filogenéticas baseadas na distância entre as seqüências obtidas no

presente estudo, baseadas no gene rrs, foram construídas usando o método de Neighbor-

Joining. As seqüências deste gene mais próximas encontradas no banco de dados GenBank

foram analisadas juntamente às seqüências dos clones para comparação e avaliação da

proximidade entre as seqüências. As seqüências foram reunidas e comparadas de acordo

com sua classificação, assim quatro árvores foram construídas com os clones relacionados

aos diferentes grupos filogenéticos, Betaproteobacteria (Figura 11), Alphaproteobacteria

(Figura 12), Gammaproteobacteria (Figura 13) e Firmicutes (Figura 14). A árvore obtida

após análise filogenética dos clones (n = 36, Tabela 1) das quatro amostras de rocha

relacionados à classe Betaproteobacteria mostra que a maioria (23 clones) apresentou

maior similaridade com a família Comamonadaceae, sendo 15 clones relacionados a



organismos não cultivados e 8 clones a bactérias dos gêneros Pelomonas, Variovorax e

Delftia. A família Burkholderiaceae também pode ser observada nesta árvore, pois um

clone apresentou similaridade com gêneros pertencentes a esta família (ex. Leptothrix). Um

dos clones agrupou com seqüências do GenBank pertencentes à família Rhodocyclaceae.

Os clones restantes (n = 11) formaram um cluster separados dos demais clones. Este cluster

continha clones das diferentes amostras de rocha e não apresentou relação a organismos

previamente conhecidos.

A árvore da Figura 12 representa a comparação de todos os clones das quatro

amostras de rochas relacionados à classe Alphaproteobacteria (n = 17, Tabela 1). Os clones

(7 clones) relacionados a esta classe apresentaram similaridade à família

Bradyrhizobiaceae, sendo 5 clones mais próximos do gênero Bradyrhizobium e 2 clones

próximos aos gêneros Rhodopseudomonas e Afipia. A segunda família que predominou

nesta análise foi a Phylobacteriaceae, com quatro clones associados a seqüências

pertencentes a esta família. Em menor número, os clones relacionados à

Methylobacteriaceae (2 clones), Brucellaceae (1 clone) e Rhodobacteraceae (1 clone)

também estão dispostos na árvore da Figura 12. Dois clones relacionados à classe

Alphaproteobacteria, T2-2/9(23) e T2-8/9(4), não apresentaram similaridade a nenhum

organismo conhecido.

A árvore obtida através da análise das seqüências relacionadas à classe

Gammaproteobacteria está representada na Figura 13. Os clones relacionados a esta classe

representaram somente 7,3% (n = 5) de todas as seqüências estudadas. Pelo menos, um

clone desta classe foi encontrado nas bibliotecas de clones construídas de cada amostra de

rocha (Tabela 1). Três clones apresentaram similaridade a seqüências de organismos

previamente estudados, duas seqüências se alinharam com membros da família

Enterobacteriaceae e um clone foi relacionado à família Xanthomonadaceae. Os dois

clones restantes apresentaram similaridade a seqüências de organismos não cultivados da

classe Gammaproteobacteria de estudos anteriores provenientes do GenBank (Figura 13).

Os clones relacionados ao filo Firmicutes (n = 9, Tabela 1) foram comparados com

seqüências mais próximas deste filo provenientes do GenBank, a árvore filogenética da

Figura 14 mostra esta análise. A maioria dos clones (6 clones) foram relacionados a

seqüências pertencentes à família Bacillaceae. Os demais clones foram associados às



famílias Paenibacillaceae [1 clone, T2-8/9 (51)], Streptococcaceae [1 clone, T2-8/9(30)] e

Leuconostocaceae [1 clone, T2-7/9(58)]. O grupo Actinobacteria foi encontrado somente

em uma amostra (T2-8/9) e esta única seqüência foi relacionada ao gênero Arthrobacter,

que é constituído por bactérias Gram-positivas com alto conteúdo de GC.

Neste estudo também foi analisada a comunidade de bactérias redutoras de sulfato

presente nas amostras de rocha e com este intuito a análise foi feita utilizando iniciadores

para o gene aprA. Entretanto, a amplificação com estes iniciadores apresentou resultado

positivo somente na amostra T2-8/9, resultando em um produto de PCR do tamanho

esperado. A distribuição de clones baseado no gene aprA mostrou-se baixa, todos os clones

(n = 19, Tabela 2) foram relacionados à classe Gammaproteobacteria, especificamente ao

gênero Desulfovibrio: D. profundus (1 clone), D. indonesiensis (2 clones) e D.

desulfuricans (16 clones). Devido ao baixo número de clones obtidos no estudo, todos os

clones foram considerados nesta análise, independente da porcentagem de similaridade com

as seqüências do GenBank. Tabela 2: Identificação das seqüências do gene aprA obtidas do testemunho T2-8/9, utilizando a

ferramenta blastn (seqüência mais próxima de uma bactéria cultivada).

Clones Identificação da seqüência % identidadeaps8 Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 98%aps87 Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 97%aps25 Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 97%aps32 Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 97%aps36 Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 97%aps37 Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 98%aps40 Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 96%aps53 Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 83%aps69 Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 98%aps72 Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 97%aps73 Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 97%aps74 Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 98%aps76 Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 97%aps80 Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 98%aps82 Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 94%aps84 Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 98%aps10 Desulfovibrio indonensis AJ271651.1 (NCIMB 13468) 93%aps18 Desulfovibrio indonensis AJ271651.1 (NCIMB 13468) 93%aps59 Desulfovibrio profundus EF442886.1 (DSM 11384) 85%



Figura 11.

Rubrivivax gelatinosus (AB250625)Burkholderia cepacia (AF244133)Ideonella sp. (DQ436455)

Leptothrix discophora (L33975)T2-8/9 (12)

Mitsuaria chitosanitabida (AB024307)Roseateles sp. (AB013424)

Roseateles depolymerans (AB003626)T2-2/9 (69)

T2-7/9 (6) T2-7/9 (64) T2-1/9 (52) *T2-2/9 (74) T2-2/9 (49)

T2-7/9 (15) T2-7/9 (36)

T2-2/9 (53) Uncultured Comamonadaceae (DQ028393)

T2-8/9 (25) T2-2/9 (26)

T2-1/9 (64) *T2-2/9 (7)

Uncultured betaproteobacteria (AF445700)T2-8/9 (50)

T2-7/9 (5) T2-7/9 (10)

Pelomonas sp. (DQ291149)T2-8/9 (22)

Pelomonas saccharophila (AF368755)Variovorax paradoxus (AY169418)

T2-2/9 (27) Betaproteobacteria (AY612302)

Rubrivivax-like (X89910)T2-8/9 (33)

T2-8/9 (5) Variovorax sp. (DQ205307)T2-1/9 (48) *T2-2/9 (4) Variovorax paradoxus (AF532868)

Uncultured betaproteobacteria (AY133088)T2-7/9 (8) Delftia tsuruhatensis (AY738262)Delftia acidovorans (AB231159)Comamonas sp. (AJ002803)

Zoogloea oryzae (AB201043)Azoarcus sp. (AF011351)T2-8/9 (48)

Dechlorosoma sp. (AY126453)Uncultured betaproteobacteria (AY133096)

Thiobacillus sp. (AJ289884)T2-2/9 (66) Uncultured betaproteobacteria (AF324205)

T2-2/9 (64) Azohydromonas lata (AB201626)

T2-8/9 (2) Uncultured betaproteobacteria (AB128892)T2-7/9 (1) T2-1/9 (38) *T2-7/9 (63) T2-1/9 (42) *T2-1/9 (36) *

T2-2/9 (29) T2-7/9 (35) T2-1/9 (43) *Uncultured Aquabacterium (AF523004)

58

75

63

100

53

100

100

95

100

96

67

74

58

93

81

82

65

0.05

Comamonadaceae

Rhodocyclaceae

Burkholderiaceae

Hydrogenophilaceae

Alcaligenaceae





T2-7/9 (6) T2-7/9 (64) T2-1/9 (52) *T2-2/9 (74) T2-2/9 (49)

T2-7/9 (15) T2-7/9 (36)


T2-8/9 (25) T2-2/9 (26)

T2-1/9 (64) *T2-2/9 (7)


T2-7/9 (5) T2-7/9 (10)













58

75

63

100

53

100

100

95

100

96

67

74

58

93

81

82

65

0.05





T2-7/9 (6) T2-7/9 (64) T2-1/9 (52) *T2-2/9 (74) T2-2/9 (49)

T2-7/9 (15) T2-7/9 (36)


T2-8/9 (25) T2-2/9 (26)

T2-1/9 (64) *T2-2/9 (7)


T2-7/9 (5) T2-7/9 (10)













58

75

63

100

53

100

100

95

100

96

67

74

58

93

81

82

65

0.05

Comamonadaceae

Rhodocyclaceae

Burkholderiaceae

Hydrogenophilaceae

Alcaligenaceae



Figura 12.

