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INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA, UNAM

MÉTODOS EN BIOQUÍMICA

SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNASPOR ESPECTROMETRÍA DE

MASAS

Ayala Bretón Camilode Regil Hernández Rubén

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Cuernavaca, Morelos 8 de Junio del 2004

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ÍNDICESecuenciación de proteínas por Espectrometría de Masas.......................................................5I. Espectrometría de masas.......................................................................................................5

1. Fundamentos.....................................................................................................................51.1. Historia de la Espectrometría de Masas....................................................................5

1.1.1. Las raíces en la física..........................................................................................61.1.2. La ramificación hacia la Química.......................................................................71.1.3. Incursionando en la biología...............................................................................81.1.3.  Antecedentes......................................................................................................9

1.2. Grupos Funcionales.................................................................................................121.3 Métodos de Ionización..............................................................................................14

1.3.1 Ionización electrónica (EI)................................................................................141.3.2 Bombardeo Rápido de Atomos (FAB) y Espectrometría de Masas de IonLíquido Secundario (LSI) ..........................................................................................161.3.3. Ionización por Electrospray..............................................................................17

1.4. Métodos de Análisis................................................................................................221.4.1. Análisis de Doble Sector..................................................................................221.4.2. Espectrometría de Masas de Tiempo de Vuelo (TOF) ....................................231.4.3. Analizador de Masas de Cuadrupolos .............................................................251.4.4. Transformada de Fourier de Resonancia Ion Ciclotrón (FT­ICR) ..................271.4.5. Análisis en Trampa Iónica  ..............................................................................281.4.6. Espectrometria de Masas en Tándem...............................................................291.4.7. PSD ­ MALDI..................................................................................................34

II. Secuenciación de proteínas por espectrometría de masas..................................................362. Determinación de la estructura y de la secuencia por espectrometría de masas............37

2.1. Fragmentación.........................................................................................................382.1.1. Influencia de la posición y deslocalización de la carga ...................................41

2.2. Identificación y secuenciación de péptidos ............................................................422.3. Correlacionando información MS/MS de la secuencia en la base de datos............472.4. Correlación de la información de m/z del péptido con secuencias conocidas.........492.5. Cuantificación de péptidos .....................................................................................49

2.5.1. Cálculo de Masa Molecular..............................................................................502.5.2. Bases de Datos de Secuencias..........................................................................512.5.3. Consideraciones sobre la Base de Datos..........................................................512.5.4.Esquemas de Puntaje.........................................................................................52

2.6 .Caracterización de proteínas con técnicas combinadas...........................................522.6.1. Identificación de proteínas en mezclas por “Shotgun”.....................................522.6.2. Interacciones proteína – proteína y complejos de proteína..............................53

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2.6.3. Detección de mutaciones..................................................................................542.6.4. Detección de variantes a través de la medición de la masa de la proteína intactacon ESI­MS................................................................................................................552.6.5. Identificación de proteínas separadas electroforéticamente.............................562.6.6. Secuenciación de proteínas en geles de poliacrilamida teñidos por plata........592.6.7. Elucidación de estructura secundaria de proteínas por ionización enelectrospray.................................................................................................................592.6.8. Localización de puentes disulfuro en proteínas................................................612.6.9. Detección y verificación de la secuencia de péptidos con puentes disulfuro porFABMS y MS/MS......................................................................................................622.6.10. Localización de puentes disulfuro en pequeñas proteínas ricas en cisteína.. .632.6.11. Secuenciación en escalera de proteínas .........................................................642.6.12. Proteínas y péptidos hidrofóbicos analizados por MALDI............................662.6.13. Análisis de Glicoproteínas y Glicopéptidos utilizando Bombardeo Rápido deÁtomos (FAB)............................................................................................................66

Bibliografia.........................................................................................................................69

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Secuenciación de proteínas por Espectrometría de Masas

I. Espectrometría de masas

1. Fundamentos

¿Qué es la Espectrometría de Masas?

La espectrometría de masas  (MS) es una herramienta espectroscópica analítica enfocadaprincipalmente a la separación de especies moleculares y atómicas de acuerdo a su masa. Laespectrometría de masas puede ser usada para el análisis de muchos tipos de muestras, desdeunidades elementales hasta grandes proteínas y polímeros.

¿Qué nos puede decir la Espectrometría de Masas?

• Una medición precisa de masa puede ser  usada para comprobar/validar  fórmulasempíricas.

• La   fragmentación,   que   muchas   veces   resulta   en   sitios   específicos   o   en   gruposparticulares puede ser usada para identificar muestras por cotejo con bases de datosde fragmentos. 

• La fragmentación controlada  puede ser  usada  para  la  elucidación de  compuestosnovedosos. 

• La observación de picos comunes en un espectro puede proporcionar informaciónútil respecto a grupos funcionales. 

• La   abundancia   relativa   de   isótopos   es   usada   para   obtener   información   de   loselementos que forman un compuesto. 

• Las mezclas complejas pueden ser analizadas mediante combinaciones de técnicascomo Cromatografía de Gases­Espectrometría de Masas o HPLC­Espectrometría deMasa y evitando, en consecuencia, las largas tareas de purificación de muestras.

1.1. Historia de la Espectrometría de Masas

La espectrometría de masas (MS) tiene una historia marcada con premios Nobel y unatecnología continuamente en avance que ha aportado importantes vías en el descubrimiento

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de   drogas,   caracterización   de   proteínas   e   incluso   en   diagnóstico   de   enfermedades.   Lahistoria de la ciencia muestra claramente que la Espectrometría de Masas (MS) tiene susraíces en la física, ramificándose a la química y en las últimas dos décadas ha incursionadoen la biología.

1.1.1. Las raíces en la física

La   historia   de   la   MS   comienza   con   Don   Joseph   John   Thompson   en   los   laboratoriosCavendish de la Universidad de Cambridge. El trabajo de Thompson “Estudios teóricos yexperimentales sobre la conducción de electricidad por gases” llevó al descubrimiento delelectrón en 1897,   por el cual le fue otorgado el Premio Nobel en Física a Thompson en1906. En la primera década del siglo veinte, Thompson construyó el primer espectrómetrode masas (llamado entonces Espectrógrafo de parábola), en el cual los iones eran separadospor sus distintas trayectorias parabólicas en campos electromagnéticos y la detección eraregistrada   por   los   choques   de   los   iones   en   una   pantalla   fluorescente   o   en   una   placafotográfica.

Figura 1. J.J. Thomson y el tubo de rayos catódicos usado para realizar unas de las primeras mediciones de larelación carga/masa. La deflección del electrón se observaba una vez que se encendía el campo eléctrico.

En los años siguientes a  la Primera Guerra Mundial,  el  asociado de Thompson en laUniversidad de Cambridge, Francis W. Aston (Premio Nobel en Química en 1922), diseñóun espectrómetro de masas que mejoró la resolución en un orden de magnitud, permitiendoa Aston estudiar  isótopos.  En ese mismo período, A. J.  Dempster de la  Universidad deChicago también mejoró la resolución con un analizador magnético y desarrolló la primerafuente   de   impacto   electrónico,   la   cual   ioniza   moléculas   volatilizadas   con   un   rayo   deelectrones.   Las   fuentes   de   impacto   electrónico   son   todavía   ampliamente   usadas   enespectrómetros de masas modernos para análisis de moléculas pequeñas.

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Thompson,   Aston   y   Dempster   sentaron   una   sólida   base   para   la   teoría   de   laEspectrometría  de  Masas  y   el  diseño   instrumental,   haciendo  posible,  para   aquellos  quesiguieron,   desarrollar   instrumentos   capaces   de   reunir   las   demandas   de   los   químicos   ybiólogos.  La tarea de crear  tales  instrumentos,  sin embargo, requirió  de seis  décadas deesfuerzo.

1.1.2. La ramificación hacia la Química

Uno de las áreas a la que se le ha dedicado esfuerzo, particularmente para los químicos,ha sido crear un instrumento con suficiente precisión para el análisis tanto de elementoscomo de pequeñas moléculas orgánicas.  La respuesta a este problema vendría en cuatrodiferentes formas: Los Sectores magnéticos de doble enfoque, el análisis  por Tiempo deVuelo (TOF), el filtro Cuadrupolo y los analizadores de masa por Transformada de Fourierde Resonancia Ion­Ciclotrón (FT­ICR). Alfred O.C. Nier en la Universidad de Minnesotadesarrolló   el   equipo  de  alta   resolución  de  masas  de  doble   enfoque  durante   la  SegundaGuerra Mundial para realizar análisis isotópicos y separar 235U de 238U. De hecho, la primerabomba   atómica   fue   desarrollada   completamente   del   Uranio   separado   por   este   tipo   deespectrómetro de masas. 

William E. Stephens de la Universidad de Pennsylvania propuso el concepto de TOF MSen 1946. En un analizador por TOF, los iones son separados en base a las diferencias en susvelocidades a medida que se mueven en una trayectoria recta hacia un colector. TOF MS esrápida, con una alta resolución y alta precisión, y aplicable para la detección cromatográfica.Es usada para la determinación de masa de grandes biomoléculas ya que virtualmente notiene límite en el rango de masa a analizar.

A mediados de la década de 1950 fue reportado por primera vez por Wolfgang Paul de laUniversidad de Bonn, que el filtro de masas Cuadrupolo era ideal para el acoplamiento conGC (Cromatografía de Gases) y, más recientemente, LC (Cromatografía de Líquidos). Eneste   equipo,   un   campo   eléctrico   cuadrupolar   (conformado   por   radiofrecuencias   ycomponentes  de  corriente  directa)   fue  usado  para   separar   iones.  Años  mas   tarde,  Paul,recibió de manera compartida el Premio Nobel en Física por su trabajo en la trampa deiones.

Aunque   los   espectrómetros  de  masas  de  cuadrupolos  no  eran   tan  precisos   como  losequipos de doble sector magnético, ofrecían un rango dinámico excelente, eran muy estables

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y fueron rápidamente aplicados a los experimentos de Espectrometría de Masas en Tándem(MS/MS).  Estas características hicieron de  los Espectrómetros de Masas de cuadrupolosequipos muy populares para el análisis cuantitativo y para aplicación de descubrimiento defármacos.

Para el problema de la alta resolución y gran precisión, la espectrometría de masas deResonancia Ion Ciclotrón (ICR/MS) ha sido la técnica más exitosa para el análisis de masas.Descrita inicialmente por J.A. Hipple y colegas, el ICR opera mediante someter a los iones auna radiofrecuencia, un campo eléctrico y un campo magnético uniforme simultáneamente,lo que causa que los iones sigan una trayectoria espiral en una cámara. Haciendo un barridoen la radiofrecuencia o en el campo magnético, los investigadores pudieron detectar ionessecuencialmente. En 1974, Melvin B. Comisarow y Alan G. Marshall de la Universidad deBritish Columbia revolucionaron el ICR desarrollando la Transformada de Fourier ICR/MS(FT­ICR/MS). La mayor ventaja de la FT­ICR/MS fue que permitió medir muchos iones almismo tiempo, y ahora es común lograr una precisión de sub­ppm (sub­ partes por millón)con los equipos comerciales. 

Todos  estos  diseños  de  analizadores  de  masas,   e   inclusive  combinaciones  de  diferentestécnicas para la MS en Tándem, son usados todavía y están desarrollándose para nuevasaplicaciones.

1.1.3. Incursionando en la biología

A pesar de los avances en la precisión en la medición de masas, el rango de masa quepodía   ser   analizado,   el   análisis   cuantitativo  y   la   habilidad  de   acoplar   los   equipos   a   lacromatografía, en la década de 1980, la MS todavía carecía de eficacia para el análisis debiomoléculas   grandes   y   pequeñas.   Una   deficiente   descomposición   molecular   ofragmentación   durante   la   vaporización/ionización   y   una   pobre   sensibilidad   eranproblemáticos.   La   aplicación   de   una   “ionización   suave”   como   la   de   Ionización   porElectrospray   (ESI)   y   la   Desorción/Ionización   por   Láser   Asistida   en   Matriz   (MALDI)permitió a la MS evolucionar hacia las áreas de la biología.

En la ESI/MS, unas finas gotas eléctricamente cargadas son dispersadas a la salida de uncapilar por un campo eléctrico y después evaporadas. Los iones resultantes eran dirigidoshacia  la entrada del espectrómetro.  Aunque el  profesor de química Malcolm Dole de  laUniversidad de Northwestern concibió primero la técnica en los años 60s, no fue sino hasta

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principios de los años 80 que John B. Fenn de la Universidad de Yale lo puso en prácticapara el análisis de biomoléculas. Koichi Tanaka y colaboradores de la compañía Shimadxu,reportaron inicialmente la técnica MALDI/MS, la cual fue desarrollada también por FranzHillenkamp y Michael Karas en la Universidad de Frankfurt. En MALDI las moléculas delanalito   son  desorbidas  por  acción de  un  rayo  láser,  de una matriz   sólida  o   líquida  queabsorbe rayos UV.

Por   su   trabajo   en   el   desarrollo   de   las   técnicas   de     ionización   suave   las   cuales   sonadecuadas para el análisis de grandes biomoléculas, Fenn y Tanaka compartieron el PremioNobel en Química en 2002. ESI y MALDI han hecho que la MS sea cada vez más útil paraexperimentos  biológicos   sofisticados   como  el   secuenciamiento  y   análisis   de  péptidos  yproteínas   utilizando   las   técnicas   desarrolladas   por   Klaus   Biemann   del   MassachussettsInstitute of Technology, estudios de complejos no covalentes y moléculas inmunológicas,secuenciación de DNA y el análisis de virus intactos.

1.1.3.  AntecedentesEl espectrómetro de masas

Los elementos que componen un espectrómetro de masas son los siguientes:

Un sistema de inyecciónUna fuente de iones  

   Un analizador de masaUn detector

Las muestras pueden ser introducidas directamente a la fuente de iones del espectrómetro enuna sonda,  o en el  caso de mezclas,  por  un sistema intermediario  (ej.  Cromatógrafo deGases, Cromatógrafo de Líquidos, Electroforesis capilar, etc.). Una vez que la muestra seencuentra en la fuente de iones, las moléculas de la muestra se someten a ionización; paraello la sustancia es bombardeada con un rayo de electrones que tienen suficiente energíapara romper la molécula. Los fragmentos positivos que se producen (cationes y cationesradicales) se aceleran en vacío a través de un campo magnético y son distribuídos en base asu   relación   carga/masa   (m/z).  Dado  que   la  mayor  parte   de   los   iones  producidos   en   elespectrómetro   de   masas   conllevan   una   carga   positiva,   el   valor   de   la   relación   m/z   esequivalente al peso molecular del fragmento. El análisis de la información del espectro demasas requiere reagrupar teóricamente los fragmentos para reconstruir la molécula original.Un esquema de un espectrómetro de masas se muestra a continuación:

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Figura  2.  Esquema general del mecanismo de desviación de iones de fragmentos mediante un imán en unespectrómetro de masas.

