Micropropagación vegetativa "in vitro" de aliso (Ainus acuminata)

César Gonzalos Ortiz Julio Vilca Aquino

Cajamarca, Febrero 1998

Edición auspiciada por la Red Andina de Semillas Forestales - RASEFOR, COSUDE – INTERCOOPERACION

Autores : César Gonzales Ortiz Julio Vilca Aquino Corrección técnica y diagramación : Equipo Técnico de ADEFOR Impresión : Talleres Gráficos de ADEFOR Lugar y año de publicación : Cajamarca, Perú. 1998 © Asociación Civil para la Investigación y Desarrollo Forestal - ADEFOR Carretera

al Aeropuerto km. 3 - Fundo Tartar Cajamarca – Tclefax: 51-44- 821369/ 823097 Apartado 208, Cajamarca - Perú.

Email: adeforc@mail.cosapidata.com.pc

CONTENIDO Pág. I. INTRODUCCIÓN 4 II. OBJETIVOS 5 2.1. Objetivo Principal 5 2.2. Objetivos Específicos 5 III. REVISIÓN DE LITERATURA 5 3.1. El mejoramiento genético forestal del aliso 5 3.2. Micropropagación vegetativa "in vitro" 6 3.3. Ventajas y desventajas del cultivo "in vitro" 7 3.4. Fases de la micropropagación vegetativa "in vitro" 8 3.5. Métodos de desinfección de explantes 9 3.6. Medios de cultivo 10 3.7. Aclimatación y trasplante de las plántulas producidas "in vitro" al invernadero. 13 IV. MATERIALES Y MÉTODOS 14 4.1. Localización 4.2. Condiciones ambientales durante el experimento 15 4.3. Materiales 15 4.4. Metodología 17 A) Tratamiento en estudio 17 B) Diseño experimental. 19 4.5. Conducción del experimento 19 4.5.1. Preparación de medios de cultivos 19 4.5.2. Fases de la micropropagación 20 4.5.3. Evaluaciones realizadas 24

V. RESULTADOS Y DISCUSIONES 26 5.1. Fase de desinfección 26 5.2. Fase de crecimiento 27 5.3. Fase de multiplicación 29 5.4. Fase de enraizamiento 30 5.5. Fase de aclimatación 31 5.6. Tipo de sustrato para trasplante 32 VI. CONCLUSIONES 35 VII. RECOMENDACIONES 36 VIII. BIBLIOGRAFÍA 37 ANEXOS 39

I. INTRODUCCIÓN Los Andes Peruanos, antiguamente cubierto de bosques nativos de importancia, se encuentran actualmente casi deforestados. Quedando todavía relictos de algunas especies nativas entre los que el aliso es una de las de mayor importancia, debido a sus múltiples usos, como la elaboración de muebles, ventanas, puertas, utensilios, herramientas de labranza y trabajos en tallado. Asimismo, la corteza se emplea para teñir lana y algodón en color canela a marrón en sus diferentes combinaciones; las hojas son usadas en la medicina folklórica, también como forraje o mejorador el suelo. Además de ser una especie nitrifícante del suelo, prometedora en la instalación de plantaciones en sistemas agroforestales y silvopastoriles, aportando gran cantidad de nitrógeno que hace aumentar la proteína de los pastos y la producción del ganado. Las plantaciones forestales en general y específicamente las del género Ainus, desarrolladas en nuestro país, se basan preferentemente en plantas que provienen de semilla botánica, sin la selección necesaria del material genético, presentando estas plantaciones una gran diversidad fenotípica en cuanto a la forma, diámetro y altura de los arboles, calidad de la madera y además de su bajo poder germinativo (20%). Frente a este contexto resulta importante el inicio de un programa de mejoramiento genético a través de la selección fenotipica de árboles plus y élite a nivel de campo entre los rodales existentes. Para luego, a partir de una parte viva de la planta, obtener ejemplares que expresen el potencial intrínseco o inducido de la planta madre, producidos a través de la propagación clonal masiva de plantas en un corto tiempo y en cualquier época del año, estas servirán para la instalación de huertos clónales, con el fin de producir semilla de alta calidad y preservar las cualidades fenotípicas y genéticas del ejemplar seleccionado.

II. OBJETIVOS 2.1. Objetivo Principal El presente trabajo busca establecer una técnica adecuada para la micropropagación vegetativa "in vitro" de aliso {Ainus acumínata}, especie en vías de extinción. 2.2. Objetivos Específicos

• Determinar el efecto del hipoclorito de calcio y la duración de aplicación en la fase de desinfección de explantes (microestacas)

• Determinar el medio de cultivo más apropiado para la fase de crecimiento de explantes

• Evaluar la influencia de los reguladores de crecimiento (citoquininas, auxinas) en las plántulas para la fase de multiplicación

• Determinar la influencia de las auxinas en el enraizamiento de los explantes

• Determinar las condiciones de aclimatación y tipo de sustrato para el trasplante de las plántulas enraizadas "in vitro" al invernadero