Bradyrhizobium sp. (AF509902)

T2-2/9 (6)

uncultured α-proteobacterium (AB231998)

T2-2/9 (65)

T2-1/9 (41) *

T2-2/9 (1)

T2-1/9 (34) *

Rhodopseudomonas sp. (AB250617)

Rhodopseudomonas faecalis (AF123085)

Afipia sp. (U87769)

Afipia broomeae (AY513505)


T2-1/9 (47) *

T2-1/9 (50) *

T2-2/9 (23)

α-proteobacterium from soil (AB245344)

Bacterium ellin (AY234449)

T2-8/9 (4)

T2-2/9 (50)

T2-2/9 (8)

Methylobacterium sp. (Z23156)

Uncultured α-proteobacterium (AB192061)

T2-8/9 (10)

Ochrobactrum sp. (AJ550273)

α-proteobacterium from sea (AY770702)

Phyllobacterium myrsinacearum (AY512821)

Phyllobacterium trifolii (AY786080)

T2-1/9 (10) *

Uncultured Rhizobium (AY599700)

Defluvibacter lusatiae (AJ132378)

Aquamicrobium defluvium (Y15403)

Gram negative α-proteobacterium (AF323261)

T2-1/9 (59) *

T2-1/9 (57) *

T2-1/9 (58) *

Paracoccus sp.(DQ347522)

Rhodobacter sphaeroides (DQ001153)

T2-7/9 (8) 100

99100

69

100

100

88

68

58

89

99

6870

80

99

99

52

98

75

100

95

68

87

69

71

99

99

0.02

Bradyrhizobiaceae

Methylobacteriaceae

Brucellaceae

Phyllobacteriaceae

Rhodobacteraceae

Bradyrhizobium sp. (AF509902)

T2-2/9 (6)

uncultured α-proteobacterium (AB231998)

T2-2/9 (65)

T2-1/9 (41) *

T2-2/9 (1)

T2-1/9 (34) *


Rhodopseudomonas faecalis (AF123085)

Afipia sp. (U87769)

Afipia broomeae (AY513505)


T2-1/9 (47) *

T2-1/9 (50) *

T2-2/9 (23)

α-proteobacterium from soil (AB245344)

Bacterium ellin (AY234449)

T2-8/9 (4)

T2-2/9 (50)

T2-2/9 (8)

Methylobacterium sp. (Z23156)

Uncultured α-proteobacterium (AB192061)

T2-8/9 (10)

Ochrobactrum sp. (AJ550273)

α-proteobacterium from sea (AY770702)

Phyllobacterium myrsinacearum (AY512821)

Phyllobacterium trifolii (AY786080)

T2-1/9 (10) *

Uncultured Rhizobium (AY599700)

Defluvibacter lusatiae (AJ132378)

Aquamicrobium defluvium (Y15403)

Gram negative α-proteobacterium (AF323261)

T2-1/9 (59) *

T2-1/9 (57) *

T2-1/9 (58) *

Paracoccus sp.(DQ347522)

Rhodobacter sphaeroides (DQ001153)

T2-7/9 (8) 100

99100

69

100

100

88

68

58

89

99

6870

80

99

99

52

98

75

100

95

68

87

69

71

99

99

0.02

Bradyrhizobiaceae

Methylobacteriaceae

Brucellaceae

Phyllobacteriaceae

Rhodobacteraceae



Figura 11: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones e

de seqüências de Betaproteobacteria provenientes do GenBank. A árvore foi construída baseada no

método neighbor-joining. As análises de bootstrap foram realizadas com 1000 repetições e somente são

mostrados os valores maiores que 50%. As seqüências dos clones de DNAr 16S foram marcadas com

diferentes símbolos de acordo com as amostras de rocha: T2-1/9 (*); T2-2/9 ( ); T2-7/9 ( ); T2-8/9

( ). Os códigos entre parênteses após o nome da amostra representam o número referência do clone.

Os números de acesso do GenBank de cada espécie está também entre parênteses. A barra de escala

representa a porcentagem de divergência de nucleotídeos.

Figura 12: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones e

de seqüências de Alphaproteobacteria provenientes do GenBank. A árvore foi construída baseada no

método neighbor-joining. As análises de bootstrap foram realizadas com 1000 repetições e somente são

mostrados os valores maiores que 50%. As seqüências dos clones de DNAr 16S foram marcadas com

diferentes símbolos de acordo com as amostras de rocha: T2-1/9 (*); T2-2/9 ( ); T2-7/9 ( ); T2-8/9

( ). Os códigos entre parênteses após o nome da amostra representam o número referência do clone.

Os números de acesso do GenBank de cada espécie está também entre parênteses. A barra de escala

representa a porcentagem de divergência de nucleotídeos.



Xanthomonas retroflexus (AY841369)

T2-1/9 (74) *

Uncultured γ--proteobacterium (AY587207)

Stenotrophomonas maltophilia (AY841799)

Dokdonella fugitiva (AJ969432)

Dokdonella ginsengisoli (AB245362)

Uncultured Rhodanobacter sp. (DQ366107)

Uncultured proteobacterium (DQ004805)

T2-2/9 (36)

Pseudomonas sp. (DQ337559)


Uncultured soil bacterium (DQ297982)

T2-8/9 (41)


T2-7/9 (66)

Escherichia albertii (AY696669)

Shigella boydii (AY696668)

Shigella flexneri (AE005674)

T2-7/9 (68)

72

100

59

97

100

98

56

46

9664

100

53

0.02

Xanthomonadaceae

Pseudomonadaceae

Enterobacteriaceae


T2-1/9 (74) *







T2-2/9 (36)




T2-8/9 (41)


T2-7/9 (66)




T2-7/9 (68)

72

100

59

97

100

98

56

46

9664

100

53

0.02


T2-1/9 (74) *







T2-2/9 (36)




T2-8/9 (41)


T2-7/9 (66)




T2-7/9 (68)

72

100

59

97

100

98

56

46

9664

100

53

0.02

Xanthomonadaceae

Pseudomonadaceae

Enterobacteriaceae

Figura 13: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones e de

seqüências de Gammaproteobacteria provenientes do GenBank. A árvore foi construída baseada no método

neighbor-joining. As análises de bootstrap foram realizadas com 1000 repetições e somente são mostrados os

valores maiores que 50%. As seqüências dos clones de DNAr 16S foram marcadas com diferentes símbolos de

acordo com as amostras de rocha: T2-1/9 (*); T2-2/9 ( ); T2-7/9 ( ); T2-8/9 ( ). Os códigos entre parênteses

após o nome da amostra representam o número referência do clone. Os números de acesso do GenBank de

cada espécie está também entre parênteses. A barra de escala representa a porcentagem de divergência de

nucleotídeos.



