Esempi di modelli cinetici

Mean open time (MOT) = 1/kc

Mean closed time (MCT) = 1/ko

Inoltre, allo stato stazionario: dPO/dt = ko - (ko + kc)Po = 0

Po = ko/(ko + kc)

Cko

kc

O

1 Gating dei canali: modello a due stati

]O[k]C[kdt

]C[dco

]O[k]C[kdt

]O[dco

Gating dei canali: Simulazioni di 2 Stati

43210Tempo (ms)

43210Tempo (ms)

1.0

0.8

0.60.4

0.2

0.0

Op

en P

rob

43210Tempo (ms)

Cinetica lenta: ko=0.5/ms kc=0.5/ms Cinetica rapida: ko=5/ms kc=5/ms

Po=0.5

Po=0.5

Significato di ko:

Per ogni ms che il canale è nello stato chiuso, esso in media si aprirà 0.5 volte.

Significato di kc:

Per ogni ms che il canale è nello stato aperto, esso in media si chiuderà 0.5 volte.

Significato di ko:

Per ogni ms che il canale è nello stato chiuso, esso in media si aprirà 5 volte

Significato di kc:

Per ogni ms che il canale è nello stato aperto, esso in media si chiuderà 5 volte.

Gating dei canali: Altre simulazioni a due stati

43210Tempo (ms)

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

Op

en P

rob

43210Tempo (ms)

Alta Po: ko=5/ms kc=0.5/ms

43210Tempo (ms)

Bassa Po: ko=0.5/ms kc=5/ms

Po=0.9

Po=0.1

C

O

O

C

C O C O1

100

100

1

Voltaggio

Livelli energetici

Costanti di velocità

Corrente attraverso singoli canali

10 msCorrente attraverso molti canali

Canale K+ Depolarizz.

-100 mV

+50 mV

Gating dei canali: Modello a 3 Staticon inattivazione

Si applica a canali V-dipendenti inattivanti

C Ok+i

k-i

Iko

kc

]O[k]C[kdt

]C[dco

]I[k]O[k]O[k]C[kdt

]O[dicio

]I[k]O[kdt

]I[dii

2

Gating dei Canali: correnti medie con 3 Stati e inattivazione

ko = 0.5/ms kc =0.005/ms k+i = 0.25/ms k-i = 0.025/ms

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

Op

en

Pro

b

50403020100

tempo (ms)

Popen

k+i = 0/ms k-i = 0/ms

C Ok+i

k-i

Iko

kc

Relazioni tra costanti di velocità e costanti di tempo in un modello a tre stati con inattivazione

C Ok+i

k-i

I

MOT = 1/(kc+k+i)

MCT = 1/ ko

MIT =1/k-i (tempo medio dello stato inattivato)

MOB*=(kC/ k+i)+1 (numero medio di aperture/burst)

ko

kc

Regola generale: il tempo medio che il canale trascorre in uno stato è uguale all’inverso della somma delle costanti di velocità che si allontanano da quello stato

* Qualora il flikering sia tra C e O; altrimenti, se fosse tra O e I allora sarebbe: MOB=(k+i/ kC)+1

ko = 0.5/ms kc =0.005/ms k+i = 0.25/ms k -i = 0.025/ms

ko = 0.5/ms kc =0.005/ms K +i = 0.25/ms k-i = 0.1/ms

ko = 0.5/ms kc =0.005/ms K +i = 0.25/ms k -i = 0.25/ms

Diversi gradi di inattivazione

All’aumentare di k-i diminuisce il grado di inattivazione

C Ok+i

k-i

Iko

kc

1 ms

IO

C

CI

O

C O I20000 10

2 1000

C O I10

1000

20

2000

Canale del Na+

Voltaggio

Livelli energetici

Costanti di velocità

Corrente attraverso singoli canali

Corrente attraverso molti canali

Depolarizz.

-100 mV

+10 mV

Che informazioni possono darci registrazioni di singolo canale circa il

gating che già non abbiamo appreso dallo studio delle correnti macroscopiche?

Seguirà una reinterpretazione del gating del canale del Na+ VD basata su registrazioni di singolo canale.

Aldrich, Corey, Stevens Nature (1983)

Modello classico di inattivazione vs nuove interpretazioni

0 10 20 30 40 500 10 20 30 40 50

Modello di H. & H.

Attivazione rapidaInattivazione lenta (e volt.dip.)

Modello alternativo

Attivazione lentaInattivazione rapida (e volt.indip.)

-100

+10

“A reinterpretation of mammalian sodium channel gating based on single channel recording”

Aldrich, Corey & Stevens – NATURE (1983)

-100

+10

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

20

40

60

80

100

N.

degl

i Eve

nti

Latenza (ms)

0 10 20 30 40 500

5

10

15

20

25

30

35

40

45

N.

degl

i Eve

nti

Latenza (ms)

=2 ms =10 ms

Modello classico di inattivazione vs nuove interpretazioni

L’analisi della latenza permette di discriminare tra i due modelli

C

O

100I C

O

800I

Modello alternativoAttivazione lentaInattivazione rapida (e volt.indip.)

Modello di H. & H.Attivazione rapidaInattivazione lenta (e volt.dip.)