III. REVISIÓN DE LITERATURA 3.1. El mejoramiento genético forestal del aliso En general, los programas de mejora genética forestal se inician, en una primera etapa, con la selección de árboles "plus", que luego son reproducidos vegetativamente para la instalación de huertos clónales; con el objeto de producir semilla certificada para los programas de reforestación. En una segunda etapa, se ejecutan los ensayos de progenies para evaluar la calidad genética de los árboles seleccionados, aplicando raleos intensos y frecuentes, a fin de dejar sólo árboles con una mayor capacidad de combinación genética,

los que producirán generaciones con mejores cualidades dendométricas. (SILVA H., L., 1992). Para que un árbol de aliso sea seleccionado como productor de material vegetativo (estacas, brotes) debe ser de la especie del aliso blanco, con raíces preformadas ("chupones"), tronco recto, libre de ataque de insectos y de enfermedades y ubicado en sitios húmedos. De esta manera se podrá lograr resaltar las ventajas de la propagación vegetativa frente a la sexual, ya que el primer método preserva mejor las características fenotípicas de los progenitores, al mostrar un mayor crecimiento. Por otro lado, se facilita la producción en viveros, se reduce los costos de producción, se evita el riesgo de raices mal formadas por un repique deficiente, se evitan las pérdidas de plántulas por ataque de hongos o daños de pájaros o roedores, etc. (AÑAZCO R., M., 1996). 3.2. Micropropagación vegetativa "in vitro" La micropropagación es el sistema de propagación vegetativa más recientemente implementado, pero que por razones de costo no ha desplazado el uso de los sistemas tradicionales, especialmente en árboles forestales; cuya reproducción masiva en viveros es más ventajosa desde un punto de vista económico. Estas técnicas modernas son un buen complemento de la producción de plantas en vivero, al permitir producir un material de alta calidad genética que podrá ser reproducido en forma masal, por semilla. (SILVA H., L., 1992). La micropropagación consiste en producir plantas a partir de porciones muy pequeñas de ellas, como son los tejidos o células cultivadas asépticamente en recipientes de vidrio; donde se puede controlar estrictamente las condiciones ambientales, sanitarias y de nutrición. Los procedimientos empleados en el cultivo de tejidos requieren de la instalación de laboratorios y la aplicación de técnicas asépticas similares a los empleados para el cultivo de hongos, bacterias y otros microorganismos. (HUDSON T., HARTMAN y DALE E., KESTER, 1992).

Desde hace unos 120 años, en las investigaciones de fisiología vegetal, se vienen utilizando las técnicas del cultivo de tejidos, órganos o células vegetales, que consiste en regenerar plantas a partir de ápices de raíces o de tallos, primordios de hojas, primordios o partes inmaduras de flores, frutos inmaduros, órganos aislados, embriones maduros o inmaduros, segmentos de órganos de tallo o de hojas, y algunas veces empleando ovarios, óvulos, anteras y polen cultivados en medios nutritivos adecuados y en forma aséptica. (HURTADO M., D.,1994). 3.3. Ventajas y desventajas del cultivo "in vitro" Ventajas :

• Permite sanear plantas con virus, mediante el cultivo de meristemos. • Facilita la realización de una propagación clonal masiva de plantas

idénticas en un corto tiempo. • Permite la ampliación de la base genética de una especie. • Los clones pueden ser propagados en cualquier época del año • El costo de mantenimiento de un banco del germoplasma, en

condiciones de laboratorio, es menor en comparación al mantenimiento en condiciones de campo, evitando el riesgo . de pérdidas por factores climáticos (presencia de heladas, sequías prolongadas, granizadas o temperaturas elevadas) o sanitarios.

• Las plántulas se mantienen libres de plagas y enfermedades, por ser una técnica que requiere de mucha asépcia.

• Permite someter a una población de plántulas a pruebas de resistencia a factores de salinidad, temperaturas bajas (heladas) o altas (en condiciones tropicales). (MEJIA A., R., 1988).

Desventajas :

• El material químico empleado en la preparación de los medios de cultivos son costosos y poco disponibles en muestro medio.

• Requie.re de la implementación de una infraestructura y equipos costosos, como la cámara de flujo laminar.

• No es posible instalar laboratorios "in vitro" donde no se cuenta con fluido eléctrico o se presentan interrupciones periódicas.

• Escasa literatura relacionada al cultivo "in vitro" de especies forestales. • Se requiere de personal de laboratorio especializado: biólogos,

químicos fisiólogos, fitomejoradores, agrónomos y forestales. (VITTORELLI, C., 1988).

3.4. Fases de la micropropagación vegetativa "in vitro" La multiplicación vegetativa ''in vitro" del Pinuspatula implica el desarrollo de cinco fases:

Fase de desinfección: la cual consiste en la eliminación de patógenos (hongos, bacterias u otros microorganismos) que pueden estar presentes en la superficie de los explantes (epicotilos), empleando hipoclorito de calcio.

Fase de crecimiento: una vez desinfectados los explantes de 25 mm de

longitud, son repicados en tubos de ensayo (22 mm de diámetro x 150 mm de longitud), que contienen el medio de cultivo para lograr el crecimiento (MS(NH4NO3/4)) e inmediatamente son llevados al cuarto de cultivo a una temperatura de 22°C con un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de noche.

Fase de multiplicación: cuando las plántulas en la fase de crecimiento han

alcanzado una altura hasta la boca del tubo de ensayo (10 cm de longitud), el tallo es cortado en fragmentos de 15 a 20 mm y sumergidos en una solución de citoquinina (Bencilaminopurina-BAP) por 1 hora, luego se repican al medio de cultivo MS(NH4NO3/4), obteniéndose tres yemas axilares por fragmento.

Fase de enraizamiento : comprende 2 sub-fases:

• Sub-fase de inducción: donde las yemas axilares de 1 cm de longitud

son extraídas de la fase de multiplicación e inducidos por 25 días en el medio de cultivo de Schenk et Hildebrant, diluiyendo a la mitad los

macronutrientes (SH/2) y adicionándole 0,20 mg/1 de AIB y ANA, más 30 g/1 de azúcar.

• Sub-fase de expresión: después que las yemas han permanecido 25

días en el medio de inducción (SH/2), éstas son puestas en el mismo medio, con 10 g/1 de azúcar pero sin hormonas, lo que permite que el 95 o 100% de yemas enraicen al término de 8 semanas,.

Fase de aclimatación: los explantes enraizados son retirados de los tubos

de ensayo, para ser repicados a un mini-invernadero que contiene como sustrato arena de río esterilizada a 100°C por 8 horas. Después de permanecer 8 semanas en el mini-invemadero son trasplantadas en condiciones de invernadero, en un sustrato de tierra-turba-arena en proporción 2:1:1 respectivamente. (AGUILAR C., L., 1990).