Bacillus anthracis (AY643481)

Bacillus cereus (AB244530)

Bacillus subtilis (AB218804)

T2-7/9 (3)

Bacillus circulans (AY724690)

T2-2/9 (68)

Uncultured Gram-positive (DQ084324)

Uncultured Bacillus sp. (AY289526)

Halobacillus trueperi (AJ310149)

T2-7/9 (69)

Halobacillus sp. (AY553078)

Halobacillus blutaparonensis (DQ058358)

T2-7/9 (38)

T2-7/9 (44)

Oceanobacillusprofundus (DQ386635)

Oceanobacillus iheyensis (BA000028)

T2-1/9 (51) *

Brevibacillus formosus (AF378234)

Brevibacillus brevis (AY591911)

T2-8/9 (51)

Brevibacillus agri (AY319301)

T2-8/9 (30)

Streptococcus mitis (AY281077)

Streptococcus pneumoniae (AY485600)

Uncultured bacterium (AY307989)

Streptococcus oralis (AY281080)

T2-7/9 (58)

Leuconostoc mesenteroides (AY675249)

Leuconostoc cremoris (M23034)

Leuconostoc pseudomesenteroides (AB023237)88

100

100

64

69

100

72

88

99

6187

98

9799

78

98

53

100

67

0.01

Bacillaceae

Paenibacillaceae

Streptococcaceae

Leuconostocaceae




T2-7/9 (3)


T2-2/9 (68)




T2-7/9 (69)



T2-7/9 (38)

T2-7/9 (44)



T2-1/9 (51) *



T2-8/9 (51)


T2-8/9 (30)





T2-7/9 (58)




100

100

64

69

100

72

88

99

6187

98

9799

78

98

53

100

67

0.01




T2-7/9 (3)


T2-2/9 (68)




T2-7/9 (69)



T2-7/9 (38)

T2-7/9 (44)



T2-1/9 (51) *



T2-8/9 (51)


T2-8/9 (30)





T2-7/9 (58)




100

100

64

69

100

72

88

99

6187

98

9799

78

98

53

100

67

0.01

Bacillaceae

Paenibacillaceae

Streptococcaceae

Leuconostocaceae

Figura 14: Árvore Filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S

de clones e de seqüências de Firmicutes provenientes do GenBank. A árvore foi construída

baseada no método neighbor-joining. As análises de bootstrap foram realizadas com 1000

repetições e somente os valores maiores que 50% são mostrdos. As seqüências dos clones de

DNAr 16S foram marcadas com diferentes símbolos de acordo com as amostras de rocha: T2-

1/9 (*); T2-2/9 ( ); T2-7/9 ( ); T2-8/9 ( ). Os códigos entre parentesis após o nome da

amostra representam o número referência do clone. Os números de acesso do GenBank de

cada espécie está também entre parênteses. A barra de escala representa a porcentagem de

divergência de nucleotídeos.



6.2 Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em sistemas de água de

injeção.

Neste trabalho foi estudado um total de 10 amostras de água de injeção de diferentes

pontos do sistema de tratamento de água localizados em três plataformas da Petrobras, as

amostras das plataformas (A, B e C) da Bacia de Campos foram designadas como A1, A2,

A3, A4, B1, B2, B3, C1, C2 e C3. As características de cada uma destas amostras estão

resumidas na Figura 10B. As amostras foram submetidas à extração de DNA e o DNA das

comunidades bacterianas presentes foi extraído com sucesso. A amplificação de um

fragmento de 433 pb do gene que codifica o RNAr 16S a partir dos extratos brutos de DNA

de cada amostra também foi realizada com eficiência. A diversidade bacteriana das

amostras de água de injeção foi estudada através da análise filogenética das seqüências

obtidas por PCR baseadas no gene que codifica o RNAr 16S. Três bibliotecas de clones

foram construídas com os produtos de PCR obtidos da amplificação do DNA extraídos das

amostras provenientes das plataformas A, B e C. O número de clones obtidos das

bibliotecas das plataformas A e B foram 213 e 260, respectivamente. Entretanto os números

de clones utilizados neste estudo estão listados nas Tabelas 3 e 4, respectivamente. Para

verificar se o número de clones de cada biblioteca estava realmente refletindo a diversidade

das amostras, foi calculado o índice de cobertura de acordo com CHELIUS & TRIPLETT

(2001). As bibliotecas obtidas nesta etapa cobriram de 90 a 99% da diversidade total

(Tabelas 3 e 4), considerando a identificação feita pelo blastn. O índice de dominância de

Berger-Parker (TATON et al., 2003) variou entre as amostras, sendo os maiores valores

encontrados nas amostras da Plataforma B (Tabela 3 e 4).

O número de organismos identificados em nível de gênero em cada amostra,

utilizando a ferramenta BLAST, foi computado como abundância relativa, de acordo com a

seqüência mais próxima encontrada no GenBank (Figura 15). Para esta análise, foram

consideradas somente as seqüências com similaridade maior ou igual a 98%. A distribuição

filogenética dos clones baseada no fragmento de rDNA 16S foi bastante homogênea dentro

de cada plataforma. O filo Proteobacteria predominou em todas as amostras. A classe

Gammaproteobacteria foi o grupo dominante encontrado nas plataformas A e B. De todos

os clones obtidos das diferentes amostras da plataforma A, 47,5 % eram relacionados ao

gênero Marinobacter (87 clones). Dos clones obtidos dos pontos de amostragem da



Tabela 3: Número de clones das amostras do sistema de tratamento de água de injeção da Plataforma

A. Os clones foram identificados em nível de gênero, baseados no gene rrs. (n) número total de clones. Amostras de água Plataforma A A1 A2 A3 A4 Total/gêneroMarinobacter 14 39 4 30 87 Vibrio - 3 - - 3 Micavibrio - 3 - - 3 Alteromonas 3 6 - - 9 Sphingopyxis - 3 - - 3 Kopriimonas - 6 - - 6 Tistrella 3 - - - 3 Desulforegula - - 3 - 3 Não cultivado 6 39 6 15 66 Total (n) 26 99 13 45 183 Índice de Shannon (H) 1,039 2,187 0,636 1,357 Índice de Berger-Parker (d) 1,85 2,53 - 1,5 ÍndÍce de Cobertura (C) 93 99 90 93

Tabela 4: Número de clones das amostras do sistema de tratamento de água de injeção da Plataforma

B. Os clones foram identificados em nível de gênero, baseados no gene rrs. (n) número total de clones.

Amostras de água Plataforma B B1 B2 B3 Total/gênero Neptumonas 9 15 0 24 Achromobacter 15 12 27 54 Colwellia 24 78 2 104 Burkholderia 3 3 12 18 Synechococcus 6 - - 6 Thiomicrospira - 3 - 3 Oceanospirillum - 2 - 2 Não cultivado 6 39 - 45 Total (n) 63 152 41 256

Índice de Shannon (H) 2,397 3,098 1,675 Índice de Berger-Parker (d) 2,63 1,95 1,52 Índice de Cobertura (C) 98 98 97



plataforma B, dois principais gêneros predominaram Colwellia (40,6%, 104 clones) e

Achromobacter (21,1%, 54 clones). Um grande grupo de seqüências bacterianas foi

associado a organismos não cultivados em ambas as plataformas A (35%) e B (14%)

(Figura 15). Na plataforma C (60 clones totais), 100% dos clones analisados foram

relacionados a organismos não cultivados quando considerado somente o primeiro hit do

blastn. Na tentativa de comparar os clones obtidos na plataforma C com organismos já

cultivados, foi observado e analisado também o primeiro hit do blastn de uma seqüência de

organismo cultivado. Esta segunda análise dos clones oriundos da plataforma C mostrou

que 21% estariam relacionados à classe Alphaproteobacteria, enquanto 79% dos clones

continuaram não identificados (Figura 15).

Todas as seqüências de clones associadas a bactérias não cultivadas encontradas nas

três plataformas foram submetidas à análise filogenética. As árvores filogenéticas baseadas

na distância entre as seqüências relacionadas a organismos não cultivados, baseadas no

gene rrs, foram construídas usando o método de Neighbor-Joining. As árvores filogenéticas

foram construídas individualmente por plataforma (Figuras 16, 17 e 18). Em cada uma das

três árvores foram formados dois grupos principais. Em um dos grupos, os clones foram

relacionados a seqüências do GenBank de clones também não identificados de outros

estudos provenientes de ambientes marinhos. O segundo grupo divergiu de todos os grupos

previamente descritos (Figuras 16, 17 e 18, em destaque nos quadrados de cor azul). Foram

reunidos os clones do segundo grupo de cada plataforma e comparados entre eles. A árvore

filogenética (Figura 19) obtida da comparação deste clones do segundo grupo mostrou que

os clones formaram um grande cluster. Todas as seqüências dos clones reunidos do

segundo grupo, independente da plataforma de origem, foram relacionadas entre elas, como

mostra a Figura 19. Desta forma, este grupo parece ser amplamente distribuído, já que foi

encontrado nas três plataformas estudadas.



Figu

ra 1

5: A

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ficos

.