Sólo  una  pequeña  cantidad  de  moléculas  de   la  muestra   se  hacen  pasar  a   la   cámara  deionización   (que   se  encuentra  a   alto  vacío)   las   cuales   son  bombardeadas  por  un  haz  deelectrones de alta energía. Las moléculas se fragmentan y los cationes que se producen seaceleran  y   se  dirigen  hacia  un  analizador.  La   trayectoria   de   las  moléculas   cargadas   esdesviada por un campo magnético aplicado. Los iones que tienen una menor masa (menormomentum) serán desviados más fácilmente provocando que choquen contra las paredes delanalizador.   De   la   misma   manera,   los   iones   con   alto   momentum   no   serán   desviadossuficientemente para seguir la trayectoria curva que el campo magnético genera y tambiénchocarán con la pared del analizador. Los iones con una relación m/z adecuada no serándesviados   y   seguirán   la   trayectoria   del   analizador,   saldrán   por   la   ranura   de   salida   yfinalmente   chocarán   con   el   colector.   Esto   genera   una   corriente   eléctrica,   la   cual   esamplificada y detectada. Variando la fuerza del campo magnético, se puede controlar losiones que pasarán al colector.

La información que arroja el espectrómetro de masas es una gráfica de intensidad relativavs. la relación carga/masa. El pico más intenso en el espectro se llama “pico base” y todoslos demás se reportan en relación a la intensidad de este. Los picos son extremadamentedelgados y comúnmente aparecen como líneas verticales. 

El proceso de fragmentación ocurre siguiendo principios químicos simples y predecibles.Los iones que se forman representan los cationes y cationes­radicales más estables que lamolécula puede formar. El pico de mayor peso en el espectro representa generalmente lamolécula “padre” menos un electrón y se le llama “Ion molecular (M+)” Comúnmente, los

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picos   pequeños   aparecen   por   arriba   de   los   pesos   moleculares   calculados   debido   a   laabundancia natural de los isótopos 13C, 2H, etc. Muchas moléculas con protones muy lábilesno producen iones moleculares; un ejemplo de esto son los alcoholes, en los cuales el picode mayor peso molecular ocurre a una relación carga/masa uno menos el ion molecular (m­1). Los fragmentos pueden ser identificados por su relación carga/masa, pero es más útilidentificarlos por su masa la cual ha disminuído por los grupos que se les han separado en lafragmentación. Es decir, la pérdida de un grupo metilo generará un pico de m­15, la pérdidade un etilo, m­29, etc. 

El espectro del tolueno (metil benceno) se muestra a continuación. 

Figura 3.   El espectro presenta un ion molecular fuerte en m/z = 92, unos picos   pequeños m+1 y m+2, unpico base en m/z = 91 y una serie de picos menores en m/z=65 y menores.

El ion molecular, nuevamente, representa la pérdida de un electrón y los picos por arriba delion molecular se deben a la abundancia de isótopos. El pico base en el tolueno es debido a lapérdida  de  un  átomo  de  hidrógeno  para   formar   el   catión  bencilo   que   es   relativamenteestable. Se cree que después sufre un rearreglo para formar el catión tropilio que es muyestable, y este fuerte pico en m/z = 91 es una característica de los compuestos que contienenun grupo bencilo. El pico menor en m/z = 65 representa la pérdida de un acetileno neutro delion tropilio  y los picos menores por debajo de m/z = 65 surgen como resultado de unafragmentación más compleja. 

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1.2. Grupos Funcionales

Alcanos:  Los alcanos suelen sufrir una fragmentación por la pérdida inicial de un grupometilo   para   formar   especies   (m­15).   Este   carbocatión   puede   sufrir   una   fragmentaciónsubsecuente a lo largo de la cadena hidrocarbonada expulsando las unidades neutrales de doscarbonos   (etilenos).   Los   hidrocarburos   ramificados   forman   carbocationes   secundarios   yterciarios más estables, y estos picos suelen dominar el espectro de masas.

Hidrocarburos Aromáticos: La fragmentación del núcleo aromático es un tanto complejo,el cual genera una serie de picos que tienen una relación carga/masa de m/z= 77, 65, 63, etc.Aunque estos  picos  son  difíciles  de describir  en  términos  simples,   forman un perfil   (el“agregado   aromático”)   que   se   aprende   a   reconocer   con   la   experiencia.   Si   la   moléculacontiene una unidad bencilo, la ruptura más importante generará el carbocatión bencilo, elcual sufre un rearreglo para formar el ion tropilio. La expulsión del acetileno (etino) generaun pico característico con una m/z = 65. 

Aldehídos y Cetonas: La ruptura predominante en los aldehídos y cetonas es la pérdida deuna de  las  cadenas   laterales  para  generar  un  ion oxonio sustituído.  Esta  es una  rupturaextremadamente favorable y este ion generalmente representa el pico base en el espectro. Elderivado metilo (CH3C O+) comúnmente se le llama el “ion acilo”

Otro   tipo  de   fragmentación   común  que   se   observa   en   los   compuestos   carbonilo   (y   ennitrilos, etc.) consiste en la expulsión del etileno neutral en un proceso llamado el RearregloMcLafferty, que sigue el mecanismo general mostrado a continuación:

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Esteres, Acidos y Amidas: De la misma manera que con los aldehídos y cetonas, la rupturaprincipal observada en estos compuestos es la expulsión del grupo “X”, como se muestraabajo, para formar el ion sustituído oxonio. Para ácidos carboxílicos y amidas no sustituídas,los picos característicos en m/z = 45 y 44 también se pueden apreciar en el espectro.

Alcoholes:  Además  de perder  un protón y un radical  hidroxilo,   los alcoholes   tienden aperder   uno  de   los   grupos   (o  hidrógenos)   para   formar   iones  oxonio.  Para   los   alcoholesprimarios, esto genera un pico en m/z = 31; en alcoholes secundarios se generan los picos enm/z = 45, 59, 73, etc. de acuerdo a la sustitución.

Eteres:  Siguiendo   el   comportamiento   de   los   alcoholes,   los   éteres   se   fragmentangeneralmente por la pérdida de un radical alquilo para formar el ion oxonio sustituído, comose muestra para el dietil éter.

Haluros:  Los haluros orgánicos se fragmentan con la simple expulsión del halógeno. Losiones moleculares de los compuestos que contienen cloro y bromo generan múltiples picosdebido al hecho que cada uno de ellos existe como dos isótopos relativamente abundantes.Así, para cloro, la relación 35Cl/37Cl es aproximadamente 3.08:1 y para el bromo la relación79Br/81Br es aproximadamente 1.02:1. El ion molecular de un compuesto que contiene clorotendrá dos picos con una diferencia de dos unidades de masa, en una proporción aproximada

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3:1, y un compuesto que contiene bromo tendrá dos picos igualmente con una diferencia enmasa de 2 unidades con intensidades muy similares.

Figura 4. Fragmentos comunes en los espectros de masa.

1.3 Métodos de Ionización

1.3.1 Ionización electrónica (EI)

Teoría

Los electrones son producidos por emisión termiónica desde un filamento de tungsteno orenio. Una corriente típica de un filamento es del orden de 1x10­4 amperios. Estos electronessalen desde la superficie del filamento y son acelerados hacia la cámara fuente de iones lacual es mantenida a una potencial positivo (igual al voltaje de aceleración) Los electronesadquieren una energía igual al voltaje entre el filamento y la cámara fuente (típicamente 70electro­voltios, eV). La trampa de electrones se mantiene a un potencial fijo positivo conrespecto  a   la   cámara   fuente.  Una  porción  del  haz  de   electrones  golpeará   la   trampa  deelectrones   produciendo   la   corriente   de   la   trampa.   Esta   es   usada   como   un   circuito   deretroalimentación para estabilizar el haz de electrones.

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Figura 5. Esquema de una fuente de Ionización Electrónica.

Un  imán  permanente   se   coloca   a   lo   largo  de   la   cámara   fuente   para   producir   un   flujomagnético  paralelo  al  haz  de electrones.  Esto  causa  que  el  haz  de  electrones   tome unadirección de espiral desde el filamento hasta la trampa, aumentando la probabilidad y laeficiencia para ionizar el analito. Las moléculas de analitos gaseosos son introducidas en lavía del haz de electrones en donde son ionizados por interacciones electrónicas con el haz deelectrones. La ionización puede realizarse también por impacto directo de un electrón conuna molécula de analito.

  El   repulsor   de   iones   con   carga   positiva   y   la   excitación   negativa   del   voltaje   actúanconjuntamente  para  producir  un  campo  eléctrico  en   la   cámara   fuente   tal  que   los   ionessaldrán de la cámara a través de la ranura de salida de iones. Los iones son dirigidos pormedio de varios lentes de enfoque y centrados y son enfocados hacia la ranura de salida dela cámara. Es entonces cuando los iones pueden ser analizados por su masa.

Mecanismos de formación de iones.

Considérese la ionización del analito AB:

1. AB + e­* ­­­­­> A+ + B­ + e­ 2. AB + e­* ­­­­­> A+ + B° + 2e­ 3. AB + e­* ­­­­­> [AB+°*] + 2e­  

seguido por   [AB+°*] ­­­­­> AB+° 4. AB + e­* ­­­­­> [AB2+*]" + 3e­  

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seguido por  [AB2+*]" ­­­­­> A+ + B+ ­ baja abundancia 5. AH + e­* ­­­­­> AH* + e­ 

seguido por AH* + AH ­­­­­> [AH+H]+ + A­ ­ 'autoionización química' Notas: 

Especies con un superíndice * se encuentran en estados de alta energía. Especies con un superíndice son radicales. Especies con un superíndice "   son intermediarios de vida corta que no pueden servistos en el espectro.1 y 2 son procesos con alta probabilidad de ocurrencia debido a la alta abundancia delas especies y se denominan fragmentación instantánea. Esta es la razón por la que laIonización Electrónica es considerada un proceso de ionización dura.3 tiene una probabilidad moderada de ocurrir debido a la relativa abundancia de susespecies   y   es   el   proceso   responsable   de   la   formación   molecular   del   ion.Desafortunadamente   el   radical   intermediario   de   alta   energía   [AB+°*]   tiende   afragmentarse (o rearreglarse) como un proceso de estabilización, esto da lugar a losfragmentos ionizados de bajo peso presentes en el espectro.4 es un proceso con baja probabilidad de ocurrir por la escasez de sus especies peroteóricamente si puede ocurrir.5 es un proceso que puede ocurrir a altas presiones (Autoionización Química), estoes especialmente problemático en la ionización de alcoholes y aminas en donde sepuede   encontrar   que   el   proceso   dominante   de   ionización   es   el   intercambio   deprotones entre dos moléculas de analito, dando lugar a la formación del ion pseudo­molecular [M+H]+.

1.3.2 Bombardeo Rápido de Atomos (FAB) y Espectrometría de Masas de IonLíquido Secundario (LSI) 

Teoría

Las técnicas de FAB y LSI consisten en el bombardeo de una mezcla sólida de analito +matriz   por  un   rápido  haz  de  partículas.  La  matriz   esta   formada  por   especies  pequeñasorgánicas   (glicerol  o   alcohol  3­nitrobencílico)   las  cuales   son  usadas  para  mantener  unasuperficie homogénea “fresca” para el bombardeo, y por lo tanto, extendiendo el tiempo devida espectral y acentuando la sensibilidad. En FAB, el haz de partículas es un gas inerteneutral, comúnmente Ar o Xe, con energías de bombardeo de 4 ­ 10keV, mientras que enLSI, el haz de partículas es un ion, típicamente CS+, con energías de bombardeo de 2 – 30KeV.

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El haz de partículas  incide en la superficie del analito en donde transfiere mucha de suenergía a los alrededores, generando colisiones e interferencias momentáneamente. Algunoscompuestos son expulsados fuera de la superficie en forma de cationes y aniones en esteproceso, y estos iones secundarios liberados son luego extraídos de la fuente y analizadospor un espectrómetro de masas. La polaridad de la fuente de extracción puede ser cambiadadependiendo que compuesto se esta analizando. 

Figura 6. Esquema de una fuente Rápida de Bombardeo Atómico (FAB).

 La figura 6 muestra un esquema que representa una fuente Rápida de Bombardeo Atómicooperando en modo de ion positivo. El rápido haz atómico incide en la superficie del analito+ matriz en donde produce una liberación de iones secundarios. Los iones positivos sonextraídos de la fuente hacia el espectrómetro de masas.

Las técnicas FAB y LSI son comparativamente técnicas de ionización suave, y por lo tantoson adecuadas para compuestos da baja volatilidad, que producen típicamente grandes picospara   las   especias   iónicas   pseudo   moleculares   [M+H]+  and   [M­H]­,   conjuntamente   confragmentos iónicos estructuralmente significativos y algunos agregados iónicos de mayorpeso molecular y dímeros.

1.3.3. Ionización por Electrospray

Teoría

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La producción de iones por evaporación de gotas cargadas eléctricamente obtenida medianteasperjado o burbujeo se conoce desde hace siglos, pero solo recientemente se descubrió queestos iones pueden contener más de una carga. Un modelo de la formación de iones en ESI,que contiene los temas comúnmente aceptados se describe a continuación:

Grandes gotas cargadas se producen por “nebulización neumática”; por ejemplo cuando seforza a pasar la solución del analito a través de una aguja, donde al final de ésta se aplica unpotencial; el potencial usado es suficientemente alto para dispersar la solución que sale enpequeñas   finas   gotas   cargadas   todas   a   la   misma   polaridad.   El   solvente   se   evapora,disminuyendo el  volumen de  la  gota y   aumentando  la  concentración de  la  carga en  lasuperficie de la gota. Eventualmente, en el límite de Rayleigh, la repulsión culómbica superala tensión superficial de la gota y ésta explota. Esta explosión culómbica forma una serie degotas más pequeñas y menos cargadas. El proceso de disminución de volumen seguido de laexplosión   se   repite   hasta   que   se   logran   formar   iones   individuales   cargados   del   analito“puro”.   Las   cargas   están   estadísticamente   distribuidas   en   todos   los   sitios   de   cargadisponibles del analito, dando lugar a la posible formación de múltiples iones cargados enlas condiciones correctas. Aumentar la velocidad de evaporación del analito introduciendoun flujo de gas desecante    a contra corriente a los iones asperjados aumenta el grado decargado múltiple. Si se disminuye el diámetro capilar y se disminuye el flujo de la solucióndel analito, como en ionización nano­spray, se producirán iones con una proporción más altade m/z (es una técnica de ionización mas suave) que los producidos por un ESI convencionaly son de mayor utilidad en el campo de bioanálisis.  

Figura 7. Esquema de la distribución típica de una fuente de electrospray.

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1.3.4. Desorción/Ionización láser asistida en Matriz (MALDI) 

Desorción láser 

El   estudio   de   los   compuestos   polares   siempre   ha   sido   un   problema   para   laespectrometría de masas. Se demostró a principios de la década de 1960 que la radiación demuestras orgánicas de bajo peso molecular con un pulso láser de alta intensidad, produceiones que pueden ser analizados por su masa.

