Embed Size (px)
Citation preview
1.Enzime pectolitice de origine microbiană
2.Metode de cercetare
I.1Enzimele pectolitice. Domeniile de aplicare.
Pectinazele prezintă un complex de enzime ce aparţin clasei
carbohidrazelor şi scindează
substanţele pectice – constituenţii fiziologici universali ai ţesuturilor vegetale,
care alcătuiesc
lamela mijlocie şi formează legătura dintre membranele celulelor .
Substanţele pectice reprezintă heteropolizaharide necelulozice prezente în
toate ţesuturile
plantelor superioare. Ele sunt compuşi macromoleculari, constituiţi din lanţuri
de acid Dgalacturonic,adesea parţial esterificate de alcoolul metilic, legate
între ele prin legături α-1,4
glicozidice. Printre substanţele pectice se disting: acizi pectinici constituiţi din
lanţuri de acid
galacturonic esterificat, acizi pectici – reprezentaţi prin acidul poligalacturonic
neesterificat şi
protopectinele ce prezintă un complex insolubil în apă, format din reţele
poligalacturonice asociate cu componentele membranei celulare (celuloză,
hemiceluloză, xilan, araban).
Complexitatea structurală a substanţelor pectice determină necesitatea
implicării în procesul
de hidroliză a acestora a unor complexe de enzime cu activitate pectolitică
Pentru prima dată enzimele pectolitice au fost detectate de către Fremy E.,
1840 în sucul de
morcov, mai apoi de Bourquelot E., 1898, în tulpinile de ovăz. Conform
nomenclaturii vechi ele
erau numite pectaza şi pectinaza. În prezent este cunoscut un şir de enzime
cu activitate
pectolitică, care în dependenţă de tipul legăturilor scindate pot fi încadrate în
două grupe: enzime
pectolitice saponifiante şi enzime pectolitice depolimerizante. La enzimele
saponifiante se referă
pectin-metil-esterazele (PME), numite şi pectinesteraze (PE), care reprezintă
esteraze înalt specifice ce catalizează demetoxilarea pectinelor prin scindarea
legăturilor esterice dintre grupele carboxilice şi alcoolul metilic din lanţurile
poligalacturonice.
În cadrul unor experienţe realizate cu utilizarea în calitate de substrat a
pectinelor modificate
(în care o parte din grupările carboxil au fost reduse) sau a metilesterilor
acidului alginic s-a stabilit că pectinesterazele nu scindează astfel de
substraturi, ceea ce demonstrează specificitatea înaltă a PE-lor faţă de
structurile poli-D-galacturonice. Specificitatea faţă de partea alcoolică este
mai redusă, pectinesterazele fiind capabile să hidrolizeze cu viteze mai mici
etil, propil şi alil esterii acidului pectinic. Viteza de descompunere a
substratului este influenţată şi de gradul de
policondensare al acestuia, diminuând odată cu scăderea lui .Kester H. şi
colaboratorii , studiind proprietăţile unei polimetilesteraze izolate din cultura
A. niger, au constatat că aceasta hidrolizează oligogalacturonaţii
metilesterificaţi (cu gradul de polimerizare 2), scindând cu precădere
metilesterii localizaţi în resturile galacturonice interne, apoi cei de la capetele
reducătoare. Enzima nu acţionează asupra metilesterilor de la capetele
nereducătoare.
Recent la bacteria Erwinia chrysanthemi 3937 a fost identificată o
pectinacetilesterază
(PaeX) sub acţiunea căreia are loc eliberarea grupărilor acetil din diferite
substraturi sintetice şi din pectina de sfeclă. Sporirea activităţii catalitice a
enzimei după depolimerizarea şi demetilarea
preventivă a pectinei indică preferinţele acesteia faţă de substraturi
oligogalacturonice nemetilate
Din literatura de specialitate se cunoaşte că majoritatea pectinesterazelor de
origine
microbiană au masă moleculară cuprinsă între 27-48 kDa, punctul izoelectric
variază între 3,6-7,4,
iar pH-ul optim între 4,2-9,0.
La grupa enzimelor depolimerizante se referă poligalacturonazele care
catalizează hidroliza
legăturilor ozidice şi pectinliazele ce catalizează scindarea transeliminatorie a
aceloraşi legături.
Pectinazele ce hidrolizează la întâmplare legăturile α-1,4-glicozidice,
producând fragmentarea
substratului, sunt denumite endo-poligalacturonaze (endo-PG) şi endo-
pectinliaze (endo-PL),
respectiv. Enzimele care eliberează succesiv molecule de acid galacturonic
pornind de la
extremităţile lanţurilor pectinice sunt denumite exo-poligalacturonaze (exo-
PG) şi exo-pectinliaze
(exo-PL). Pectinazele ce acţionează preferenţial asupra acizilor pectinici cu
grad de esterificare mai
mare de 75% sunt numite polimetilgalacturonaze (PMG), iar cele ce
hidrolizează în special acizii
pectici – poligalacturonaze şi pectatliaze (Pel.
Modelul unei molecule de pectină şi de pectat. Punctele de atac ale
enzimelor pectolitice:
Poligalacturonazele şi pectatliazele acţionează asupra substraturilor de
acelaşi tip, însă
mecanismul lor de acţiune este diferit – poligalacturonazele scindează
substratul prin hidroliză ce
decurge preponderent în mediul acid până la neutru, pe când pectatliazele
scindează substratul prin β-eliminare în mediul slab alcalin şi necesită
prezenţa ionilor de Ca2+ .
Un singur microorganism poate biosintetiza o multitudine de forme
moleculare de
poligalacturonaze, pectinliaze, pectatliaze variate după modul de acţiune şi
specificitate .
Acţiunea poligalacturonazelor şi pectatliazelor depinde în mare măsură de
gradul de esterificare şi
de polimerizare al substratului. Astfel, poligalacturonaza B (PG B) produsă de
Aspergillus niger
hidrolizează preferenţial pectina parţial metilată (grad de esterificare 22-
45%), alte cinci PG-ze
produse de aceiaşi tulpină manifestă activitate maximă pe substraturi
nemetilate . Studiile
întreprinse de Benen au pus în evidenţă particularităţile de acţiune a trei
endopoligalacturonaze (I, II şi C) izolate din tulpina recombinată de A. niger.
Viteza maximă de scindare a poligalacturonatului a fost înregistrată la pH -
4,1. Utilizând pectine cu diferite grade de esterificare s-a determinat că
endopoligalacturonaza II manifestă specificitate sporită faţă de metilesteri, pe
când poligalacturonazele I şi C preferă pectate neesterificate .
Pectatliazele sintetizate de E. chrysanthemi – Pel B, Pel C, Pel I şi Pel L
acţionează în
special asupra substraturilor cu gradul de esterificare 31%, Pel Z – asupra
substratului cu gradul de esterificare 7%, iar unele Pel-ze preferă substraturi
neesterificate .
Un alt factor ce influenţează activitatea enzimelor pectolitice este lungimea
lanţului
galacturonic (cu diverse grade de polimerizare - G). Majoritatea PG-lor
acţionează puternic asupra
tri-, tetra- şi pentagalacturonaţilor, moderat sau slab asupra galacturonaţilor
cu grad de polimerizare G6-G8 şi practic nu scindează digalacturonaţii şi
oligogalacturonaţii .