3.5. Métodos de desinfección de explantes El material vegetal (porción de tallo con una yema) procedente de las plantas madres de papa del invernadero, fueron desinfectados por separado (yemas apicales y axilares) en alcohol de 90° durante un minuto, para luego someterlos a una solución de hipoclorito de calcio al 10%, por espacio de 5 a 30 minutos. Finalmente se enjuagan estos tejidos, repetidas veces en agua destilada estéril, de las yemas desinfectadas se extraen las hojas y primordios foliares, hasta llegar al meristemo, se seccionan lo más pequeño posible, colocándolo rápidamente en el medio de cultivo. (ESCALANTE Z., S., 1984). Los segmentos de tallos con yemas axilares en dormancia, llamados explantes tipo C; que corresponde a la parte basal de la planta de Bucalyptus globulus de 3 meses desde la germinación, fueron desinfectados con una solución de hipoclorito de calcio al 3% adicionando Tween 80 (agente humectante) durante 10 minutos. Luego son enjuagados en agua destilada estéril. Para ser repicados en tubos de ensayo con el F(NH-i/4) como medio de cultivo, creando un ambiente óptimo de humedad, con lo cual se reduce la presencia de callos sobre las hojas, hasta en un 97% (GONZALES O., C. , 1989).

Secciones de rebrotes de Eucalyptus globulus, de un metro de altura, obtenidos a los 6 meses de realizada la tala, fueron almacenados en bolsas plásticas y colocados en la nevera durante dos días. Para luego, cortar tallitos de 0,5 a 1 cm de longitud con dos yemas y lavarlos con Teepol y agua destilada. La desinfección se realizó con etanol al 70% por 30 segundos, luego fueron puestos en hipoclorito de sodio (clorox) al 2,5% durante 5 minutos y enjuagados con agua destilada estéril. Siendo sembrados en el medio de cultivo MS/2 (SILVA H., L. , 1992). En el cultivo de hojas de violeta africana, las hojas jóvenes son lavadas en una solución jabonosa al 1%, tratando de lavar cuidadosamente el haz y el envés, luego se enjuagan con agua potable y se sumergen en alcohol etílico al 70% durante 10 segundos; enseguida en una solución de hipoclorito de calcio al 2% durante 15 minutos. Posteriormente, en una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% por 15 minutos y enjuagadas cuatro veces en agua destilada estéril, tratando de eliminar los residuos del hipoclorito. Luego se procede a eliminar todo el margen de la hoja junto con el peciolo, cortando secciones de 1 cm2 y se siembrándolas de manera que el haz esté en contacto con el medio de cultivo (MERINO M., M., 1994). 3.6. Medios de cultivos

Para la fase de crecimiento: para el crecimiento de epicotilos de Pinus patula, se comparó 7 medios de cultivo, entre los cuales están considerados el de macro-elementos de Murashige y Skoog (MS), 1962 y las variantes del medio MS; como el MS/2, MS (NI-L,N03/4), MS/2(NH4NC»3/4), Schenk y Hildebrant (SH) 1972, Lepoívre (LP) 1977, Campbell y Durzan (CD) 1975, Gupta (DCR) 1985. Adicionándoles macro y micro-elementos, vitaminas de DCR, 20 g/1 de azúcar, 6 g/1 de agar, 5 g/1 de carbón activo a un pH de 5,8. Después de efectuado el análisis estadístico del incremento en altura de las plántulas a las 8 semanas, se obtuvo que el medio más eficaz para el crecimiento fue el MS (NH4NO3/4) seguido del LP (AGUILAR C, L., 1990).

A fin de determinar la influencia del medio mineral sobre el alargamiento de las yemas axilares en dormancia, de los segmentos de tallos del Eucalyptus globulus, se probaron 9 medios de cultivos : macro-elementos de Murashige et Skoog (MS) 1962; MS(NH4/2), MS(NH4/4), De Fossard (F) 1974, F(NH4/2), F(NH4/4), Schenk et Hildebrant (SH), Konp (K) 1965, Quoirin et Lepoivre (QL) 1977; añadiéndoles micro-elementos y vitaminas de F, 20 g/1 de azúcar, 9 g/1 de agar, 9 g/1 de carbón activo a un pH de 5,8. Después de 30 días se efectuó la evaluación, llegando a la conclusión que el medio de De Fossard con dilución del nitrato de amonio en 4 partes, F(NH.»/4); muestra una mayor influencia y reduce el porcentaje de vitrificación (GONZALES O., C., 1989).

Para el crecimiento de yemas terminales de Ainus crispa, Ainus glutinosa, Ainus incana, Ainus japónica, Ainus rubra, Ainus sínuata, Alnas viridus, el medio de cultivo a emplearse debe ser el de Tremblay & Lalonde (TL) 1984, adicionándole 0,56 mg/1 de citoquinina (BAP), 30 g/1 de azúcar como fuente de energía, ajustando el pH a 5,5 con hidróxido de sodio (NaOH) o ácido clorhídrico (HC1), solidificando el medio con 7 g/1 de agar y esterilizando el medio en autoclave a 120°C por 30 minutos (GEORGE E., F., 1987).