Desde estos primeros experimentos, la desorción láser (LD) ha sido ejecutada con un ampliorango de condiciones instrumentales y una gran variación en la calidad de los resultados. Laaplicación   de   LD   al   análisis   de   macromoléculas   biológicas   polares   no   volátiles,macromoléculas orgánicas y polímeros fue un paso importante en el desarrollo de LD. Sinembargo, estos experimentos revelaron tener un límite máximo para el peso molecular de 5­10 kDa.

El requisito primario para una Desorción Láser exitosa es que la transferencia de energía delrayo   láser   hacia   el   analito   debe   ocurrir   en   el   menor   tiempo   posible   para   prevenir   ladescomposición   de   las   moléculas   térmicamente   lábiles   del   analito.   El   límite   del   pesomolecular es probablemente debido a que la energía necesaria para provocar la excitaciónresonante y la transferencia exitosa de energía es más grande que la energía de disociacióndel   analito.   Por   lo   tanto,   el   analito   no   se   desorbe   quedando   intacto   en   una   cantidadsignificativa   dando   como   resultado   un   espectro   de   fragmentos   de   bajo   peso   molecularsolamente.

Otra restricción importante de la ionización LD es la corta duración del destello iónico quese  produce  después  del  pulso   láser.  Una  consecuencia  de  esto   es  que   la   técnica  no  esadecuada para instrumentos de análisis de barrido en sector o en cuadrupolos. Esto indicaque LD es particularmente adecuada para espectrometría de masas de Tiempo de Vuelo(MS/TOF).

Desarrollo de la Desorción/Ionización asistida en Matriz (MALDI) 

En 1987, se descubrió que el uso de una matriz en Desorción Láser (LD) podría liberar lalimitación restrictiva del peso molecular de la técnica. Los requisitos de la matriz son quetenga una fuerte absorbancia en la longitud de onda láser y que tenga un peso molecular

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suficientemente bajo para poder sublimarse. El analito,  a baja concentración, se dispersauniforme y completamente en la matriz sólida o líquida, depositada al final de una sonda oen una placa metálica e introducida al pulso del rayo láser.

Una analito a baja concentración tiene ventajas importantes:

• La eficiencia de la transferencia de energía del láser al analito (a través de la matriz)aumenta,  mientras que  los  problemas asociados con  la disociación del  analito  sereducen significativamente. 

• La   asociación   de   las   moléculas   de   analito   para   formar   agregados   de   alto   pesomolecular   también   se   reduce   y   se   cree   que   ciertas   matrices   específicas   puedeninclusive acentuar la formación de iones.

Mecanismo de la Desorción Iónica 

El mecanismo de la técnica MALDI no se ha comprendido totalmente, pero se cree quefunciona de la siguiente manera:

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Figura 8. Esquema de desorción por MALDI.

(i) La formación de una “Solución Sólida”. Las moléculas de analito están completamente distribuidas en toda la matriz de manera quese   encuentran   aisladas   unas   de   otras.   Esto   es   necesario   para   que   la   matriz   forme   una“solución   sólida”  homogénea   (cualquier   solvente   líquido  usado  en   la  preparación  de   lasolución se retira cuando la mezcla se seca antes del análisis)(ii) Excitación de la Matriz. Algo   de   la   energía   láser   incidente   en   la   solución   sólida   es   absorbida   por   la   matriz,produciendo rápidas vibraciones y causando una desintegración local de la solución sólidaformando   agregados   compuestos   de   moléculas   individuales   de   analito   rodeadas   demoléculas de matriz neutras y excitadas. Las moléculas de la matriz se evaporan de estosagregados dejando atrás la molécula excitada del analito.(iii) Ionización del Analito.Las moléculas de analito pueden ionizarse por simple protonación por la matriz excitadafotónicamente,  dando lugar a  la formación del compuesto típico de tipo [M+X]+  (dondeX=H,  Li,  Na,  K,  etc.).  Algunos  compuestos  con  carga  múltiple,  dímeros  o   trímeros   sepueden formar también. Se producen aniones  por  las  reacciones con desprotonación delanalito por la matriz para formar [M­H]­ y por las interacciones con los fotoelectrones paraformar iones moleculares radicales [M]­ .

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Estas reacciones de ionización ocurren en las primeras decenas de nanosegundos después dela radiación, y dentro de la nube de desorción inicial de matriz/analito. Es en esta forma enque se produce el espectro característico MALDI, dando lugar típicamente a grandes señalespara compuestos del tipo [NM+X]n+ (N * n).

1.4. Métodos de Análisis

1.4.1. Análisis de Doble Sector

Teoría

Los iones se aceleran desde la fuente, bajo la acción de un voltaje, Va, y entran al analizadorelectrostático el cual funciona como un instrumento de direccionamiento de energía. Debidoa la naturaleza física de muchos tipos de ionización, los iones con una misma masa y cargase   producen   con   una   energía   de   distribución,   la   cual,   si   no   se   corrige,   disminuirádrásticamente   la   resolución   observada   y   la   precisión   en   la   medición   de   la   masa.   Elanalizador electrostático dirige los iones con una misma relación carga­masa, m/z, hacia unatrayectoria más coherente a través del sector magnético.

El sector magnético consiste en un tubo amplio colocado entre un imán variable de fuerza decampo B y radio r (comúnmente 60  O  ­120O). Al cambiar el campo magnético la fuerzadirigirá   a   los   iones   de   diferente   relación   masa­carga   hacia   el   punto   de   “dobledireccionamiento” (figura 9) y en consecuencia hacia el detector de iones (usualmente unmultiplicador electrónico).

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Figura 9. Esquema de un espectrómetro de masas de dos sectores. Componentes básicos de un espectrómetrode masas de dos sectores (electrostático/magnético).

Iones de masa m, carga z y velocidad v, entran al campo magnético con una energía cinéticadefinida por la ecuación 1, la cual la adquirieron al salir de la ranura de la fuente.

Ecuación 1:

La   fuerza   centrífuga   experimentada   por   los   iones  debe   balancear   la   fuerza  de  Lorentzejercida por el campo magnético (fuerza B, radio r) para que sea dirigido hacia el punto dedoble direccionamiento. 

1.4.2. Espectrometría de Masas de Tiempo de Vuelo (TOF) 

Teoría

El espectrómetro de masas TOF es el más simple de los analizadores de masas y tiene unamuy alta sensibilidad en virtualmente un rango ilimitado de masas. Los iones de la muestrase generan en una zona fuente, s, en el equipo, por cualquiera de los métodos de ionización.Un potencial Vs (la fuente de extracción) se aplica a lo largo de toda la fuente para extraer yacelerar los iones de la fuente hacia la zona libre de campo d, del equipo.

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Figura  10.  Desorción laser de un espectrómetro de masas con tiempo de vuelo.  (A) Un sistema lineal detiempo de vuelo en el cual los iones generados por la desorción laser se aceleran a través de la región de lafuente de iones hacia el tubo de campo libre que va al detector. (B) Un sistema de tiempo de vuelo con unespejo   reflectrón   de   iones   que   invierte   la   trayectoria   de   vuelo   de   los   iones   de   manera   que   corrige   lasdiferencias en la energía cinética de los iones con la misma m/z.

En un caso ideal, todos los iones producidos saldrán de la fuente al mismo tiempo con lamisma   energía   cinética,   debido   a   que   fueron   acelerados   por   la   misma   diferencia   depotencial. En este caso, los iones producidos por la técnica Tiempo de Vuelo, dependeránsolamente de la masa y de la carga producida en el ion. Descartando el tiempo de extracciónde la fuente, la fórmula básica para el análisis de masas por TOF está dada por la siguienteecuación:  

Donde: 

mi = masa del ion de analito 

zi = carga en el ion de analito 

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E = campo de extracción 

ti = tiempo de vuelo del ion 

ls = longitud de la fuente 

ld = longitud de la región libre de campo magnético 

e = carga electrónica (1.6022x10­19 C) 

Para obtener un espectro de masas confiable, el tiempo de extracción del ion debe ser de unaalta precisión.  Este problema se aborda generalmente usando una técnica de ionización depulsos  como  la  desorción   láser  o  MALDI.  Hay  ciertos  problemas  con  las   técnicas  quecausan una distribución en el tiempo de vuelo para cada masa, y por lo tanto disminuyen laresolución. Estos factores deben ser corregidos si se desea un espectro de alta resolución.Para obtener una alta resolución se requiere usar los equipos más complejos reflectrón, tubosmás largos y/o extracción iónica retrasada.

1.4.3. Analizador de Masas de Cuadrupolos 

Teoría 

En  un  analizador  de  masas  de  Cuadrupolos,   se  usan  campos   eléctricos   solamente  paraseparar los iones de acuerdo a su relación carga­masa. Un cuadrupolo consiste en cuatrovarillas paralelas o polos a través de los cuales se hacen pasar los iones a separar. Los polosreciben   una   corriente   directa   fija   y   voltajes   de   radio   frecuencia   (RF)   alternantes.Dependiendo del campo eléctrico producido, solamente iones con cierta relación de carga­masa serán dirigidos  hacia  el  detector;   todos  los demás   iones serán desviados hacia   lospolos. Al variar la fuerza y la frecuencia de los campos eléctricos, diferentes iones puedenser   detectados   y   formar   el   espectro   de   masas.   La   trayectoria   de   un   ion   a   través   delcuadrupolo es muy compleja.

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Figura  11.  Esquema   de   un   analizador   de   masas   de   Cuadrupolos.   Las   cuatro   varillas   muestran   un   áreatransversal circular pero en la práctica son de área transversal hiperbólica.

Dos polos opuestos tendrán un potencial de +(U+Vcos(t)) y los otros dos (U+Vcos(t))donde U es un potencial fijo y  Vcos(t) representa un campo de frecuencia de radio (RF)de amplitud V y frecuencia cos(t). Cuando cos(t) se encuentra en fase con el tiempo, t,los voltajes aplicados en pares de polos opuestos variarán de manera sinusoidal pero enpolaridad  opuesta   (debido  a  que  están  en   fase  opuesta).  A  lo   largo  del   eje   central  delcuadrupolo y también en el eje entre cada polo adyacente el campo eléctrico resultante escero. En dirección transversal de los cuadrupolos, un ion oscilará entre los polos con unatrayectoria   compleja,   dependiendo   de   su   relación   carga­masa,   los   voltajes   U,   V   y   lafrecuencia  del  potencial  alternante RF.  Mediante  una  selección adecuada de  U,  V y wc

solamente   iones   con   una   relación   carga­masa  oscilarán   de  manera   estable   a   través   delanalizador de masas de cuadrupolo hacia el detector. Todos los demás iones tendrán unamayor amplitud de oscilación haciendo que se estrellen en uno de los polos. En la práctica,la frecuencia se mantiene fija con valores típicos entre 1­2 MHz. La longitud y diámetro de los cuadrupolos determinará el rango de masas y la resoluciónfinal que puede conseguirse por el conjunto de cuadrupolos. Sin embargo, el rango máximoque puede lograrse es alrededor de 4000 kDa con una resolución de aproximadamente 2000. 

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1.4.4. Transformada de Fourier de Resonancia Ion Ciclotrón (FT­ICR) 

Teoría 

La espectrometría de masas por resonancia ion ciclotrón transformada de Fourier (FT­ICR)es probablemente el método más complejo de análisis de masas. La técnica ha pasado por uncomplejo desarrollo desde su concepción a mediados de los años 50´s. Es la más sensible delas técnicas de uso común hoy en día, y tiene casi una resolución de masas ilimitada, >106

puede observarse con la mayoría de los instrumentos y tiene resoluciones en el rango de 104

a 105. 

El espectrómetro de masas FT­ICR consiste de tres secciones principales. La primera es lafuente de la muestra, la cual puede ser prácticamente cualquiera de las técnicas, aunque ESIy MALDI son las más comunes. La segunda sección es la región de transferencia iónica,donde los iones generados en la fuente son dirigidos, agrupados y transferidos hacia unaregión de alto vacío antes de entrar a la celda de analizador. La región final es la celdamisma.   Es   posible,   en   algunos   casos   (especialmente   con   MALDI)   generar   ionesdirectamente   en   la   celda;   esto   evita   la   necesidad   de   las   regiones   complejas   dedireccionamiento iónico y bombeo.

El arreglo estándar para la región del analizador del equipo de FT­ICR, es una trampa iónicacolocada dentro un campo magnético estático B0 espacialmente uniforme. El efecto delcampo magnético es restringir la trayectoria de los iones incidentes a una órbita circular,cuya frecuencia es determinada por la masa m, la carga z, y la velocidad v, del ion, poracción de la fuerza de Lorentz, definida en la ecuación 1. El ion del analito es desviado haciauna trayectoria circular en un plano perpendicular al campo magnético. 

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Figura 12. Esquema de la trampa de iones, la excitación y la detección de iones para producir un espectro demasas en espectrometría de masas FT­ICR.

La presencia de iones entre un par de electrodos del detector (en la celda de la trampa)realmente  no  producirá   ninguna   señal  medible.  Es  necesario   excitar   los   iones   con  unarelación carga­masa específica como un paquete coherente para un radio orbital más largoaplicando un barrido de radiofrecuencia de pocos milisegundos a través de la celda. Unafrecuencia dada excitará a un ion con una relación carga­masa particular (La transformadade   Fourier   permite   medir   todas   las   frecuencias   simultáneamente).   La   medición   de   lafrecuencia angular (ecuación 2) lleva a valores de relación carga­masa (ecuación 3) y por lotanto al espectro de masas. Debido a que la frecuencia puede ser medida de manera másprecisa que cualquier otra propiedad, la técnica tiene una muy alta resolución de masas.Después de la excitación, a los iones se les deja relajarse y regresar a su estado natural demovimiento para ser medidos nuevamente si es necesario.

1.4.5. Análisis en Trampa Iónica  

Teoría 

El   analizador   de   masas   con   cuadrupolo   y   trampa   iónica   consiste   de   tres   electrodoshiperbólicos: el electrodo circular, el electrodo de tapa de entrada  y el electrodo de tapa desalida. Estos electrodos forman una cavidad en la que es posible atrapar y analizar iones. Losdos electrodos de tapa tienen un pequeño orificio en su centro a través de los cuales los ionespueden pasar. El electrodo circular se encuentra a la mitad entre los dos electrodos de tapa.

