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ESERCITAZIONI 2008APPLICAZIONI DI GENETICA
UMANA E MOLECOLARE
• Quantizzazione delle proteine• Applicazioni delle proteine di fusione
Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di Bradford
N+
N
Coomassie Brilliant Blu R
HN
OCH2CH3
SO3Na
SO3Na
Il legame del colorante Il legame del colorante Coomassie Brilliant BlueCoomassie Brilliant Blue G-250 alle G-250 alle proteine proteine determina uno spostamento del massimo di assorbimento del determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, 1976)1976)
Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di Bradford
• Tale colorante forma forti complessi non covalenti con le Tale colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminici e proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminici e carbossilici e tramite forze di van der Waalscarbossilici e tramite forze di van der Waals
• Il colorante è preparato come soluzione Il colorante è preparato come soluzione stockstock in acido fosforico in acido fosforico
• Il metodo è un semplice procedimento costituito da un unico Il metodo è un semplice procedimento costituito da un unico passaggio in cui il colorante è aggiunto ai campioni e si determina passaggio in cui il colorante è aggiunto ai campioni e si determina l’assorbanza a 595 nml’assorbanza a 595 nm
• La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di proteina presente in soluzione, pertanto l’intensità del colore blu (e proteina presente in soluzione, pertanto l’intensità del colore blu (e dunque l’assorbimento) è proporzionale alla concentrazione dunque l’assorbimento) è proporzionale alla concentrazione proteica. In genere quantità uguali di proteine differenti legano la proteica. In genere quantità uguali di proteine differenti legano la stessa quantità di colorante → stessa quantità di colorante → il saggio è indipendente dal tipo di il saggio è indipendente dal tipo di proteinaproteina
•
VANTAGGI• Semplicità di preparazione del reattivo• Sviluppo del colore immediato• Stabilità del complesso• Elevata sensibilità (fino a 22 µg/ml)• Il saggio è compatibile con la maggior parte dei tamponi
comuni,degli agenti denaturanti come guanidina·HCl 6M e urea 8 M e dei preservanti come sodio azide
SVANTAGGISVANTAGGI• Il reagente colora le cuvette ed è piuttosto difficile da rimuovere• La quantità di colorante che si lega alla proteina dipende dal
contenuto in aminoacidi basici → ciò rende difficile la scelta di uno standard
• Molte proteine non sono solubili nella miscela di reazione acida
Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di Bradford
• Saggi di Pull-Down• Doppio Ibrido• Saggi di legame
APPLICAZIONI DELLE PROTEINE DI FUSIONE
Pull-Down
• Tecnica per verificare interazioni proteina-proteina “sospette”
ESCAProteina di fusione
PREDAProteina d’interesse
(eucariotica)
Pull-Down
• Produrre la proteine di fusione (ex: GST-proteina)• Purificare la proteina di fusione (ex: GST-Resina
Glutatione)• Controllare su gel di poliacrilammide la qualità
della purificazione• Preparare gli estratti cellulari eucariotici che
contengono la proteina d’interesse
Preda
Pull-DownESPERIMENTO CONTROLLO
GST EscaResina
Estratto cellulare
PredaX
lavaggi
GST EscaResina
X
GSTResina
Estratto cellulare
PredaX
lavaggiX
GSTResina Preda
JYZ JY
Z
Z Z
Pull-DownVerifica dell’interazione tramite SDS-Page Western Blot
SDS-PAGE TRASFERIMENTO WESTERN BLOT
WESTERN BLOTWESTERN BLOT
BLOCKING ANTICORPOPRIMARIO
ANTICORPOSECONDARIO
SVILUPPO
Pull-DownVerifica dell’interazione tramite SDS-Page Western Blot
MK INPUT CO ESP
La nostra proteinad’interesse è stata legatadalla proteina di fusione!
Il controllo è pulito
Pull-Down
LIMITI DEL SAGGIO:• Necessità di controlli negativi, presenza di legami
aspecifici alla resina.• Interazioni deboli o transienti potrebbero non
essere rilevate.• La presenza del tag potrebbe interferire con il
legame.• E’ un sistema forzato che potrebbe non
rispecchiare l’effettiva situazione biologica.
Sistema del Doppio Ibrido
Con questa tecnica è possibile individuare interazioni proteina-
proteina.Si basa sulla proprietà dei fattori di trascrizione di essere
organizzati funzionalmente in domini distinti1)Il dominio legante il DNA (DBD)2)Il dominio di transattivazione (AD)
I domini proteici sono normalmente identificati a classificati in base alle loro caratteristiche strutturali, funzionali e legate all’evoluzione.
Un dominio può quindi essere descritto come un’unità strutturale foldata, compatta e autonoma, conservata durante l’evoluzione e in grado di funzionare indipendentemente dal contesto a cui appartiene la proteina.
Sistema del Doppio Ibrido
Sperimentalmente è quindi possibile scindere due domini di una proteina che singolarmente non funzionerebbero, e fare in modo che riaquistino la loro funzionalità “rincontrandosi”.
Sistema del Doppio Ibrido
AD
DBDBAD
DBAD
AD
DB
Sistema del Doppio Ibrido Tra i fattori di trascrizione più utilizzati c’è GAL4, che legando il
promotore di Lacz permette la trascrizione della β-galattosidasi. Se nel mezzo di coltura è presente X-Gal, la β-galattosidasi è in
grado di scinderla e le colonie che hanno integrato il plasmide si colorano di blu.
Lacz
Gal4
β-galattosidasi X-Gal
UAS
Creazione di due ibridi:• DBD Hybrid: costituito dal dominio DBD fuso alla proteina
d’interesse (Esca). Questa proteina di fusione può legare il DNA, ma non è in grado di attivare la trascrizione.
• AD Hybrid: costituito dal dominio AD fuso ad un’altra proteina (Preda). Normalmente viene utilizzata una libreria di DNA.
Sistema del Doppio Ibrido
Sistema del Doppio Ibrido
Peptide Microarray
Peptide Microarray
High signal intensity
Low signal intensity
Positive data set Negative data set