Para verificar como as amostras de água de injeção de cada plataforma se

relacionaram, ou seja, o quanto estas eram semelhantes segundo as variáveis ambientais

utilizadas neste trabalho, e assim mostrar se a diversidade bacteriana de cada ponto de

amostragem nas plataformas variou de acordo com o tratamento aplicado, foi feita a análise

de RDA utilizando o programa Canoco. As variáveis ambientais escolhidas neste trabalho

foram os tratamentos físicos e químicos e o tempo de operação das plataformas. Somente as

seqüências de clones que apresentaram similaridade a organismos cultivados foram

consideradas nesta análise como variável biológica. Para complementar esta análise

estatística, foi realizado outro teste estatístico com base na distribuição das seqüências

obtidas para inferir o índice de diversidade Shannon. O gráfico de ordenação (Figura 20 a)

mostra que o vetor que mais influenciou a distribuição da diversidade das bactérias das

amostras de água foi o vetor de explicação do tempo de operação do sistema de injeção (P

= 0,02). Desta forma, dentre as variáveis ambientais analisadas neste estudo, o principal

fator para determinar a diversidade da comunidade bacteriana das amostras A2, A4, B1, B2

e B3 foi o tempo de operação de cada plataforma. As amostras influenciadas pelo tempo de

operação mostraram-se diversas, apresentando índices de diversidade Shannon variados:

A2 (H´= 2.187), A4 (H´= 1.367), B1 (H´= 2.387), B2 (H´= 3.098) e B3 (H´= 1.675)

(Tabelas 3 e 4). Estes valores do índice de diversidade Shannon estão indicados na Figura

20 a. O ponto A3 foi influenciado pelo THPS, levando a uma comunidade bacteriana

menos diversa devido ao efeito biocida sobre a sobrevivência bacteriana (H’= 0.636). O

ponto A1 não foi influenciado por nenhum fator estudado. Os vetores que explicam os

tratamentos cloração, desaeração e adição de QAT determinaram pouca influência sobre a

diversidade bacteriana total das amostras de água (Figura 20 a). Na disposição dos dados

das amostras de água é possível observar que a primeira componente principal (PC1)

explica 53,2% da variância total dos dados, onde observa-se a separação entre as amostras

da plataforma A e as amostras da plataforma B. Os pontos da plataforma C não foram

incluídos nesta análise, pois todas as seqüências desta biblioteca eram relacionadas a não

cultivados (considerando 98% de similaridade). No entanto, os índices de diversidade

Shannon foram calculados para cada ponto: C2 (H’= 1.971), C1 (H’=1.298) e C3 (H’=

0.978).



A dominância dos principais grupos obtidos em cada amostra foi também

representada de forma gráfica. Para tal, a análise de PCA foi realizada para ordenar os

gêneros bacterianos dominantes (presença e ausência; abundância relativa) de acordo com

os tratamentos aplicados em cada amostra (Figura 20, b e c). Os grupos predominantes na

plataforma A (Marinobacter) e na plataforma B (Colwellia) foram observados em todos os

pontos estudados nas respectivas plataformas, ou seja, o gênero Marinobacter foi

encontrado nos pontos A1, A2, A3 e A4. Do mesmo modo, o gênero Colwellia foi

observado nos pontos B1, B2 e B3. Os gráficos de ordenação na Figura 20 (b e c) mostram

que os vetores que representam estes dois gêneros tendem a inclinar perto do eixo da

componente principal (PC1). Desta forma, não foi possível correlacionar estes gêneros a

nenhum dos tratamentos utilizados. Na disposição dos gêneros bacterianos na PCA da

Figura 20 b é possível observar que a primeira componente principal (PC1) explica 57,4%

da variância total dos dados, observa-se que existe a separação de dois grupos (Figura 20

b). Em um dos grupos, os clones associados aos gêneros Sphingopyxis, Kopriimonas,

Micavibrio, Vibrio e Alteromonas foram agrupados pelos tratamentos com QATS, cloro e

pela desaeração, separando o gênero Marinobacter que foi mais influenciado pelo

tratamento com nitrato. Enquanto o gênero Desulforegula foi encontrado somente na

amostra tratada com THPS (Figura 20 b), que é um gênero que pertence ao grupo de BRS

da classe Gammaproteobacteria. Os clones relacionados ao gênero Tistrella também não

puderam ser relacionados aos tratamentos, já que foram detectados na amostra de água não

tratada. Na plataforma B (Figura 20 c), os clones relacionados com Achromobacter e

Burkholderia foram agrupados devido à influência da desaeraçcão. Nenhuma outra relação

positiva foi observada neste gráfico de ordenação, pois os vetores que explicam os dados

biológicos estão inclinados em posição oposta aos vetores de dados físico-químicos

(tratamentos). Também nesta análise, os pontos da plataforma C não foram incluídos.



Figura 16: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones

procedentes da plataforma A e de seqüências provenientes do GenBank. A árvore foi construída

baseada no método neighbor-joining. As seqüências dos clones de DNAr 16S estão identificadas pelo

nome designado da amostra juntamente ao número de referência do clone. A barra de escala

representa a porcentagem de divergência de nucleotídeos. O quadrado em cor azul destaca o grupo de

clones que divergiu de grupos previamente descritos.



Figura 17: Árvore filogenética baseada na

comparação de seqüências do RNAr 16S de clones

procedentes da plataforma B e de seqüências provenientes

do GenBank. A árvore foi construída baseada no método

neighbor-joining. As seqüências dos clones de DNAr 16S

estão identificadas pelo nome designado da amostra

juntamente ao número de referência do clone. A barra de

escala representa a porcentagem de divergência de

nucleotídeos. O quadrado em cor azul destaca o grupo de





procedentes da plataforma C e de seqüências provenientes do GenBank. A árvore foi construída

baseada no método neighbor-joining. As seqüências dos clones de DNAr 16S estão identificadas pelo

nome designado da amostra juntamente ao número de referência do clone. A barra de escala

representa a porcentagem de divergência de nucleotídeos. O quadrado em cor azul destaca o grupo de





procedentes das três plataformas, não relacionados a organismos previamente descritos, e de

seqüências provenientes do GenBank. A árvore foi construída baseada no método neighbor-joining. As

seqüências dos clones de DNAr 16S estão identificadas pelo nome designado da amostra juntamente ao

número de referência do clone. A barra de escala representa a porcentagem de divergência de

nucleotídeos.

B2G02 B2G11

B1B01 A2B07 A2D03 B2G12 B2G06

B2E10 B2D09 B2E08

B2G05 B1B02 B2E03 B1A05

B2F08 B1A02

B2C12 C2D02

B2F09 B2H02

C2D04 A2E09 B1A11

B2H26 C2D07

C2D08 A2C07 A2D01

B2G08 A1E05

B2H30 B2H25 C3E04 B1A04 B2A02 C3E05 A2D05

B2D07 C2D09 A1E03 C2D11 A2C11 C2D01

B2B08 C1C06 A1E04 C1C02 C2D03 C2D05 C2D06

Uncult marine Gammaproteobacteria Colwellia psychroerythraea100

99

82

83

98

7653

56

97

70

73

75

98

58

90

97

57

9252

90

0.2



Figura 20: Gráfico de ordenação das comunidades bacterianas das plataformas A e B. (a)

Gráfico RDA mostrando a relação entre a diversidade bacteriana em cada ponto de amostragem e os

tratamentos da água de injeção (P = 0,02). Os índices de diversidade (em nível de gênero) foram

estimados para cada ponto (indicados entre parênteses abaixo das abreviações das amostras. (b e c),

Gráfico PCA mostrando a relação entre os principais gêneros bacterianos das plataformas A (b) e B (c)

e os tratamentos de água utilizados nos sistemas de injeção. O número de clones de cada gênero está

indicado entre parênteses.



6.3 Ação antimicrobiana da substância produzida pela estirpe de Bacillus

isolada de reservatório de petróleo contra biofilmes formados por bactérias redutoras

de sulfato.

Em estudo previamente realizado, foi observado que o consórcio T6-lab, cultura

mista de BRS proveniente de reservatório de petróleo, foi sensível ao contato com a SAM

produzida pela estirpe de Bacillus firmus H2O-1 (KORENBLUM et al., 2005). Foi

observado sob condições de anaerobiose que SAM H2O-1 inibiu o crescimento da T6-lab

em placa. Portanto, foi avaliado se este mesmo consórcio de BRS crescendo em biofilme

seria também sensível à SAM H2O. A capacidade de adesão das células do consórcio T6-

lab sobre coupons de vidro borosilicato foi testada em sistema contínuo, em um biorreator

CDC (BioSurface). Após 5 dias de incubação total em condições de anaerobiose (sob purga

de nitrogênio), foi observada a formação de biofilmes aderidos sobre os coupons de vidro.