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Figura 13. Componentes básicos de un espectrómetro de masas de trampa iónica

Los   iones   generados   desde   la   fuente   entran   a   la   trampa   a   través   del   sistema   dedireccionamiento de entrada y el electrodo de tapa de entrada. Se aplican varios voltajes alos electrodos para atrapar y expulsar a los iones de acuerdo con su relación carga­masa. Seaplica un potencial a.c. de frecuencia constante y amplitud variable al electrodo circular paraproducir   un   campo  potencial   cuadrupolar   3D   dentro   de   la   cavidad  de   la   trampa.   Estoatrapará a los iones en una trayectoria oscilante estable confinada en la celda de la trampa.La naturaleza de la trayectoria depende del potencial de la trampa o de la relación carga­masa de los iones. Durante la detección los potenciales del sistema de electrodos se alteranpara producir inestabilidades en las trayectorias de los iones y en consecuencia expulsan alos iones en una dirección axial. Los iones son expulsados en orden creciente de acuerdo asu relación carga­masa, dirigidos por el lente de salida y detectados por el sistema detectorde iones.

1.4.6. Espectrometria de Masas en TándemEl término “tándem” indica el uso de una segunda etapa de análisis de masas en el

mismo   experimento.   Esto     da   lugar   a   la   capacidad   de   estudiar   selectivamente   ionesespecíficos  en una  mezcla  compleja  para  obtener   información estructural   sobre  ese  ion.Acoplando dos analizadores, separados por una cámara de colisiones se puede obtener másinformación de la molécula. El primer analizador se usa para seleccionar el ion de interés.Este ion se hace pasar luego hacia la cámara de colisiones, la cual, usualmente se encuentra

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presurisada con un gas  inerte.  La colisión del   ion con  los  átomos en  la  cámara puedeninducir la disociación del ion. A este proceso se le conoce como Disociación Inducida porColision (CID). El ion original se le llama “ion precursor” y a los iones disociados se lesconoce como “iones producidos”. Estos iones producidos luego se analizan en el segundoespectrómetro de masas dando lugar a un espectro de masas de iones producidos del ionoriginal.Estos análisis se conocen como MSn en donde “n” significa el número de etapas de análisisde masas. Un espectro MS2 o MS/MS de iones producidos contiene dos etapas de análisis.

Figura 14. Caracterización estructural de un ion seleccionado en base a su masa por espectrometría de masasen tándem. El análisis de masa del ion precursor determina la m/z del péptido ionizado de interés. Ese ion seselecciona en base a su masa en la primera etapa del análisis y se activa por colisión con una molécula de gasneutral para inducir la reacción de fragmentación. Los iones producidos de la reacción de fragmentación seanalizan en la segunda etapa del análisis de masa para producir un espectro de iones producidos.

La MS/MS proporciona información estructural mediante el establecimiento de relacionesentre los iones precursores y sus fragmentos producidos por las colisiones.

La espectrometría de masas en tándem puede clasificarse en dos tipos:

Tándem en espacio:

• Cuadrupolos en tándem• Reflectrón Tiempo de Vuelo• Sector en tándem

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• Sector – Cuadrupolo

Tándem en tiempo:

• Trampa iónica• Transformada de Fourier

Figura 15. Una representación de cuatro modos de barrido de espectrometría de masas en tándem (A). Modoestándar de análisis, el primer analizador y la cámara de colisiones transmiten todos los iones para que elsegundo   analizador   realice   el   análisis   de   masas.   (B)   Barrido   de   iones   producidos,   el   ion   en   estudio   seselecciona de acuerdo a su masa en el primer analizador y se fragmenta en la cámara de colisiones. En elsegundo analizador de masas se analiza la masa de los iones producidos. La señal es el resultado de los ionesproducidos derivados del ion precursor que fue seleccionado en base a su masa. (C) Barrido de ion precursor,en el primer analizador se realiza un barrido secuencial para transmitir los iones hacia la cámara de colisionespara su fragmentación, el segundo analizador selecciona el ion producido de interés de acuerdo a su masa. Laseñal que llega al detector es el resultado de todos los iones precursores que se pudieron fragmentar en un ionproducido común. (D) El barrido de pérdida neutral, el análisis de masas se realiza en ambos analizadoresenlazándolos   con  una  diferencia   constante  en  masa.  La  señal  que   llega   al  detector  es  el   resultado  de   lafragmentación de los iones precursores al perder una especie neutral específica, formando un ion con unadiferencia de masa característica.

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Equipos de Tándem en espacio.

Los equipos en la categoría de tándem en tiempo utilizan más de un analizador de masas quefuncionan independientemente durante el experimento. El ejemplo clásico de este tipo deequipos es el de Cuadrupolos en Tándem, al cual se le conoce como “espectrómetro de triplecuadrupolo”. Se emplea un analizador cuadrupolo en ambas etapas de análisis de masas conuna   cámara   de   colisiones   entre   los   dos   analizadores.   Las   primeras   versiones   delespectrométro de triple cuadrupolo usaban otro cuadrupolo para la cámara de colisiones, ypor eso el nombre de triple cuadrupolo. El propósito de este sistema, es que en la cámara decolisiones se lleven a cabo las colisiones que producirán la activación y fragmentación a lavez de retener los iones de todos los tamaños y liberarlos hacia la segunda etapa de análisisde masas.

Otro equipo de tándem en tiempo utilizado para la secuenciación de proteínas tiene uncuadrupolo para el primer analizador de masas y un analizador Tiempo­de­Vuelo (TOF)para el segundo analizador. Además utiliza un sistema de lentes octapolo alrededor de lacámara de colisiones. La diferencia principal en este tipo de equipo es que el espectro demasas y el espectro de de iones producidos se registran en un analizador TOF con todas susventajas características.

Un tercer tipo de equipos de tándem en espacio es el analizador de masas configurado paraestudiar reaciones de Post Source Decay (PSD). La característica particular de estos equiposy el equipo estándar Reflectron Tiempo de Vuelo, es la compuerta electrostática utilizadapara la selección de iones precursores. Estas compuertas utilizan pulsos de voltaje paradesviar los iones de m/z no deseados de la entrada al tubo de vuelo. Debido a que laresolución m/z de estas compuertas es relativamente baja (ej, 100) la selección de un ion aun m/z de 1000 Th permite transmitir o liberar en una ventana de m/z cerca de 20 Th.

Figura  16.  Diagrama de un espectrómetro  de masas con  cuadrupolos  en   tándem. En un  experimento  deespectrometría en tándem, ambas etapas del análisis de masas se realizan con un filtro de masas cuadrupolo.La cámara de colisión es un sistema de lentes octapolo que contiene y transmite iones de cualquier m/z. Para

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mediciones de peso molecular, el primer cuadrupolo se utiliza en un modo de radio frecuencia para transmitirtodos los iones y el segundo cuadrupolo realiza el análisis de masas.

Equipos de Tándem en tiempo.

Los equipos que realizan espectrometría de masas en tándem en el tiempo constan de soloun analizador, que por nececidad, este analizador debe ser capaz de atrapar iones. Unejemplo de estos equipos es el espectrómetro con trampa iónica. Otros equipos en estacategoría son los de Resonancia Ion Ciclotrón (ICR). En un espectrómetro con trampa iónica, el análisis en tándem comienza atrapando iones detodas las m/z. Se aplican una serie de funciones de barrido de radiofrecuencia (rf), lo cuallibera de la trampa a todos los iones excepto a los que tienen la  m/z de interés. En estascolisiones, la energía cinética de las colisiones se convierte en energía interna en el ion parainducir la fragmentación. Finalmente se efectúa un análisis de masas en secuencia paramedir la relación m/z de todos los iones producidos.

La espectrometría de masas en tándem también puede ser empleada para cuantificación.Esto   se   logra   mediante   el   registro   en   dos   etapas   del   ion   seleccionado.   El   primerespectrómetro se configura para transmitir el ion de interés hacia la cámara de colisiones yposteriormente uno de sus iones producidos se monitorea en el segundo espectrómetro demasas. 

La espectrometría de masas puede utilizarse también para efectos de selección y existen dostécnicas principales. El segundo espectrómetro se configura estadísticamente para transmitiriones producidos seleccionados con una relación m/z específica. Esta masa se monitoreaconstantemente mientras que el primer espectrómetro se realiza un barrido. Se detecta unaseñal solamente cuando un ion precursor se fragmente en el ion que se esta monitoreando.Esta técnica se conoce como “Barrido de Ion precursor” y se usa generalmente para filtraruna matriz compleja (ej. orina o fluídos corporales) con el fin de localizar compuestos conestructura relacionada, como metabolitos de una droga conocida.

La   otra   técnica   es   el   “Barrido   de   Pérdida   Neutral   Constante”.   En   esta   técnica,   ambosespectrómetros realizan barridos simultáneamente pero se encuentran desfasados por unacantidad   fija   que   corresponde   a   la   diferencia   de   masa   entre   el   ion   precursor   y   el   ionproducido. La señal aparece solo cuando el ion precursor genera un ion producido con la

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diferencia   de   masa   seleccionada.   Esta   técnica   puede   ser   utilizada   para   seleccionarcompuestos que contengan una caractarística estructural específica que genere un proceso defragmentación común.

1.4.7. PSD ­ MALDI

El método esta basado en el análisis de los iones producidos (iones PSD) en la primeraregión libre de campo magnético de un reflectrón en un espectrómetro con Tiempo de Vuelo(TOF).

Al contrario del análisis de peso molecular por MALDI/MS tradicional, la producción deiones es mejorada cambiando a un diseño apropiado de la fuente de iones mientras que elanálisis   de   los   iones   producidos   se   procesa   mediante   una   evaluación   de   los   tiemposcaracterísticos de vuelo de los iones PSD en el reflectron.

Cristalización de la Muestra/Matriz

La matriz tiene tres principales funciones:• La separación y solvatación de moléculas de analito en  la  fase sólida,

evitando su aglomeración.• Absorber la energía del rayo laser utilizada para la desorción e ionización

de la matriz y el analito.• La ionización de analito (protonación) mediante reacciones ácido/base en

la fase gaseosa.

La matriz tiene generalmente un alto espectro de absorción en la longitud de onda del láserusado,   mientras   que   generalmente   el   analito,   aunque   no   necesariamente,   tiene   bajaabsorción. La solvatación del analito  y  la desorción de moléculas de analito  entre ellas,requieren  de   la   formación,  durante   la  preparación,  de  cristales  de   la  matriz,   los   cualesincorporan el analito a la red de la matriz.

Desorción e Ionización

Las moléculas de la matriz se calientan y se excitan rápidamente por la absorción de fotones,dando  lugar a  una rápida expulsión de material.  Las moléculas protonadas de  la matriz(iones  de  la  matriz)  se   forman después  de una serie  de reacciones  fotoquímicas que  sesuceden rápidamente en una fase densa justo encima de la superficie. Poco después, en unafase menos densa (aun dentro de una distancia de 1mm de la superficie) se lleva a cabo la

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ionización de las moléculas de analito por la transferencia de un protón de los iones de lamatriz a las moléculas neutrales del analito; esto es debido a una mayor afinidad del analitopor protones.

Activación dentro de la fuente

Dado que en la pluma de desorción predominan moléculas neutras de la matriz, se producenfrecuentes colisiones de baja energía de los iones con estas moléculas neutrales durante laaceleración en los primeros microsegundos después del pulso láser. La densidad de la nubede moléculas neutrales y la energía cinética de los iones de analito que colisionan son losdos factores clave para fragmentaciones subsecuentes. Una mayor densidad y una mayorenergía   de   colisión   resultan   en   una   activación   más   eficiente   y   en   fragmentacionessubsecuentes   (más   señales   de   fragmentos   iónicos).   La   densidad   neutral   se   controlaprincipalmente por la radiación del láser, la temperatura de sublimación de la matriz y eldiámetro de enfoque. La energía de colisión, por otro lado, se controla básicamente por lafuerza de campo inicial de aceleración. 

Desactivación iónica

Los iones activados por colisión pasan a un estado de desactivación en la región libre decampo magnético del espectrómetro. Esta desactivación tiene velociadades k típicamente enel rángo de 2,000 – 30,000 seg­1. Las velociadades de desactivación disminuyen al aumentarla masa del ion. La larga región libre de campo de un espectrómetro de masas TOF es por lotanto una buena opción para obtener una alta eficiencia de fragmentación.

Análisis de masa

Los fragmentos iónicos (iones PSD) formados en la región libre de campo magnético tienenuna   velocidad   igual   a   la   de   los   iones   precursores   y,   en   un   equipo   lineal   TOF,   seríandetectados en el mismo tiempo. La energía cinética de los iones en una medida directa de lafracción   de   la   masa   del   ion   precursor.   Los   fragmentos   pequeños   (con   menos   energíacinética) son reflejados primero y por lo tanto toman trayectorias más largas a través delreflector que los fragmentos más grandes. Para conocer el espectro completo de los ionesPSD   desde   los   fragmentos   con   menor   masa,   es   necesario   obtener   varios   espectros   adiferentes potenciales en el reflector para direfentes energías cinéticas. Después de pasar lasegunda región libre de campo magnético del equipo TOF, los iones PSD se detectan en undetector de iones común como una placa de microcanales o un multiplicador electrónico.

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Figura  17.  Un equipo   reflectrón  con   tiempo  de  vuelo  y  una   compuerta   iónica.  La  compuerta   iónica   semantiene a un voltaje positivo excepto durante un pequeño intervalo, específico para transmitir selectivamenteiones a una cierta m/z. La fragmentación debe ocurrir antes de entrar al reflectrón, el cual separa los ionesproducidos de acuerdo a la cantidad de energía cinética que llevan.

II. Secuenciación de proteínas por espectrometría demasas

Los   péptidos   y   proteínas   son   polímeros   constituídos   por   combinaciones   de   los   20aminoácidos más comunes unidos por puentes peptídicos. Además, las proteínas producidaspor los ribosomas pueden sufrir modificaciones covalentes, llamadas modificaciones post­traduccionales. Más de 200 modificaciones han sido detectadas, las más importantes son:glicosilación, formación de puentes disulfuro, fosforilación,  hidroxilación, carboxilación y

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acetilación   del   ácido   N­terminal.   La   espectrometría   de   masas   no   sólo   permite   ladeterminación precisa del peso molecular sino también la determinación de sus secuencias. 

Tabla 1. Modificaciones post­traduccionales y variaciones en la masa de la proteína

Modificación post­traduccional Diferencia de masa (Da)Metilación 14.03Propilación 42.08Sulfación 80.06Fosforilación 79.98Glicosilaciones por:        Desoxihexosas (Fuc) 146.14        Hexosaminas (GlcN, GalN) 161.16        Hexosas (Glc, Gal, Man) 162.14        N ­ Acetilhexosaminas (GlcNAc, GalNAc) 203.19        Pentosas (Xyl, Ara) 132.12        Ácido siálico (NeuNAc) 291.26Reducción de un puente disulfuro 2.02Carbamidometilación 57.03Carboximetilación 58.04Cisteinilación 119.14Etilpiridilación 105.12Acetilación 42.04Formilación 28.01Biotinilación 226.29Farnesilación 204.36Miristoilación 210.36Condensación Shiff del piridoxal fosfato 231.14Estearoilación 266.47Palmitoilación 238.41Lipoilación 188.30Carboxilación de Asp o Glu 44.01Deamidación de Asn o Gln 0.98Hidroxilación 16.00Oxidación de Metionina 16.00Proteólisis de un puente peptídico 18.02Desaminación de Gln a piroglutámico ­17.03

2. Determinación de la estructura y de la secuencia porespectrometría de masas

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El análisis de proteínas puede dividirse en dos categorías básicas: análisis de masas ysecuenciación de aminoácidos. La habilidad para medir de   manera precisa la masa de laproteína   intacta   sirvió   como  un  método  para   revisar   rápidamente   si   la   secuencia  de   laproteína era correcta o para determinar la presencia de modificaciones post­traduccionales. 