Pectinazele sintetizate de E. chrysanthemi degradează preferenţial
trigalacturonaţi şi doar
oligogalacturonat liaza este capabilă să acţioneze asupra digalacturonaţilor.
De menţionat, că Ogl nu hidrolizează di- şi trigalacturonaţi mono-
metilesterificaţi în cazul când cel de al doilea rest de acid galacturonic de la
capătul reducător este metil-esterificat. Liazele Pel X şi Pel W acţionează doar
asupra 1-metilgalacturonaţilor . Pectatliaza din Pseudomonas cellulosa
acţionează în deosebit asupra resturilor de acid galacturonic neesterificat,
manifestând activitate maximă la temperatura de 620C şi pH 10,0 . S-a
determinat că activitatea Pel A produsă de A. niger 4M-147 creşte
proporţional cu creşterea mărimii moleculei de substrat .
Pe lângă enzimele pectolitice enumerate în degradarea substanţelor pectice
sunt implicate şi
alte enzime: pectinacetilesteraze, ramnogalacturonan acetilesteraze,
endopoligalacturonatliaze,
ramnogalacturonanliazele şi ramnogalacturonazele
Graţie capacităţii de a scinda substanţele pectice enzimele pectolitice sunt pe
larg utilizate
în procesele de prelucrare a materiei prime vegetale.
La fabricarea sucurilor şi conservelor din fructe şi legume enzimele pectolitice
sunt solicitate
pentru macerarea pulpelor, evitarea formării suspensiilor coloidale,
prevenirea gelificării pectinei în siropurile concentrate, sporirea productivităţii
preselor şi filtrelor, limpezirea rapidă şi stabilă a
sucurilor. Utilizarea pectinazelor asigură obţinerea produselor calitative cu
păstrarea aromei, culorii naturale şi majorarea randamentului de extracţie cu
circa 10-20% Folosind pectinaze şi celulaze a fost elaborat un nou procedeu
de extragere a pigmenţilor carotenoizi din ţesuturile plantelor. S-a stabilit că
pigmenţii astfel obţinuţi sunt mult mai stabilicomparativ cu cei extraşi cu
utilizarea solvenţilor organici
.Undomeniu tradiţional de aplicare a pectinazelor este vinificaţia. Prelucrarea
strugurilor cu
preparate enzimatice pectolitice oferă un şir de avantaje printre care
scurtarea timpului de presare şi mărirea cantităţii de must (cu circa 10-20%),
facilitarea filtrării şi limpezirii mustului, intensificarea
procesului de fermentare, sporirea extracţiei pigmenţilor ceea ce permite
obţinerea vinurilor intens
colorate, îmbunătăţirea calităţilor organoleptice.
Savanţii australieni G. Skurray şi S. Clare au descoperit că adăugarea
enzimelor pectolitice
în vasele cu struguri zdrobiţi favorizează extragerea din învelişul bobiţelor a
resveratrolului -
antioxidant ce se conţine în vinul roşu şi îi conferă calităţi curative (reţine
evoluarea bolilor cardiovasculare,oncologice ş. a.). Conform autorilor, la
majorarea nesemnificativă a dozei de enzime cantitatea resveratrolului din
vin poate fi mărită cu circa 37% fără a afecta calităţile gustative alevinului .
De perspectivă este utilizarea enzimelor pectolitice, în complex cu cele
celulozolitice şi
hemicelulozolitice, pentru hidroliza enzimatică a protopectinei din materia
primă vegetală
pectincomponentă în scopul obţinerii pectinei cu aplicare în farmaceutică în
calitate de emulgator,
agent de comprimare. Hidroliza enzimatică spre deosebire de cea acidă
decurge în condiţii blânde
de pH, nu necesită includerea agenţilor chimici agresivi, iar prin varierea
dozei de enzime poate fi
redusă cantitatea produselor secundare .
Pectinazele sunt recomandate ca agenţi biologici efectivi capabili să
dezintegreze selectiv
substanţele intracelulare ale ţesuturilor vegetale cu formarea celulelor izolate,
viabile. Ele pot fi
folosite în cadrul cercetărilor ştiinţifice la etapa de pregătire a ţesuturilor
vegetale pentru examinare la microscop, în domeniul geneticii plantelor, în
lucrările de selecţie şi mutageneză indusă, hibridizarea intraspecifică, pentru
obţinerea protoplaştilor stabili şi viabili . Unii cercetători folosesc enzimele
pectolitice la extragerea ARN-ului şi ADN-ului vegetal
pentru modificarea substanţelor contaminante (polizaharide, polifenoli,
metaboliţi secundari) ce pot coprecipita cu acizii nucleici afectând procedura
de extragere.
Un alt domeniu de aplicare al enzimelor pectolitice este industria textilă.
Complexele de
enzime pectolitice şi hemicelulozolitice produse de tulpinile de fungi sunt
eficiente la separarea
fibrelor din unele specii de lemn, plante anuale (in, cânepă) utilizate în
industria textilă
Tratarea tulpinilor de in cu pectinaze permite de a înlătura amestecurile
necelulozice ce conferă
fibrelor asprime, de a majora flexibilitatea, de a segrega fibrele tehnice în
complexe mai subţiri, mai fine, ceea ce îmbunătăţeşte calităţile de toarcere.
Prelucrarea enzimatică a fibrelor poate fi o
alternativă a tratării chimice şi prezintă unele avantaje comparativ cu
aceasta: procesul decurge în
condiţii de temperatură scăzută (35-400C), pe când prelucrarea chimică
necesită fierberea fibrelor în soluţii bazice; fibrele obţinute în urma tratării
enzimatice sunt mai trainice, mai elastice.
Tratamentul biologic permite reducerea consumului de agenţi chimici
implicaţi în procesul
tehnologic.
Interes prezintă invenţia unui grup de cercetători francezi care au brevetat un
procedeu de
obţinere a ţesăturilor vopsite cu zone de densitate diferită a culorii. Procedeul
constă în tratarea
ţesăturii cu un amestec de enzime ce conţine pectinaze, galactaze,
arabinaze .
A fost demonstrată eficacitatea folosirii preparatelor enzimatice pectolitice, în
special a
poligalacturonazelor, în îmbinare cu lipazele, la prelucrarea pieilor şi
blănurilor.
Poligalacturonazele asigură hidroliza polizaharidelor texturii pieii, ceea ce
ameliorează plasticitatea pieilor, le reduce masa, le conferă maleabilitate,
contribuie la majorarea randamentului suprafeţei intensifică procesul
tehnologic.
Importantă este obţinerea şi comercializarea enzimelor pentru industria
detergenţilor .
Astfel, Baeck A., Herbots I. au propus noi compoziţii ale detergenţilor ce
conţin enzime
pectolitice şi facilitează curăţirea suprafeţelor dure, spălarea veselei,
eliminarea petelor dificile de
origine vegetală (pete de suc, iarbă) de pe rufe.
