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Epigenetics의 이해와 연구

Epigenetics

Epigenetics(후성유전학)란 DNA 염기서열에 변화를 수반하지 않으면

서도 DNA 메틸화methylation나 히스톤histone 단백질의 아세틸화acetylation

등과 같은 후천적인 수식에 의해 유전자발현 메커니즘의 변화가 일어나

는 현상을 의미한다.

Chromatin의 기본 구조는 DNA와 히스톤 단백질의 복합체인

nucleosome이다. DNA가 히스톤을 감싸는 방식이 변하면 유전자 발현

의 양상도 변하는데, 이 같은 chromatin의 리모델링은 종종 DNA 메틸

화에 의해 일어난다. DNA 메틸화는 유전자발현의 억제에 관여하고, 히

스톤 단백질의 아세틸화는 전사 제어나 chromatin의 구조 변화 등을 통

해 유전자발현의 활성화나 억제에 관여한다.

동물 게놈 DNA의 CpG dinucleotides 및 식물 CpG와 CpNpG 서열의

사이토신cytosines(C)에는 메틸화가 일어난다. CpG 서열은 게놈에서 산

발적으로 존재하지만, 특히 CpG islands라 불리는 지역에서 메틸화

가 많이 발생한다. 대부분의 CpG islands는 유전자의 발현 조절 부위

인 프로모터 근처에 위치하며, 길이는 300bp~3,000bp 정도이다. CpG

islands 외에 인간과 마우스 게놈에서는 CpG dinucleotides 의 약 70%

는 메틸화된 사이토신을 갖고 있지만, 발현되는 유전자의 CpG islands

내 사이토신은 메틸화되어 있지 않다. CpG islands의 메틸화는 일반적

으로 chromatin 응집과 유전자 전사를 억제시킨다. DNA 메틸화 분석

연구는 이 CpG islands의 메틸화 상태를 분석하는 것에 집중되어 있다.

최근 후성유전학적 제어가 여러 질환의 발병 메커니즘 및 세포의 분화

제어 등과 연관성이 있다는 사실이 차례로 밝혀지고 있어, 다양한 연구

분야에서 epigenetics 분석의 중요성이 증대되고 있다.

Epigenetics 해석 실험 과정

그림 1. DNA 메틸화와 히스톤 수식

染色体

ヒストン修飾ヒストン複合体

DNAメチル化

염색체

히스톤 수식 히스톤 복합체

DNA 메틸화

• Methylation sensitive or dependent Restriction enzyme

• TaKaRa EpiTaq HS (for bisulfite-treated DNA)

• EpiScope MSP Kit

• 제한효소

• COBRA 법

• 각종시약

• SYBR Premix Ex Taq GC (Perfect Real Time)

• EpiScope Promoter qPCR Array (Human)

• Control DNA EpiScope Methylated/ Unmethylated HCT116 gDNA

• EpiXplore Methylated DNA Enrichment Kit

• EpiXplore ChlP Assay kit

• Anti-Histone antibody

• ChlP qPCR Primer

• Magnetic Stand

• EpiScope Nucleosome Preparation Kit

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Epigenetics의 이해와 연구

DNA 메틸화 부위의 검출 및 해석 과정

1. Bisulfite를 이용한 비메틸화 사이토신cytosine의 우라실uracil 변환

Bisulfite(HSO3-) 처리로 비메틸화 사이토신(C)은 우라실(U)로 변환되

지만, 메틸화된 사이토신은 변환되지 않는다.