A análise dos biofilmes formados foi feita através de microscopia confocal a laser, e as

imagens de microscopia confocal dos biofilmes formados e corados com LIVE/DEAD

BacLight (Figura 21 a) mostraram que a máxima espessura do biofilme de BRS alcançou

240 μm a partir do substrato de adesão (vidro de borosilicato). Avaliando o biofilme da T6-

lab ao longo de sua profundidade, foi detectada uma maior intensidade de fluorescência na

profundidade do biofilme de 100 μm. Esta observação indica que nesta profundidade havia

maior densidade de células que no restante do biofilme, ou seja, as células se concentraram

no interior do biofilme. Já na base do biofilme, próximo ao substrato de adesão (o vidro) as

células formaram uma camada com células dispersas. O biofilme em estudo foi corado,

como já descrito, com LIVE/DEAD BacLight. Este kit de fluoróforos é constituído por dois

corantes o SYTO 9 (verde) que indica a viabilidade celular e o iodeto de propídeo

(vermelho) que indica inviabilidade celular, corando somente as células mortas. O biofilme

da T6-lab cobriu a superfície do vidro homogeneamente, contendo principalmente células

vivas (células coradas somente em verde, SYTO 9). No entanto, poucas células vermelhas

também foram observadas formando grupos espalhados. A máxima intensidade de

fluorescência dos grupos de células vermelhas (400 pixels) chegou à terça parte da

intensidade da fluorescência verde (1200 pixels). A técnica do NMP mostrou que a

concentração de células removidas por raspagem dos coupons chegou a 2,4x107

células/mm2.



A partir do mesmo biorreator usado no estudo da formação de biofilme pelo

consórcio de BRS T6-lab, os coupons utilizados como substrato de adesão foram tratados

com a SAM H2O-1. Os biofilmes tratados foram incubados por 24 horas na presença da

substância antimicrobiana. Através da análise de microscopia confocal a laser, foi

observado que o biofilme pré-estabelecido de BRS foi drasticamente reduzido quando

tratado com a SAM H2O-1. A Figura 21 b mostra que a intensidade total de células vivas e

mortas, verdes e vermelhas, apresentou uma redução de 94% da fluorescência comparada

ao biofilme não tratado (Figura 20 a), indicando que o número total de células e a

viabilidade celular reduziram significativamente. No biofilme tratado com a SAM, tanto as

células coradas em verde quanto aquelas coradas em vermelho formavam grumos de

células (micrografia em destaque na Figura 21 b). Apesar da redução da intensidade de

fluorescência ter sido extremamente alta, a espessura do biofilme não foi reduzida (200

μm), indicando a persistência da matriz polissacarídica sobre o coupon de vidro. A

contagem total de células usando NMP indicou uma redução de 1 log somente (NMP do

biofilme tratado ≅ 2x106 células/mm2).



Figura 21: Análise do biofilme de T6-lab por microscopia confocal a laser. Os gráficos

mostram a intensidade de fluorescência das células contidas no biofilme de BRS coradas com o kit

LIVE/DEAD BacLight de acordo com a profundidade da matriz. (a) Biofilme formado pelo consórcio

T6-lab não tratado (controle); (b) Biofilme formado pelo consórcio T6-lab tratado com a SAM H2O-1.

As fotos destacadas no canto direito dos gráficos são imagens de projeção máxima do biofilme não

tratado (a) e tratado (b). Barra de escala = 30 μm.



7 DISCUSSÃO

No início do século passado, os estudos de geomicrobiologia não haviam detectado

ainda comunidades microbianas significativas, e por muitas décadas se acreditou que o

papel dos microrganismos presentes nestes ambientes de subsuperfície profunda era

insignificante (PHELPS, RAIONE & WHITE, 1989). Entretanto, concomitantemente aos

interesses da indústria de petróleo no controle microbiano em sistemas de produção de óleo

devido a problemas causados por microrganismos, como a corrosão e acidulação biogênica,

o estudo da comunidade microbiana em reservatório de petróleo representa atualmente uma

importante área na microbiologia ambiental e industrial. O advento da extração de petróleo

facilitou a coleta de amostras para estudos de geomicrobiologia (a partir de 100 m abaixo

da superfície). Mesmo assim, a amostragem é ainda hoje um impedimento e um desafio ao

estudo da microbiologia de subsuperfície, principalmente devido à necessidade do uso de

tecnologias especializadas, caras e complicadas de perfuração (testemunhagem). A

testemunhagem para estudos de biologia requer ainda técnicas de amostragem em

condições assépticas. Seccionar a amostra e remover a parte mais externa do testemunho

são os principais cuidados para evitar contaminação de microrganismos alóctones. Neste

trabalho, uma das etapas estudadas foi a avaliação da diversidade bacteriana presente em

testemunhos obtidos em subsuperfície ultraprofunda (2.822 a 2.828 m abaixo do fundo do

mar, apresentando ainda uma coluna de água de 1.700 m) no campo de Marlim, na Bacia de

Campos, através de métodos independentes de cultivo. Foi a primeira vez que se

evidenciou a possível presença de bactérias nesta profundidade.

A quantidade de células em amostras de rocha é muito baixa, tornando a eficiência

da extração de DNA também baixa. Assim, a quantidade de ácido nucléico disponível para

análises de microrganismos se encontra em ordens de magnitude menores que o limiar de

detecção de muitas das técnicas de biologia molecular (OGRAM et al., 1995). Neste

trabalho, o primeiro obstáculo foi exatamente a quantidade de DNA extraída, assim como

observado em outros estudos que trabalharam com sedimentos coletados abaixo do fundo

do mar. O outro obstáculo foi a presença de óleo, que pode inibir ou atrapalhar a técnica de

amplificação por PCR (TSAI & OLSON, 1992; WILSON, 1997; NEWBERRY et al.,

2004; PARKES et al., 2005; INAGAKI et al., 2006). No presente trabalho, utilizamos 30

gramas de rocha para estudo da comunidade bacteriana de cada testemunho. O protocolo de



extração de DNA usado foi baseado no fracionamento da amostra, separando as células do

sedimento rochoso, e na lise mecânica por bead-beating. Este procedimento resultou em

uma baixa concentração de DNA, mas foi suficiente para a amplificação por PCR da

comunidade bacteriana presente nas diferentes amostras de rocha. Os cuidados referentes à

contaminação com produtos pré-amplificados de experimentos anteriores foram uma

preocupação constante nesta pesquisa, principalmente pela natureza da amostra de rocha

que poderia contaminar-se, durante o processamento de extração, com DNA estranho. Para

se obter então, a garantia de que o produto amplificado era realmente proveniente da

comunidade autóctone da rocha, foram utilizadas soluções esterilizadas, material

descartável, ponteiras com barreira filtrante durante todo o experimento para evitar este

problema. E ainda, como já comentado acima, também foi retirada a camada mais externa

da rocha e então o cerne do testemunho foi amostrado como descrito nos materiais e

métodos. Além disso, foram feitos controles negativos durante a extração de DNA e a

amplificação por PCR, ou seja, tubos brancos nos quais não foi adicionado nenhum

material proveniente das amostras de rocha.