În pofida faptului că enzimele pectolitice sunt unii dintre principalii factori de
virulenţă ai
bacteriilor şi ciupercilor ce provoacă diferite boli ale plantelor, efectul
exercitat de aceste enzime
este contradictoriu. Astfel, în studiul influenţei unor preparate enzimatice cu
acţiune
hemicelulozolitică, celulozolitică şi pectolitică asupra statutului imunologic al
plantelor infectate cu putregai alb (Sclerotinia libertiana) şi putregai negru
(Rhizopus nigricans) Talieva M.N. şi coautorii au stabilit că tratarea cu
preparate enzimatice a ţesuturilor vegetale infectate a avut efect
pozitiv asupra sistemului imun: apariţia rezistenţei nespecifice faţă de
patogeni, intensificarea
reacţiilor de apărare ca răspuns la infecţie, formarea calusului – reacţie
orientată spre izolarea
agentului patogen şi detoxicarea produselor sale metabolice.
Influenţa benefică a enzimelor pectolitice asupra sistemului imun al plantei
poate fi
explicată prin faptul că în urma degradării enzimatice a peretelui celular se
formează oligozaharide
– molecule biologic active, reglatori ai organogenezei şi elisitori ce induc
sinteza antibioticilor,
terpenoizilor şi substanţelor fenolice
Nugmanova T. şi colaboratorii au obţinut un biopreparat complex,
bicomponent, ce
constă dintr-un preparat în bază de ciuperci endofite, care facilitează nutriţia
plantei şi un preparat
fungicid în bază de trihodermă, ce asigură rezistenţa plantei la putregaiuri,
fuzarioze, fitoftoră,
mucegai alb, etc. Partea activă a preparatului este constituită de citochinine,
acidul indolilacetic, cât şi enzimele pectolitice, proteolitice şi celulozolitice.
În rezultatul investigării influenţei enzimelor pectolitice asupra înfloririi unor
plante
fotoperiodic sensibile - Rudbeckia bicolor şi Perilla nankinesis s-a stabilit că
înflorirea plantelor de Perilla în condiţii fotoperiodice nefavorabile sporeşte cu
circa 50%. Autorii presupun că la
scindarea substanţelor pectice se formează oligogalacturonide morfogenic
active cu rolul de reglare post-hormonală a tranziţiei spre înflorire.
Posibilitatea inducerii înfloririi plantelor în condiţii nefavorabile prin tratarea
cu preparate enzimatice în microconcentraţii oferă posibilităţi
colosale fiziologilor plantelor, fitotehnicienilor.
Actualmente pentru producerea nutreţurilor uşor asimilabile, cu valoare
nutritivă înaltă, de
rând cu procedeele fizice şi chimice efectiv se aplică şi cele biologice – cu
utilizarea levurilor şi
altor microorganisme.
Aplicarea preparatului elaborat pe bază de microorganisme celulozolitice şi
pectolitice la
prelucrarea biologică a nutreţurilor grosiere asigură sporirea de 2,0-2,5 ori a
cantităţii de proteine şi glucoză, reducerea conţinutului de celuloză şi
îmbogăţirea nutreţului cu vitamina D, B, E etc. .
Un rol deosebit le revine enzimelor ce sunt adiţionate la nutreţurile complexe,
dificil
digerabile, pentru facilitarea asimilării lor. Utilizarea enzimelor în acest scop în
gospodăriile avicole duce la majorarea productivităţii de carne de pasăre şi
ouă. Astfel, la lotul de puici în raţia
alimentară a cărora s-a introdus Celoviridina (preparat enzimatic cu activitate
pectolitică şi
celulozolitică) numărul total de ouă a fost cu 7,8% mai mare comparativ cu
martorul, masa ouălor a crescut cu 1,5%, s-au micşorat cheltuielile de nutreţ,
s-a îmbunătăţit calitatea cărnii [245].
Există date referitoare la utilizarea preparatului Pectofoetidină S 3x ca adaos
în alimentarea
puilor-broiler. Acesta a contribuit la majorarea cu 1,83 a gradului de asimilare
a celulozei, a
determinat creşterea masei puilor cu 5,26-8,46% .
Din cele prezentate reiese că degradarea substanţelor pectice este un proces
biochimic
important din punct de vedere fiziologic, fitopatologic, precum şi din punct de
vedere practic în
diverse ramuri ale industriei. Procesul de scindare a pectinelor cu excepţia
cazurilor când este
nevoie de o hidroliză fină, parţială (ex. obţinerea pectinei destinate industriei
farmaceutice,
obţinerea piureurilor dispersate din fructe şi legume) ce poate fi realizată
utilizând anumite tipuri de enzime pectolitice, necesită implicarea unui sistem
enzimatic complex ce conţine poligalacturonaze, pectinesteraze, pectinliaze.
Gama largă de aplicare a enzimelor pectolitice microbiene în diverse ramuri
ale industriei,
agriculturii, cercetărilor ştiinţifice argumentează necesitatea şi actualitatea
cercetărilor de selectare a unor microorganisme cu potenţial biosintetic înalt
şi de creare a tehnologiilor moderne, eficiente şi ieftine de obţinere a
complexelor enzimatice pectolitice stabile, cu conţinut de PE, PG, PL.
1.2. Microorganisme – surse de enzime pectolitice
Enzimele pectolitice sunt larg răspândite în lumea vegetală şi
microbiană. În organismele
vegetale enzimele pectolitice se întâlnesc în pereţii celulari (în faza lichidă a
acestora sau legate de polimerii constituenţi). Pectinazele în ansamblu cu alte
enzime ale pereţilor celulari – glucozidaze, glicanaze, fosfoeteresteraze ş. a.
au rol important la realizarea diferitor procese fiziologice aflate în conexiune
cu modificarea pereţilor celulari: creşterea plantelor, germinarea seminţelor,
maturizarea
fructelor, înflorirea plantelor, formarea oligozaharidelor biologic active etc. .
Ţesuturile vegetale conţin diferite forme de poligalacturonaze (PG) variate
după masa
moleculară, termo- şi pH-stabilitate. În acest sens se remarcă că din tomatele
mature sortul
„Marion” au fost izolate două poligalacturonaze cu masa moleculară de 84 şi
44 kDa, în fructele
Lycopersicon esculentum Mill au fost identificate alte trei forme (izoenzime)
de PG, în partea
apicală a coleoptilului de ovăz - o exo-PG cu masa moleculară de 63 kDa. Exo-
PG analoge cu cea
din urmă au fost izolate din rădăcinile de morcov, fructele de piersic şi păr. În
ţesuturile fructelor au fost detectate şi pectinesteraze (PE). Astfel, două forme
de PE (cu masa moleculară de 51 şi 30
kDa) au fost izolate din hurma Dyospyrus kaki, alte două izoforme ale PE cu
masa moleculară de 36 şi 29 kDa au fost descoperite în epiteliul seminţelor şi
păstăile verzi de Phaseolus vulgaris .
La plantele superioare se întâlnesc preferenţial endo-, exo-PG şi PE şi foarte
rar pectatliaze
După proprietăţile fizico-chimice pectinazele vegetale sunt mai active în medii
neutre sau
slab bazice (pH 7,0-9,0), spre deosebire de cele microbiene care au optim de
acţiune la valori ale
pH-ului cuprinse între 4,0-5,0. PE-le de origine vegetală sunt mai rezistente la
temperaturi înalte –
unele îşi păstrează circa 60% din activitatea iniţială, fiind menţinute la 800C
timp de 5 min.
