MICROBIOLOGIE QUANTITATIVE

I- MICROBIOLOGIE QUANTITATIVE

Microorganismes =- combien? Quel taux?

- distribution?

- diversité?

- rôle fonctionnel?

- contrôles?

Méthodes de mesure

standardisées, précises, répétables, sensibles

1- Echantillonnage

Accès

Echantillonnage

Traitement

direct, éloigné

filet, bouteille, filtre

dilution, concentration

éloigné

pelle, carottier

dilution

Eau Sédiment

- stériliser ou rincer

- fixation (glutaraldéhyde, formaldéhyde)

- stockage (4 ou - 20 ou - 80°C)

- faire les analyses le + vite possible!!!!

Filet à plancton

(algues et protozoaires)

Bouteille de Niskin

Pelle à sédiment

Carottier

2. Activité enzymatique

Substrat produitenzyme

Disparition du substrat

Apparition du produit

- Activité réelledynamique

- Activité potentielleTraceurs et marquage- fluorescent, coloré- isotopique stable ou radioactif

2.1- Dynamique

0

50

100

150

0 200 400 600 800time (h)

Fe(II

) uM

AUTOCLAVED

Fe(II)

Quantifier substrats et produits

Au cours du temps

Réduction de Fe (III)

Inhibiteurs ou compétiteurs

nitrapyrine NH4+ oxidase

chlorate NO2- oxidase

C2H2 N2O réductases

2.2- Traceurs et marqueurs

Ajout de substrat devenir?

- chromogène ou fluorogène

- marquage isotopique

Attention!!!

Activité potentielle

- Microcosmes (radioactifs, chromogène, fluorogène)

- Nature (isotopes stables)

Substrat chromogène ou fluorogèneColorimétrie Microplaque Biolog

INTrespiration

INT-formazan

Fluorimétrie

Methylumbellyferone

Amino-methylcoumarine

Marquage isotopique

Même élément = différentes masses

Carbon-12 Carbon-13 Carbon-14

(6P + 6N)

protons

electronselectrons

neutrons

(6P + 7N) (6P + 8N)

Isotopes radioactifsIsotopes stables

Isotopes radioactifs

3H [3H]-CH3 Oxydation du méthane

14C [14C]-CaCO3 photosynthèse

35S [35S]-SO42- Réduction des sulfates

Particules β

Cocktail scintillant =

Solvant + émulsifiant + fluor 3H

Excitation

solvant

fluorcpm

Isotopes stables Fractionnement

Soufre 32S, 33S, 34S, 35S

réagit + viteIsotope + léger

Desulfovibrio spp.

Desulfatomaculum spp.SO4

2- H2S enrichi en 32S

Rapport isotopique

δ34Sechantillon = x 100034S/32Séchantillon – 34S/32Sstandard

34S/32Sstandard

Spectromètre de masse + GC

Séparation et identification des isotopes

Rapport masse/charge

• 13C/12C = 0.011225• 13C/12C = 0.011071• 13C/12C = 0.010918

Bombardement e-

ions

Masse molaire

3- Biomasse

Densité = nb de cellule par volume ou par surface

Biomasse = mg de C par volume ou par surface

fg C Cell-1

culture

Escherichia coli 109-323

bacterioplancton

Antarctique 7-13

2 Stratégies:

Comptage direct

DIRECT

Biomarqueurs

Quantité?

cultureINDIRECT

2.1. CULTURE EN MILIEU SOLIDE

COMPTAGE des UFC

2.2. CULTURE LIQUIDE Estimation statistiqueNombre le plus probable (NPP)

10-2 10-510-410-3 10-6

+ + + - -+ - - - -+ + - - -3 2 1 0 0

1 ml dans 9 ml

Table de Mac Grady (extrait)

NPP

3

33

2

22

0

12

9

1521

Bactéries/ml = 15/10-2 = 1500

2.3. COMPTAGE DIRECT

Microscope photonique

Hémocytomètre Eucaryotes

Compteur de particules = cytomètre de flux

Electrolyte

FluorescenceMicroscope àépifluorescence

Hémocytomètre

Algues, champignons, protozoaires

Microscope à épifluorescence

Occulaire

excitation

Filtre em.

objectif

Filtre exc.

emission

Acridine orange, DAPI, Syber green

Hybridation FISH

Populations, groupes taxonomiques

Cytomètre de flux

Laser488nm

SSC

FSC

Flux d’échantillon

Détecteur de lumière

SSC = granularité

FSC = taille

Dispersion et émission

2.4. BIOMARQUEURS

ADN, ATP, chla, lipides, acide muramique….