A estratégia de estudo foi baseada, como em outros trabalhos (PARKES et al.,

2005; INAGAKI et al., 2006), em seqüências de DNAr 16S para a análise da comunidade

bacteriana presente em rochas de sedimentos coletados abaixo do fundo do mar. Diferentes

filos bacterianos já foram detectados em subsuperfície, como Proteobacteria, Firmicutes,

Actinobacteria e Bacteroidetes (D’HONDT et al., 2004; TESKE, 2005). O resultado da

presente análise filogenética indicou que a diversidade bacteriana nas amostras de rocha

ultraprofunda apresenta uma ampla distribuição de grupos do domínio Bacteria (filos

Proteobacteria, Firmicutes e Actinobacteria) com a predominância da classe

Betaproteobacteria. Dentre estas seqüências de Betaproteobacteria, a maioria foi

relacionada a seqüências de organismos não cultivados (Figura 11). Somente um clone se

afiliou ao gênero Pelomonas, e cinco clones aos gêneros Variovorax (Figura 11). A espécie

de V. paradoxus já foi descrita como degradadora de hidrocarboneto (SMITH, ALVEY &

CROWLEY, 2005). Além destas espécies, clones relacionados aos gêneros

Comamonas/Delftia e Azoarcus foram encontrados dentre as Betaproteobacteria. Algumas

das espécies relacionadas a estes gêneros já foram identificadas em processos de

biorremediação (LIN et al., 2005; VACCA, BLEAM & HICKEY, 2005)



Os 17 clones relacionados à classe Alphaproteobacteria obtidos neste trabalho

foram encontrados nas quatro amostras de rocha, entretanto foram representativos em maior

número nas bibliotecas das amostras T2-1/9 e T2-2/9. Sete clones foram relacionados à

família Bradyrhizobiaceae (Figura 12), sendo dois clones associados a membros de cada

um dos gêneros Rhodopseudomonas e Methylobacterium. Estirpes pertencentes a estes

gêneros já foram detectados em fluido produzido (óleo) (SETTE et al., 2007; LIEW &

JONG, 2008). Os clones T2-8/9(10) e T2-7/9(8) são próximos a uma bactéria degradadora

de diesel, Ochrobactrum sp. (PRINCE, 2005) e Rhodobacter sphaeroides (VRDOLJAK et

al., 2005), respectivamente. Três clones foram relacionados aos gêneros Defluvibacter e

Aquamicrobium. A espécie Defluvibacter lusatiae é uma bactéria Gram-negativa que é

capaz de degradar fenol (FRITSCHE et al., 1999).

A distribuição dos grupos Gammaproteobacteria e Firmicutes foi ampla, pois foram

obtidos clones das quatro amostras relacionados a estes grupos, entretanto foram menos

abundantes que a classe Betaproteobacteria. Os clones obtidos neste estudo que foram

relacionados à classe Gammaproteobacteria, foram associados especificamente aos gêneros

Xanthomonas, Stenotrophomonas e Pseudomonas, que já foram descritos como

degradadores de hidrocarbonetos (DUARTE et al., 2001; BOSZCZYK-MALESZAK et al.,

2006). Quanto aos clones relacionados ao filo Firmicutes, dois clones foram relacionados

ao gênero Bacillus. Em um estudo anterior de amostras de rocha provenientes também do

campo de Marlim, na Bacia de Campos, foram isoladas estirpes de Bacillus capazes de

degradar petróleo e de crescer em hidrocarbonetos como única fonte de carbono (CUNHA

et al., 2006). Foi detectado um clone relacionado à espécie Oceanobacillus iheyensis. Esta

espécie foi isolada de sedimentos de mar ultraprofundo (1.050 m de profundidade) no Japão

e foi reconhecida por ser halotolerante e alcalifílica (LU, NOGI & TAKAMI, 2001). Outro

clone foi relacionado a Brevibacillus sp., considerado como potencial degrador de asfalteno

(PINEDA-FLORES et al., 2004).

Finalmente, somente um clone da amostra T2-8/9 foi relacionado ao filo

Actinobacteria (Tabela 1). Esta seqüência apresentou maior similaridade ao gênero

Arthrobacter, que foi isolado de sedimentos ultraprofundos e mostrou ter capacidade em

degradar uma ampla variedade de compostos (PRINCE, 2005).

A comunidade de BRS somente pôde ser detectada em uma das amostras de rocha



ao usar os iniciadores para o gene aprA. Três espécies do gênero Desulfovibrio foram

identificadas (D. desulfuricans, D. profundus e D. indonesiensis). Este resultado indica a

que a presença de BRS está em baixo número e diversidade neste ambiente. O mesmo foi

observado anteriormente por PARKES e colaboradores (2005). Estes autores observaram

procariotos relacionados diretamente à redução de sulfato representados por uma pequena

porção da população total encontrada no ponto de amostragem no Peru, Oceano Pacífico.

Nesta etapa foi possível obter DNA total dos testemunhos de rocha de subsuperfície

profunda e a partir deste material amplificar fragmentos de DNAr 16S possibilitando assim

a avaliação da diversidade bacteriana total destes testemunhos. A comunidade de bactéria

redutora de sulfato foi detectada somente em um dos testemunhos de rocha de subsuperfície

profunda utilizando os iniciadores para o gene aprA. Os processos de corrosão e acidulação

biogênica causados pela presença autóctone de BRS, não devem ser esperados inicialmente

neste reservatório, pois este apresentou baixo número de clones relacionados a este grupo

utilizando métodos moleculares. Entretanto, estes processos podem ser intensificados à

medida que este campo de petróleo seja explorado, assim alterando as condições ambientais

internas do reservatório, e estimulando a população de BRS. Outro grande problema que

indústria de petróleo enfrenta é a biodegradação do óleo. A degradação de óleo é um

problema cuja relevância é geralmente observada em ambientes contaminados por petróleo

ou seus derivados, ou seja, onde estes compostos não são encontrados naturalmente.

Contudo, este processo também é encontrado em reservatório de petróleo, resultando no

acúmulo de óleos biodegradados, com característica de óleos considerados pesados. Este

processo é também um grande problema para a indústria de petróleo, pois o óleo pesado é

comercialmente menos favorável. Muitos dos clones obtidos nesta etapa deste estudo foram

relacionados a bactérias descritas previamente como degradadoras de hidrocarbonetos do

petróleo. Esta evidência pode indicar a qualidade do óleo do reservatório como sendo de

densidade pesada. Esta evidência é corroborada com o histórico das reservas de óleos

pesados no Brasil, que são significativamente grandes. No Brasil, o local com maior

incidência de óleos pesados está exatamente em reservatórios de águas profundas da Bacia

de Campos, no estado do Rio de Janeiro.

A avaliação de microrganismos autóctones de subsuperfície foi a primeira etapa do

trabalho. Considerando a possibilidade de contaminação antropogênica dos reservatórios de



petróleo pelos procedimentos de perfuração e pelos diferentes métodos de extração de

petróelo, a segunda etapa deste estudo foi a avaliação do sistema de tratamento de injeção

de água do mar utilizada na recuperação secundária do petróleo.

Durante a drenagem do petróleo em um poço produtor é necessário a manutenção da

pressão dentro do reservatório para manter a produção do óleo. Em plataformas offshore, a

manutenção da pressão é geralmente alcançada pela injeção de água do mar. Esta água do

mar deve ser desaerada para evitar problemas de corrosão, pelo oxigênio, das tubulações

metálicas. Este processo de injeção de água do mar está associado a outros problemas

envolvendo microrganismos, como a acidulação biogênica e a corrosão influenciada por

microrganismos. Isto se deve ao fato que a injeção de água do mar, rica em sulfato, pode

estimular o crescimento de BRS e conseqüentemente a produção de H2S. Outros grupos

bacterianos, como Bacillus e Pseudomonas, também conseguem se desenvolver após a

injeção de água, devido à redução da temperatura do reservatório ao chegar a água do mar

em seu interior (DAVIS, 1967; BEEDER et al., 1996).