Se   ha   mejorado   con   gran   éxito   las   técnicas   para   medir   las   masas   moleculares   de   lasproteínas  separadas  por  electroforesis  en gel  utilizando MALDI/TOF directamente,  paralograr esto, las proteínas son transferidas a una membrana adecuada o cortadas directamentedel gel. El corte del gel deshidratado o la membrana, es colocado  en el lugar de la muestra,tratado con una solución matriz e  irradiada con láser.  La proteína se  libera del gel o  lamembrana y se determina la masa molecular.

2.1. Fragmentación

Si se quiere obtener información estructural por medio de espectrometría de masas, lamolécula que se estudia debe de cortarse en uno o varios enlaces del esqueleto peptídicopara después corresponder el valor de m/z de los fragmentos resultantes con su estructuraquímica.   Las   técnicas   más   comunes   implican   la   formación   de   iones   estables   que   noproducen fragmentos. Esta característica se usa para determinar el peso molecular de lospéptidos o proteínas aun cuando se encuentren en una mezcla compleja. Sin embargo, estamisma   característica   conlleva   una   falta   de   información   respecto   a   su   estructura.   Esteinconveniente se puede superar transfiriendo por lo menos la energía extra requerida para lafragmentación a los iones estables producidos durante la ionización. Aunque varias técnicaspermiten   una   transferencia   de   energía,   tales   como   la   fotodisociación   y   la   disociacióninducida en superficie, el método más común es la Disociación Inducida por Colisión (CID).Los fragmentos que resultan son analizados utilizando MSn

Los  espectros  de  masa  en   tándem pueden   ser  obtenidos  utilizando   los   instrumentos  yamencionados   como   analizadores   magnéticos,   trampas   de   iones,   cuadrupolos,   etc.   Ladiferencia básica entre todos estos métodos radica en la cantidad de energía cinética de losiones.   En   instrumentos   magnéticos   la   energía   del   ion   precursor   es   de   varios   kilo­electrovoltios (keV) mientras que en los otros, como los cuadrupolos o trampas iónicas, laenergía cinética nunca excede los 100 eV. Esta diferencia en energía influye, obviamente, enel proceso de fragmentación. Los espectros de alta energía en tándem presentan un ampliorango de rutas de fragmentación, algunas de las cuales no se observan a baja energía. Unnúmero mayor de iones de fragmentos frecuentemente tienen más información pero tambiénincrementan la dificultad para interpretar el espectro.

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El análisis MS/MS de muchos péptidos con secuencias conocidas y desconocidas permiteidentificar   los distintos procesos de fragmentación existentes. Hay rutas de fragmentaciónraras y otras más comunes que ocurren dependiendo de las condiciones en las que se realicela fragmentación. Como ejemplo se muestran los espectros de fragmentación de alta y bajaenergía de un péptido (metionina­encefalina) en la figura 18.

                                                                 

Figura  18.  Espectros  de   fragmentación  de  alta  y  baja  energía  de   la  metionina­encefalina   (secuenciaYGGFM).

Los fragmentos pueden clasificarse en dos categorías:1) Aquellos derivados del corte de uno o dos enlaces peptídicos en la cadena

peptídica.2) Aquellos que además sufren un corte en una cadena lateral de aminoácidos.

  Los iones de péptidos se fragmentan comenzando por los puentes amida a lo largo delesqueleto peptídico. El corte de un enlace en la cadena peptídica puede ocurrir en tres tiposde enlaces a) Cα  – C, b) C­N o c) N – Cα,  que forma seis tipos de fragmentos que senombran an,  bn  y  cn  cuando se queda una carga positiva  en el  extremo N­terminal  y  senombran xn,  yn  y zn  cuando  la  carga positiva se mantiene en el  extremo C­terminal.  Elsubíndice  n  indica el  número de aminoácidos contenidos en el  fragmento.   La figura 19muestra los distintos tipos de fragmentos producidos a través del corte de un enlace en lacadena peptídica.

Figura 19.  Principales vías de fragmentación de los péptidos en CID/MS/MS.

La diferencia de masa entre iones consecutivos (entre dos picos) dentro de una serie permitedeterminar la identidad de aminoácidos consecutivos y por lo tanto deducir la secuenciapeptídica.   Hay   dos   excepciones:   Leu   –   Ile,   que   son   isómeros   y   por   lo   tanto   tienenexactamente la misma masa; y Gln – Lys, que son isobares, es decir, que son diferentes encomposición pero tienen la misma masa nominal. Normalmente el espectro muestra variasseries incompletas de iones que producen información redundante y hacen al espectro muycomplejo y difícil de interpretar.

Hay una marcada diferencia entre la fragmentación observada a alta y baja energía. A altaenergía se generan todas las fragmentaciones descritas en la figura 19.  Sin embargo, notodos los fragmentos son observados en el espectro debido a que la fragmentación puede serinfluenciada  por   la  naturaleza  de   los   aminoácidos  en   la   secuencia.  A  baja   energía,   los

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fragmentos   observados   son   principalmente  bn  y   yn.   Estos   fragmentos  pierden   pequeñasmoléculas como agua y amonio de los grupos funcionales de las cadenas laterales de losaminoácidos. 

Los iones de las series dn y vn se producen por la escición de la cadena aminoacídica lateral yse observan solamente en espectros CID de alta energía. 

Los mejores espectros son aquellos con una o dos series de iones, de manera que cada enlacepeptídico en la molécula esta representado en el espectro. De esta manera, la secuencia sedetermina por la diferencia de masas entre iones sucesivos. La producción de más de dosseries   de   iones   ocurre   en   espectros   de   alta   energía   y   generalmente   con   un   espectroincompleto de cualquiera de las series, y por lo tanto haciendo la interpretación más difícil.

Las masas monoisotópicas y químicas de los aminoácidos se muestran en la tabla 2. La masamonoisotópica es la masa del isótopo con menor m/z en un espectro donde se muestran lospicos  de   todos   los   isótopos   (espectro  de  alta   resolucion).  La  masa  química  es   la  masapromedio de todos los isótopos (espectro de baja resolución).

Tabla 2. Masa de varios aminoácidos

Aminoácido Código (3)

Código (1)

Masamonoisotópica

Masaquímica

Glicina Gly G 57.02147 57.052Alanina Ala A 71.03712 71.079Serina Ser S 87.03203 87.078Prolina Pro P 97.05277 97.117Valina Val V 99.06842 99.133Treonina Thr T 101.04768 101.105Cisteína Cys C 103.00919 103.144Isoleucina Ile I 113.08407 113.160Leucina Leu L 113.08407 113.160Asparagina Asn N 114.04293 114.104Aspartato Asp D 115.02695 115.089Glutamina Gln Q 128.05858 128.131Lisina Lys K 128.09497 128.174Glutamato Glu E 129.04260 129.116Metionina Met M 131.04049 131.198Histidina His H 137.05891 137.142Fenilalanina Phe F 147.06842 147.177Arginina Arg R 156.10112 156.188Tirosina Tyr Y 163.06333 163.17Triptofano Try W 186.07932 186.213

Generalmente, en la fragmentación se producen en cada corte dos fragmentos, uno con unN­ terminal y otro con un C­terminal. Se pueden encontrar otros tipos de fragmentos en la

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mayoría de  los  espectros que resultan del  corte  de al  menos dos  puentes   internos en  lacadena  peptídica.  El   primer   tipo   se   llama   fragmento   interno  debido   a   que  no   contieneextremos N­ y C­  terminal,  esta formado por  tres a cuatro aminoácidos y es muy pocoabundante. Se representa por una serie de simples letras correspondientes a la secuencia delfragmento. Los péptidos que contienen prolina son más abundantes debido a que el grupoimino de la prolina esta incluido en un anillo de cinco átomos y por lo tanto tiene una mayorafinidad por el protón que otros enlaces peptídicos en la cadena. Por lo tanto la protonacióny corte del enlace amida de la prolina está favorecido para formar un fragmento interno.

El segundo tipo de fragmento que resulta de un corte múltiple de la cadena peptídica es elion imonio que, al igual que el ion anterior, muestra una baja masa en el espectro. Estosiones se marcan por la letra correspondiente al aminoácido padre. 

Además de estos fragmentos, en un espectro de alta energía se pueden encontrar  otros trestipos que resultan del corte de la cadena peptídica y de la cadena lateral del aminoácido loscuales se muestran en la figura 20. En la figura 21 se muestra las vías para su formación.

                           

Figura 20. Fragmentos derivados de un corte doble de la cadena principal del péptido

       

Figura 21. Vías de fragmentación que producen los iones característicos de las cadenas laterales de losaminoácidos

Dos de estos tipos de fragmentos resultan del corte de un puente entre los carbonos β y γ dela  cadena  lateral  de   los  aminoácidos,   se   simbolizan  como dn  o  wn,   respectivamente,  deacuerdo   a   si   contienen   la   carga   positiva   en   el   N­   terminal   o   en   el   C­terminal.   Estosfragmentos son útiles para distinguir los isómeros Leu e Ile.

2.1.1. Influencia de la posición y deslocalización de la carga 

La protonación ocurre principalmente en sitios más básicos. Si se añaden más protonesestos se dirigirán primero hacia los otros aminoácidos básicos, si se encuentran presentes, ydespués a los grupos amida.

La presencia y la posición de un aminoácido básico dentro del péptido influencia el procesode fragmentación. La presencia de aminoácidos básicos   tales como Arg, Lys, His o Procerca del C­terminal induce principalmente la formación de iones conteniendo el extremo C­terminal (yn, vn  y wn) como se muestra en la figura 22, mientras que la presencia de estos

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aminoácidos cerca del N­terminal   favorece la formación de iones conteniendo el extremoN­terminal (an y dn). Sin embargo, la ausencia de un aminoácido básico dentro del péptido secaracteriza por una distribución más marcada de iones que contienen ya sea el C­ o el N­terminal por lo que la complejidad del espectro se incrementa..

Figura 22 Influencia de la presencia y posición de la carga en los fragmentos resultantes. 

2.2. Identificación y secuenciación de péptidos 

La Disociación Inducida por Colisión (CID) produce una escalera de secuencia de ionesdonde la diferencia en el valor m/z entre iones consecutivos (picos en el espectro) indica lamasa del aminoácido en esa posición de la secuencia.  La interpretación exitosa requieredeterminar cuales iones se originaron del N­ o C­terminal de forma que las diferencias en lasmasas entre iones consecutivos del mismo tipo de fragmento (ej. yn) puedan ser calculadas.Por lo tanto, una serie de iones secuenciales con valor m/z en orden ascendente definirá lasecuencia de aminoácidos. El espectro que contenga una serie completa de iones tipo bn nospermite deducir la secuencia del péptido desde el N­terminal al C­terminal, mientras que laserie de iones tipo yn permite la identificación de la secuencia en la dirección inversa.

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La   distinción   entre   fragmentos   que   contengan   el   C­   o   N­   terminal   se   puede   lograr   alintroducir un átomo 18O en el C­terminal de los péptidos obtenidos por digestión tríptica. Laidentificación se consigue al identificar el aumento de masa producido por la adición del18O.

La diferenciación entre Leu e Ile se logra favoreciendo la fragmentación de la serie dn o wn.Otra forma, es fragmentar los iones imonio de estos aminoácidos a baja energía en m/z  = 86que corresponde a la masa característica de este par de aminoácidos. La diferenciación entreLys y Gln se logra por la acetilación del grupo amino utilizando anhídrido acético.

Para generar dos series distintas del péptido, la proteína se digiere con tripsina o por otrasproteasas. El sitio específico de corte para estas y otras proteínas  utilizadas se muestra en latabla 3.

Tabla 3. Corte específico o enzimático de polipéptidos (el corte está entre el extremo carboxilo del residuo Xy el extremo amino del residuo Y)

Reactivo Sitio de CorteCorte químico        Bromuro de cianógeno Met­Y        Ácido Fórmico Asp­Pro        Hidroxilamina Asn­Gly        2–Nitro–5–tiocianobenzoato X­Cys        Fenil isotiocianato (Edman) Grupo amino terminal del péptidoCorte enzimático        Tripsina Arg­Y, Lys­Y        Quimiotripsina Tyr­Y, Phe­Y, Trp­Y        Endoproteasa V8 Glu­Y (Asp­Y)        Endoproteasa Asp ­ N X­Asp (X­Cys)

Cerca de 0.1 – 2 nmol por digestión son suficientes para un análisis CID­MS/MS.  El pesomolecular   de  cada  péptido   se   determina  después   de  una   separación  por  HPLC de   fasereversa, 

El espectro de masas en tándem, adquirido en un Espectrómetro de masas de trampa deiones Finnigan MAT LCQ, se muestra en la figura 23. El análisis MS/MS de los péptidosderivados a partir de una digestión de proteínas por tripsina generalmente presenta una serieprominente de iones tipo­y en el lado de alta masa del espectro y un residuo de lisina yarginina como el aminoácido C­terminal. Estos aminoácidos pueden ser reconocidos comodel tipo­y1  en el m/z 147 o 175, pero cuando se producen iones de péptidos grandes porMS/MS el espectro de la trampa de iones de los péptidos no muestra los valores bajos de

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m/z.     La   masa   que   se   obtiene   por   la   diferencia   entre   picos   es   el   valor   calculado   delaminoácido y la masa química conocida de un aminoácido es el valor predicho.

Figura 23. Espectro de masas de disociación inducida por colisión (CID) grabado en los iones [M + 2H]2+ am/z de 786 de [Glu]1­fibrinopéptido B. Los valores de m/z debajo de la secuencia son aquellos predichos apartir de la secuencia. Debajo de ellos están los valores de m/z medidos y la diferencia entre los dos valores.

La interpretación puede iniciarse con el ion más abundante y de más alto m/z, en este casom/z 1285.  Se puede crear  una   tabla de diferencias  de  masa  restando  los  valores  de  losaminoácidos probables para buscar el siguiente ion (del mismo tipo, ej. yn) de la secuencia,la diferencia de masa corresponde a la masa del aminoácido siguiente. En este caso el ion am/z  1171 muestra  una  diferencia  de  114.04  que  corresponde  al  aminoácido  Asn.  Si   secontinúa con este proceso a lo largo del espectro de masas en tándem se puede determinar laserie de ocho aminoácidos. Debido a que el péptido fue producido por cortes por tripsina sepuede limitar el residuo C­terminal a Lisina o Arginina. El ion presente a 246.1 es el ion y2

asi  que  probablemente   las  combinaciones  de  aminoácidos  son  Val­Lys  y  Ala­Arg.  Unarevisión al espectro muestra una baja abundancia a m/z 1396. La diferencia entre [M + H]+

(m/z 1221) y este ion es 175. La masa del residuo de Arg [156 + 18 (H2O) = 175] sugiereque la secuencia C­terminal del péptido es Ala­Arg.