2. PCR을 이용한 증폭 및 분석

3. MSP (Methylation Specific PCR/qPCR)에 의한 메틸화 검출M Primer와 UM Primer로, PCR 또는 qPCR로 각각 검출

4. DNA 메틸화 부위의 검출 관련제품

Bisulfite 처리 DNA의 PCR 증폭TaKaRa EpiTaq HS(for bisulfite-treated DNA) (Code R110A)

•... Bisulfite 처리한 DNA를 주형으로 높은 효율의 PCR 증폭 가능 •... 우라실 함량이 높은 DNA 증폭에 최적 : GC-rich 타겟 및 AT-rich 타겟도 손쉽게 증폭 가능

•... Anti-Taq 항체를 포함한 hot start PCR로 비특이적 증폭 억제

•... 1 kb 정도 증폭 가능 bisulfite 서열 확인에 유용

•... 증폭 산물의 3’ 말단에 A가 부가되므로 T/A cloning 가능

Bisulfite 처리로 비메틸화 사이토신(C)이 우라실(U)로 변환된 DNA를

주형으로 PCR 증폭을 할 경우, 대부분의 PCR 효소로는 증폭에 어려움

이 많지만, TaKaRa EpiTaq HS를 이용하면 효율적으로 특이적 증폭을

할 수 있다.

MSP(Methylation Specific PCR) 해석

※ PCR 증폭에는 EpiTaq HS 추천

Bisulfite sequence 해석(Cloning 후 Sequencing)

COBRA법(제한효소 전달, 전기영동 확인)

비메틸화 DNA가 주형인 경우 우라실로 변환된 염기부분에 mismatch 되는 M Primer에서는 증폭이 일어나지 않고, UM Primer에서만 증폭이 일어난다

반면, 메틸화 DNA에서는 우라실로 변환되지 않은 사이토신 염기부분에 mismatch 되는 UM Primer에서는 증폭이 일어나지 않고, M Primer에서 증폭이 일어난다.

(각 5㎕ 적용)(당사 비교 데이터)

Bisulfite 처리 후 HeLa 게놈 DNA를 주형으로, TaKaRa EpiTaq HS 이외 각 회사 PCR 효소로 증폭했다. (HeLa 게놈 DNA 100 ng/50 ㎕ 반응)

★TaKaRa EpiTaq HS에서 가장 양호한 증폭을 확인할 수 있었다.

레인 1 ： TaKaRa EpiTaq HS 5 ： C사 PCR 효소＊ 2 ： TaKaRa Taq HS 6 ： D사 PCR 효소＊

3 ： A사 PCR 효소＊ 7 ： E사 PCR 효소＊

4 ： B사 PCR 효소＊ M ： 100 bp DNA Ladder

실험예 2. PCR 효소에 따른 bisulfite 처리 DNA의 증폭 비교

* 각 회사에서 bisulfite 처리 DNA에 추천하는 PCR 효소 제품

실험예 1. Bisulfite 처리 한 HeLa 게놈 DNA를 주형으로 PCR 증폭

HeLa 게놈 DNA를 bisulfite 처리하고, CDH1, MLH1, BRCA1 유전자 상류의 CpG islands 영역을 TaKaRa EpiTaq HS로 PCR 증폭했다. (HeLa 게놈 DNA 100 ng/50 ㎕ 반응)

★1 kb가 넘는 타겟도 증폭 가능하고, 각 영역에서 양호한 증폭을 확인할 수 있었다.

레인 1： CDH1（153 bp） 5： BRCA1（613 bp）

2： CDH1（297 bp） 6： BRCA1（1,017 bp）

3： MLH1（136 bp） M： 100 bp DNA Ladder

4： MLH1（292 bp）

(각 5㎕ 적용)

[PCR 조건]

98℃ 10 sec.55℃ 30 sec. 40 cycles72℃ 30 sec.＊(＊613 bp, 1,017 bp의 경우는 1 min)

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Epigenetics

EpiScope MSP Kit (Code R100A)

•... DNA polymerase의 priming 정확성이 높고, 메틸화/비메틸화 서열을 고감도로 식별하여 검출

•...End-point PCR 및 Real Time PCR (SYBR Green I) 사용 가능

MSP 실험을 위해 먼저 bisulfite 처리로 CpG 서열의 메틸화 유무에 따

라 사이토신이 우라실로 변환되는 영역을 확인해야 한다. 그 다음 이

영역에 대한 메틸화 DNA 특이적 검출용 프라이머 (M Primer) 와 비

메틸화 DNA 특이적 검출용 프라이머 (UM Primer)를 설계하고, 각

각의 PCR에서 증폭 유무에 의해 특정 영역의 DNA 메틸화 여부를 식

별한다 (Methylation Specific PCR/qPCR). EpiScope MSP Kit는

MSP(Methylation Specific PCR) 전용 PCR/qPCR kit로, 우라실을 포

함하는 bisulfite 처리 DNA를 주형으로 사용할 경우 특이성 높게 증폭

하여 메틸화/비메틸화 여부를 고감도로 검출할 수 있다.

