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Espectrometría de masas
CG-EM CL-EM
Es una técnica instrumental sofisticada que
separa y detecta iones en fase gaseosa. Se
basa en ionizar moléculas gaseosas
convirtiéndolas en iones (generalmente
cationes), que se separan al ser acelerados por
un analizador de masas: la separación se basa
en la distinta relación m/z de los iones.
Espectrometría de masas
Componentes del instrumento
Introducción
de la muestra
Fuente de
ionización
Separador
de masas
Detector
iónico
Procesador
de señal
Registrador
El acoplamiento
entre CG y CL
con EM se
analizará más
adelante
Espectrómetro de masas
Sistema de
vacío
10-5 10-8 torr
Ionización por impacto electrónico
Ionización química
Fuente de bombardeo con átomos rápidos
Desorción con láser
Ionización a presión atmosférica:
- Electronebulización asistida con un gas: electrospray
- Ionización química a presión atmosférica
- Fotoionización a presión atmosférica
Fuentes de ionización
CL
Ionización por impacto electrónico
placa de repulsión
placas focalizadoras
haz de electrones (70 eV)
moléculas neutras moléculas neutras gaseosas
placas aceleradoras
(4000 V)
filamento de W
iones
M + e M.+ + 2e ion molecular
(alta energía
interna)
Las moléculas
gaseosas son
bombardeadas por
un haz de electrones
de alta E cinética
generados por un
filamento de
tungsteno o renio
Ionización por impacto electrónico
+ .
+ .
El ión molecular tiene alta energía interna que se disipa por reacciones de
fragmentación y reordenamiento
Molécula hipotética ABCD (A, B, C y D = átomos)
Fragmentación
del ion
molecular
ABCD.+ + ABCD (ABCD)2.+ BCD. + ABCDA+
Colisión seguida de
fragmentación
ABCD.+ ADBC.+ BC. + AD+
AD. + BC+
Reordenamiento seguido
de fragmentación
ABCD + e ABCD.+ + 2 e
ABCD.+ A+ + BCD.
A. + BCD+ BC+ + D
CD. + AB+
AB. + CD+
B + A+
A + B+ D + C+
C + D+
Ionización por impacto electrónico
En condiciones establecidas (E del haz de
electrones constante) el patrón de
fragmentación es el mismo para el mismo analito
Ionización por impacto electrónico
¿Porqué se fija a un valor estándar de 70 eV?
esta es la E electrónica a la cual ocurre la mayor
formación de iones.
el espectro de masas cambia solo ligeramente con
cambios en las proximidades de esta energía.
se obtiene mucha información estructural.
la distribución de E interna de los iones formados es
prácticamente la misma para distintos instrumentos,
volviendo a los espectros virtualmente independientes del
equipo usado.
CH4+ + CH4 CH5
+ + CH3
CH3+ + CH4 C2H5
+ + H2
CH5+ + MH MH2
+ + CH4
C2H5+ + MH M+ + C2H6
CH4 + ê de alta energía CH4+ y CH3
+
Gas reactivo: metano, isobutano, amoníaco [cámara de
ionización de “alta” presión a 10 torr (0.013 atm)]
Transferencia protónica entre molécula reactiva y analito
moléculas
reactivas
Las moléculas de analito son indirectamente ionizadas vía
una serie de reacciones con un gas reactivo
Ionización química
EM de sector magnético
EM de cuadrupolo
EM de tiempo de vuelo
EM de trampa iónica
Utiliza un campo eléctrico o magnético para
afectar la trayectoria o la velocidad de las
partículas cargadas
Separador de masas
Instrumento
de sector
de 90o
Utiliza un electroimán para hacer que el haz de iones
de la fuente se muevan en una trayectoria circular de
180, 90 o 60 grados.
Espectrómetro de masas de sector magnético
Instrumento
de sector
de 90o
Los iones formados se aceleran a través de la
rendija B hacia el tubo analizador metálico (presión
= 10-7 torr). Se puede variar la fuerza del campo del
imán o el potencial de aceleración entre las rendijas
A y B.
Espectrómetro de masas de sector magnético
Instrumento
de sector
de 90o
Espectrómetro de masas de sector magnético
Cada catión pasa a través de la rendija de salida y
cuando llega al detector se neutraliza con un electrón
(electrodo colector). La corriente necesaria para
neutralizar el haz de cationes es proporcional al
número de cationes que llegan al detector.
Instrumento
de sector
de 90o
Espectrómetro de masas de sector magnético
El espectro de masas es una representación de
esta corriente en función del número de masa
seleccionado por el campo.