La presencia de arginina en zonas terminales facilita la secuenciación óptima de un péptidoporque solo dos series de iones se producen y se ha visto que siempre son series completas.

Valores predichosValores calculados

Diferencia

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Una arginina situada a mitad del péptido resulta en la producción de iones N­terminales y C­terminales dependiendo del lugar de escición respecto a la arginina. El espectro resultante esmás difícil de interpretar y pueden aparacer zonas en blanco. 

Figura 24. Espectro de disociación inducida por colisión de (A) Un péptido (SYSMEHFRWGKPVG) [M + H]+ = 1680.3 y (B) el mismo péptido derivatizado con TMMA (trimetilamonioacetilo)  [M]+ = 1780.0

Los péptidos sin arginina generalmente producen tanto iones N­terminales como C­terminales. También presentan zonas en blanco. El perfil del espectro y la presencia dezonas en blanco en los patrones de fragmentación varían de péptido a péptido.

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Figura  25.  Espectro   de   disociación   inducida   por   colisión   de   (A)   El   péptido  α­endorfina(YGGFMTSEKSQTPLVT) [M + H]+ = 1745.5 (B) Derivatizado con TMMA (trimetilamonioacetilo)  [M]+ =1844.4

Derivados con carga fija.

Una manera efectiva de dirigir la producción de series completas de iones an y dn es el uso dederivados con carga fija en el N­terminal. La derivación se realiza en el N­terminal porqueexisten   métodos   para   la   modificación   selectiva   del   extremo   N   en   presencia   de   lisina,mientras que la modificación selectiva al extremo C­terminal no es tan simple. Hasta ahorael  amonio cuaternario (dimetilalquilamonio),   trifenilfosfoniometil   (TPPE),   trihidrotiofeno(THTA) han sido utilizados para realizar las derivatizaciones en el N­terminal.

El ion precursor con carga fija lleva una carga inmóvil en vez de una carga móvil de protón.En teoría todos los iones son producidos por una fragmentación de carga remota dirigida porla carga fija. En la práctica se observa la fragmentación esperada, aunque pueden ocurrirrearreglos en los que la carga se transfiere a otros sitios en el péptido. Estos procesos detransferencia  de  carga  ocurren  más   a  menudo  cuando  una  arginina  esta  presente   en  elpéptido y se encuentra cerca del N­terminal.

Tres factores deben considerarse al escoger derivados cargados y son: el efecto en laproducción de iones, el efecto en la eficiencia de la ionización y la facilidad de síntesis.

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Los derivados que se ha observado que tienden menos a provocar rearreglos en la carga yproducir iones problematicos, y que tienen un efecto neutral o positivo en la eficiencia deionización y que son fácilmente sintetizados son los derivados de dimetilaquilamonio.

Ejemplos del uso de Derivados Cargados

Las   figuras   24A  y  25A muestran   el   espectro  CID  de  dos  péptidos  que   se   fragmentanpobremente. El primer péptido tiene una arginina a mitad del péptido y el segundo no tieneargininas. La derivatización con TMMA (trimetilamonioacetilo ) se muestra en las figuras24B y 25B respectivamente. El efecto de la derivatización con TMMA es producir seriescompletas de iones an y dn.

Para resolver la identidad de los aminoácidos N­terminales se requiere de un experimentoMS3 para confirmar cualquier interpretación. Basándose en la información de la secuenciaya disponible, la información puede ser usada para buscar en la base de datos utilizandoprogramas de similitud en secuencia. 

2.3. Correlacionando información MS/MS de la secuencia en labase de datos.

Utilizando algoritmos computacionales la información creada por la ionización inducidapor   colisión   (CID)  de   los   péptidos  puede   ser   usada  para  buscar   en  bases   de  datos   denucleótidos y proteínas. 

Los iones de fragmentos contenidos en el espectro proveen un grado de especificidad a lamasa del péptido y permite la identificación de las proteínas basado en sólo un espectro demasas en tándem. La mayoría de los algoritmos usan cada espectro de masas en tándem enuna búsqueda independiente en la base de datos. Es muy baja la probabilidad de que dos omas espectros de masas,  de calidad razonable (buena proporción señal­ruido),  coincidanincorrectamente con la misma secuencia de proteína.

Los espectros de masas en tándem de péptidos contienen tres niveles de información. Elprimero es la masa del péptido. La pura masa exacta del péptido puede reducir el número deposibilidades de secuencia a un pequeño número (miles a decenas) cuando se compara conlas secuencias obtenidas y se corta la proteína con cierta enzima.

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Figura  26.  Secuenciación  espectrométrica  de  masas   en   tándem.  Los   iones  de   fragmentos   representan   lasecuencia  de  aminoácidos  del  péptido.  Al   restar   los  valores  m/z  de   iones  adyacentes  del  mismo  tipo,   lasecuencia puede ser elucidada. El patrón de fragmentación puede ser utilizado para buscar en la base de datosde proteínas para encontrar la secuencia de aminoácidos que corresponda mejor con el espectro de masas entándem.

Al conocer   la  especificidad  de  la  enzima y con   una  amplia   tolerancia  de  masa  (comomargen de error), se pueden identificar un gran número de péptidos basándose simplementeen la masa. Para identificar únicamente la secuencia de aminoácidos representada por unamedición de la masa, se necesita un segundo nivel de información. Un espectro de masas entándem provee un patrón de los fragmentos o secuencia de iones que son únicos para unasecuencia  dada.  Al   comparar   la  masa  predicha  del  péptido   a  partir  de   la   secuencia  deaminoácidos con aquella observada en el espectro de masas en tándem, se puede determinarla cercanía de la correspondencia. El tercer nivel de información presente en un espectro demasas en tándem es la secuencia real. Al correlacionar una secuencia corta de aminoácidos(3 – 4 residuos de aminoácidos) que pueden no ser únicos para un proteína específica con lamasa del péptido completo se crea un nivel más alto de especificidad.

Un inconveniente potencial, cuando se utiliza información de espectrometría de masas entándem para buscar en grandes bases de datos, es la existencia de proteínas similares consecuencias conservadas.

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2.4. Correlación de la información de m/z del péptido consecuencias conocidas

Con las estrategias de análisis de proteínas se busca obtener suficiente información paraidentificar a la proteína. El primer paso después de obtener la secuencia, es buscar en basesde datos para determinar si la secuencia es conocida. Los valores observados de m/z soncomparados en la base de datos con los valores predichos de cada proteína. Si la proteína nose encuentra muy modificada y no hay mas de dos proteínas presentes en el análisis demasas   se   puede   encontrar   una   correspondencia   exacta.   Este   método   es   útil   en   laidentificación rápida de las proteínas, en particular, en la identificación de las proteínas engeles de dos dimensiones. 

Las mejoras recientes en la exactitud de la masa (10 – 50 ppm)  y la resolución (10,000 –15,000)   en   espectrómetros  de  masas  TOF,   creados  por   la   combinaciones  de   extracciónretardada   y   reflectores,   han   mejorado   la   precisión   en   la   medición   de   la   masa,   lo   queminimiza la ambigüedad en la identificación. El  mapeo de masas también se ha propuestocomo un método para la identificación de especies relacionadas. Este proceso involucra  eluso de información en la base de datos de un organismo para identificar proteínas similaresu homólogas de otro organismo para el cual no hay muchas secuencias de proteínas.

2.5. Cuantificación de péptidos 

La cuantificación es un proceso que requiere de especificidad. Algunos métodos analíticoscomunes como los radioinmunoensayos, proporcionan alta sensibilidad en la detección perouna pobre especificidad. La espectrometría de masas en tándem (MS/MS) es un método queayuda   a   incrementar   la   especificidad   en   el   análisis   cualitativo   y   cuantitativo   deneuropéptidos endógenos de extractos de tejidos.

En MS/MS el alto nivel de especificidad se logra después de la desorción e ionización delpéptido   para   producir   la   molécula­ion   protonada   (M+H)+  del   péptido   por   el   primerespectrómetro;   el   segundo   espectrómetro   colecta   solamente   los   fragmentos   de   ionesproducidos a partir de esa molécula­ion que fue seleccionada por el primer espectrómetro.Para  mejorar   la   especificidad  molecular   se   usa  un   estándar   interno,   un   isótopo   estableincorporado a la secuencia de aminoácidos del péptido. 

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El espectro de masas  del  péptido endógeno y del  estándar  interno se registra usando laprimera etapa (MS1) del espectrómetro en tándem. Muchos de los fragmentos de iones quedeterminan  la   secuencia  de  aminoácidos  que   se  observan  en  el   espectro  no  pueden serdiferenciados entre los fragmentos del péptido endógeno del estándar interno.

Los parámetros de operación de la cámara de colisiones inducidas (CID) para el ion (M+H)+

pueden ser optimizadas de manera que el ion (M+H)+ produzca o aumente la intensidad delos fragmentos de iones producidos. Por esta razón, el gas de colisión, la presión del gas y laenergía de colisión se optimizan para producir la mayor cantidad de fragmentos de iones quedeterminan la secuencia de aminoácidos. Específicamente la presión del gas en la cámara decolisiones inducidas (CID) se ajusta para reducir la cantidad de la ion (M+H)+ al 50% de suvalor original y producir una corriente apreciable de fragmentos de iones.

El espectro de los fragmentos del ion (M+H)+ del péptido endógeno se registra en la segundaetapa (MS2) del espectrómetro en tándem. 

Antes de  la  cuantificación se realiza un análisis  cualitativo  del  péptido para verificar  lapresencia   de   los   fragmentos   de   iones   que   determinan   la   secuencia.  El   espectro   de   losfragmentos de iones del   ion (M+H)+  del  péptido nativo se compara con un ion (M+H)+

sintético. Si los fragmentos de iones son equivalentes en estos dos espectros, entonces lasecuencia del péptido nativo queda establecida.

La cuantificación del péptido se obtiene registrando la corriente iónica producida por el  ionprecursor seleccionado al pasar a ion producto (fragmentos).

La   especificidad  molecular   de   los   métodos  MS/MS   para  una   cuantificación   precisa   depéptidos endógenos supera a otras técnicas debido a:

1. El análisis cuantitativo en MS/MS establece primero la secuencia de aminoácidos del péptido endógeno.

2. MS/MS establece y mantiene el enlace estructural entre el ion (M+H)+ y losiones correspondientes que determinan la secuencia de aminoácidos.

3. Se emplea un isótopo estable incorporado a un péptido sintético comoestándar interno. 

2.5.1. Cálculo de Masa MolecularPara el cálculo de pesos moleculares de péptidos proteolizados, es esencial que los valoresde masa de  los  residuos  amino ácidos  correspondan a aquellos  que se encuentran en la

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mezcla. La confusión más común es el estado de los residuos de cisteína. Generalmente esdeseable cortar los puentes de disulfuro antes de la digestión para hacer la proteína másaccesible a la proteasa. En este caso solo se requiere añadir un agente reductor para lo cualse  deberá   considerar   el  peso  de   la   cisteína  en   su  estado   reducido.  Por  otro   lado,   si   elprotocolo   implica   cisteínas   en   estado   corboximetilado   o   piridietilado,   entonces   el   pesomolecular de la cisteína debe modificarse para cada caso.

Las modificaciones post­traduccionales presentan mayores dificultades. Una gran parte delos   registros   de   las   bases   de   datos   son   derivaciones   de   traducciones   conceptuales   desecuencias de ácidos nucléicos, y por lo tanto no contienen información de modificacionespost­traduccionales.Los pesos moleculares se calculan generalmente de los pesos atómicos, los cuales son losvalores promediados isotópicamente de los materiales en estado natural.

2.5.2. Bases de Datos de Secuencias

Las  más  grandes  bases  de  datos   son  mantenidas  por  varias   instituciones   independientesalrededor del mundo. Aunque hay un intenso intercambio de información entre estos gruposy una base de datos incorpore actualizaciones de varias otras, no existe un sistema rigurosopara asegurar que alguna base de datos contenga todas las secuencias conocidas.

Esto presenta una dificultad para elegir la base de datos: elegir solo una y reconocer quefalta una fracción de una secuencia conocida, o formar una base de datos compuesta demúltiples bases de datos y aceptar la redundancia que se encontrará. La solución ideal esconstruir una base de datos concisa de la que se eliminen registros duplicados. El mejorejemplo de una base de datos no redundante es la base de datos compuesta OWL, disponiblepor medio del protocolo de intercambio de archivos FTP de la página en internet http://s­ind2.dl.ac.uk   o   http://ncbi.nlm.nih.gov   que   contiene   registros   de   SwissProt,   PIR,   PDB(Brookhaven) y otras.

2.5.3. Consideraciones sobre la Base de Datos

Reglas de proteólisis enzimática

Una base  de  datos  de   referencia  de  valores  de  masa  de  péptidos  proteolizados   se   crearelacionando el comportamiento observado de una enzima en los registros de una colección

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de secuencias como el SwissProt o PIR.   En la práctica,   a concentraciones de orden depicomolar, es difícil asegurar que la digestión se lleve a cabo completamente, así que muchodel arte de la creación de bases de datos radica en la simulación adecuada de digestionesincompletas.

2.5.4.Esquemas de PuntajeLas estrategias de búsqueda y puntaje más simples, consisten en calcular la masa del péptidode   cada   registro   en   la   base  de  datos   de   la   secuencia   y   se   compara   contra   los   valoresexperimentales. Cada valor calculado que cae dentro de un cierto rango de tolerancia conrespecto al  valor  experimental  cuenta como un punto.  El  puntaje   final  es el  número depéptidos encontrados por registro.

2.6 .Caracterización de proteínas con técnicas combinadas

2.6.1. Identificación de proteínas en mezclas por “Shotgun”El análisis por shotgun consiste en acoplar la Ionización por electrospray (ESI) con

cromatografía líquida (LC) para resolver los componentes de mezclas complejas antes deintroducirlas al  espectrómetro de masas en tándem.   Grandes cantidades de espectros demasas en tándem (cientos a miles)  pueden ser automáticamente generados,   lo cual  seríaimposible de adquirir a través de la operación manual del instrumento.  El análisis directo yautomatizado de los espectros de masas en tándem del péptido es posible con el  uso dealgoritmos y  bases de datos. 

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Figura 27.  Identificación por shotgun de mezclas de proteínas. Una mezcla de proteínas se digiere con unaproteasa para producir  una  mezcla compleja de péptidos.  Los péptidos son analizados en serie  utilizandoHPLC acoplado a un espectrómetro de  masas. Los espectros de masas en tándem se utilizan para  buscar enuna base de datos utilizando el software de búsqueda en base de datos SEQUEST y algoritmos de revisión deinformación para identificar las proteínas presentes en la mezcla.

