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Introducción

Un objeto es la suma de sus partes y algo más. Muchas veces solohay que juntar las partes en la forma adecuada, y es esaorganización novedosa la que le da sentido al nuevo proyecto, a undescubrimiento o una invención.

Nuestro laboratorio (el Lab 8) forma parte del IQUIFIB, el Instituto deQuímica Fisicoquímica Biológicas, un Instituto de CONICET que estáubicado en el Departamento de Química Biológica de la Facultadde Farmacia y Bioquímica. Esto determina que convivan al menosdos aspectos de cada uno de nosotros: la mayor parte somosDocentes e Investigadores. En el laboratorio estudiamos diferentesaspectos de la conformación de proteínas, como su estructura, suestabilidad termodinámica, el mecanismo de plegado, la movilidadinterna y la actividad biológica. A su vez, buscamos entender lasrelaciones entre estos aspectos. Por ejemplo, algunos cambios en lasecuencia de aminoácidos de una proteína pueden produciralteraciones en la estabilidad termodinámica y/o cambios en lamovilidad de ciertas regiones de la macromolécula. A veces, estoscambios pueden tener consecuencias sobre la actividad biológica.¿Cómo están conectadas estas propiedades? Usamos herramientasmuy variadas, incluyendo resonancia magnética nuclear (para elestudio de la dinámica de la conformación), difracción de rayos X(para determinación de estructura), equipos de mezclado rápido(para estudiar reacciones de plegado), dispersión luminosa (paraevaluar el tamaño de proteínas en solución), entre muchas otras.

También llevamos adelante simulaciones computacionales que, enconjunto con las herramientas experimentales, nos permiten construirdescripciones de eventos moleculares a escala atómica y entenderlos procesos proteicos, incluyendo la dimensión temporal. Endefinitiva, una de las cosas que nuestro laboratorio hace bien esproducir proteínas recombinantes en bacterias y purificarlas. Hemosaprendido a estudiarlas y también a asociarnos con otrosinvestigadores para resolver problemas complejos. Estos últimos añoshemos avanzado mucho, gracias a colaboradores de otroslaboratorios, que nos ayudan.

TEORÍA

por Javier Santos

Javier Santosnació el 22 de diciembre de 1972.

En su infancia, orientado por sumaestro Otto Fenninger se interesó

por la Biología y especialmente porlas Aves. Estudió Ciencias

Biológicas en la UBA, dondeconoció al profesor Dr. Daniel

Goldstein, quien rápidamente lecontagió su fascinación por las

proteínas. Inició su camino en laciencia en el laboratorio del Dr.

Mario R. Ermácora y obtuvo allí sutítulo de Doctor de la UBA. Realizó

estudios de Post­doctorado junto alDr. José M. Delfino en en el IQUIFIB

(UBA­CONICET). Actualmente esJefe de trabajos prácticos en la

Facultad de Farmacia y Bioquímicay es Investigador adjunto del

CONICET. Se desempeña comoinvestigador en el IQUIFIB, siendo

director del Laboratorio 8. Participóen proyectos biotecnológicos y

actualmente se dedica al estudiode los mecanismos moleculares

que conducen a la consolidaciónde la estructura de las proteínas, en

particular de la frataxina.

Estudio de la conformación, dinámica y estabilidad delas proteínas y el desarrollo de herramientas de

diagnóstico. Formando una red para avanzar sobreproblemáticas necesarias en Centros de Salud

Figura de portada: Dos modelos devariantes de frataxina humana.

Fuente: Roman et al., 2012.

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Para investigar además se necesita dinero. Losinsumos para hacer experimentos son muycostosos. Una fecha importante para nuestrogrupo es 2010, el año en el que recibimos elprimer subsidio de la Agencia Nacional dePromoción Científica y Tecnológica (ANPCyT)para grupos consolidados con el objetivo delestudio de diversos aspectos relacionados con laconformación y la estabilidad de la frataxinahumana.