¿Cómo se separan los iones de distinta masa?
m : masa
v : velocidad de la partícula
z : carga
V : diferencia de potencial
FM = Bzv
FC = mv2/r
mv2/r = Bzv
v = Bzr/m
FM : fuerza centrípeta
FC : fuerza centrífuga
B : campo magnético
r : radio de curvatura
Bzr/m = (2zV/m)½
m/z = B2r2/2V
Ecinética = ½ mv2 = zV
v = (2zV/m)½
Cuando las placas aceleradoras aceleran un ion por aplicación de una
diferencia de potencial, el ion adquiere una energía cinética igual a:
Por otro lado, si el ion circula perpendicularmente a un campo magnético B,
sobre él actúan fuerzas centrípeta y centrífuga igual a:
Espectrómetro de masas de sector magnético
Espectrómetro de masas de cuadrupolo
Ø = 6 mm
4 barras
metálicas cortas
de 6 mm de
diámetro,
paralelas entre
sí y dispuestas
simétricamente
alrededor del
haz de iones
Un par de barras
están conectadas al
polo positivo y el
otro par a la terminal
negativa. A las
barras se aplica un
voltaje cte que
genera una corriente
continua o directa y
potenciales de
corriente alterna de
radiofrecuencia
variable, desfasadas
180°.
Espectrómetro de masas de cuadrupolo
Los campos
eléctricos
combinados hacen
que los iones
oscilen alrededor de
su eje central de
trayectoria
haciéndolos seguir
trayectorias distintas
hacia el detector.
Solo llegan los iones
resonantes (con
determinada m/z)
que no colisionan
con las barras
Ø = 6 mm
Po
ten
cia
l co
rrie
nte
dir
ecta
tiempo
masa
Po
ten
cia
l de
ra
dio
fre
cu
en
cia
Relación de voltajes durante un barrido de masa con
un analizador cuadrupolo
Espectrómetro de masas de cuadrupolo
pulsos de 300 V, 3.000-20.000 veces/s
Se aplica una ΔV a las rejillas aceleradoras de 300 V (3000
a 20.000 veces por segundo) para acelerar los iones y
lanzarlos a un tubo de deriva con una energía cinética
constante. Los iones, con igual energía cinética pero distinta
relación masa/carga, adquieren distinta velocidad.
EM de tiempo de vuelo (TOF: time of flight)
Ecinética = ½ mv2
El orden de llegada al detector es: desde los más livianos a los
más pesados. En el EM se representa la corriente del detector
en función del tiempo.
EM de tiempo de vuelo (TOF: time of flight)
pulsos de 300 V, 3.000-20.000 veces/s
electrodo
anular central
tapa
tapa
Consiste en un electrodo anular y un par de electrodos
colectores. Cuando las moléculas llegan a la trampa, se
ionizan y fragmentan. Los iones permanecen en la trampa
iónica con trayectorias estables. Al electrodo anular se aplica
un potencial de radiofrecuencia variable que controla el
barrido.
Espectrómetro de masas de trampa iónica (ITD)
Vrf
electrodo
anular central
tapa
tapa
Espectrómetro de masas de trampa iónica (ITD)
Vrf
El análisis de los iones se logra con pulsos sucesivos de
radiofrecuencia (rf) creciente: las trayectorias se vuelven
inestables y los iones son expulsados sucesivamente por
la trampa hacia el multiplicador de electrones donde se
detectan. Los iones se retienen o expulsan de la trampa en
función de su relación m/z.