Este é o primeiro estudo a comparar a diversidade de bactérias planctônicas em

sistemas de tratamento de água do mar para injeção na recuperação secundária de petróleo

em plataformas offshore no Brasil. Os sistemas de tratamento de três plataformas offshore

foram analisados em diferentes pontos da linha de tratamento da água (Figura 10). A

predominância de Marinobacter sp. (87 clones) na plataforma A e de Colwellia sp. (104

clones) na plataforma B foi observada em todos os pontos amostrados em cada plataforma,

com exceção dos pontos tratados com THPS. Somente dois trabalhos recentes foram

realizados até hoje em sistemas de tratamento de água de injeção, e resultados semelhantes

foram observados em plataformas offshore (Mar do Norte, Noruega) onde a água foi tratada

com nitrato (BØDTKER et al., 2008; SCHWERMER et al., 2008). BØDTKER e

colaboradores (2008) e SCHWERMWER e colaboradores (2008) detectaram também a

prevalência dos gêneros Marinobacter e Colwellia, respectivamente. Entretanto, mesmo

reconhecendo que ambos os gêneros conseguem obter energia da redução de nitrato, a

presença destes grupos no presente estudo não foi restringida por este tratamento, pois

foram detectados tanto em amostras não tratadas e tratadas com nitrato (somente um poço

da plataforma A foi tratado com nitrato). Tanto os gêneros Marinobacter como Colwellia já

foram descritos em processos de corrosão de materiais metálicos e degradação de



hidrocarbonetos, processos que podem causar grandes perdas econômicas para a indústria

de petróleo (GORSHKOVA et al., 2003; POWEL, BOWMAN & SNAPE, 2004; LOPEZ et

al., 2006; SCHWERMER et al., 2008). DUNSMORE e colaboradores (2006) detectaram a

espécie Marinobacter aquaeolei em uma cultura mista de bactérias redutoras de nitrato,

proveniente de um poço de produção do Mar do Norte, tratado com nitrato. Estes autores

sugerem que Marinobacter pode ser um indicador da eficiência do tratamento com nitrato

(DUNSMORE et al., 2006). Marinobacter sp. provavelmente é capaz de sobreviver às

condições de reservatório. No presente estudo este gênero foi observado em todas as

amostras provenientes da plataforma A. como observado no gráfico de ordenação onde é

observada a presença deste grupo na amostra antes do tratamento com nitrato (somente

tratada com cloro e QATS) como também na amostra tratada com nitrato (Figura 20 b).

Assim, de acordo com DUNSMORE e colaboradores (2006), este grupo tem grande

potencial para servir como indicador no monitoramento do sistema de produção de petróleo

como um todo, desde a injeção de água até o poço produtor. Não foi encontrado nenhum

trabalho relatando a sobrevivência do grupo Colwellia em reservatório de petróleo.

Provavelmente as bactérias do gênero Colwellia não são capazes de sobreviver a este

ambiente mesmo após o resfriamento com a água de injeção. Os membros pertencentes ao

gênero em questão são estritamente psicrofílicos (crescem abaixo de 20ºC) (METHÉ et al.,

2005).

Em menor número, outros clones relacionados ao filo Proteobacteria também foram

obtidos nas plataformas A e B, assim como nos trabalhos anteriores também evidenciaram

outros clones relacionados a este mesmo filo nos sistemas de água de injeção (BØDTKER

et al., 2008; SCHWERMER et al., 2008). Em comum também foram detectados os gêneros

Alteromonas e Vibrio (SCHWERMER et al., 2008). Todos os gêneros observados neste

estudo (Figura 15) já foram detectados ou têm algum membro comumente encontrado em

ambiente aquático. Os gêneros Pseudomonas, Vibrio, Alteromonas (plataforma A) e

Achromobacter (plataforma B) estão dentre os grupos bacterianos mais freqüentemente

encontrados em ambientes marinhos e capazes de degradar hidrocarbonetos (RISER-

ROBERTS, 1992; FLOODGATE, 1995; MUNN, 2004). Neptunomonas sp. é degradador

de hidrocarboneto aromático (naftaleno) (HEDLUND et al., 1999). Os gêneros

freqüentemente encontrados em ambiente marinhos são, na plataforma A, Sphingopyxis



(Mar Amarelo, Corea - YOON et al., 2005), Kopriimonas (KWON et al., 2005); na

plataforma B, Burkholderia (Mar Sul da China – WANG et al., 2008), Synechococcus (Mar

Negro – UYSAL, 2001), Thiomicrospira (Oceano Pacífico – SCOTT et al., 2006),

Oceanospirillum (POT et al., 1989). No entanto, todos são microrganismos aeróbios, ou no

caso de Synechococcus e Thiomicrospira que são fotoautotróficos e litoautotróficos,

respectivamente. Mesmo que tenham persistido ao sistema de tratamento de água,

dificilmente irão sobreviver no interior do reservatório, na ausência de oxigênio. Já os

gêneros Micavibrio (LAMBINA et al., 1989), Tistrella (SHI et al. 2003) e Desulforegula

(REES & PATEL, 2001) foram originalmente isolados de ambientes de água doce (lagos).

Micavibrio é um gênero parasito obrigatório de bactérias em ambientes aquáticos, não

sobrevive sem seu hospedeiro. Tistrella foi recentemente descrita como degradadora de

fenantreno em solo (ZHAO et al., 2008), porém provavelmente não suportaria a salinidade

do reservatório, que geralmente é superior à salinidade do mar, chegando a ponto de

saturação (5,5 % a 20% de sais totais) (DAVIS, 1967).

O estudo da comunidade de bactérias redutoras de sulfato é de grande interesse para

a indústria petrolífera, pois são as responsáveis por danos causados pelos processos de

acidulação biogênica e corrosão microbiológica. Somente três clones do gênero

Desulforegula foram observados na plataforma A, o único gênero de BRS encontrado neste

trabalho utilizando o gene rrs como ferramenta. Foi avaliada a presença de BRS pelo uso

de iniciadores para o gene aprA, em todas as amostras das plataformas A, B e C, porém o

produto quando obtido era muito fraco. Infelizmente nenhum clone baseado no gene aprA

foi obtido nesta etapa do trabalho. Quando avaliada pelos técnicos do grupo de Corrosão do

CENPES/Petrobras, a concentração de biomassa de BRS total chegou a um máximo de 28

NMP/ml em todas as amostras. Estes resultados demonstram que há BRS nos sistemas de

injeção de água, porém em baixo número. A dificuldade de detectar um grupo minoritário

com grande influência biogeoquímica como as BRS já foi observado anteriormente por

métodos moleculares, quando comparado a grupos bacterianos predominantes (D’HONDT

et al., 2004; PARKES et al., 2005; WEBSTER et al., 2006). A análise de classificação dos

clones das três bibliotecas construídas usando a ferramenta blastn do NCBI foi feita com

base na escolha de 98%, ou mais, de similaridade entre as seqüências dos clones e das

provenientes do BLAST. Esta escolha foi feita para garantir a confiabilidade na



identificação dos clones em nível de gênero.

As Figuras 21 a, b e c agrupam por meio gráfico os dados apresentados das

plataformas A e B como um todo. O gráfico de ordenação (Figura 21 a) permite a

observação das diferenças entre as plataformas A e B através da diversidade bacteriana, dos

tratamentos das amostras e do tempo de operação. Comparando as variáveis ambientais

escolhidas para este estudo, o resultado do gráfico da Figura 21 a indica que as plataformas

diferem quanto à diversidade bacteriana principalmente pelo tempo de atividade de cada

uma delas, e não pelo tratamento aplicado na água de injeção. Outra possibilidade, que

pode ser ressaltada, apesar de não ter sido avaliada, é a variação das amostras de acordo

com a plataforma de origem, mesmo que sejam todas localizadas na Bacia de Campos, as

correntes marinhas locais podem influenciar a comunidade bacteriana da água do mar bruta

usada na injeção. O litoral do sudeste brasileiro é banhado por duas correntes marinhas, a

corrente do Brasil, com águas quentes (vinda do equador), e a corrente das Malvinas com

águas gélidas (vinda do pólo Sul). Possivelmente, a temperatura das águas pode ter

determinado desde o início a população bacteriana dos sistemas de tratamento de água de

injeção. De fato, a análise de PCA, mostrou que as diversidades das comunidades

bacterianas nas plataformas de injeção de água avaliadas neste estudo diferiram de maneira

“plataforma-dependente”. Além disso, as Figuras 21 b e c indicam que os gêneros

predominantes nas amostras das plataformas A e B não são influenciados pelos tratamentos

aplicados, pois são detectados em todos os pontos. Não foi observada assim nenhuma

correlação dos gêneros Marinobacter e Colwellia com nenhum tratamento específico.

O objetivo do tratamento da água de injeção é principalmente a redução de BRS

pelo fato de promoverem os processos conhecidos como souring e corrosão. Nestes

sistemas de tratamento de injeção de água foi detectado um único gênero pertencente ao

grupo Desulforegula (3 clones) somente na plataforma A, utilizando os iniciadores para o

gene rrs. Assim, o tratamento utilizado é, sem dúvida, necessário. A aplicação em batelada

com THPS é a etapa mais drástica do tratamento, possibilitando uma melhor eficiência no

controle microbiano, mas não há a eliminação total de microrganismos do sistema.