DNA 1.6-5.7 fg / bactérie

ATP 1 fg / bactérie

Problèmes = état physiologique, tous les organismes vivants

Membranes cytoplasmiquesLIPIDES

FAME = Fatty acid methyl ester

PLFA = Phospholipid linked fatty acids

1- Extraction avec des solvants

2- Esterification

3- chromatographie gazeuse

Acides gras phospholipidiques Acides gras

Groupes fonctionnels

i15:0

Champignons18:2w6Bactéries 18:1w7c

cy19:0

Actinomycètes 10Me 18:0

i14:0

a15:0

Biomarqueurs = diversité + biomasse

ACIDES NUCLEIQUES

ARNm =

gènes fonctionnels

Extraction=

1- lyse (physique, chimique, enzymatique)

2- extraction (phenol/chloroforme)

3- purification

4- précipitation (éthanol, iso-propanol)

ADN

ARNr 23SARNr 16S

ARNr 5S

-

+

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.htmlhttp://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/index.htm

PCR = Polymerase Chain Reaction

94-96dénaturation

Température ºC

1er cycle

50-60hybridationamorces

72élongationpolymérase+ dNTPs

94-96

2e cycle

PCR en temps réel

Sonde TaqMan

mesurer à chaque cycle d’amplification la quantitéd’ADN par marquage fluorescent

log[ADN]=a(nombre de cycle)+b

[AD

N]

Nb de cycles

= Acides nucléiques4- Diversité génétique

ARNm = diversité phénotypique

ADN = diversité génotypique

- Population

- Groupes fonctionnels

- Communauté

PROFIL = code barre de l’espèce ou de la communauté

SEQUENCE = succession de paires de base

Quel gène amplifier?

genres et espèces- ARN ribosomal

16S 23SITS

- Eléments répétés espèces

espèces- DNA gyrase (gyrA et gyrB)

groupes fonctionnels- Gènes fonctionnels

Ex. Nir K et Nir S codent des nitrites réductases

dénitrification

Séparation par la TAILLE

Fragments de taille variable

ITS, éléments répétés, microsatellitesPaires de bases

1000

500

200

-

+

Électrophorèse

en cuve ou en capillaire

Gel d’agarose ou d’acrylamide

par LC (pair d’ions)

ARNr 16S, gènes fonctionnelsFragments de même taille

Couper avec une enzyme de restriction

POPULATION

BA

Souche

RFLP

(restriction fragment length polymorphism)

COMMUNAUTE Trop de bandes

amorce fluorescente*Espèce A

Espèce B*

*

RFLP tRFLP

BA A+B A+B

*

*Gel d’acrylamide(electrophorèsecapillaire)

Séparation par la COMPOSITION

DENATURATION% bases G+C

Gradient dénaturant chimique (DGGE)

ou

thermique (TGGE, TTGE)

dHPLC

pair d’ions

GC clamp Amplicon

Électrophorèse sur gel d’acrylamide

Élution à 65 ºC

CONFORMATION = SSCP

Single strand conformation polymorphism

Électrophorèse d’acrylamide

(gel ou capillaire)

Dans le gel à 20°C les simples brins se replient sur eux-mêmes

ARNr 16S, gènes fonctionnels

Dénaturation (98°C-5 min) A+B

2 simples brins

Analyse du profil = Diversité et structure

Richesse: nombre de phylotypes

chaque bande = 1 phylotype ou OTU

Structure: profil de bandes

Similarité entre 2 communautés = similarité entre 2 profils

Composition? Quelles espèces?

Identification = séquençageAnalyse phylogénétique

Électrophorèse

ou dHPLC

Séquençage

séparation des phylotypes

Identification

Séparer sans électrophorèse= clonage

β-galactosidase

Résistance

ADN environnement

restriction

vecteur

vecteur

ligation sélection

Plasmides 2 kb

Fosmides 40kb

Cosmides 40kb

BAC 300 kb

YAC >300 kb

Maxima cloaca (genoscope- Evry)

ATGGCCTTAAAAGCséquençage

ATGGCCTTAAAAGCATGGCCTTAAAAGATGGCCTTAAAAPCR ATGGCCTTAAA

ATGGATG

ATGGCCTTATGGCCT

AT

ATGGCCATGGC

A

ATGGCCTTAAATGGCCTTAÉlectrophorèse

capillaire dNTPsfluorescents

STOP!

HybridationPuces à ADN

ARNr 16S ou gènes fonctionnels

Attention!!!

Choix de la méthode

Biais