Para la fase de multiplicación: entre los medios de cultivo probados para

el aliso se cuenta con el de Tremblay & Lalonde (TL) 1984, al que se añade 0,23 mg/1 BAP +0,1 mg/1 AIB, 30 g/1 de azúcar a un pH de 5,5, para el caso del empleo de yemas terminales de Ainus crispa, Ainus incana, Ainus japónica, Ainus rubra, Ainus sinuata, Ainus viridus; para explantes tipo nudos simples de Ainus glutinosa, es conveniente el medio de Lloyd & Me Cown (LM) 1981 WPM, incorporándole 0,23 mg/1 BAP, 20 g/1 de azúcar a un pH de 5,75; para explantes tipo epícotilos de Ainus glutinosa, el de Périnet & Lalonde (PL) 1983, adicionándole 0,1 - 1,1 mg/1 de BAP, 30 g/1 de azúcar a un pH de 5,8; en el caso de segmentos de tallos de Ainus glutinosa y Ainus incana, el de Chalupa (C) 198 laD, más 0,2 mg/1 de BAP y 20 g/1 de azúcar. En todos los medios se añade 7 g/1 de agar y al término de 1 mes se obtiene una buena proliferación de tallos (PUTTOCK D., J., 1987).

Para la fase de multiplicación de segmentos de tallos, de 3 meses con yemas axilares en dormancia, de Eucalyptus globulus, el medio de cultivo adecuado corresponde al de los macro y mícro-elementos más vitaminas de De Fossard (F(NH4/4)), sin carbón activo, incorporándole una combinación de 2 hormonas, 0,3 mg/1 de BAP y 0,3 mg/1 de K o la asociación de 0,3 mg/1 de BAP y 1 mg/I de AIB, que al cabo de 30 días se obtiene en promedio 3,6 yemas/explante (GONZALES, O. C. , 1989).

Para el caso de la propagación "in vitro" de plántulas de papa, se cortan nudos con una yema axilar con hojas, llamadas "micronudos", de 0,2 a 0,5 cm de longitud, las hojas grandes se disectan con cuidado, luego los nudos son cultivados en tubos o irascos (magentas) conteniendo el medio de cultivo básico de Murashige & Skoog (MS) 1962, al cual se agrega 0,4 ppm de AG3, 0,5 ppm de BAP, que permiten rompen la dormancia de la yema axilar; además, 0,01 ppm de ANA, 2 ppm de pantotenato de Ca, sacarosa al 2%, agar al 0,7% a un pH de 5,7. De esta manera, la yema crecerá rápidamente y en tres o cuatro semanas se desarrollará una nueva plántula, con otros seis o siete yemas disponibles para la micropropagación (ESPINOZA, N. , 1995).

Para la fase de enraizamiento: para la fase de enraizamiento de tallos de

Ainus crispa, Ainus glutinosa, Ainus incana, Ainus japónica, Ainus rubra, Ainus sínuata, Ainus viridus, el medio de cultivo recomendado es la mitad de la concentración de Tremblay & Lalonde (TL) 1984, más 0,2 mg/1 de la auxina AIB, 15 g/1 de azúcar, 7 g/1 de agar a un pH de 5,5; para el enraizamiento de tallos de Airáis glutinosa, el medio adecuado es el de Périnet 86 Lalonde (PL) 19831, adicionándole 0,2 mg/1 de AIB, 30 g/1 de azúcar, 7 g/1 de agar a un pH de 5,8; en el caso del enraizamiento de tallos de Ainus glutinosa, Ainus incana, se recomienda emplear la mitad de la composición del medio de Chalupa (C) 198 laD, con adición de dos auxinas, 0,1 mg/1 de ANA y 0,1 mg/1 de AIB, 10 g/1 de azúcar, 6 g/1 de agar. En ambos medios al cabo de un mes, las plantas enraizadas son repicadas en el invernadero (GEORGE, E. F. , 1987).

Para la fase de enraizamiento de tallos de Pinus patula, debe utilizarse una inducción de 25 días sobre el medio de cultivo de Schenk y Hildebrant (SH) 1972, diluyendo los macro-elementos a la mitad y adicionando micro-elementos y vitaminas de Gupta (DCR) 1985, más dos auxinas, 0,20 mg/1 de AIB y 0,20 mg/1 de ANA, 30 g/1 de azúcar, 6 g/1 de agar Kadoya a un pH de 5,8. Después son repicados los tallos en el mismo medio (expresión) pero sin hormonas y con 10 g/1 de azúcar por un periodo de 8 semanas, lo que permite que el 100% de tallos enraicen (AGUILAR C., L., 1990).

Para el enraizamiento de brotes provenientes del cultivo "in vitro" de hojas de violeta africana, el medio de cultivo apropiado son: las sales inorgánicas de Murashige y Skoog (MS) 1962 a la mitad de su concentración, suplementadas con 0,170 mg/1 de NaHi P04.H;>0, 0,4 mg/1 de tíamina, 100 mg/1 de inositol, 80 mg/1 de sulfato de adenina, 30 g/1 de sacarosa, agar 0,8%; a un pH de 5,7. El medio es esterilizado en autoclave a una presión de 1 kg/cm2 y temperatura de 121°C por 15 minutos. Los brotes una vez sembrados en tubos de ensayo, son colocados en el cuarto de cultivo; bajo una intensidad luminosa de 8 000 a 10 000 lux, una temperatura de 25°C, un fotoperíodo 16/8 horas de iluminación y una humedad relativa de 80 a 90% (MERINO M., M., 1994).

3.7.Aclimatación y trasplante de las plántulas producidas "in vitrow al invernadero Cuando las plántulas "in vitro" de papa lograron una altura de 3 a 5 cm y un buen desarrollo del sistema radicular, fueron llevadas del laboratorio a invernadero para una etapa de aclimatación, de 4 a 6 días al medio ambiente. Para alcanzar una buena aclimatación, se debe reducir la humedad del aire dentro de los frascos, eliminando el parafínado que protege la tapa de los mismos; después de la aclimatación, se trasplanta el material vegetal a macetas o camas que contengan un sustrato compuesto de arena íína y musgo molido en una proporción de 1:2 respectivamente, esterilizado con vapor a 110°C durante 4 horas o con bromuro de metilo, cubriendo las plántulas en las macetas con papel toalla húmeda por unos 4 a 6 días. En el caso de que sean repicadas a las camas, éstas deben cubrirse con tela tocuyo color blanco para producir sombra y evitar el stress por deshídratación (MEJIA A., R., 1988).