Actualmente, producerea preparatelor enzimatice este bazată pe exploatarea
potenţialului
biosintetic al microorganismelor care prezintă un şir de avantaje în
comparaţie cu sursele vegetale
sau animale: independenţă faţă de condiţiile sezoniere şi geografice;
posibilitatea utilizării materiei prime ieftine; randamente sporite ce pot fi
asigurate prin ameliorarea tulpinii producătoare (prin inginerie genică,
mutageneză indusă) şi optimizarea condiţiilor de fermentare; tehnici simple
de separare şi purificare a produsului final; echipamentul enzimatic bogat - un
microorganism este capabil să sintetizeze până la 1000 tipuri de diferite
enzime cu proprietăţi şi specificităţi diferite .
Microorganismele producătoare de enzime se izolează din diferite habitate
naturale, unde
sunt prezente în abundenţă substraturile de acţiune ale enzimei precăutate.
Deoarece enzimele
pectolitice reprezintă factori de virulenţă capabili să distrugă substanţele
pectice ale pereţilor
celulari şi să asigure penetrarea şi invazia ţesuturilor vegetale de către
microorganisme, producătorii pectinazelor pot fi selectaţi, în special, printre
bazidiomicetele distrugătoare de lemn, printre bacteriile şi fungii ce provoacă
diferite boli ale plantelor – fuzarioze, putregai negru, putregai alb .
O atenţie deosebită se acordă studiului bacteriilor producătoare de enzime
pectolitice ce se
caracterizează printr-o viteză înaltă de sinteză a pectinazelor. Numărul
speciilor de bacterii capabile să producă pectinaze este destul de mare, însă
acestea de regulă sintetizează pectatliaze (Pel), ce acţionează asupra
substanţelor pectice cu gradul de esterificare mic. Astfel, pectatliaza tulpinilor
din genul Arthrobacter manifestă activitate maximă pe substratul cu grad de
esterificare 44-45%, Pel produsă de tulpina Bacillus polymyxa – pe pectina cu
gradul de esterificare 26%
.Un loc aparte printre bacteriile producătoare de enzime pectolitice îl ocupă
bacteriile din
genul Erwinia (E. aroide, E. chrysanthemi, E. caratovora şi al.) care provoacă
diferite boli ale
plantelor atât în perioada de vegetaţie, cât şi în perioada de păstrare a
acestora.
Analiza preparatelor pectolitice obţinute din Erwinia a permis descoperirea
câtorva forme
moleculare de pectatliaze, poligalacturonaze, pectinmetilesteraze (PG şi PME
s-au depistat doar la
unele specii de Erwinia testate), endoglucanaze, rolul de bază în procesul de
macerare revenind,
însă, pectatliazelor, ceea ce s-a confirmat prin experienţe in vitro cu enzime
pure, precum şi prin
experienţe de clonare a genelor pectatliazelor în celulele de E. coli, utilizate
ulterior pentru
infectarea ţesuturilor vegetale. Pectatliaza sintetizată de bacteriile Erwinia
este prezentată de diferite izoforme, structura cărora este determinată de o
genă individuală .
Capacitatea înaltă de sinteză a enzimelor pectolitice este caracteristică
pentru diferite tulpini
ale bacteriei E. chrysanthemi. Tulpinile E. chrysanthemi EC 16 şi ENA 49
produc intens Pel, atât în prezenţa inductorilor, cît şi în lipsa lor, viteza
secreţiei Pel-lor fiind însă de 6-10 ori mai înaltă în cazul sintezei induse
comparativ cu cea constituitivă. Producătoare activă de pectinaze este tulpina
E. chrysanthemi B 374 ]. E. chrysanthemi 3937 sintetizează şapte izoforme
depectatliaze, dintre care cinci de bază şi două secundare . O nouă enzimă
pectolitică –
pectintranseliminaza a fost descoperită la tulpina E. chrysanthemi 3931.
Ca producător de pectatliaze a fost brevetată tulpina E. caratovora E.c. 2-82
care produce
activ Pel, fiind cultivată pe medii nutritive ieftine . E. caratovora 14, fiind
cultivată pe mediul
sintetic ce conţine pectat în calitate de sursă de carbon produce endo-Pel şi
PG extracelulare şi patru pectindepolimeraze endocelulare [.
Activi producători de enzime pectolitice sunt şi bacteriile din genul
Azospirillum (A.
irakense, A. brasilense), Aeromonas (A. liquefaciens), Clostridium, Bacillus (B.
circulans, B.
polymyxa, B. subtilis), Pseudomanas (P. fluorescens, P. marginalis) etc.
Clostridium pectinofermentans 15 este utilizată pentru producerea la scară
industrială
a unui preparat enzimatic complex ce conţine exo-PG, PE,
pectintranseliminaze, xilanaze .
Studiul complexului enzimatic pectolitic sintetizat de bacteria C.
multifermentans a permis de a
evidenţia un complex cu masă moleculară de 400 kDa constituit dintr-o
pectatliază asociată cu o
pectinesterază]. Din lichidul cultural al bacteriei C. felsineum au fost izolate
două PG cu masa
moleculară de 33 şi 24 kDa, ambele active la pH - 5,0 .
Prezintă interes descoperirea unui grup de cercetători japonezi care au
depistat la o
tulpină alcalofilă de Bacillus KSM-P358 o enzimă pectolitică bifuncţională,
sinteza căreia este
codată de o singură genă. Enzima dată conţine două domene separate care
posedă diferite activităţi enzimatice: unul – pectatliazică şi celălalt –
polimetilesterazică. Masa moleculară a enzimei constituie 110 kDa, pH-ul şi
temperatura optimă de acţiune este 10 şi 400C pentru Pel şi respectiv 8,5,
450C – pentru PME.
Un şir de bacterii posesoare ale activităţii pectolitice au fost detectate printre
bacteriile
saprofite de rizosferă şi rizoplan a rădăcinilor plantelor. Totodată este
cunoscut faptul că bacteriile
saprofite sintetizează de circa 200-1000 ori mai puţine enzime pectolitice
comparativ cu bacteriile
fitopatogene
Ca producători de enzime pectolitice pot fi utilizate şi levurile care spre
deosebire de alte
microorganisme producătoare de pectinaze sintetizează şi elimină în mediul
de cultură o singură
enzimă pectolitică - poligalacturonaza. Aşa, Datunashvili şi coautorii au stabilit
că 90% din
proteinele eliberate în lichidul cultural de levura K. marxianus revin endo-PG .
Graţie acestei
particularităţi unicale levurile pot fi folosite pentru a obţine preparate
omogene după activitatea
enzimatică.