Existen varias razones para extender la capacidad de la identificación por shotgun para elanálisis de proteínas. Primero, el producto final de muchos experimentos biológicos, comola inmunoprecipitación, son mezclas pequeñas de proteínas. Segundo, los procedimientos depreparación   y   digestión   de   la   muestra   pueden   ser   más   agresivos   con   calor   o   agentescaotrópicos lo que ayuda a una proteólisis más completa.  Finalmente, esta técnica tiene unalto potencial para experimentar en un amplio rango de condiciones fisiológicas. 

Varias  aplicaciones  del  método de   identificación por  shotgun han  sido  demostradas.  Laprimera y más  importante,  este método es más poderoso en organismos con su genomacompleto   secuenciado.   Cuando   un   genoma   está   completo,   la   secuencia   debería   estardisponible para cada proteína expresada.

2.6.2. Interacciones proteína – proteína y complejos de proteínaLas proteínas involucradas en procesos enzimáticos o rutas bioquímicas pueden ser

identificadas por la asociación bajo condiciones que indiquen una interacción específica. Lastécnicas   bioquímicas   como   la   co­inmunoprecipitación   son   ampliamente   utilizadas   paraidentificar la interacción de proteínas. La determinación de interacciones proteína – proteínase  ha  vuelto  un  componente   importante  para   elucidar   la   función  de   la  proteína  o  paraidentificar proteínas en procesos y rutas metabólicas.  Varias estrategias bioquímicas para la

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determinación de interacciones proteína – proteína se han adaptado a la identificación porshotgun utilizando LC/MS/MS y una búsqueda posterior en la base de datos (Figura 28). 

Figura 28. Tres métodos bioquímicos para determinar las interacciones proteína – proteína. El primero es laco­inmunoprecipitación. Se utiliza un anticuerpo para precipitar la proteína junto con las proteínas unidas. Elsegundo método, cromatografía de afinidad por interacción de proteínas, utiliza  una proteína “anzuelo” paraunirse a las proteínas que interactúan. El último método es la purificación del complejo protéico intacto.

2.6.3. Detección de mutacionesUna   mutación   puntual   dentro   de   una   proteína   produce   una   variación   en   su   peso

molecular. La espectrometría de masas es un método rápido para el análisis de mutacionesespecialmente cuando se pueden obtener cantidades suficientes de proteínas, además es útilpara verificar la estructura de proteínas recombinantes. Estas variantes protéicas pueden seranalizadas al compararlas con las proteínas de referencia. 

Para la caracterización de mutaciones de proteínas, se realiza un experimento químico queconsiste en dos pasos: mapeo del péptido y secuenciación del péptido. Estos pasos puedenser   reemplazados   por   análisis   espectrométrico   de   masas   de   una   mezcla   compleja   depéptidos,   seguido   por   MS   en   tándem   (MS/MS)   de   las   especies   de   interés.   El   análisisestructural de variantes de proteínas por espectrometría de masa puede ser resumido de lasiguiente manera:

La variación de masas entre las especies silvestre y la mutante es igual a la diferencia en lamasa entre  el   residuo mutado y el   residuo de  la  proteína silvestre,  asumiendo sólo  unamutación. La región de una proteína que contiene la mutación puede ser determinada por uncorte químico o por digestión proteolítica de esta proteína seguido de una espectrometría de

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masa  del   los  péptidos   resultantes.  Los  péptidos  que  contienen   la  mutación presentan   lamisma variación del peso molecular con la proteína intacta. Por el otro lado, los péptidoslibres de mutación tienen pesos moleculares calculados idénticos a aquellos calculados paralas proteínas silvestres.

Tabla  4  Diferencias   en   la   masa   (Da)   observada   entre   varios   aminoácidos;   el   residuo   en   la   columnacorresponde al aminoácido esperado mientras que el residuo en la fila corresponde al aminoácido mutante

Gly Ala

Ser

Pro

Val

Thr

Cys

Leu

/Ile

Asn

Asp

Gln/

Lys

Glu

Met

His

Phe

Arg

Tyr

Trp

Gly ­ 14 30 40 42 44 46 56 57 58 71 72 74 80 90 99 106 129Ala ­ ­ 16 26 28 30 32 42 43 44 57 58 60 76 76 85 92 115Ser ­ ­ ­ 10 12 14 16 26 27 28 41 42 44 60 60 69 76 99Pro ­ ­ ­ ­ 2 4 6 16 17 18 31 32 34 50 50 59 66 89Val ­ ­ ­ ­ ­ 2 4 14 15 16 29 30 32 38 48 57 64 87Thr ­ ­ ­ ­ ­ ­ 2 12 13 14 27 28 30 36 46 55 62 85Cys ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 10 11 12 25 26 28 34 44 53 60 83Leu/Ile ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 1 2 15 16 18 24 34 43 50 73Asn ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 1 14 15 17 23 33 42 49 72Asp ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 13 14 16 22 32 41 48 71Gln/Lys ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 1 3 9 19 28 35 58Glu ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 2 8 18 27 34 57Met ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 6 16 25 32 55His ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 10 19 26 49Phe ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 9 16 39Arg ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 7 30Tyr ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 23Trp ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­

La diferencia entre el peso molecular del péptido nativo y el del péptido mutante permite ladeterminación del aminoácido natural que ha sido mutado, siempre y cuando sólo existauno, de otra forma se necesita de MS/MS.

2.6.4. Detección de variantes a través de la medición de la masa de laproteína intacta con ESI­MS

La figura 29 muestra el espectro de masas transformado ESI de una mezcla de cadenasβ­globina. Dos diferentes especies de β­globina son claramente diferenciadas en el espectrode masas a una resolución de 3000 y la separación de masas, para este análisis, es de 14 u. 

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Figura 29 Espectro de masas transformado ESI de una mezcla de cadenas β­globina que difieren en 14 u

Las variantes que tienen sustituciones de aminoácidos (exceptuando Leu e Ile, Lys y Gln)son, teóricamente, detectables al medir la masa molecular de la proteína intacta. La pequeñadiferencia   en   las  masas  moleculares  detectables  por  MS  incrementa  con el  aumento  detamaño de las proteínas. 

La identificación de variantes de especies difiriendo en 14 u en un análisis real, correspondeal patrón teórico en la figura 30, como se presenta en la figura 29. La diferencia mínima enla masa molecular detectable como el patrón D en la figura 29, para una mezcla equimolarcon   proteínas   normales   de   Mr  (masa   de   una   molécula   calculada   utilizando   los   pesosatómicos de cada elemento) mayor a 100 000, es cerca de 20 u. Esto significa que la mitadde todas las posibles sustituciones de aminoácidos en una proteína de este tamaño podrándetectarse. 

Figura 30. β­globinas normales y variantes: (A). Proteína normal pura; (B) Normal y mutante con +4unidades de masa; (C) Normal y mutante +9; (D) Normal y mutante +14

2.6.5. Identificación de proteínas separadas electroforéticamente

Dos diferentes estrategias espectrométricas de masa han sido utilizadas para identificara   las  proteínas   separadas  por   electroforesis   en  gel.  Todos   los   intentos   publicados  usanmétodos de digestión in situ después de la electroforesis en gel para obtener péptidos de laproteína a analizar. Las colecciones de péptidos obtenidas son adecuadas para el análisis porespectrometría de masas para obtener mapas de masa del péptido y, por lo tanto, identificarla proteína después de una búsqueda en la base de datos.

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El espectro generado por la digestión de una proteína por una enzima es único y específicode dicha proteína y puede ser suficiente para cuantificarla.

La manera común de realizarlo es tomando una pequeña muestra de la proteína de interés ydigerirla   con   una   enzima   proteolítica;   la   mezcla   de   fragmentos   es   analizada   por   MSempleando ya sea MALDI o ESI. Las lecturas experimentales son luego comparadas en unabase de datos de masas de péptidos. Si el espectro de la proteína de interés que se deseaidentificar se encuentra en la base de datos, entonces la proteína ha sido identificada. Si elespectro no se encuentra en la base de datos,  se escoge el  espectro que tenga el  mayorporcentaje de identidad con el espectro de la proteína de interés.

Este método de identificación es más rápido y sensible que el método de secuenciación deEdman y mucho más sensible que la detección de firmas por los perfiles de migración conelectroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) o por los tiempos de retención en HPLC. 

Selección de instrumentación

Se utilizan dos tipos de espectrómetros de masas: MALDI acoplado a un analizador TOF oun ESI acoplado a un analizador de cuadrupolos.

El método MALDI tiene dos características que lo hacen especialmente adecuado para elanálisis de mezclas de digestión intactas comparado con otros métodos de ionización:

1) Es relativamente tolerante a bajos niveles de contaminantes como sales debuffer y,

2) La discriminación entre componentes en las mezclas es relativamente baja.

Aunque al   tolerancia de MALDI a bajos niveles de contaminantes es mayor que en otrosmétodos   de  ionización,   muchos   métodos  cromatográficos   y   electroforéticos  son   mástolerantes a contaminantes que el MALDI y más precisos en la cuantificación. Es decir,MALDI es la mejor elección cuando lo que se quiere es la firma de los fragmentos de ladigestión en órdenes de picomoles o menores y no se busca una cuantificación . El error enla medición de masa es significativo y es generalmente  menor al 0.1% llegando hasta 0.01%si el espectro contiene un pico de masa conocida que sirve como calibrador interno lo queequivaldría a 1 o 2 Daltones para un péptido tríptico común.

Aislamiento y Purificación de Proteína

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El análisis  mediante  firmas de fragmentos  de proteínas no funciona bien en mezclas deproteínas. En estos casos la electroforesis en gel es la opción indicada para el aislamiento dela muestra. Las dificultades al analizar proteínas de geles con MS son que los reactivospueden suprimir la señal, modificar covalentemente la muestra o alterar el peso molecular.Algunos   de   los   reactivos   que   mayores   problemas   causan   son   el   SDS,   monómero   deacrilamida y muchos marcadores comunes.

Algunos métodos  prácticos  para  la  producción de péptidos  proteolíticos  a  partir  de unamezcla son:

1) La proteína intacta se eluye del gel para una digestión subsecuente2) La proteína es digerida en el mismo gel3) La proteína se transfiere por blotting a una membrana y luego digerida in

situ, en condiciones que se favorezca la liberación de péptidos a la solución

La transferencia hacia una membrana tiene la gran ventaja de que la mayor parte del SDSpuede ser lavado antes de la digestión. De otra manera, sería necesario hacer la remoción delSDS por precipitación de la proteína o por purificación de los  péptidos por HPLC. Lasmembranas de fluoruro de Polivinilideno (PVDF) funcionan mejor que las de nitrocelulosapara digestiones in situ que se van a analizar por MALDI debido a que tienen un fondoquímico más limpio.

Algunos marcadores como la sulforodamina B para PVDF o el imidazol de zinc suprimenmenos la señal en MALDI que el azul de Coomasie y en consecuencia no es forzosa suremoción. Los buffers  volátiles  se remueven por  liofilización.  El glucósido  de octilo  esmejor tolerado que el SDS tanto en MALDI y ESI.

Elección de la enzima

Enzimas de poca selectividad que digieren proteínas produciendo mezclas de amino ácidos ypéptidos  muy cortos  no   son  una  buena opción.  En un  sentido  práctico,  un  mezcla  quecontiene  un  gran  número de   fragmentos  de  masas  similares   resulta   en  un  espectro  quecontiene muchos picos coincidentes que se sobrelapan. De la misma manera, péptidos demayor   tamaño   tienen   mayor   discriminación   que   los   pequeños   porque   son   hay   menorcantidad   y   porque   el   número   de   posibles   permutaciones   de   amino   ácidos   aumentageométricamente con el tamaño del péptido.

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Una  versión altamente   resolutiva  de   la   electroforesis   en  gel   es   la   electroforesis  de  dosdimensiones en gel (2­DGE), la cual combina una separación por punto isoeléctrico en laprimera dimensión con la separación por tamaño en la segunda dimensión. Este método escapaz de separar miles de proteínas en un solo análisis.

2.6.6. Secuenciación de proteínas en geles de poliacrilamida teñidos porplata

La detección y secuenciación subpicomolar de proteínas a partir de poliacrilamida esuna proposición realista. Después de una electroforesis las proteínas son visualizadas poruna tinción con azul de coomassie si la proteína es lo suficientemente abundante (más de100 ng), aunque la tinción por plata es un método mucho más sensible con un límite dedetección entre 1 y 10 ng. La proteína es digerida, después, para producir péptidos los cualesson   extraídos   para   posteriormente   ser   analizados.     Este   método   es   compatible   con   lacaracterización   microanalítica   de   proteínas   debido   a   que   no   introduce   modificacionesquímicas, incluso en las cadenas laterales altamente inestables como los grupos –SH de lacisteína.

2.6.7. Elucidación de estructura secundaria de proteínas por ionización enelectrospray

Para   este   estudio,   la   espectrometría  de  masas   requiere   un  método   en   el   cual   lasdiferencias de la conformación de la proteína puedan ser monitoreadas.

Los cambios en la distribución del estado de carga de los iones de los fragmentos en unespectro son  interpretados  como el   resultado de  las  diferencias  en el  plegamiento  de  laproteína. Por ejemplo, la figura 31 muestra los espectros obtenidos para la lisozima bajo lasmismas   condiciones   de   calibración   en   el   espectrómetro   de   masas,   pero   en   diferentescondiciones de solvente. Ambos muestran el peso molecular de la proteína como 14,305 Dpero claramente muestran diferentes distribuciones en el estado de carga. 

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Figura 31 Espectro de masas ESI de lisozima de huevo que muestra la distribución del estado de  cargaobtenido utilizando diferentes solventes. El espectro superior fue obtenido de una solución 100% acuosa a pHde 5.0 y el espectro inferior se obtuvo bajo condiciones estándar de solvente para electrospray con unasolución acetonitrilo­agua ­ ácido fórmico 50:49:1

El espectro superior fue obtenido de una solución acuosa 100% a pH de 5.0 y muestra unaproporción del estado de carga de 9+, mientras que el espectro inferior, obtenido de unasolución conteniendo acetonitrilo al 50% y ácido fórmico al 1% exhibe un máximo de 12+.Estas  diferencias  del  estado  de  carga  pueden ser   interpretadas  en   término  del  grado deplegamiento de la molécula de proteína. El bajo pH (antes de la ionización) del solventealtamente orgánico despliega la proteína de una forma mayor que la solución acuosa en lacual la proteína se encuentra en su conformación nativa. Por lo tanto, el desplegamiento dela  proteína  desorganiza   los  puentes   salinos  y  expone   los   sitios  que   son  propensos  a   laprotonación pero que están enterrados en la estructura nativa. 

Aunque   estas   diferencias   en   el   estado   de   carga   son   un   reflejo   del   plegamiento   de   lamolécula, también son muy sensibles a las condiciones de calibración del espectrómetro, aligeras variaciones en el pH y a efectos de contraión.