Para la aclimatación de las plántulas enraizadas de Pinus patula, éstas son repicadas primero a un mini-invernadero que contiene como sustrato arena de río esterilizada a 100 grados centígrados por ocho horas. Después de permanecer 8 semanas en el mini-invemadero, las plantas son trasplantadas en condiciones de invernadero sobre un sustrato desinfestado de tierra-turba-arena de rio en una proporción de 2:1:1 respectivamente; al término de 8 semanas, las plantas son trasladadas a condiciones de vivero y luego a campo definitivo (AGUILAR C., L., 1990). Para la aclimatación de plántulas de manzano, éstas deben ser colocadas durante una semana en un ambiente controlado, con una iluminación mayor a 10 000 lux y 24 °C de temperatura, después las plántulas son llevadas al invernadero para ser trasplantadas a pequeñas macetas con agrolita, como material inerte de soporte y una solución nutritiva de MS al 50%, permaneciendo allí por 3 a 4 semanas. Para protegerlas, son cubiertas con un marco de polietíleno transparente que mantendrá una humedad relativa entre 85 y 95%. Posteriormente, son transferidas en macetas de 15x7 cm, las cuales contendrán tierra negra esterilizada, mezclada con agrolita en una proporción 2:1; las plantas son cubiertas con una bolsa de plástico transparente, que será retirada a la tercera semana de haberse realizado el trasplante, permaneciendo las plantas en el invernadero por 2 a 3 meses, antes de ser llevados a condiciones de campo (HURTADO, M. D. , 1994). IV. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Localización El presente trabajo se llevó a cabo en dos ambientes: En invernadero y en el Laboratorio de cultivos de tejidos vegetales, pertenecientes a la Línea de Mejoramiento Genético, de la Asociación Civil para la Investigación y Desarrollo Forestal (ADEFOR), que se encuentra ubicado en el fundo Tartar Km. 3, carretera al aeropuerto - Cajamarca.

A una altitud de 2 676 m s n m, con una temperatura promedio anual de 15,5°C, humedad relativa promedio anual de 51%, precipitación de 496,6 mm/año y cuyas coordenadas son: 7°08' de latitud sur y 78°29' de longitud oeste. 4.2. Condiciones ambientales durante el experimento Se tomaron registros de temperatura máximas y mínimas, y húmeda relativa en ambos ambientes en los cuales de condujo el experimento. En el invernadero se tomó datos desde el repique de estacas hasta la cosecha de explantes (microestacas) y después cuando las plántulas llegaron para la aclimatación y trasplante, haciendo un total de 4 meses y en el Laboratorio durante 6 meses, los datos se presentan en la siguiente tabla.

4.3. Materiales Material experimental

• explantes (microestacas) de Ainus acuminata de plantas de 30 cm de altura de estacas enraizadas en invernadero, provenientes de árboles seleccionados fenotípicamente en el campo (Porcón)

• producto químico para desinfección (hipoclorito de calcio al 70%)

• medios de cultivos compuestos por: macro-elementos, micro-elementos, vitaminas, reguladores de crecimiento, azúcar y agar.

Material de invernadero

• camas de enraizamiento con gravilla de 2 mm de diámetro. (desinfectado).

• sustrato mu sgo-arena-turba, en proporción 1:1:'/a (desinfectado) • maceteros • bolsas de repique 10x18 cm • equipo de nebulización y calecfacción • termómetros de máxima y mínima • regaderas • fungicidas

Material de laboratorio

Equipos: autoclave, cámara de flujo laminar, potenciómetro, dispensador de medios, temporizador, refrigeradora, agitador eléctrico, destilador de agua, balanza analítica, estufa, esterilizador eléctrico, cocina eléctrica, estereoscopio.

Materiales: tubos de ensayo de 23 x 150 mm, erienmeyer de 250, 500 y

1000 mi, magentas, beaker, placas petri de pyrex, pipetas de 1, 2, 5 y 10 mi embudos, probetas de 10, 50, 100, 500 y 1000 mi, balones de 1 y 6 Its, mechero de alcohol, papel aluminio, parafilm, bisturí y hojas de bisturí N° 10 y 11, pizetas de 250 mi, gradillas, alcohol de 96°, algodón y guardapolvos.

Productos químicos

• Macro-elementos: nitrato de calcio, nitrato de amonio, nitrato de

potasio, nitrato de sodio, cloruro de calcio, cloruro de potasio, sulfato de magnesio, sulfato de amonio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, fosfato monobásico de potasio, fosfato monobásico de amonio, fosfato monobásico de sodio.

• Micro-elementos: ácido bórico, ácido etelenediamina tetracético, sulfato ferroso, sulfato de cobre, sulfato de zinc, sulfato de manganeso, cloruro de cobalto, cloruro de níquel, fluoruro de sodio, óxido de molibdeno, ioduro de potasio.

• Vitaminas: tiamina, myo-inositol, biotina, ácido ascórbico, ácido

nicotínico, riboflavina, chioline cloride, pyridoxina, ácido pantotenato de calcio.

• Aminoácidos: glicina, cysteína.

• Fuentes de energía: azúcar.

• Agente solidificante: agar.

• Modificadores de pH: hidróxido de potasio (KOH), ácido clorhídrico

(HC1).

• Reguladores de crecimiento

- Aminas: ácido indoibutírico (AIB), ácido naftalenacético (BAP). - Citoquininas: bencilammopurina (BAP), kinetina (K), zeatina (Z). - Giberelinas: ácido giberélico (AG3).

