Enzymová kinetika

Enzymová kinetika• studuj časový průběh enzymové reakce za různých reakčních

podmínek • zabývá se faktory, které ovlivňují rychlost reakcí katalyzovaných

enzymy

Rychlost enzymové reakce závisí na:• koncentrace substrátů• koncentraci enzymu• Fysikálně chemické vlastnosti prostředí (iontová síla, pH, teplota...)• Přítomnost aktivátorů a inhibitorů

Proč studovat enzymovou kinetiku?• Charakterizace substrátové preference enzymů

• Identifikace a studium inhibitorů

Typy enzymových reakcí

Jednosubstrátové reakce• Jeden substrát jeden produkt (isomerasy)• Jeden substrát dva produkty (lyasy)• Jeden substrát a voda dva produkty (hydrolasy)

Dvousubstrátové reakce• Dva substráty dva produkty (oxidoreduktasy,

transferasy)• Dva substráty jeden produkt (lyasy)

Třísubstrátové reakce• Dva substráty a ATP jeden hlavní produkt a dva

produkty z ATP (ligasy)

Závislost reakce na koncentraci substrátu a enzymu

• V roce 1902 Brown studoval rychlost hydrolytického štěpení sacharosy na fruktosu enzymem fruktofuranosidasou:

• sacharosa + H2O glukosa + fruktosa

• Při konstantní koncentraci sacharosy (a různé koncentraci enzymu) byla závislost počáteční rychlosti reakce na koncentraci enzymu lineární 0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120

koncentrace enzymu

rych

lost

Závislost reakce na koncentraci substrátu a enzymu

• Pokud je koncentrace enzymu konstatní, a mění se koncentrace substrátu, je závislost počáteční rychlosti na koncentraci substrátu hyperbolická

0 20 40 60 80 100

0

10

20

30

40

50

rea

ctio

n ra

te

sucrose concentration (mM)

Enzymová kinetika

Maud MentenLeonor Michaelis

Enzymová kinetika – matematické odvození

Jako příklad uvažujme jednoduchou nekatalyzovanou reakci:

S ===> P

Rychlost reakce je charakterizována rychlostí přírůstku produktu P

Reakční rychlost je přímo úměrná koncentraci substrátu [S]

dP

dtv k S

Cíl: vypracování rovnice vyjadřující rychlost katalyzované reakce

Rovnice Michaelise a Mentenové

k1 kcat

E + S <===> ES ===> P + E k-1

Základním předpokladem je existence komplexu enzym-substrát (ES)

K1 je rychlostní konstanta pro tvorbu ES (rychlost = k1 [E][S])K-1 je rychlostní konstanta pro disociaci ES (rychlost = k-1 [ES])

Celková rychlost reakce je: ESkdt

Pdcatv

Rovnice Michaelise a MentenovéNemůžeme ale snadno měřit [ES]. Cílem je stanovit [ES] jako funkci parameterů které můžeme měřit.

•Michaelis a Mentenová použili dva základní předpoklady:

1. Předpokládáme, že k1 a k-1 jsou podstatně větší než kcat, takže enzym a substrát jsou v rovnováze.

V rovnováze je rychlost tvorby komplexu [ES] stejná jako rychlost jeho disociace, takže:

k1[E][S] = k-1[ES]

Po úpravě:

kde KS je definována jako rovnovážná disociační konstanta.

k 1

k1

E S ES

KS


2. Předpokládáme že počáteční koncentrace substrátu [S]o, je mnohem větší než celková koncentrace enzymu [E]tot, takže během prvé periody enzymové reakce (než je spotřebována podstatná část substrátu), je koncentrace volného substrátu stejná jako původní celková koncentrace substrátu (která je při expertimentu známa):

tj.. [S]o >> [E]tot takže [S] ≈ [S]o

Omezíme pozorování a výpočty pouze na počáteční rychlost reakce.


Enzym není v průběhu reakce spotřebováván, takže:

[E]tot = [E] + [ES]

Náhrada za [E] (zavedení KS):

Přeskupení:

Tedy:

E totKS

[ES]

[S] ES

ES E tot

1 KS S

vd P

dtkcat ES

vkcat ES kcat E tot

1 KS S

KS E S ES

E + S <===> ES ===> P + E


Toto je rovnice hyperboly. Pro [S] v kcat[E]tot kterou definujeme jako vmax. Máme tedy:

kde vmax = kcat[E]tot

(Připomenutí: [S] ≈ [S]o a v je počáteční rychlost reakce.)

vvmax

1 KS S

maxS

S

maxS

and S

K>>1 [S], vysokéPro

K a

S

K<<1 [S], nízké Pro

vv

vv

S

vkcat ES kcat E tot

1 KS S

[S] = Low → High

zero order

1st order

Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea

Nemůžeme předpokládat, že k1 a k -1 jsou vždy větší než kcat Místo předpokladu rovnováhy mezi E, S a ES, uvažujeme tvorbu ustáleného stavu. Předpokládáme, že (pro [S]o >> [E]tot) reakce rychle dosáhne stav během kterého je koncentrace [ES] konstantní.

Steady state

Time

v or [ES]

Předpokládáme tedy:

Reakční schéma je:

k1 kcat

E + S <===> ES ===> P + E k-1

reakční rychlost v = kcat[ES]

d ES dt

0

Konstantní koncentrace ES v ustáleném stavu

S P

EES

Reaction Time

Concentration


Úprava:

Tedy:

kde KM je známa (nepřesně!!) jako Michaelisova konstanta.