Lucrările de selectare a unor producători de pectinaze au scos în evidenţă un
şir de levuri
capabile să sintetizeze PG – Cryptococcus albidus, Saccharomyces marxianus,
Sacch. cerevisiae,
Sacch. bayanus, Sacch. vini, Sacch. oviformis, Rhodotorula glutinis, Candida
lipolytica,
Zygofabospora marxiana VKM U-848.. Din lichidul cultural al levurei Sacch.
fragilis au fost separate trei izoforme ale PG, ce hidrolizau neordonat acizii
pectici şi aveau pH
optim de acţiune cuprins între 4,0-5,0, temperatură optimă - 500C. Din filtratul
de cultură al
Sacch. pastorianus prin metoda cromatografică pe schimbători de ioni şi gel-
filtrare a fost purificată o PG ce era asociată cu hidraţi de carbon (79%) şi
avea masa moleculară de 200 kDa In calitate de producători ai enzimelor
pectolitice se utilizează, în special, micromicetele
care sintetizează un spectru larg de pectinaze exocelulare (PE, PG, Pel) ce pot
fi recuperate din
lichidul cultural prin tehnici simple şi ieftine de purificare. Enzimele pectolitice
sunt sintetizate de micromicetele din diferite genuri, diferite grupe ecologice.
Într-un şir de lucrări se menţionează faptul sintezei PG şi PL la unii
reprezentanţi ai hifomicetelor acvatice – Lemoniera aquatica,
Mycocentrospora angulata, Tetrachaetum elegans,Tetraclodium splendens,
Varicosporium elodea ş. a., caracterul sintezei enzimatice fiind diferit –
constituitiv pentru PG şi inducibil pentru PL Prin capacitate înaltă de sinteză a
pectinazelor se caracterizează bazidiomicetele, în special
cele distrugătoare de lemn (genurile Bjerkadera, Coriolus, Pleurotus etc.) .
Danileak şi
coautorii au propus în calitate de producători de pectinaze tulpinile Coriolus
hirstus 069,
Coriolus versicolor (Fr) Ruel, nei 087, Pleurotus ostreatus (Fr) Kumm K-69,
Irpex lacteus Fr 0187 care sintetizează preponderent PG (atât exo-PG, cât şi
endo-PG) şi mai puţin PE.
Există date referitor la prezenţa activităţii pectolitice la unele ciuperci de
micoriză –
micromiceta de micoriză vezicular-arbusculară Glomus mosseae , unii fungi
de
ectendomicoriză din genul Wilcoxina ş. a. .
Majoritatea preparatelor enzimatice comercializate prezintă produse
sintetizate de fungii
filamentoşi, în special de fungii fitopatogeni – Aspergillus, Botrytis, Fusarium,
Penicillium,
Rhizopus, etc. ce se disting prin activitate pectolitică majoră.
Un grup de autori studiind sinteza pectinazelor şi capacitatea de colonizare a
puietului
de Allium cepa, de către două tulpini de Fusarium oxysporum FOC 6 şi FOC 8,
au stabilit corelaţia dintre mărimea valorii activităţii pectolitice a
fitopatogenilor şi evoluarea infecţiei. Aşa, tulpina FOC 6 ce este mai puţin
agresivă manifestă activitatea pectolitică mai scăzută comparativ cu FOC 8
mai agresivă.
Micromicetele sintetizează mai multe forme moleculare de PG, PL, PE, diferite
după
mobilitatea electroforetică, masa moleculară, specificitatea de substrat şi alte
proprietăţi . De
exemplu, din cultura de Botrytis cinerea au fost izolate două izoenzime PG I şi
PG II, cu masa
moleculară de 34 şi respectiv 56 kDa, cu pH optim de 4,5 şi 4,0, două forme
de PE cu optim de
acţiune la pH 7,0 şi 6,5]. Un alt fitopatogen cunoscut Phytophtora infestans –
sintetizează PE cu
masa moleculară de 47 şi 37 kDa, active la pH de 5,6 şi 8,7 [225]. O Pel cu
masa moleculară de 32kDa, pH optim de acţiune – 8,0 este produsă de
micromiceta fitopatogenă Pythium splendens ce
cauzează putrezirea fructelor de castravete
Deseori pentru obţinerea enzimelor pectolitice se folosesc culturile de
Aspergillus care se
caracterizează prin adaptabilitate înaltă la condiţiile noi şi capacitate de
metabolizare a unei game
vaste de substraturi ]. Printre aspergilii producători de enzime pectolitice se
enumeră – A.
nidulans, A. foetidus, A. awamori , A. carbonarius ce sintetizează două forme
de PG
(masa moleculară de 75 şi 60 kDa) , diferite tulpini de A. alliaceus ce produc
un complex de
PG cu componente prezentate printr-o multitudine de forme moleculare de
endo- şi exo-PG ,
A. japonicus, complexul pectolitic al căruia constă din două endo-PG cu masă
moleculară – 38 şi 65 kDa, două PE – masa 46 şi 47 kDa, o PL - 50 kDa .
La speciile de Aspergillus au fost detectate nouă forme moleculare de PG,
cinci dintre care
având structură diferită, posedau particularităţi enzimatice asemănătoare .
În rezultatul screening-ului a 40 de tulpini de Aspergillus Reazanova L. şi
coautorii au
stabilit activitate pectolitică la 11 dintre tulpinile studiate, cu precădere la
diferite tulpini de A.
niger, mai puţin la tulpinile de A. awamori, A. foenicus, A. japonicus, A.
heteromorphus ].
Reprezentanţii genului Penicillium prezintă interes ca producători ai
complexelor de PL care
acţionează asupra pectinei direct şi nu necesită implicarea preventivă a altor
enzime din complexul pectolitic . De rând cu aceasta speciile de Penicillium
sintetizează diferite izoforme de endo- şi exopoligalacturonaze,
pectinesteraze . Drept producători activi de enzime pectolitice sunt
cunoscuţi P. adametzii, P. citrium, P. lanosum, P. janthinellum, P. ulaiense, P.
frequentans, P.
griseoroseum ].
Pe lângă tulpinile naturale, adesea ca producători de preparate enzimatice se
utilizează
diferite forme mutante, obţinute prin tehnici de mutageneză indusă, atât
fizică, cât şi chimică.
Acestea se deosebesc printr-o capacitatea biosintetică mai înaltă comparativ
cu formele paterne. Ca exemplu, prin mutageneză indusă a fost obţinută o
variantă de Neurospora crassa F USA 2256 ce manifesta activitate pectolitică
de 5-6 ori superioară faţă de cea a tulpinii iniţiale, prin
acţiunea combinată a radiaţiei UV şi nitrozoetilureii a fost obţinută o variantă
de A. foetidus înalt
producătoare de enzime pectolitice şi celulozolitice , la tratarea cu raze UV a
tulpinii
Trichoderma longibrachiatum a fost obţinută o mutantă ce producea un
complex activ de
carbohidraze - celulaze, β-glucozidaze, xilanaze, pectinaze, manaze [217].
Însă, de rând cu acestea, lucrul cu variantele mutante prezintă un şir de
dezavantaje – dificultatea selectării unor variante înalt producătoare în cazul
când tulpina parentală posedă ea însăşi potenţial biosintetic înalt, lipsa
posibilităţii de dirijare (adiţional mutaţiilor dorite pot apărea şi unele nedorite
– ca ex. Intensificarea sintezei unor substanţe toxice, etc.), precum şi
instabilitatea formelor mutante ce pot reveni la stareainiţială, ceea ce
constituie un argument în favoarea folosirii în calitate de surse de substanţe
biologic active a tulpinilor naturale .