-100

+10

-100

+10

Gating dei canali: Modello a 3 Stati

Si applica a bloccanti del canale apertoUn semplice schema di blocco

C

O

k+B·[B]

k-B

B

canale non bloccato

C

O

burst burst

canale bloccato

Ricordarsi che la transizione O →B è data da k+B · [B], dove [B] è la concentrazione del bloccante.

u.d.m.: k+B · [B] (s-1), [B] (M) k+B (M-1·s-1)

Mean open time (MOT) = 1/(k+B · [B])Mean closed time tra i bursts (MCT) = 1/Mean closed time all’interno dei bursts (MBT) = 1/k-B

Mean opening per burst (MOB)=(k+B· [B]/)+1

3

+B

Effetto della [B] sulla cinetica

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

0 10 20 30 40 50 60

[B] (M)

+

k*[

B]

C

O

k+B·[B]

k-B

B

Effetto della concentrazione del bloccante

k-B k+B·[B] [B] o1/o=+k+B·[B] k+B=(1/o-)/[B]

s-1 s-1 s-1 s-1 M ms ms-1 M-1·s-1

500 1000 100 500 50 0.67 1.49 9.9

250 25 0.81 1.23 9.3

100 10 0.913 1.10 9.5

50 5 0.95 1.05 9.6

- 0 1 1.00 -

k+B

Ricavabile dall’analisi dei tempi medi di apertura

[B]=50 M

o=0.67 ms

[B]=25 M

[B]=10 M

[B]=5 M

[B]=0

Un semplice schema di blocco cont.

Sappiamo inoltre che in assenza di bloccante MOT=1/ quindi, possiamo ricavare k+B·[B].

Inoltre, possiamo ricavare la costante di dissociazione del bloccante KD in quanto KD=k-B/k+B (Neher & Steinbach, 1978).

Pertanto, in questo semplice schema tutte e quattro le costanti di velocità e la KD possono essere determinate dall’analisi dei tempi di chiusura e di apertura.

Un approccio alternativo è il seguente (Colquhoun & Hawkes, 1983):

Mean open time per burst = Mo· Mr = 1/

dove Mo=mean OT, Mr= numero medio di aperture per burst

e

Mean closed time per burst = Mc · Mr = CB/

dove CB = [B]/KD

Un canale con due stati chiusi distinti

C2

k +1

k -1C1

O

MOT = 1/

MC1T = 1/(+k-1)

MC2T = 1/k+1

E’ Inoltre possibile ricavare che:

il numero medio di aperture per burst MOB=(/ k-1)+1

il(Colquhoun & Hawkes, 1981)

(Johnston & Wu, Foundations of Cellular Neurophysiology p. 268)

4

C

Oburst burst

Registrazioni di singolo canale da canali del Ca2+. Configurazione di cell-attached con la pipetta di patch riempita con Ba2+. Il bagno contiene una soluzione salina normale.

Risposte a depolarizzazioni di circa -5 mV (sinistra) e +15 mV (destra). Nel pannello di destra il livello di corrente zero è indicato con linee orizzontali. Le ampiezze medie di singolo canale sono 0.9 pA a -5 mV, e 0.6 pA a +15 mV. Filtro passa-bassi a 1 kHz.

Istogramma dei tempi di apertura per i dati a -5 mV (pannello di sinistra di (A). L’istogramma è stato interpolato con un singolo esponenziale la cui costante di tempo è o = 0.81 ms.

Istogramma dei tempi di chiusura per gli stessi dati a -5 mV . L’istogramma è stato interpolato con un doppio esponenziale con costanti di tempo c = 1.05 ms e s = 25.5 ms.. c rappresenta la durata media delle brevi chiusure all’interno dei bursts osservabili nel pannello di sinistra di (A). s rappresenta il tempo medio tra eventi indipendenti. Il numero medio di aperture per burst è 0.57.

Correnti di singolo canale (A), e istogrammi dei tempi di apertura, chiusura e latenza (B), calcolati dalle correnti in (A).

Istogramma dei tempi di apertura: interpolato con un singolo esponenziale (costante di tempo di 1.2 msec).

Istogramma delle latenze: il picco più alto è a circa 5-6 ms, suggerendo la presenza di una fase di attivazione.

Istogramma dei tempi di chiusura: la linea continua è ottenuta dqall’interpolazione con il doppio esponenziale A1exp(-t/c1) +A2exp(-t/c2).

A1/A2 = 4.5 = numero medio di aperture per burst.

Our motivation was to learn more about the mechanisms by which the Ca channel operates.

0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50

C1 3

O C2 C3 2

Equivalente lineare della cinetica m3 secondo il modello di H&H

Entrambi gli schemi predicono lo stesso andamento temporale dell’attivazione (a livello macroscopico), tuttavia il modello di destra non è più interpretabile come l’apertura di tre gates m identiche e indipendenti. Piuttosto, esso potrebbe essere interpretato come un’attivazione con cooperatività positiva in cui ciascuna gate è più facile da aprire della precedente.

C1

O C2 C3 2

Cooperatività positiva

È prevista cooperatività nell’attivazione dei canali del Na e del K

Un semplice schema di attivazione da agonista

A+Rk +1

k -1AR

AR*(open)

MOT = 1/

Il tempo di chiusura sarà la somma dei tempi trascorsi negli stati A e AR:

MCT = 1/(+k-1) + 1 /(k+1·[A])

Questo potrà essere separato in due componenti di tempi di chiusura se le costanti di velocità sono significativamente differenti.

Tempo medio in AR (chiusure dentro i burst) = 1/(+k-1)

Tempo medio di chiusura tra i burst) = 1/(k+1·[A])

MOB= /k-1 + 1

5

Bibliografia

1. Colquhoun & Hawkes (1977) Proc R Soc Lond [Biol] 199:231-262.

2. Colquhoun & Hawkes (1983) in Single channel recording eds. Neher & Sakmann, Chapter 9.

3. Neher & Steinbach (1978) J Physiol 277:153-176.

FINE