Pokud k-1 >> kcat, KM KS (= k-1/k1).

d ES dt

k1 E S k 1 ES kcat ES 0

E S ES

k 1 kcat

k1

KM

k1 kcat

E + S <===> ES ===> P + E k-1

Steady state

Time

v or [ES]

k1 [E][S] = k-1[ES] + kcat [ES]


Pro výpočet reakční rychlosti použijeme stejný postup:

Enzym není spotřebován: [E]tot = [E] + [ES]

Náhrada za [E] (z výrazu pro KM):

Úprava:

Tedy:

kde vmax = kcat[E]tot.

E totKM

[ES]

[S] ES

ES E tot

1 KM S

vkcat ES kcat E tot

1 KM S

vmax

1 KM S


Tyto dva postupy vedou k podobným rovnicím:

vvmax

1 KS S

Michaelis-Menten Briggs-Haldane

vvmax

1 KM S

vo =Vmax [S]

Km + [S]


B-H poskytuje obecnější rovnici pro rychlost enzymových reakcí. Pro usnadnění výpočtů je často používána v reciproké formě. Převrácením obou stran rovnice dostaneme:

Graf 1/v proti 1/[S] poskytuje přímku se směrnicí KM/vmax a úsekem na ose y o hodnotě 1/vmax

1

v

1 KM S vmax

1

v

1

vmax

KM

vmax

1

S

1/v

1/[S]

KM/vmax

1/vmax

Double-reciprocal Lineweaver-Burke Plot

-1/KM

vvmax

1 KM S

Km = [S]

Km + [S] = 2 [S]

Vmax

2=

Vmax [S]

Km + [S]

Km: Afinita vůči substrátu

If vo =Vmax

2

S2S1 S3

S1 S2 S3

Vmax

1/2

When using different substrate

Affinity changesKm

vo =Vmax [S]

Km + [S]

Důležitost KM

• Nezávisí na koncentraci enzymu

• Závisí na reakčních podmínkách

• Hlavní substrát má nejnižší KM

• Koncentrace substrátu pro dosažení limitní rychlosti je cca 100 KM

KM

Km: příklad hexokinasy

Glucose + ATP → Glc-6-P + ADP

1

2

3

4

5

6

Glukosa Allosa Manosa Substrátčíslo

Km = 8 8,000 5 M

CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

CHO H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

CHO HO-C-H HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

Číslo přeměny, molární aktivita enzymu, kcat

(vo)E + S ES E + P

k2

k1 kcat

kcat, číslo přeměny (turn over number, t.o.n)

Počet molekul substrátu přeměněných jednou

molekulou enzymu za jednu sekundu

Číslo přeměny vybraných enzymů

Katalasa H2O2

Karbonát-hydrolyasa HCO3-

Acetylcholinesterasa Acetylcholin

40,000,000

400,000

140,000

-Laktamasa Benzylpenicilin 2,000

Fumarasa Fumarát 800

Enzymy Substrát kcat (s-1)

Počet molekul produktu získaného ze substrátu jednou molekulou enzymu za sekundu

Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263

Jak stanovit KM a V

Vmax

Km S

vo

1/S

1vo

Double reciprocal Direct plot

1)1) použij známé množství enzymu → E

2)2) přidej substrát v různých koncentracích → S (osa x)

3)3) změř produkt v určeném čase (P/t) → vo (osa y)

4)4) (x, y) graf, hyperbolická křivka, limita → Vmax

5)5) pokud y = 1/2 Vmax spočti x ([S]) → Km

1Vmax

- 1 Km

1/2

Jednotky enzymové aktivity

Reakční doba (min)P

rodu

kt [P

]0 10 20 30 40

směrnice

tan

S → P mol

vo = [P] / min

Unit =

Jednotky aktivity

Protein (mg)

t

mol /min

yx

yx = tan

Specifická aktivita =

kcat / Km (katalytická účinnost) chymotrypsinu

O R O

H3C–C–N–C–C–O–CH3

H H

= – =––

–HGlycin

kcat / Km

1.3 ╳ 10-1

–CH2–CH2–CH3Norvalin 3.6 ╳ 102

–CH2–CH2–CH2–CH3Norleucin 3.0 ╳ 103

–CH2–Phenylalanin 1.0 ╳ 105

(M-1 s-1)

R =

Adapted from Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.379

Jak zvýšit rychlost reakce

• přídavek enzymu (zvýšení [E]tot)

• přídavek substrátu (zvýšení [S])

• modifikace enzymu (optimalizace kcat nebo KS )

vvmax

1 KS S vo =Vmax [S]

Km + [S]

Kinetika vícesubstrátových reakcí

• Nejčastěji přeměna dvou substrátů na dva produkty

• Reakce může probíhat různými mechanismy

Mechanismus následný (postupný, sekvenční) uspořádaný

• Vazba prvého substrátu A změna konformace komplexu (indukované přizpůsobení) vazba druhého susbtrátu B (volný enzym má pro něj malou afinitu) vznik komplexu EAB

• Přeměna komplexu EAB na EPQ (enzym s reakčními produkty)

• Postupné oddělení jednoho a poté druhého produktu

• Využíván např. u oxidoreduktas (substrát A je NAD+)

Mechanismus následný (postupný, sekvenční) náhodný

• Pokud nezáleží na sledu vazby substrátů na enzym a na pořadí uvolňování produktů

• Enzym má zhruba stejnou afinitu k oběma substrátům

Mechanismus ping-pongový

• Na enzym se naváže prvý substrát, dojde k reakci, oddělí se prvý produkt

• Substrát předá nějakou skupinu enzym se uvolní v pozměněné formě

• Poté připojení druhého substrátu, který převezme od enzymu skupinu z prového substrátu

• Poté uvolnění produktu a obnova enzymu• Transferasy

Documents

Enzymová kinetika