În conformitate cu cele menţionate se remarcă că cele mai avantajoase surse
de pectinaze
sunt micromicetele ce sintetizează un complex de enzime pectolitice
exocelulare (PG, PE, Pel, etc.) prezentate prin diverse izoforme spre deosebire
de bacterii ce produc, în special, pectatliaze şi levuri ce sintetizează
poligalacturonaze.
2. Metode de cercetare:
În cadrul cercetărilor au fost folosite metode aplicate în practica
microbiologică şi biochimică
2.1. Condiţiile de păstrare şi multiplicare a culturii:
Cultura de 14 zile crescută la
temperatura de 300C pe coloane oblice de malţ-agar este conservată în
frigidere la +40C. Pasajele pe mediu proaspăt se efectuează la fiecare 6
luni.Tulpina este înmulţită pe coloane oblice de malţ-agar. Multiplicarea se
efectuează prin porţiuni de miceliu cu conidii. Cultivarea se realizează în
termostate la temperatura +300C timp de 10–14 zile.
2.2. Studierea particularităţilor morfologo-culturale şi fiziologo-
biochimice:
Studiul
particularităţilor morfologice s-a efectuat pe mediile agarizate Czapek,
Reistrich, malţ-agar, mediul cu extract de cartof, mediul cu extract de cartof-
dextroză. Prin metoda diluţiilor în serie au fost pregătite diluţii zecimale de
spori spălaţi cu apă distilată sterilă de pe suprafaţa unei culturi bine sporulate
crescută pe coloane oblice de malţ-agar. Din diluţiile 10-10, 10-12 s-au dispersat
câte 0,1 ml pe cutii Petri - câte 5 repetări pentru fiecare variantă de mediu.
Cutiile au fost incubate la
temperatura de 300C, urmărindu-se zilnic evoluarea creşterii şi sporulării
coloniilor. La a 4-a şi a
12-a zi de cultivare s-au realizat măsurări ale dimensiunilor coloniilor.
Examinarea coloniilor s-a
făcut direct şi cu lupa. Structurile microscopice s-au examinat pe preparate
necolorate la
microscopul optic cu diferite obiective.
Lucrările de selecţie a coloniilor de Penicillium viride cu potenţial sporit de
sinteză a
enzimelor pectolitice s-au realizat folosind mediul agarizat cu malţ de bere
70Balling suplimentat cu 1% pectină de sfeclă. Ca criteriu de selecţie a servit
viteza de creştere, intensitatea sporulării,
diametrul coloniilor, activitatea pectolitică manifestată . Coloniile selectate au
fost transferate
pe coloane oblice de malţ-agar şi menţinute în termostate la temperatura de
300C timp de 14 zile.
Ulterior, pentru aprecierea nivelului de biosinteză a pectinazelor culturile au
fost inoculate în medii lichide de biosinteză. Stabilitatea capacităţii de
producere a coloniilor de P. viride a fost verificată realizându-se câteva pasaje
ale culturii pe medii solide, urmate de inocularea în mediul lichid şi
determinarea cantitativă a activităţii pectolitice.
Exigenţele nutritive ale micromicetei Penicillium viride CNMN FD 04 P au fost
stabilite în
condiţii de cultivare submersă. Ca mediu de bază pentru cultivarea tulpinii a
servit mediul mineral
Czapek. Sursele de carbon (monozaharide, dizaharide, polizaharide, alcooli)
au fost introduse în
mediul de bază în cantitate de 1%. Sursele de azot de natură organică s-au
introdus - în cantitate de 0,5% (autolizatul de drojdie, extractul de porumb) şi
3% (făina de soia, fasole). Pentru a stabili
influenţa surselor de azot anorganic, NaNO3 din mediul de bază a fost
substituit prin sursele testate în cantităţi echivalente după azot. Creşterea a
fost evaluată după cantitatea de biomasă absolut uscată (la temperatura de
1050C). Paralel au fost studiate particularităţile morfologo-culturale ale
micromicetei P. viride CNMN FD 04 P la cultivarea în fază lichidă.
Determinarea primară a toxicităţii.
Toxicitatea primară a fost apreciată conform testului cu
paramecii (Paramaecium caudatum). Drept criteriu de apreciere a
sensibilităţii a servit timpul de la începutul interacţiunii micromicetei studiate
(sub formă de extract apos) cu paramecii până la
moartea acestora, constatată după stoparea mişcării parameciilor şi
descompunerea lor.
Micromicetele extrem de toxice provoacă moartea paramecilor în primele 3
minute de
contact, cele toxice – peste 8-20 minute, slab toxice – peste 1-3 ore, foarte
slab toxice – peste 16-24 ore şi netoxice nu provoacă moartea paramecilor
timp de 24-48 ore ..
2.3. Condiţiile de cultivare a micromicetelor:
În cercetările de triere a tulpinilor fungice
a fost folosit mediul mineral Czapek (g/l, NaNO3 – 3,0; KH2PO4 – 1,0; MgSO4 ·
7H2O – 0,5; KCl – 0,5; FeSO4 – 0,01; zaharoza – 30,0) cu unele modificări:
zaharoza a fost substituită prin făină de
porumb: pectină de mere, în raport de 1:1 (2:2 g), precum şi mediul nutritiv
(g/l, pectină de sfeclă – 5,0; făină de porumb – 15,0; glucoză - 1,0; (NH4)2SO4 -
1,0; MgSO4 · 7H2O - 0,7; ZnSO4 - 0,25)
folosit de colaboratorii laboratorului Enzimologie al Institutului de
Microbiologie şi Biotehnologie
al A.Ş.M. pentru cultivarea micromicetei Rhizopus arrhizus F 67 –
producătoare de pectinaze
Cultivarea submersă, în retorte Erlenmayer cu capacitate de 0,75, 1,0 l ce
conţineau 0,2 l
mediul nutritiv, s-a efectuat pe agitatoare rotative (180 r.p.m.), la
temperatura de 28-300C.
Preinoculul a fost prezentat de cultura statică crescută pe coloane oblice de
malţ-agar. În
calitate de inocul a servit suspensia de spori cu densitatea de 106 spori / ml,
obţinută prin spălarea cu apă distilată sterilă a culturilor de 7-14 zile crescute
pe medii înclinate. Numărarea sporilor s-a
realizat cu ajutorul camerei Goreaev. La finele procesului de cultivare
biomasa a fost separată de lichidul cultural prin filtrare, uscată la temperatura
de 1050C şi cântărită. În lichidul cultural s-a dozat activitatea pectolitică.
Influenţa temperaturii asupra producerii de pectinaze a fost urmărită în
dinamică, incubând cultura la temperatura de 20, 25 şi 300C.
Pentru a studia influenţa aerării s-au folosit retorte Erlenmayer cu capacitate
diferită: 0,25,
0,5, 0,75 şi 1,0 l, în care s-a repartizat câte 0,1 l de mediu nutritiv lichid.
Probele au fost pregătite în dublu exemplar, jumătate fiind cultivate în condiţii
de agitare continuă, iar jumătate – în condiţii staţionare. Pentru stabilirea pH-
ului optim de sinteză a pectinazelor la tulpina fungică P.
viride CNMN FD 04 P, aceasta a fost cultivată pe medii cu următoarele valori
ale pH-ului iniţial:
2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 5,5; 6,0; 7,0 şi 8,0.