La frataxina humana (hFXN)

La frataxina (FXN) es una proteína esencial deubicación mitocondrial, cuyo déficit y/o fallofuncional puede ser la causa de la Ataxia deFriedreich (FRDA). Esta patología está asociadaen el 95% de los casos con la presencia de unaexpansión anómala de un triplete –indicadacomo “(GAA)n”– en el primer intrón del gen de laFXN. Si bien los intrones son regiones de los genesque no codifican parte de la secuencia proteica–y los exones, en cambio, son las regionescodificantes– esta mutación produce unsilenciamiento de la transcripción de la proteína.Cuando esta mutación ocurre en uno solo de losdos alelos del gen fxn (genotipo heterocigota), elindividuo no posee FRDA. A su vez, en la mayorparte de los casos de FRDA ambos alelos poseenexpansiones del triplete. Sin embargo, un númeroreducido de pacientes con FRDA poseen un alelocon la expansión (GAA)n y otro portando unamutación puntual que afecta la estabilidad de laproteína (Tabla 1, Figuras 1 y 2). Estos individuos sedenominan dobles heterocigotas.

La Ataxia de Friedreich

Se trata de una enfermedad hereditarianeurodegenerativa autosómica recesiva, conuna prevalencia de ~ 1 en 50.000 personas y conigual frecuencia en hombres y mujeres, cuyasintomatología por lo general se manifiesta entrelos 11 y los 18 años de edad. Se ha demostradoque en los pacientes con este tipo de ataxia, laexpresión insuficiente de FXN funcional deriva endesórdenes metabólicos importantes queincluyen deficiencia en el ensamblado de centrosFe­S, unos grupos químicos que sonfundamentales en numerosos procesos biológicos.Así, se produce el aumento de la cantidad deradicales libres, lo que produce daño por estrésoxidativo con la consecuenteneurodegeneración. Además, se ha demostradoque la FXN participa en las últimas etapas de labiosíntesis del grupo hemo, a través de unainteracción específica con la ferroquelatasa(Figuras 3 y 4).

Investigación y desarrollo de agentesterapéuticos

Actualmente, no hay tratamientosfarmacológicos disponibles para incrementar laexpresión de FXN y detener la progresión de laenfermedad. Sin embargo, sí se hanimplementado algunas estrategias paracompensar los efectos de la disminución de FXN.El caso más sobresaliente es la administración deidebenona (un agente antioxidante); suadministración ha demostrado producir mejoras

Tabla 1: Estabilidad termodinámica de lasvariantes de frataxina producidas en ellaboratorio. El alelo normal se indica como“silvestre” (variante Nº 1); las variantes 2 a 6representan proteínas a las cuales se les hasustituido el aminoácido en la posición 198 (unaleucina, señalada como L) por diferentesaminoácidos. La variante 7 representa unaproteína a la cual se le ha eliminado el extremocarboxilo terminal. La diferencia de energía libreentre los estados plegado (N) y desplegado (D)permite evaluar la espontaneidad del proceso deplegado y la fracción de moléculas que seencuentran desplegadas en la solución: cuantomayor la diferencia, más estable la proteína.

Figura 1. Modelo de cintasde la estructura de lafrataxina humana. Enamarillo se muestran lashebras beta, mientras queen rojo las hélices alfa. Enceleste los conectores y enazul la región C­terminal,importante para laestabilidad de la proteína(el modelo fue construidousando el programa VMDy el archivo PDB: 1EKG).

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clínicas apreciables, como disminución de laincidencia de cardiomiopatías. En los últimos añosse han propuesto varias estrategias molecularespara solucionar el problema de la Ataxia deFriedreich, que se encuentran en diferentesetapas (experimentales o clínicas). Entre ellas, eldiseño de inhibidores de desacetilasas de histonas(HDAC) que controlan el remodeladoepigenético de complejos DNA­proteína ypodrían impedir el silenciamiento de latranscripción del gen de la FXN (Recuadro 1).Otro proyecto se basa en el desarrollo deinhibidores de la degradación de FXN por la víaubiquitina­proteasoma (Recuadro 2). Así, se ponede manifiesto que las estrategias para aumentarlos niveles de FXN intracelulares incluyen tanto ala vía de síntesis como a las vías naturales dedegradación de esta proteína. En este últimocaso la propuesta es inhibir específicamente ladegradación de la FXN que ocurre por víasnaturales (Figura 4).