4.4. Metodología A) Tratamientos en estudio

B) Diseño experimental En las fases de crecimiento, multiplicación, enraizamíento, aclimatación y tipo de sustrato se utilizó el Diseño Completamente al Azar, con 4 tratamientos y 24 repeticiones. 4.5. Conducción del experimento 4.5.1. Preparación áe medios de cultivos: consiste en una mezcla de macro y micro-elementos, vitaminas, aminoácidos, reguladores de crecimiento, azúcar, agar, según cantidades indicadas por el autor y de acuerdo a los tratamientos en estudio para cada fase. El pH de los medios se ajusta con KOH o HC1 al 1 normal, en agitación. Luego, los medios de cultivo se distribuyen en volúmenes de 10 mi por tubo de ensayo, de 23 mm de diámetro por 150 mm de longitud, cubriéndolos con papel aluminio o dispensando 30 mi de medio por frasco (magentas de 100 mi de capacidad). Enseguida se procede a la esterilización del medio en autoclave a 121°C, con una presión de 1,3 kg/cma, durante 30

minutos.

4.5.2. Fases de la micropropagación a) Fase O: consiste en realizar una selección fenotípica de los árboles en el campo (Foto 1), los criterios para seleccionar el árbol ejemplar considera que éste debe ser "dominante" en relación a los árboles vecinos y presentar características deseables para la especie, como rectitud de fuste, buen crecimiento en altura y diámetro, excelente estado sanitario, entre otras. Para luego proceder a cortar estacas de 25 a 30 cm de longitud, de las cuales unos 2 a 3 cm de la base sean sumergidas en ácido indol butírico a 3 000 ppm, durante 10 segundos; luego son sembradas en camas de enraizamiento en el invernadero (Foto 2), con la finalidad de obtener plantas madres.

b) Fase I: llamada también fase de desinfección, que consiste en la eliminación de patógenos (hongos y bacterias) presentes en las plantas madres y en las microestacas a obtenerse de ellas. Por lo que, antes de transferir las plantas madres del invernadero al laboratorio, se realiza una pre-desínfección con la aplicación de un fungicida cada 3 días, a una concentración del 0,2%, por un período de 15 días. De cada planta madre se obtiene microestacas de 1 cm de longitud con una yema lateral, las cuales son desinfectadas en un baño de alcohol al 70%, por 1 minuto. Luego son sometidos a cuatro tiempos de remojo diferentes 10, 20, 30 y 40 minutos, en una solución de hipoclorito de caldo al 3% más Tween 80, ver foto 3. Transcurrido los tiempos ensayados, los explantes son enjuagados repetidas veces en agua destilada estéril. En la cabina de flujo laminar, son repicados a tubos de ensayo con el medio previamente determinado y llevados al cuarto de cultivo. Foto 3. Proceso de pre-desinfección en laboratorio c| Fase II: es la fase de crecimiento, una vez que los explantes superan la prueba de desinfección, son repicados a tubos de ensayo conteniendo los medios de cultivo en estudio (ver tabla 3), repicándose 24 explantes por tratamiento. Los explantes son colocados al azar en gradillas y mantenidos en el cuarto de cultivo a una temperatura promedio de 23grados C, con 16 horas luz y 8 horas de oscuridad (Foto 4 y 5).

Foto 6. Detalle de los explantes para multiplicación. d) Fase III: fase de multiplicación, cuando las plántulas de la fase n han alcanzado un crecimiento de 10 cm de longitud (hasta la boca del tubo de ensayo), son llevadas a la cabina de flujo laminar, para ser retirada del tubo a una placa petri esterilizada, donde el tallo es cortado en micronudos de 0,3 a 0,5 cm de longitud, que presenten una yema axilar y una hoja. Luego son sembrados, de 6 a 8 por magenta, en total 24 micronudos por medio de multiplicación seleccionado (ver tabla 4); luego son sometidos a condiciones controladas.

e) Fase IV: de enraizamiento, se inicia cuando en la fase anterior se aprecia un crecimiento de las yemas axilares de 0,5 a 1 cm de longitud aproximadamente. De las cuales se obtienen nuevos micronudos con yemas axilares, que son repicados a los dos medios de cultivo en estudio, Tremblay & Lalonde (TL) 1984 y Chalupa (C) 198 laD, cuyas concentraciones de macro-elementos han sido divididas a la mitad y se les ha agregado dos concentraciones diferentes de auxínas a cada uno, como se indica en la tabla 5. Los tubos de ensayo, con las yemas para su enraizamiento (Foto 8), son colocados en el cuarto de incubación en condiciones ambientales son similares a las de la fase de crecimiento.

f) Pase V: de aclimatación y trasplante; cuando las plántulas en el medio de enraizamiento, muestran un buen sistema radicular y una altura de 4 cm al cabo de 1 mes; son llevados en los tubos de ensayos al invernadero, para determinar el número de días necesarios de aclimatación al medio ambiente, probando períodos de O, 3, 6 y 9

días antes del transplante, (ver tabla 6). Transcurridos estos tiempos, las plántulas son extraídas de los tubos de ensayo para ser trasplantadas en bolsas de repique con sustrato de vivero, tierra + turba + arena en una de proporción 3:2:1 y desinfectado con formol al 40% (Foto 9). Una vez superada la fase de aclimatación en sustrato durante 6 días, se vuelve a enraizar nuevas yemas del mejor medio de cultivo, a fin de ensayar el tipo de sustrato más adecuado para el trasplante (ver tabla 7). Repicándose 24 plántulas por cada tipo de sustrato, los que son desinfectados previamente con bromuro de metilo.