La etapele ulterioare ale investigaţiilor cultivarea producătorului s-a realizat în
condiţii
optime stabilite experimental: mediul de cultivare (M 1) cu componenţă
optimizată: (g/l), borhot de sfeclă – 25,0; făină de porumb – 15,0; glucoză -
1,0; (NH4)2SO4 - 1,0; MgSO4 · 7H2O - 0,7; ZnSO4 - 0,25; pH-ul iniţial al mediului
– 6,0; temperatura de cultivare – 28-300C; pentru realizarea unui grad de
aerare favorabil mediul nutritiv lichid s-a repartizat a câte 0,1 l în retorte
Erlenmayer cu capacitate 0,75, 1,0 l; durata de cultivare a constituit 4 zile. Ca
material de inoculare a servit 10% v/v suspensie de spori obţinută prin
spălarea unei culturi de 17-21 zile cu apă distilată sterilă la care s-a adiţionat
agent de umectare Tween 80 în cantitate de 0,3 %.
2.4. Metode de sporire a capacităţii biosintetice a producătorului:
Studiile de
ameliorare a potenţialului biosintetic al tulpinii Penicillium viride CNMN FD 04
P au fost efectuate în două direcţii: utilizarea biostimulatorilor de natură
chimică şi utilizarea undelor milimetrice de intensitate joasă.
Utilizarea biostimulatorilor de natură chimică:
Pentru evidenţierea unor stimulatori ai
sintezei pectinazelor la tulpina în studiu a fost testată influenţa a două grupe
de compuşi
coordinativi. Prima grupă a inclus complecşi ce conţineau atomi de Cu, V, Co,
Zn, Ni - în calitate
de atom central şi piridină, tiocarbamidă, tiosemicarbazone, anilină,
dimetilglioxime, etc. - în
calitate de liganzi. La a doua grupă de metalocomplecşi s-au referit un şir de
compuşi ai Cu şi Ni în combinaţie cu diferite forme optice ale aminoacizilor
alanină, serină, treonină. Compuşii
coordinativi utilizaţi au fost sintetizaţi în laboratoarele Chimia Compuşilor
Coordinativi
(conducător N. Gărbălău - academician al A.Ş.M., profesor universitar) şi
Chimie Bioanorganică
(conducător C. Turtă - membru corespondent al A.Ş.M.) ale Institutului de
Chimie al A.Ş.M..
Cultivarea tulpinii producătoare a fost realizată în condiţii optime
enunţate în p. II.2.3. Compuşii
coordinativi au fost adiţionaţi la mediul de bază (M 1) după sterilizarea
acestuia. Iniţial s-a studiat
influenţa a trei concentraţii ale compuşilor coordinativi: 1,0 mg/l; 5,0 mg/l;
10,0 mg/l. În calitate de martor a servit mediul de bază, fără adaos de
metalocomplecşi. La fazele ulterioare ale
investigaţiilor a fost lărgit diapazonul de concentraţii a compuşilor selectaţi ca
perspectivi
stimulatori – 5,0, 10,0, 20,0, 30,0 şi 40,0 mg/l, s-au realizat cercetări în
dinamică.
Pentru studiul modificărilor morfologice ale micromicetei în procesul
creşterii şi dezvoltării
culturii în fază lichidă au fost pregătite frotiuri în picătură strivită ce s-au
examinat la microscopul
optic. În scopul studierii influenţei compuşilor coordinativi asupra activităţii
catalitice şi
stabilităţii enzimelor pectolitice sintetizate de tulpina P. viride CNMN FD 04 P
aceştia au fost
introduşi în lichidul cultural rezultat în urma cultivării micromicetei pe mediul
de bază în
concentraţie de 10 mg/l. Probele au fost menţinute în frigider, la temperatura
de +50C, dozându-se
activitatea pectolitică la interval de 24, 120 şi 168 ore. Rezultatele s-au
exprimat procentual faţă de activitatea enzimatică iniţială, considerată drept
100% .
Utilizarea undelor milimetrice de intensitate joasă:
A fost studiată influenţa undelor
milimetrice de intensitate joasă (mW/cm2÷10 mW/cm2) asupra procesului de
biosinteză a enzimelor pectolitice a tulpinii P. viride. Ca sursă de unde a servit
generatorul „Явь-1” cu destinaţie terapeutică ce emite unde milimetrice cu
λ=5,6 (53,8 GHz) în regim periodic şi continuu, produs în or. Freazino
(Federaţia Rusă).
2.5. Separarea şi studiul proprietăţilor fizico-chimice ale complexului
enzimatic
pectolitic:
a) Selectarea condiţiilor de separare a complexului enzimatic
pectolitic din lichidul
cultural al tulpini producătoare
Lichidul cultural (LC) a fost separat de biomasă prin filtrare, folosind
filtre de hârtie. Ulterior
filtratul de cultură a fost centrifugat la 3500-4000 r.p.m. timp de 20 minute.
Separarea complexului de enzime pectolitice din filtratul de cultură al
micromicetei Penicillium viride CNMN FD 04 P s-a realizat cu alcool etilic (AE)
de 96% răcit ce permite obţinerea preparatelor enzimatice cu grad de
purificare 10 x.
Pentru a stabili parametrii optimi de recuperare a enzimelor pectolitice din
lichidul cultural al
micromicetei Penicillium viride a fost studiată influenţa unui şir de factori
fizico-chimici asupra
eficienţei sedimentării:
- concentraţia solventului – sedimentarea s-a realizat cu 1-6 volume de alcool
etilic;
- durata de contact solvent-lichid cultural - 0,5, 1, 2, 3, 4 şi 24 ore;
- influenţa pH-ului mediului de sedimentare – 2,0-8,0;
- temperatura – +5, +10 şi +200C;
- efectul exercitat de ionii de Ca2+ şi Mg2+ asupra procesului de sedimentare s-
a studiat
prin adiţionarea acestora (sub formă de cloruri) în diverse concentraţii – 0,05,
0,1, 0,15,
0,20, 0,25 şi 0,30 % la amestecul LC : AE.
Separarea sedimentului s-a realizat prin centrifugare la 6000 r.p.m. timp de
20 min.
Precipitatul obţinut a fost uscat în exicator pe CaCl2, la temperatura camerei,
timp de 2 zile.
b) Studiul proprietăţilor fizico-chimice ale complexului enzimatic
pectolitic
Influenţa pH-ului asupra activităţii pectolitice s-a determinat la valori
cuprinse între 2,8-10,0.
Tampoanele utilizate au fost: tamponul citrat-fosfat, pH 2,6-7,0; şi tamponul
glicină-NaOH (0,05
M), pH 8,0; 9,0 .
Temperatura optimă de acţiune s-a determinat prin realizarea hidrolizei la 20,
30, 40, 50, 60,
70 şi 800C.
Influenţa concentraţiei de substrat s-a urmărit variind concentraţia pectinei de
sfeclă între 0,5-
5,0 %.
Pentru studiul termostabilităţii enzimelor pectolitice soluţiile de preparat (în
lipsă de substrat)
au fost menţinute timp de 15, 30, 60 min. la diferite temperaturi (30, 40, 50 şi
600C). Ulterior în
probele de preparat supuse tratării termice s-a dozat activitatea pectolitică
prin metodele respective.