메틸화서열 검출용 프라이머의 설계

인터넷에서 무료 툴을 이용해서 설계할 수 있다.MethPrimer ： http://www.urogene.org/methprimer/index1.htmlBiSearch ： http://bisearch.enzim.hu/?m=msp

Chromatin 해석을 통한 Epigenetic 분석

1. 마그네틱 비즈를 이용한 Chromatin 분석

• 마그네틱 비즈를 이용한 간편하고 신속한 ChIP

• 마우스 IgG 항체 또는 Protein G 중 선택 가능

세포 내 핵에서 일어나는 단백질과 DNA의 결합을 연구하기 위한 방법

으로 ChIP (Chromatin immunoprecipitation)를 이용하면 특정 단백

질이 어느 DNA 부위에 결합하는지를 알 수 있다. 히스톤 단백질의 아세

틸화 또는 메틸화 상태에 따라 그 주변 유전자의 발현 정도가 조절되는

데, 수식 히스톤에 대한 항체를 이용하면 유전자 주변의 chromatin 상

태에 대한 정보를 얻을 수 있다.

EpiXplore ChIP Assay Kit : Anti-mouse IgG (Code 632015)EpiXplore ChIP Assay Kit : Protein G (Code 632012)

ChIP용 마그네틱 비즈에는 마우스 IgG나 Protein G (immunoglobulin

-binding protein)와 특이적으로 결합하는 항체가 고정화되어 있기 때

문에, 목적 단백질을 인식하는 마우스 IgG 항체 (수식 histone H3 항

체 등)를 준비하면 ChIP 실험을 시작할 수 있다(그림 2). 면역 침강후 용

출 DNA는 정제없이 곧바로 PCR 주형으로 사용할 수 있기 때문에, 게

놈 영역의 ChIP실험 후 농축율을 Real Time PCR을 이용해 신속히 측

정 가능하다

HeLa 게놈과 메틸화 HeLa 게놈을 각각 1μg씩 bisulfite 처리하여 주형으로 사용하

고 qPCR 기기는 Thermal Cycler Dice Real Time System II (Code TP900)사용했다.

[결과] 메틸화 HeLa 게놈 주형에서는 M Primer (실선)에서 3종의 타겟 모두 증폭되

었고, UM Primer(점선)에서는 증폭이 확인되지 않았다. 반면, 원래의 HeLa 게놈 주

형에서는 CDKN2A, MLH1 에서 UM Primer (점선)로 증폭되어, 이 영역이 메틸화되

지 않았음을 확인할 수 있었다. 간섭 반응은 거의 없고, 명확히 DNA 메틸화/비메틸

화를 식별할 수 있었다.

실험예 3. Real Time MSP에 의한 DNA 메틸화/비메틸화 해석

실험예 4. Real Time MSP에 의한 메틸화 DNA의 정량해석

析解

이론값

실험값

실험값

이론값

이론값 실측값

HeLa 게놈과 메틸화 HeLa 게놈을 혼합하고, 각각 1 μg을 bisulfite 처리하여 주형으

로 하여 HeLa 게놈에서 비메틸화되어 있는 CDKN2A 유전자 프로모터 영역을 타

겟으로 해석하였다. 각 샘플의 DNA 메틸화/비메틸화의 비율은 DNA 메틸화 및 비

메틸화 컨트롤 PCR 단편을 이용하여 검량선을 작성하고 상대정량을 실시하였다.

qPCR 기기는 Thermal Cycler Dice Real Time System II (Code TP900) 사용했다.

[결과] 실측값은 거의 이론값과 유사하게 결과를 얻을 수 있고, DNA 메틸화/비메틸

화의 5%의 비율 식별도 가능했다.