Espectros de masas
Energía de ionización de la molécula
Grupos funcionales de la molécula
Método de ionización
Presión y temperatura de trabajo
Diseño instrumental
Dependen de:
Espectros de masas obtenidos por impacto electrónico
En este ejemplo el pico
base se forma por pérdida
de CH3
Etilbenceno pico base
ion molecular (ion “parent”)
M+ → fragmento de
mayor masa
molécula con número par de N → M+ con masa par
molécula con número impar de N→ M+ con masa impar
4 H → M-4 F → M-19
CH3→ M-15 HF → M-20
NH3 → M-17 C2H2 → M-26
H2O → M-18
Átomos y grupos
frecuentemente
desplazados
Espectros de masas de cloruro de metileno
13C1H235Cl2 (m= 85)
12C1H235Cl37Cl (m= 86)
13C1H235Cl37Cl (m= 87)
12C1H237Cl2 (m= 88)
Picos isotópicos 12C1H2
35Cl2 (m= 84)
pico base → pérdida de Cl
Impacto electrónico
El ion molecular (m/z = 226) prácticamente no se distingue
Impacto electrónico
Espectros de masas de pentobarbital (sedante)
Ionización química
Espectros de masas de 1-decanol (PM = 158)
Ionización química
Impacto electrónico
Sistemas de acople
Cromatografía Gaseosa – EM
Separador de chorro (columnas rellenas)
Ensamblaje con columnas capilares
desde el
CG
constricción
de salida
tubo de vidrio
poroso
cámara de
evacuación
hacia la
bomba
collarín que se atornilla
en el receptáculo de
fuente iónica
constricción
de entrada
A cámara
de
ionización
Sistema de acople
Cromatografía Líquida – EM
Formación de iones gaseosos a partir de analitos en solución
Consideraciones en la conexión LC/MS
Electronebulización asistida con un gas:
electrospray (ESI)
Ionización química a presión atmosférica (APCI)
Fotoionización a presión atmosférica (APPI)
Ionización a presión atmosférica (API)
Es una familia de técnicas que incluye
Electronebulización asistida con
un gas
Electrospray (ESI)
(ortogonal)
HPLC
Iones desolvatados
Malla de montaje: -3500 V
(atraerá cargas + a la
superficie de la gota)
La fase móvil con el analito se nebulizan a un elevado
voltaje asistidos con una corriente coaxial de N2
generando un fino aerosol, con formación de
microgotas altamente cargadas (la solución ya
contiene iones )
(ortogonal)
HPLC
Iones desolvatados
Malla de montaje: -3500 V
(atraerá cargas + a la
superficie de la gota)
A medida que el solvente se evapora, la densidad de carga en
las gotas aumenta y al llegar al límite Rayleigh la gota sufre
explosiones de Coulomb y se rompe en gotas más pequeñas.
Los iones libres de solvente (desolvatados) se mueven hacia el
analizador de masa. En el caso mostrado, la diferencia de
potencial negativa hace que los cationes entren al capilar
La solución se
inyecta
directamente en
el instrumento
La caída de
voltaje entre la
fuente y el
analizador
genera gotas
ionizadas
El solvente se
evapora a medida
que las gotas hacen
su recorrido
presión atmosférica vacío
Expulsión de gotas cargadas La solución inyectada
usualmente incluye agentes
ionizantes: H+, Na+, K+
Agua
Metanol
Cloroformo
Acetonitrilo
Las gotas grandes
espontáneamente se
rompen en gotas
menores debido a
repulsión electrostática
Gas y/o calor
disminuyen el
tamaño de las gotas
Los iones resultantes
pueden ser sencillos
o con carga múltiple
Iones observados frecuentemente
¿Cuándo es apropiado trabajar en ESI?
- Solutos ionizables de alto y bajo peso molecular. El analito
de interés debe ser capaz de portar carga en solución
Ejemplos:
a) Muestras con heteroátomos: carbamatos, benzodiacepinas
b) Ácidos y bases
c) Especies iónicas: fosfatos, conjugados con grupos sulfato,
aminas, etc
d) Muestras que se multi-cargan en solución (ej: péptidos,
proteínas, oligonucleótidos)
e) Compuestos que pueden aceptar carga inducida
Evitar: muestras con grupos no polares (ej. HPAs)
Ionización química a presión atmosférica
APCI
La fase móvil y el
analito se
nebulizan
(dispersan en
pequeñas gotas)
y vaporizan a
elevada
temperatura, y
entran en la
región corona
(entre la aguja y
el capilar).
Las moléculas de
fase móvil se
ionizan en la
región corona por
electrones
provenientes de
una descarga
eléctrica,
transformándose
en iones gaseosos
reactivos
Estos iones
reactivos (iones
formados de la
fase móvil)
reaccionan con
las moléculas
de analito,
ionizándolas
Ionización APCI clásica
Reacciones de ionización positiva
Reactivo/reacción electrón
Transferencia protónica
solvente – e- [solvente+H]+ fase gas
[solvente+H]+ + analito [analito+H]+ + solvente fase gas
Reacciones de ionización negativa
Captura electrónica
e- + solvente [solvente]- fase gas
Intercambio de cargas
[solvente]- + analito [analito]- + solvente fase gas
Reacciones ion molécula
analito + [solvente]- [analito-H]- + [solvente+H] fase gas
Ionización APCI clásica
¿Cuándo es apropiado trabajar en APCI?
Muestras: Compuestos de PM/polaridad intermedias (bifenilos
policlorados (PCBs), ácidos grasos, ftalatos, etc).