Por otro lado, se ha propuesto el uso de péptidos“troyanos” (como el péptido TAT) para mediar elingreso de FXN producida en el laboratorio alinterior celular. El péptido TAT es un péptido corto,capaz de traslocar una proteína a través de lamembrana. Así, unido a FXN como una proteínaquimérica (TAT­FXN), se han obtenido resultadosmuy alentadores en el rescate de fibroblastos de

pacientes, y luego aumentando la vida media deratones con un knockout condicional para el genFXN. En la actualidad existen además proyectoscon financiamiento para llevar adelante terapiagénica en el caso particular del gen de la FXN.Todos los detalles de estas estrategias puedenencontrarse en la página de la FARA (TheFriedreich's Ataxia Research Alliance, enhttps://www.curefa.org/).

Detección de frataxina en muestras

Volviendo a nuestro trabajo experimental,nuestro laboratorio se ha focalizado desde 2010en entender las bases de la estabilidad de la FXNy de variantes asociadas con la enfermedad. Enel camino nos hemos vuelto expertos en laproducción de estas proteínas. Una herramientamuy útil para el estudio de proteínas son losanticuerpos, un tipo especial de proteínas que losorganismos utilizan para poder diferenciar ”lopropio de lo ajeno”, y combatir parásitos, einfecciones virales y bacterianas. Así, si leinyectamos frataxina humana con alto grado depureza a un conejo, el sistema inmune del conejoreconocerá como ajena a la proteína inyectaday producirá una batería de anticuerpos con lacapacidad para unirse a la frataxina humanamuy específicamente. Con el objetivo de

Las histonas

Las histonas son proteínas muy conservadas evolutivamente que se asocian al ADN, y forman losnucleosomas, empaquetando al ácido nucleico. Las histonas presentan un contenido elevado deargininas y lisinas (aminoácidos básicos, cargados positivamente, que interactúan electrostáticamentede manera favorable con los grupos fosfato del ADN, cargados negativamente). Las histonas puedensufrir una serie de modificaciones químicas; entre ellas, las acetilaciones de lisina y arginina modifican elestado de empaquetamiento, determinando que se pueda transcribir el ADN a ARN. Por el contrario,las desacetilaciones (las enzimas encargadas son las HDAC) determinan la compactación del complejoDNA­proteínas silenciando la transcripción génica. Así, los inhibidores de desacetilasas de histonas sonactivadores de la transcripción.

Figura 2 (izq.). Estudio de variantes de frataxina de estabilidad variable. El contenido de estructura secundaria (eje y) se cuantificapor dicroísmo circular en función del incremento de la temperatura (eje x). Se observa como al incrementar la temperatura elcontenido de estructura secundaria se reduce. Figura 3 (der.). Funciones biológicas de la frataxina en la célula. Se la ha vinculadocon la regulación del la síntesis de centros hierro azufre (Fe­S), así como con la biosíntesis del grupo hemo. Por su capacidad deunir hierro se la considera una chaperona de este metal y se la vincula con el control de la formación de radicales libres.

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producir anticuerpos específicos, nos vinculamoscon otro laboratorio de la Facultad que esexperto en inmunología, y tuvimos la suerte deconocer a Alejandro Ferrari. Ese fue el inicio de loque estoy tratando de contar.

Si uno quisiera detectar el nivel de producción defrataxina en muestras de pacientes, unaposibilidad es utilizar estos anticuerposespecíficos. Por otro lado, al contar con nuestrapropia frataxina producida en el laboratorio,también contamos con un estándar deconcentraciones conocidas para podercomparar con las muestras y cuantificar lafrataxina presente en ellas. En eso comenzamos atrabajar: la elaboración de un método quecombine ambas partes –anticuerpos y frataxinade laboratorio– que permita diagnosticar muyrápidamente y con bajo costo la Ataxia deFriedreich. Con un poco de lectura pudimos verque si bien nuestra idea no era del todonovedosa (unos cuantos grupos están avanzandoen la misma dirección) no estábamosequivocados, y que podría ser importante que loscentros de salud de referencia contaran con estaherramienta. Con este propósito nos pusimos encontacto con expertos locales: el Dr. RalphPikielny (FLENI), el Dr. Federico Micheli, laNeuróloga Dra. Daniela Calvo (Hospital deClínicas) y la Dra Claudia Perandones (UNSAM), ygeneramos un proyecto para poner a prueba elsistema de detección con muestras de pacientesy con donantes sin ataxia. Una vez que elproyecto fue aprobado por el comité de ética, elDr. Ferrari hizo los experimentos necesarios con elapoyo y la participación de los pacientes (cabedestacar que los pacientes donantes norecibieron nada material a cambio, sin dudaponiendo de manifiesto su generosidad con elresto de la comunidad, ya que el resultado en