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Epigenetics의 이해와 연구

1. Sample preparation 2. Methylated DNA binding 3. Elution and analysis

Isolate and purifygenomic DNA methylated

DNA

nonmethylatedDNA

Shear DNA to100-1,000 bpfragments

TALONmagneticbead

MBD2protein

Combine shearedgenomic DNA

with protein-TALONmafmetic bead

complexes

Methylated DNAis captured by the

protein-TALONmagnetic beadcomplexes

Nonmethylated DNAremains unbound

Separate methylated DNAfrom unmethylated DNA

by magnet

Remove flow through(nonmethylated/unbound DNA)

Eluate (methylated DNA)is now ready to perform

“DNA Methylome” analyses

ChIP, 면역염색에 의한 수식 히스톤 해석

2. 수식 histone H3/H2B monoclonal antibody

• ChIP 적용 가능한 마우스 Monoclonal Antibody

• Polyclonal Ab로는 어려운 높은 재현성 실현

• EpiScope ChIP Kit를 이용한 ChIP 해석에 최적

적용• ChIP 해석에 의한 수식 히스톤의 게놈상 위치 해석

• 면역염색에 의한 수식 히스톤의 핵내 위치(영역) 해석

• Western blot

Code 제품명 용량

MA251B Anti-Phospho Histone H2B (Ser14), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

MA301B Anti-Histone H3 (mouse), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

MA302B Anti-Monomethyl Histone H3 (Lys4), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

MA303B Anti-Dimethyl Histone H3 (Lys4), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

MA304B Anti-Trimethyl Histone H3 (Lys4), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

MA305B Anti-Acetyl Histone H3 (Lys9), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

MA306B Anti-Monomethyl Histone H3 (Lys9), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

MA307B Anti-Dimethyl Histone H3 (Lys9), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

MA308B Anti-Trimethyl Histone H3 (Lys9), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

MA309B Anti-Acetyl Histone H3 (Lys27), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

MA310B Anti-Acetyl Histone H3 (Lys9/27), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

MA312B Anti-Phospho Histone H3 (Ser10), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

MA321B Anti-Monomethyl Histone H3 (Lys27), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

MA323B Anti-Trimethyl Histone H3 (Lys27), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

MA331B Anti-Monomethyl Histone H3 (Lys36), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

MA332B Anti-Dimethyl Histone H3 (Lys36), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

MA333B Anti-Trimethyl Histone H3 (Lys36), mouse monoclonal antibody 100 ㎕

Nucleosome 구조 해석

3. EpiScope! Nucleosome Preparation Kit (Code 5333)

• Nucleosome을 감고 있는 DNA를 회수

• 게놈 DNA상의 nucleosome 위치 해석에 응용

• 0.5 ∼ 2×106개 포유류 배양 세포로부터 약 90분만에 조제 가능*

*DNA의 회수에는 별도의 NucleoSpin Gel and PCR Clean-up 등 정제 키트 사용

Nucleosome의 위치는 chromatin 구조나 전사 제어에 밀접하게 연관되

어 있다고 알려져 있다. 따라서, “Nucleosome Position”은 epigenetics

연구에 있어서 중요한 분석 대상 중 하나이다.

EpiScope Nucleosome Preparation Kit(Code 5333)를 이용하면 배

양 세포로부터 nucleosome을 조제할 수 있고, 회수된 nucleosome에

서 추출한 DNA를 Real Time PCR이나 고속 시퀀싱을 통하여 게놈상의

nucleosome 위치를 분석할 수 있다(그림 3).

그림 3. Genomic DNA regions occupied with nucleosomes are quantified or identified

with downstream applications, such as qPCR, DNA sequencing and microarray.

그림 2. ChIP assay for epigenetic interactions. DNA-binding proteins and crosslinked DNA are immunoprecipitated using a primary antibody specific for the protein of interest, and mag-netic beads for easy separation. The protein-DNA crosslinks are then reversed, to release DNA fragments that are ready for direct PCR.

License Notice [L11, L15, L46, L51, L52, P5]