Compuestos sin grupos ácidos/básicos (ej: hidrocarburos,
alcoholes, aldehidos, cetonas y esteres)
Muestras con heteroátomos (ureas, benzodiacepinas,
carbamatos, etc). Analitos con mal comportamiento ESI
Parámetros en solución: Mucho menos sensible a las
condiciones de disolución que ESI. Tolera mayores flujos.
Admite solventes no compatibles con ESI
Evitar: muestras térmicamente lábiles, o cargadas en solución,
o biomoléculas (habitualmente no volátiles).
Principales características de ESI y APCI
Estas interfaces son hoy en día las más utilizadas
Fotoionización a presión atmosférica
APPI
APPI (modo positivo)
El solvente y la
muestra se nebulizan
y son completamente
vaporizados por
calefacción.
La ionización del
solvente y la muestra
ocurre por bombardeo
con fotones a partir de
una lámpara UV
La molécula de analito M se ioniza a ion molecular
(si el potencial de ionización del analito es menor a
la energía del fotón).
El ion M.+ puede extraer un hidrógeno del solvente
para formar [M+H]+
Un dopante fotoionizable está en exceso y rinde
muchos iones moleculares. El analito se ioniza por transferencia protónica a
partir del dopante o solvente El ión molecular del dopante ioniza al analito
por transferencia electrónica
¿Cuándo usar APPI?
• Puede ionizar compuestos que no se ionizan bien con ESI
o APCI (ej: PAHs).
• Tiene mejor sensibilidad global para algunos compuestos
(THC-tetrahidrocanabinol, ácido benzoico, vitaminas no
hidrosolubles).
• Tiene mejor sensibilidad a bajas velocidades de flujo que
APCI.
• Es robusto y altamente reproducible.
Selección del sistema CL/EM
1.000
No polar Muy polar
10.000
100.000
Peso m
ole
cula
r
Polaridad del analito
ESI
APCI
APPI
GC/MS
Cromatograma de corriente iónica total
Cromatograma de ión seleccionado
Arreglo tridimensional: señal en función del tiempo
(información cromatográfica) y en función de la
relación m/z (información espectroscópica)
Registros gráficos CG-EM y CL-EM
Modos de adquisición de la señal
Registros gráficos CG-EM y CL-EM
Modos de adquisición de la señal
Modo scan Consiste en hacer barridos entre dos valores de masas para
tener la información total de la muestra. Se emplea en análisis
cualitativo para la identificación de compuestos por búsqueda
en biblioteca de espectros. También se usa para cuantificar.
Se puede trabajar con:
TIC (total ion chromatogram)
cromatograma correspondiente a la suma de
abundancias a todas las masas adquiridas.
EIC (extracted ion chromatogram)
cromatograma correspondiente a una
determinada masa (extraída del barrido)
Sensibilidad
media
Alta
sensibilidad y
selectividad
Registros gráficos CG-EM y CL-EM
Modos de adquisición de la señal
Modo scan
Registros gráficos CG-EM y CL-EM
Modos de adquisición de la señal
Modo SIM
Consiste en una monitorización selectiva de iones
característicos de la muestra. Ideal para cuantificar vestigios
de compuestos conocidos. En este modo, el detector es muy
sensible y muy selectivo.
Registros gráficos CG-EM y CL-EM
Modos de adquisición de la señal
Modo SIM
La comparación de las respuestas relativas de los distintos
iones con respecto a las del patrón permite confirmar la
identificación del compuesto analizado.
La sensibilidad aumenta con la disminución del número de
masas seleccionado.
Modos de adquisición en GC/MS
SCAN vs SIM
CH3(CH2)3OH + Br- CH3(CH2)3Br + OH-
Síntesis de 1Br-butano a partir de butanol (CG-EM)
cromatograma EM pico 1 EM pico 2
1-butanol
1-bromobutano
Combustión de tela tratada con producto
ignífugo
Cromatograma de
corriente iónica
total (TIC)
EM de pico 12
(benceno)
Confirmación presencia de cocaína en orina
por CG-masa
Cromatograma de corriente iónica total
EM del pico a 11.5 min
EM de testigo de cocaína (m = 303)
a igual tiempo de elución
Cromatograma
convencional
con detección
UV
Mezcla de 6 herbicidas resuelta por HPLC-
masas
Cromatograma de masas de corriente iónica total
Detección de
un ion
seleccionado
m/z = 312
(corresponde a
MH+ formado a
partir de
imazaquina de
masa = 311)
Representación de la estructura
tridimensional de datos CG-EM en modo
barrido completo (full-scan)
Se obtiene: el cromatograma iónico total, el cromatograma
iónico de un ión seleccionado (a determinada masa) y los
espectros de masas (a determinados tiempos de retención)