Las plántulas transplantadas son cubiertas con tela de color blanco por 8 días para darles sombra y evitar el stress por deshidratación. Mantíéndolas en un ambiente de humedad relativa alta (80%) durante los primeros días; después de permanecer 2 meses en invernadero son llevadas a

condiciones de vivero (Foto 10), hasta alcanzar un tamaño adecuado para su traslado a campo definitivo, para la instalación de huertos semilleros. 4.5.3. Evaluaciones realizadas a) Eu la fase de desinfección: la evaluación se realizó a los 15 días después del repique, observando sí el explante estaba o no contaminado por algún tipo de patógeno (hongo o bacteria). b) Eu la fase de crecimiento: se realizó 2 meses después del repique de tes explantes a los medios de cultivos, midiéndose la longitué de la plántula desde el cuello hasta el ápice en milímetros y tí TBUbes^óe hojas por plántula por tratamiento.

c) En la fase de multiplicación: evaluación que se efectuó a los 15 días de haber colocado los mícronudos en los medios de cultivos, consideró el porcentaje de micronudos con yemas axilares crecidas y la longitud promedio de las yemas axilares por tratamiento. d) En la fase de enraizamiento: después que las yemas han permanecido por 1 mes en los medios de cultivos, se evaluó el porcentaje de plántulas enraizadas, el número de raices por plántula y la longitud de la raíz mayor por plántula en cada tratamiento. e) En la fase de aclimatación y transplante al invernadero: la evaluación de la prueba de aclimatación se realizó después de 15 días de ser repicadas las plántulas al invernadero, evaluándose el porcentaje de plantas aclimatadas por trata-miento. Para determinar que tipo de sustrato fue el más adecuado, se evahró la altura de las plántulas después de 2 meses de ser trasplantadas, midiéndolas desde el cuello hasta el ápice en centímetros.

V. RESULTADOS Y DISCUSIONES Los resultados de cada fase de experimentación son presentados a continuación: 5.1. Fase de desinfección

Según el cuadro 8 y el gráfico 1, se puede observar que los tratamientos T3 y T4 son los que registran el mayor porcentaje de desinfección de explantes, superando al Tí (testigo) y T2.

Esto nos indica que para la desinfección de microestacas se tendrá que utilizar el T3 (hipoclorito de calcio al 3% + Tween 80 durante 30 minutos), y no el T4 por tener mayor tiempo de desinfección, previa inmersión delas

microestacas por alcohol 70% por un minuto y en invernadero una pre-desinfección en las plantas madres con fungicidas al 0,2%, con aplicaciones cada 3 días por un período de 15 días. 5.2. Fase de crecimiento

En el cuadro 10, observamos que el coeficiente de variabilidad es de 10,14%, lo cual nos indica que l os datos obtenidos son confiables, por su baja variabilidad, además se observa que existe

una alta significación estadística entre tratamientos tanto para un nivel del 5 y 1% de probabilidad y a fin de determinar cual de los tratamientos (medios de cultivo) es el mejor se realizará la prueba de significación estadística de Duncan al 5% de probabilidades.

Según el cuadro 11 y el gráfico 2, se puede observar que el tratamiento 1 es superior estadísticamente a todos los demás tratamientos, así mismo el T3 supera al T4, pero no al T2 (testigo), con el cual es igual estadísticamente, pero el T2 comparado con el T4 es superior estadísticamente.

Por lo tanto para la fase de crecimiento de explantes (microestacas) de Alrus acuminata se debe utilizar el medio de cultivo T1 (macro-elementos Murashige & Skoog (MS), 1962, más los micro-elementos, vitaminas y aminoácidos de Fossard (F), 1974 por alcanzar la mayor altura de las plántulas y mayor número de hojas por plántula, a los 2 meses. 5.3. Fase de multiplicación

En el cuadro 12 y el gráfico 3, observamos que el tratamiento 2 (T2, Tremblay & Lalonde (TL) 1984 + 0,23 mg/1 BAP + 0,1 mg/1 AIB) es el que registra el máximo porcentaje (lOO%) de micronudos con yemas axilares crecidas, en

tercer lugar le sigue el tratamiento 1 (T1, testigo) y por último el tratamiento 4 (T4).

Por lo tanto para. la fase de multiplicación con micronudos de Ainus acuminata se debe emplear el medio de cultivo T2 (Tremblay & Lalonde) más la interacción de una citoquinina (0,23 mg/1 BAP) y una auxina (0,1 mg/1 AIB), sustancias que . influyen en el crecimiento de yemas dormantes, que activan la división celular y el desarrollo de tallos laterales respectivamente. 5.4. Fase de enraizamiento

En el cuadro 13 y el gráfico 4 muestran que el tratamiento 2 supera a todos los demás tratamientos, en cuanto a los parámetros evaluados: porcentaje de enraizamiento, número de raíces por explante, y en cuanto a la longitud de la raíz mayor por explante, debido a la aplicación conjunta de las 2 auxinas al medio de cultivo (Tremblay & Lalonde), que ejercen mayor efecto en la formación de raíces adventicias de los explantes, seguido del tratamiento 1

(testigo) con 91,67% de explantes enraizados, 6,80 raíces por plántula y 21,93 mm de longitud de la raíz mayor por plántula, seguidamente los tratamientos 4 y 2 con 83,33 y 58,33% de explantes enraizados respectivamente. Cabe recalcar que para la fase de enraizamiento de yemas de Alnus acuminata se debe utilizar el (tratamiento 2) que corresponde al medio de cultivo de Tremblay & Lalonde (TL), 1984 dividiendo solamente los macro-elementos a la mitad, más 2 auxinas (0,1 mg/1 ANAyO.Img/lAIB). 5.5. Fase de aclimatación

En el cuadro 14 y el gráfico 5 se aprecia que a medida que aumenta el número de días de aclimatación (0, 3, 6), también aumenta el porcentaje de plántulas aclimatadas en invernadero del 45,83 a