Entretanto, a biomassa que sobrevive ao sistema de tratamento pode ou não resistir às

condições do interior do reservatório, sobretudo devido à salinidade e temperatura, como

discutido acima. Desta forma, a estimulação da atividade de redução de sulfato pela injeção



de água do mar influencia provavelmente as BRS autóctones, que são encontradas na rocha,

como observado neste trabalho (no testemunho T2-8/9), e estão adaptadas às condições

locais. No momento da introdução da água do mar, há o aumento da concentração de

sulfato e outros nutrientes, levando à redução de sulfato por essas bactérias, e

conseqüentemente à produção de H2S.

O grande grupo encontrado no estudo da diversidade bacteriana em sistemas de

tratamento de injeção de água das plataformas A, B e C foi formando por clones

relacionados a organismos não cultivados das três plataformas. Este grupo divergiu, se

distanciando de organismos já conhecidos cultivados e não-cultivados, mostrando assim

pouca similaridade às seqüências previamente estudadas incluídas no GenBank. A

possibilidade de estas seqüências serem de origem quimérica foi descartada pela análise

destas seqüências utilizando a ferramenta CHECK_CHIMERA (do site RDP). Este cluster

foi formado por clones provenientes das três plataformas (Figura 20). Portanto, os clones

são provenientes de produtos formados de reações de PCR também distintas. O grupo em

questão foi separado como um grupo monofilético, ratificando a idéia de estas seqüências

são de fato autênticas. Além disso, há também o indicativo de que este cluster é

amplamente distribuído, já que foi detectado nas três plataformas, independente do local ou

de tempo de operação. Este cluster pode ser uma nova subdivisão bacteriana. Entretanto,

não pode ser categorizado como tal devido ao estudo ser baseado em uma região pequena

(433 nucleotídeos) do DNAr 16S. Este cluster não classificado e predominante é o único

grupo em comum nos três sistemas de injeção de água das plataformas estudadas. Contudo,

ainda não é possível determinar qual a importância ecológica e industrial da presença deste

grupo nos sistemas de água de injeção da indústria de petróleo, pois como foi sugerido

neste presente trabalho: alguns grupos bacterianos, mesmo após resistirem às etapas de

tratamento do sistema de injeção de água do mar, podem não suportar as condições

extremas do reservatório. O mesmo pode acontecer com este grupo não identificado.

Porém, por terem sido amplamente encontrados nas amostras, pode se tratar de um grupo

que resistente a diferentes condições ambientais.

Os resultados obtidos no estudo da comunidade bacteriana presente em pontos do

tratamento de água de injeção forneceram uma ampla análise da comunidade destes

sistemas sugerindo que a presença de alguns grupos bacterianos pôde sobreviver aos



tratamentos. Sobretudo, o sistema de tratamento é de extrema necessidade para indústria de

petróleo. Assim, também é de interesse desta indústria o desenvolvimento de novos agentes

antimicrobianos mais eficientes e ambientalmente corretos. A busca por novos agentes

biocidas se deve ao fato de que com o tempo muitos dos biocidas aplicados podem perder a

eficiência no controle microbiano e pela incapacidade de controlar a formação de biofilmes.

Vários métodos têm sido propostos para controlar biofilmes em diversas instalações da

indústria de petróleo.

A última etapa deste trabalho foi a avaliação da ação antimicrobiana da substância

produzida pela estirpe de Bacillus isolada de reservatório de petróleo contra biofilmes

formados por bactérias redutoras de sulfato. Na procura por novas substâncias inibitórias,

muitos autores trabalharam com estirpes bacterianas selvagens e geneticamente

modificadas, objetivando a produção de compostos ativos contra a formação de biofilme e

conseqüentemente a redução da biocorrosão (JAYARAMAN, MANSFELD & WOOD,

1999; ÖRNEK et al., 2002, ZUO & WOOD, 2004). Procedimentos industriais de limpeza

devem levar em conta o material remanescente aderido às superfícies após aplicação do

tratamento, pois este material restante pode facilitar a adesão subseqüente de

microrganismos indesejáveis (PARKAR, FLINT & BROOKS, 2004). GARDNER &

STEWART (2002) mostraram que o composto biocida glutaraldeído, comercialmente

usado pelas indústrias de petróleo, suprimiu a atividade de BRS na concentração de 100

mg/l. Entretanto, eles também observaram que não houve redução significativa da

espessura do biofilme, indicando uma remoção incompleta do biofilme. Além disso, é

sabido que há maiores chances de corrosão por aeração diferencial da superfície, quando a

camada de células deixa de ser homogênea, formando grumos espalhados pela superfície de

adesão. A disposição de células remanescentes e de resíduos aderidos após tratamento com

o biocida pode causar corrosão por aeração diferencial (GARDNER & STEWART, 2002).

FANG, XU & CHAN (2002) também demonstraram o aumento da corrosão quando o

biofilme formado por BRS foi exposto a substâncias químicas e metais tóxicos, pois o

tratamento aplicado não removeu totalmente o biofilme formado sobre a superfície testada.

No presente trabalho, o biofilme de BRS foi crescido em um reator CDC por 5 dias

em condições anaeróbicas sobre coupons de vidro. Esta superfície foi escolhida para evitar

a formação de produtos de corrosão que podem interferir na visualização microscópica. LI



e LOGAN (2004) observaram a formação de biofilme sobre superfícies inertes e

compararam diferentes superfícies (de vidro e metálicas). Estes autores observaram que não

há um efeito significativo (P = 0,26) da adesão bacteriana quanto à topologia da superfície.

O biofilme formado pelo consórcio de T6-lab, que é uma cultura mista de BRS

proveniente de reservatório de petróleo, foi colocado em contato com o extrato bruto da

SAM H2O-1 por 24 horas. O contato da SAM H2O-1 com o biofilme causou uma redução

de 94% da fluorescência total, indicando uma remoção de células do biofilme previamente

formado. As células restantes no biofilme tratado apresentaram principalmente a coloração

vermelha, determinada pela marcação com iodeto de propídeo que indica inviabilidade

celular. Porém, foi observada a manutenção da espessura do biofilme tratado, quando

comparado ao biofilme de BRS controle (não tratado). Isto é, provavelmente a matriz

polimérica extracelular que confere o arcabouço do biofilme se manteve constante, mesmo

após a morte e remoção das células do biofilme tratado. Este resultado pode trazer

problemas adicionais devido ao material remanescente sobre a superfície, que pode

funcionar como camada condicionante para adesão de novas células da fase líquida. Assim,

para evitar este inconveniente, um tratamento mais longo ou mesmo contínuo, como é feito

com os biocidas atualmente aplicados em diferentes sistemas da indústria petrolífera, pode

ser necessário para alcançar melhor eficiência de remoção do biofilme existente.

Finalmente, o presente estudo abrangeu a diversidade bacteriana autóctone e

alóctone presente em sistemas de produção da indústria de petróleo, destacando os grupos

dominantes de cada amostra (rocha e água de injeção), sugerindo seus possíveis impactos

na produção de petróleo. A presença de BRS foi detectada em baixo número nestas

amostras. Contudo, o controle deste grupo bacteriano é de extrema importância pelos

motivos aqui apresentados. Assim, a SAM produzida pela estirpe Bacillus firmus H2O-1

poderá ter aplicações industriais, pois esta SAM tem potencial na redução do crescimento

de BRS e, conseqüentemente, no controle da biocorrosão e acidulação biogênica.



8 CONCLUSÕES FINAIS

A extração de DNA da comunidade bacteriana presente nos quatro testemunhos de

reservatório de subsuperfície profunda analisados foi eficiente e foi possível amplificar

por PCR fragmentos do gene rrs e aprA.

O filo Proteobacteria predominou nas quatro amostras de rocha petrolífera.

As BRS foram encontradas em uma amostra de rocha e todos os clones obtidos foram

relacionados ao gênero Desulfovibrio.

O sistema de tratamento de água de injeção não elimina todas as bactérias presentes no

sistema. Os clones obtidos das três plataformas puderam ser divididos em dois grupos:

o primeiro foi relacionado ao filo Proteobacteria e o segundo não apresentou

similaridade a organismos previamente descritos.

O tempo de atividade das plataformas de injeção de água foi o fator que mais

influenciou a diversidade bacteriana nestas amostras.

A SAM H2O-1 apresentou atividade inibitória sobre biofilme de BRS pré-formado. A

análise deste biofilme por microscopia confocal a laser indicou uma redução de 94% da

intensidade de fluorescência total.



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