Otra   forma   para   observar   la   estructura   secundaria   es   el   marcaje   por   intercambio   dehidrógeno – deuterio. El método de marcado de intercambio de hidrógeno – deuterio explotael   hecho  de  que   los   elementos  de   la   estructura   secundaria   que   involucran   la   unión  dehidrógeno entre las cadenas laterales del aminoácido y amidas del esqueleto protéico en elnúcleo de la proteína ofrecen protección contra el intercambio de hidrógeno, mientras que

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las   regiones  que  no   están   involucradas   en   la   estructura   secundaria   (que   se   exponen   alsolvente en la superficie de la proteína) intercambiarán más rápido el hidrógeno. Por estarazón, la medición en el cambio en la masa de una proteína con el tiempo puede ser utilizadapara obtener información acerca de la estructura secundaria de una proteína, debido a que lasproteínas plegadas más fuertemente   conservarán   el marcado en el núcleo de la proteínadurante más tiempo que los estados parcialmente menos estables.

2.6.8. Localización de puentes disulfuro en proteínas

Los   grupos   sulfihidrilos   de   los   residuos   de   cisteínas,   además   de   ser   altamentereactivos, están involucrados en los sitios activos para catálisis enzimáticas, como en lasproteasas de cisteína. Las reacciones de los grupos sulfihidrilos libres incluyen la oxidaciónpara   formar   puentes   disulfuro,   los   cuales   participan   en   procesos   de   plegamiento.   Laestrategia   general   para   localizar   puentes   disulfuro   en   las   proteínas   por   métodosconvencionales involucra varios pasos:

1. Determinar el número de grupos sulfihidrilos libres y los puentes disulfuro.Esto se logra de la siguiente manera:

• Reducir todos los puentes disulfuro y alquilar los grupos sulfihidrilolibres.

• Alquilar sólo los grupos sulfihidrilos originales sin reducción de lospuentes disulfuro 

• Determinar el peso molecular de la proteína nativa y de las proteínasmodificadas

Para calcular el número de cisteínas, grupos sulfihidrilos libres y puentesdisulfuro   se   determina   la   masa   molecular   de   la   proteína   nativa   (Mnat),proteínas reducidas y alquiladas (Mr + a), proteínas alquiladas (Ma) y la masaconocida del agente alquilante, que en este caso es 59 para el –CH2COOH.

Tabla  5.  Determinación del número de cisteínas, grupos sulfihidrilos libres y puentes disulfuro enproteínas por ISMS

β­LactoglobulinaMnat 18,276.7Mr+a 18,572.8Ma 18,333.8Ncys 5

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N­sH 1N­s­s­ 2

Nota: Ncys = (Mr+a – Mnat)/59; N­SH = (Ma – Mnat) (59 – 1); NS­S­ = (Ncys – N­SH)/2

2. La proteína es cortada con reactivos químicos y/o enzimas entre los residuoscisteinil. 

3. Los   péptidos   que   contienen   cisteínas   se   separan   utilizando   técnicascromatográficas. 

4. Los péptidos unidos por puentes disulfuro son identificados por análisis de lasecuencia de aminoácidos   y se relacionan con segmentos específicos de laproteína.

2.6.9. Detección y verificación de la secuencia de péptidos con puentesdisulfuro por FABMS y MS/MS

Después de la separación, los péptidos purificados pueden ser analizados directamentepor FAB/MS. Se puede emplear la reducción y oxidación en sonda de los péptidos paradetectar rápidamente las fracciones que tienen péptidos con puentes disulfuro. Si un péptidocontiene un puente disulfuro intramolecular un nuevo pico aparecerá 2 Da más alto una vezque   es   reducido   en   la   matriz   de   glicerol/tioglicerol.   Si   un   péptido   contiene  un  puentedisulfuro intermolecular, nuevos picos correspondientes a los dos péptidos constituyentesdel   puente   disulfuro,   pueden   aparecer   en   el   rango   de   más   baja   masa   molecular   ydesaparecerá el pico correspondiente al péptido intacto conteniendo el disulfuro.

Aunque esta reducción en sonda es simple y útil,  no puede ser utilizada para identificarpéptidos que contengan tiol. Esto requiere de  de una buena resolución del instrumento paraidentificar   péptidos   conteniendo   disulfuros   intramoleculares   con   masas   molecularesrelativamente altas. 

La   oxidación   en   sonda   es   otra   técnica   para   identificar   péptidos   que   contienen   tiol   ydisulfuros, rápidamente. El ácido perfórmico puede convertir un residuo de cisteína a ácidocistéico, lo que incrementa la masa molecular por 48  Da. Los péptidos unidos por disulfurosintramoleculares   incrementarán  el  peso  molecular   en  98  Da,  mientras  que   los  péptidosunidos por disulfuros intermoleculares desaparecerán y formarán dos péptidos conteniendoresiduos de ácido cistéico.

Esquema 1. Estrategia general para la localización de puentes disulfuro en proteínas por MS.

Proteína purificada

Determinar el número de puentes disulfuro en la proteína por MS

Cortar la proteína entre la mitad de los residuos cisteinil por cortes químicos o enzimáticos

Separar los péptidos por HPLC

Identificar los péptidos que contienen disulfuro por MS

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La figura 32 muestra  el  espectro de masas FAB de una fracción HPLC de un digeridopéptico de papaína antes (a) y después (B) de la oxidación con ácido perfórmico. El pico enla figura 32A en m/z 1875 corresponde a dos péptidos, en los segmentos Val150 – Ala162 yGly198   –   Tyr   203,   unidos   por   un   puente   disulfuro,   y   los   picos   en   m/z   11   y   1267corresponden a los péptidos formados por el corte del puente disulfuro. Una serie similar deiones (m/z 1946, 1338 y 611) está formada por el corte antes de Ala163. Una vez oxidados(figura 32B) los picos para los péptidos con puentes disulfuro (m/z 1875 y 1946) no estánpresentes y las masas moleculares para los péptidos constituyentes se incrementan en 48 Da.Estos resultados demuestran que Cys153 y Cys 200 en la papaína estaban unidos por unpuente difsulfuro.

Figura 32 Espectro de masa FAB de una fracción HPLC de un digerido peptídico de papaína antes (A) ydespués (B) de la oxidación con ácido perfórmico.

2.6.10. Localización de puentes disulfuro en pequeñas proteínas ricas encisteína.

Los  puentes   disulfuro   en  moléculas   como   toxinas,     juegan  un  papel   clave  paramantener la estructura tridimensional. Para la localización exitosa de puentes disulfuro, lasproteínas   tienen   que   ser   cortadas   entre   los   residuos   cisteinil   por   métodos   químicos   oenzimáticos, sin intercambio de disulfuros. Varios intentos, que combinan corte por CNBr ydigestión Enzimática fallaron en su intento de producir péptidos con puentes disulfuro queno tuvieran cambios en éstos.

La hidrólisis ácida parcial es una forma alternativa de producir péptidos diagnóstico para lalocalización de los puentes. Un método consiste en la hidrólisis parcial seguida por análisisFAB/MS y otra consiste en hidrólisis suave y análisis con ionspray MS/MS (Figura 33)

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Figura 33. El espectro de masas de una fracción de una digestión de papaína tiene los picos mayores en m/z611 1657 y 2265 (A). Se utilizó  oxidación y reducción en sonda   para identificar estos picos. El pico delpuente disulfuro fue localizado en el m/z 2265 que equivale a los aminoácidos 150 – 166/ 198 – 203. Esto secomprobó   posteriormente  por  FAB/MS  con  una   subdigestión  con   carboxipeptidasa  B   que   cortó   las  dostirosinas del C­terminal para generar, al mismo tiempo, los picos en m/z 448, 1494 y 1939 (B).

2.6.11. Secuenciación en escalera de proteínas Este ensayo, llamado “secuenciación en escalera de proteínas”, no utiliza MS/MS y

consiste en dos pasos. Primero, se genera una serie de fragmentos de péptidos, que difierendel siguiente por un aminoácido; estos se generan a partir de la cadena polipeptídica que sequiere secuenciar. Segundo, se utiliza espectrometría de masas MALDI para leer la seriecompleta de fragmentos en una sola operación. El  espectro de masas contiene los  ionescorrespondientes a cada especie polipeptídica presente. La diferencia de masas entre picosconsecutivos corresponde a los residuos de aminoácidos  y su orden de aparición en la serie

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de datos define la secuencia de aminoácidos en la cadena peptídica original. La sensibilidadde esta secuenciación (en picomoles) es comparable a la existente en el método de Edman.

Un método se basa en  la  degradación por pasos  utilizando el   reactivo  de Edman  (fenilisotiocianato,  PITC)  en    presencia   de  pequeñas   cantidades  del   agente   terminador   (fenilisocianato). Una pequeña porción de péptido N­terminal es bloqueada durante cada pasopara evitar mayor degradación. Después de un suficiente número de ciclos,  se toma unapequeña alícuota del análisis de masa. Al sustraer la diferencia de valores adyacentes de m/zse obtiene la información de la secuencia (figura 34). Las estrategias de secuenciación enescalera requieren de un péptido puro para ser exitosas.

Figura 34. (Arriba) Principio de secuenciación en escalera de proteínas. El fenil isotiocianato (PITC) producefeniltiohidantoina (PTH) del aminoácido terminal y un nuevo péptido   con un aminoácido menos. El fenilisocianato   (PIC),  en  baja  cantidad,  produce   fenilcarbamato  N­terminal  de  una  pequeña   fracción  de  cadapéptido. (Abajo) Ejemplo de secuenciación de [Glu1] fibrinopéptido B.

En otro método, se utiliza un reactivo volátil para degradación, el trifluoroetilisotiocianato,para evitar  la necesidad de un método complejo de  limpieza.  La producción de la  seriecompleta de péptidos fragmentados se logra añadiendo, a cada ciclo, la misma cantidad de laproteína original. No hay necesidad de añadir un agente terminador.

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Estos métodos permiten secuenciar a partir del N­terminal. Para secuenciar a partir del C­terminal se utiliza el corte enzimático, en el cual la muestra del péptido se divide en variaspartes, cada una se trata con una cantidad creciente de carboxipeptidasa. El primer intento, ainicios  de 1980,  utilizaba FAB para crear   iones de péptidos  secuencialmente cortados através del uso de la carboxipeptidasa Y para dejar un C­terminal desigual. Este intento hasido   renovado   y   usado   en   conjunción   con   MALDI/TOF,   que   es   altamente   sensible.Ajustando la concentración de la enzima utilizada para crear la escalera, se puede disminuirla   velocidad   del   proceso   de   corte   enzimático   y   además   pueden   observarse   los   ionesformados por el corte de cada enlace amida. 

2.6.12. Proteínas y péptidos hidrofóbicos analizados por MALDILa versatilidad de MALDI/MS nos brinda una alternativa viable para el análisis de

proteínas insolubles en agua. Específicamente, las características atractivas de MALDI parael análisis de especies incluyen su insensibilidad a contaminantes como lípidos y algunosdetergentes.  Aunque el  mecanismo de selectividad de la proteína en MALDI permaneceoscuro, la cocristalización de la matriz y la proteína (y por lo tanto la preparación de lamuestra) claramente juega un papel importante en los análisis exitosos.Los   protocolos   de   preparación   de   la   muestra   involucran   estrategias   que   emplean   lasolubilización del analito y la matriz en un solvente apropiado, ya sea en solventes orgánicosfuertes o solubilización en una solución de detergente.

Una vez que se ha solubilizado la matriz y la proteína se pueden emplear métodos MALDIestándar. El desarrollo de MS para el análisis de péptidos hidrofóbicos y proteínas es unaherramienta altamente valiosa para estudios estructurales para esta clase tan importante deproteínas. 

2.6.13. Análisis de Glicoproteínas y Glicopéptidos utilizando BombardeoRápido de Átomos (FAB)

El  enfoque  para   analizar   las  muestras  de  glicoproteínas,  utilizando  este   tipo  deespectrometría   (FAB/MS),   depende  de   la   información   requerida.  Si   sólo   se   requiere   laporción del carbohidrato de la molécula de interés, entonces los glicanos unidos al N puedenser   liberados  directamente  de   la   glicoproteína   intacta   utilizando  peptide­N4­(N­acetyl­β­glucosaminyl)  asparagine amidase F (PNGase F),  mientras que los glicanos unidos al  Opueden ser cortados por eliminación β reductiva.

 Si se requiere de la información de los glicanos y los péptidos, entonces la proteína primerodebe ser reducida   y someterse a un proceso de eliminación de puentes disulfuro y unasubsecuente digestión con tripsina u otra proteasas específicas. Una indicación rápida del

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sitio o sitios de la glicosilación unida al N puede ser obtenida del espectro de FAB antes ydespués  de  la   liberación de  los  glicanos unidos  al  N con PNGase F.  Debido a que  lospéptidos   forman   iones   pero   no   los   glicopéptidos,   cualquier   nueva   señal   que   aparezcadespués  del   tratamiento  con PNGase F  corresponde al  péptido  que  contenía  el   sitio  deglicosilación N.

Si   se   requiere  un  análisis  detallado  de   los   sitios  de  glicosilación  N y  O,   la  mezcla  depéptidos trípticos y glicopéptidos puede ser fraccionada usando una cromatografía en fasereversa (HPLC) para aislar los glicopéptidos individuales.

Para   identificar   el   sitio   de   unión   del   glicano   al   péptido   N­glicosilado   casi   siempre   esnecesario   quitar   el   carbohidrato   utilizando   la   PNGase   F   y   luego   analizar   el   péptidoutilizando FAB/MS (este  análisis  se puede realizar  directamente en una alícuota de unamezcla de digestión con PNGase F, ya que contiene un buffer volátil que se evapora en lacámara de vacío del espectrómetro de masas). Los iones de los fragmentos generados, tantodel amino terminal como del carboxilo terminal del péptido, permiten su secuenciación ypor lo tanto deducir el sitio de glicosilación.

PNGase FC18

Reducción yCarboximetilación

Reducción y carboximetilaciónProteólisis HPLC

Fracción que no retiene N­glicanos

Fracción retenida con O­glicoproteína

β­eliminación

Fracción que no contiene O­glicanos

Paracetilación

FAB­MS

Reducción y carboximetilación       

Proteólisis      FAB­MS       

Glicopéptidos aislados                                             PNGase F      B­eliminación                   Péptido modificado       Péptido modificado 

        aislado aislado                                                  

     FAB MS                 FAB MS

Glicoproteína

Análisis de N­ y O­ glicanos                Mapeo por FAB            Análisis del sitio

Esquema 2. Estrategia general para el análisis espectrométrico FAB de glicoproteínas

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Los sitios de O­glicosilación tienden a encontrarse cerca de residuos de serina y de treoninay pueden ser determinados con una eliminación β reductiva de un glicopéptido unido al O,para liberar la cadena de carbohidratos y generar un residuo de aminoácido no saturado adiferencia del aminoácido en el péptido no degradado.

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