80,33 y 95,83% respectivamente. Pero con 9 días de aclimatación baja el porcentaje a 54,16%, la explicación puede ser el hecho que el medio con las plántulas en los tubos comienza a contaminarse por microorganismos (hongos, bacterias), los cuales afectan a las plántulas. Entonces para la fase de aclimatación de las plántulas in vitro, se llevará del laboratorio a invernadero, 6 días (testigo) antes del trasplante en sustrato. Ésto confirma lo que Mejía, A.R. (1988) demostró en el cultivo de papa, donde se debe realizar una aclimatación de 4 a 6 días antes del trasplante al sustrato. 5.6. Tipo de sustrato para trasplante

En el cuadro 16, podemos observar que el coeficiente de variabilidad es de 12,81% lo que nos indica que la conducción del experimento ha sido aceptable. Así mismo se muestra que existe alta significación estadística entre tratamientos, puesto que la F calculada supera a la F tabular a los niveles de 0,05 y 0,01 de probabilidades, lo cual indica que hay diferencias reales entre los promedios de los tratamientos. Pero no indica que tratamiento es el mejor, para ello sé hará uso de la prueba de rango múltiple de Duncan al 5% de probabilidades.

En el cuadro 17 y el gráfico 6, se observa que el tratamiento 3 (M + A + T, proporción 1:1:1/2) obtuvo la mayor altura de planta (7,96 cm) al cabo de 2 meses, superando estadísticamente a todos los demás tratamientos, en segundo orden tenemos el T4 que es superior estadísticamente al T2 y T1, seguido el T2 que es superior al T1 (testigo).

Por lo tanto, para el trasplante de plántulas enraizadas in vitro al invernadero se debe utilizar un sustrato compuesto de musgo + arena + turba, en la proporción arena + turba, en la proporción 1:1:1/2 respectivamente (T3), por ser un sustrato suelto que favorece el desarrollo del sistema radicular de la planta y por ende el crecimiento.

VI. CONCLUSIONES De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente estudio y dentro de los lincamientos perseguidos a través de los objetivos trazados, se concluye: 1. Para la fase de desinfección de explantes (microestacas) se debe emplear

alcohol al 70% por 1 minuto y una solución de hipoclorito de calcio al 3% más Tween 80 durante 30 minutos, antes realizar en invernadero una pre-desinfección en las plantas madres con fungicidas al 0,2%, con aplicaciones cada 3 días por un período de 15 días.

2. En la fase de crecimiento de explantes se debe utilizar el medio de cultivo

compuesto por macro-elementos de Murashige & Skoog (MS), 1962 y micro-elementos y vitaminas de Fossard (F), 1974. (Anexo 1).

3. Para la fase de multiplicación, debe usarse el medio de cultivo de Tremblay

& Lalonde (TL), 1984, adicionando 0,23 mg/1 BAP +0,1 mg/1 AIB, el cual ha inducido el crecimiento el 100% de las yemas axilares de los micronudos, en 15 días. (Anexo I).

4. Para la fase de enraizamiento, debe utilizarse el medio de cultivo de

Tremblay & Lalonde (TL), 1984, diluido a la mitad los macro-elementos, agregando 2 auxinas: 0,1 mg/1 ANA y 0,1 mg/1 AIB. (Anexo 1).

5. Para la fase de aclimatación y tipo de sustrato para el trasplante de las

plántulas enraizadas "in vitro" al invernadero, se colocará en el invernadero las plántulas durante 6 días antes del trasplante. Transcurrido este tiempo se procede a trasplantar en bolsas de repique con sustrato: musgo + arena + turba en la proporción 1:1:1/2 respectivamente.

VII. RECOMENDACIONES

VIII. BIBLIOGRAFÍA 1. AGUILAR, C. Luis, 1990. Mícropropagation végétative "in vitro" du

Pinus patula Schient et Cham. Mémoire de la Faculté des Sciences Agronomiques - Université Catholique de Louvain - Bélgica. 120 p.

2. AÑAZCO, R. Mario, 1991. El aliso [Ainus acuminata}. Primera edición.

Editorial Gráficas Iberia, Quito - Ecuador. 166 p. 3. CENTRO INTERNACIONAL DE AGRICULTURA TROPICAL (CIAT),

1991. Cultivo de tejidos en la agricultura. Primera edición. Editorial XYZ , Cali - Colombia. 996 p.

4. ESCALANTE, Z. Berardo, 1984. Cultivo de Meristemos para la

producción de plantas madres de papa (S. tuberosum L. Var Huagalina). Tesis para optar el grado de Ing. Agrónomo - Universidad Nacional de Cajamarca, Cajamarca - Perú, 70 p.

5. FLORES, A. Flavio, 1995. Diseños Experimentales, Procesamiento y

análisis con computadoras un enfoque forestal (SAS). ADEFOR Cajamarca - Perú. 60 p.

6. GEORGE, E. and D. PUTTOCK, 1987. Plant culture media. Vol. 1:

Formulations and uses. First edition. England. 567 p. 7. GONZALES, O. César, 1990. Contributíon a amélioration génétique d'

Bucalyptus globulus. Labill á Cajamarca -Pérou. Mémoire de la Faculté des Sciences Agronomiques, Université Catholique de Louvain - Bélgica. 95 p.

8. HURTADO, M. y MERINO M, 1994. Cultivo de tejidos vegetales. Primera edición. Editorial Trillas S. A. México. 232 p.

9. HUDSON T. HARTMANN y DALE E. KESTER, 1987. Propagación de

plantas, principios y prácticas. Primera edición. Compañía Editorial Continental S.A. México. 760 p.

10. MEJIA, Rubino y VITORELLI, César, 1988. Cultivo "in vítro" de plantas

de papa. Primera edición. Lima - Perú. 112 p. 11. SABJA, A. y JORDÁN, M, 1991. Propagación vegetativa por medio de

estacas y cultivo in vitro de Eucalyptus spp. Pontificia Universidad Católica de Chile. 84 p.

ANEXOS