principio, no brindaría ninguna ventaja para ellos,en tanto cada uno de ellos ya cuenta con unanálisis genético que permite relacionarunívocamente la enfermedad con el genotipodel paciente). Los resultados preliminares indicanque el sistema es robusto y eficiente y que logradiferenciar los niveles bajos presentes en muestrasde sangre periférica de pacientes con respecto alos observados en donantes sin Ataxia. Así nuestroproyecto (un proyecto que ya incluye a muchaspersonas y colaboradores) avanza y esperamospronto poder transferirlo a los centros de saludque lo requieran.

Proteasoma

El proteasoma es un complejo multiproteicopresente en las células fundamental en elproceso de degradación natural intracelular deproteínas. Su estructura es similar a la de untanque y en su interior se ubican subunidades concapacidad proteolítica (proteasas). Así, elproteasoma, en conjunto con otras moléculas,controla la vida media y en definitiva la actividadde ciertas proteínas, entre ellas de la frataxina.Para entrar en la vía de degradación, lasproteínas deben marcarse; esto ocurre por mediode una reacción en la que una proteína pequeña(ubiquitina) que cumple el rol de “etiqueta” esunida a la proteína que va a ser degradada porel proteasoma por medio de la enzima“ubiquitina ligasa”. Una vez etiquetada, elproteasoma la reconoce y la degrada.Comúnmente esta es la vía para la degradaciónde proteínas mal plegadas, químicamenteenvejecidas, parcialmente degradadas. Tambiénse degradan por esta vía ciertas proteínas virales,o bacterianas que la célula presentará al sistemainmune y que le permitirán a nuestro organismoreconocer lo ajeno.

Figura 4. Esquema del procesamiento yactividad de la frataxina en una célula. Lafrataxina está codificada por el DNAnuclear. El correspondiente RNA mensajerose traduce en el citoplasma (no mostrado) yla proteína es importada como un precursorde 210 residuos a la mitocondria. Participandiversas proteínas, entre ellas se ha sugeridola participación de chaperonas y proteínastransportadoras de membrana. En lamitocondria, a continuación, es procesada.Primero, un corte proteolítico la transformaen el intermediario FXN42­210.Posteriormente, un segundo corte en el queprobablemente participan átomos de Fe yradicales produce la molécula maduraFXN81­210. Esta proteína podrá unir hierro(en sus estados de oxidación +2 y +3) através de cadenas laterales ácidas deresiduos de aminoácidos de ácidoglutámico y aspártico. Esta forma podráactivar al complejo de proteínas delcomplejo de biosíntesis de centros hierroazufre (ISCU, NFS1 e ISD11). Una vezsintetizados los centros podrán sertransferidos a enzimas (entre ellas laaconitasa mitocondrial) que lo requierenpara su actividad biológica.

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Bibliografía recomendada

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El aprovechamiento de recursos y lacolaboración

Como mencionamos más arriba, muchas vecessolo hay que juntar partes en la forma adecuada,y esa organización novedosa de las partes es laque le da el sentido al nuevo proyecto. Un puntomuy importante es que la colaboración entregrupos llevar a un mejor aprovechamiento de losrecursos que disponemos. En nuestro caso, esto sepuede transcribir en forma de ecuación:

Anticuerpos + frataxina + médicos + pacientes +investigadores + recursos económicos = Testpara detección de Ataxia de Friedreich.

Mirando hacia adelante

Estamos convencidos que nuestro aporte esmínimo y que es parte de un aprendizaje:compartir nuestra pequeña experiencia ydevolver lo máximo posible. Así, en la actualidadcontinuamos con nuestros estudios sobre lasdistintas variantes de frataxina e intentamoscombinar algunas de las ideas existentes conideas nuevas como estrategias para laproducción de una nueva variante que seacapaz de atravesar las membranas biológicas,localizarse en el interior de las mitocondrias,específicamente en la matriz mitocondrial, quesea funcional, que sea resistente a proteasas y alsistema de ubiquitinación y que no seaantigénica, es decir, que el organismo lareconozca como propia y no como una proteínaajena.

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con Alejandro Ferrari (alejandro.ferrari@gmail.com)