Pentru studierea pH-stabilităţii, soluţiile de preparat cu valori ale pH-ului în
diapazon de 3,0-
10,0 s-au menţinut timp de 24 ore la temperatura de 200C. După expirarea
timpului pH-ul a fost
ajustat până la valoarea optimă de acţiune a enzimelor (3,0) şi s-a determinat
activitatea pectolitică.
În cercetările de stabilire a termo- şi pH-stabilităţii rezultatele s-au exprimat
procentual faţă de
activitatea pectolitică iniţială care s-a luat drept 100% .
2.6. Metode de determinare a activităţii enzimatice:
Activităţile enzimatice au fost
determinate în filtratele de cultură sau în mostrele de preparat enzimatic
după acţiunea asupra
substraturilor corespunzătoare.
Determinarea activităţii pectolitice totale.
Activitatea pectolitică totală a fost determinată prin
metoda interferometrică . În calitate de substrat a servit pectina de sfeclă cu
gradul de
esterificare 68%. Drept unitate de activitate enzimatică s-a considerat acea
cantitate de enzimă care catalizează transformarea unui gram de pectină
până la produse nesedimentate de sulfatul de zinc timp de o oră, la
temperatura de 300C.
Amestecul de reacţie: 20 ml soluţie de pectină de sfeclă (1%), 10 ml lichid
cultural, pH – 4,0.
Hidroliza s-a realizat la temperatura de 300C, timp de o oră. După expirarea
timpului de incubare la soluţia reactantă s-au adăugat 2 ml soluţie de ZnSO4
(15%) pentru inactivarea enzimelor şi
separarea produselor pectolizei. Activitatea pectolitică s-a determinat
conform formulei:
Apc=
unde n – indicaţiile interferometrului; m – cantitatea preparatului enzimatic
(g) sau a LC (ml) ce se conţine în 10 ml soluţie; 0,06425, 19,62 şi 1000 –
coeficienţi permanenţi.
Determinarea activităţii endopoligalacturonazice.
Activitatea endopoligalacturonazică s-a dozat prin metoda
viscozimetrică. Drept unitate de activitate endo-PG
este considerată cantitatea de enzimă ce catalizează hidroliza 1 g de pectină
cu reducerea viscozităţii cu 30% timp de 1 min. la temperatura de 300C. Ca
substrat a servit soluţia de 1% de pectină de mere cu gradul de esterificare
72 %. Pentru măsurarea viscozităţii a fost folosit viscozimetrul Oswald cu d =
0,8 mm. Calculul activităţii s-a realizat după următoarele formule:
B=
unde B – scăderea viscozităţii substratului, %; tm , t – timpul de scurgere a
soluţiei martor (pectină
cu apă sau preparat enzimatic inactivat) şi a soluţiei probă (după hidroliză),
sec., t0 – timpul de
scurgere a apei, sec.
endo-PG =
unde 100 – cantitatea de pectină în 10 ml soluţie de substrat, mg; a –
cantitatea de preparat ce
determină scăderea viscozităţii substratului cu 30 %; t – timpul incubării, min.
Determinarea activităţii pectinesterazice.
Activitatea pectinesterazică s-a
determinat prin metoda titrimetrică. Metoda este bazată pe determinarea
grupelor carboxilice
eliberate în rezultatul hidrolizei soluţiei de pectină. În calitate de substrat s-a
utilizat pectina de
sfeclă 1%. Ca unitate de activitate pectinesterazică este considerată
cantitatea de enzimă ce
catalizează hidroliza 1 microechivalent de legături esterice din componenţa
moleculei de pectină
timp de 1 min. la temperatura de 300C.
Formula de calcul a activităţii pectinesterazice este următoarea:
PE =
unde : a – cantitatea de hidroxid de sodiu de 0,1 N utilizat pentru titrarea
grupelor carboxilice
eliberate în urma acţiunii enzimei (diferenţa dintre cantitatea de NaOH
folosită pentru titrarea
probei şi a martorului), ml; 100 – cantitatea de microechivalenţi de legături
esterice hidrolizate ce
corespunde la 1 ml de NaOH de 0,1 N; t – timpul de hidroliză, min.; m –
cantitatea de preparat
enzimatic inclus în analize, g;
Determinarea activităţii celulozolitice.
Determinarea activităţii enzimelor
celulozolitice s-a efectuat prin dozarea zaharurilor reducătoare (prin metoda
Somogy – Nelson)
formate în urma acţiunii celobiohidrolazelor asupra hârtiei de filtru timp de 60
minute la
temperatura 500C, endoglucanazelor asupra Na-carboximetilcelulozei timp de
30 minute la
temperatura 500C, β-glucozidazelor asupra fenil-β-glucopiranozidului timp de
40 minute la
temperatura 400C. Ca unitate de activitate a servit cantitatea de enzimă care
în condiţii standard
catalizează formarea 1 mg de zaharuri reducătoare.
Determinarea activităţii amilolitice.
Activitatea amilolitică s-a determinat prin
metoda colorimetrică cu iod, utilizând ca substrat soluţia de 1% de amidon
solubil. Ca unitate de
activitate amilolitică a fost admisă cantitatea de enzimă care în condiţii
determinate de pH,
temperatură şi durată de acţiune, catalizează hidroliza unui gram de amidon
până la dextrine cu
masa moleculară diferită.
Electroforeza.
SDS-electroforeza a fost efectuată în sistemul de tampoane Laemmli.
Pentru determinarea maselor moleculare prin electroforeză în gel de
poliacrilamidă au fost folosite
proteinele standard: fosforilaza b (94 kDa), albumina serică bovină (67 kDa),
ovalbumina (43 kDa),
carboanhidraza (30 kDa), inhibitorul tripsinei (20,1 kDa).
Masele moleculare au fost determinate în baza curbei de etalonare construită
în programul
„Grapher” folosind proteinele standard.
Determinarea cantitativă a proteinei.
Cantitatea de proteină în preparatul enzimatic a fost
determinată conform metodei Bradford ce permite determinarea proteinei în
cantităţi de 0,2-20 μg.
Mecanismul reacţiei constă în faptul că reactivul Comassie Blue G-250 în
mediul acid
interacţionează cu proteina formând legături ionice şi interacţiuni hidrofobe
cu resturile de
aminoacizi. Ca rezultat colorantul trece în formă anionică modificându-se
maximul de absorbţie de la 465 la 590 nm .
LISTA ABREVIERILOR
G – grad de polimerizare
Ogl – oligogalacturonat liaza
Pae – pectinacetilesteraza
PE – pectinesteraza
Pel – pectatliaza
PG – poligalacturonaza
PL - pectinliaza
PME – pectinmetilesteraza
PMG - polimetilgalacturonaza
SDS – dodecilsulfat de sodiu
UMM – unde milimetrice
UV – raze ultraviolete
BIBLIOGRAFIE
1.STELIANA CLAPCO-Teza de doctorat in biologie,Chisinau2006
2.DINU D.-Enzimele pectolitice de origine microbiana
3.MAGHEARU V.-Controlul analitic al proceselor biotehnologice,Buc,1988
4.BANU C.-Biotehnologii in industria alimentara,Editura tehnica,Buc,2000
