EVALUACIÓN DEL EFECTO DE ÁCIDO GIBERÉLICO CON AGUA DE COCO Y CASEÍNA HIDROLIZADA COMO FUENTES DE NITRÓGENO EN LA MADURACIÓN DE EMBRIONES DE PALMA COCO

EVALUACIÓN DEL EFECTO DE ÁCIDO GIBERÉLICO CON AGUA DE COCO Y CASEÍNA HIDROLIZADA COMO FUENTES DE NITRÓGENO EN LA MADURACIÓN DE EMBRIONES DE PALMA COCO CUMBÉ (Parajubaea cocoides Burret) OBTENIDOS A PARTIR DE CALLOS, MEDIANTE ESTABLECIMIENTO DE SUSPENSIONES CELULARES.

BLANCA ESTHELA ENCALADA ALDAZ

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

M.Sc. Grace Tatiana Páez Barrera Codirectora

Ing. Cristian Javier Peña Pontón Director

Dr. Marcelo Mejía Secretario Académico

INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN

Parajubaea cocoides Burret

Palma alto andina

Palma alto andina

Valles y

alturas ecuatoriales

Suramérica Colombia

hasta Ecuador

Suramérica Colombia

hasta Ecuador

15-20 m. de altura 15-20 m. de altura

EndocarpioEndocarpio

ArecaceaeArecaceae

Palma solitaria monoica

Palma solitaria monoica

Espermatofita

Angiosperma

Dicotiledóna

Tallo lisoTallo lisoHojas pinadas Hojas pinadas

InflorescenciaInflorescenciaInfrutescenciasInfrutescenciasFrutos

elipsoides Frutos

elipsoides

Seis y ocho meses Endospermo sensibleRaíces sensibles

Distrito Metropolitano de Quito emprende proyectos para la

reforestación de esta especie.

Distrito Metropolitano de Quito emprende proyectos para la

reforestación de esta especie.

Especie amenazada

Especie amenazada

Embriogénesis somática

Fusión de gametos Fusión de gametos

ETAPAS-Inducción

-Proliferación-Diferenciación

-Maduración -Germinación

ETAPAS-Inducción

-Proliferación-Diferenciación

-Maduración -Germinación Tipos de

embriogénesis Tipos de

embriogénesis

Embriogénesis Somática Directa

Embriogénesis Somática Directa

Embriogénesis Somática Indirecta

Embriogénesis Somática Indirecta

Eje radicular

Eje apical

v

Fases de los embrionesFases de los embriones

Globular Globular Corazón Corazón Torpedo Torpedo Cotiledonar Cotiledonar

OBJETIVOS OBJETIVOS

Evaluar el efecto de ácido giberélico, agua de coco y caseína hidrolizada en la maduración de embriones somáticos de palma coco cumbé (Parajubaea cocoides Burret) obtenidos a partir de callos, mediante establecimiento de suspensiones celulares.

GENERAL GENERAL

ESPECÍFICOS ESPECÍFICOS

Validar el método de desinfección, establecimiento e inducción de callo embriogénico de palma coco cumbé.

Evaluar el efecto y la concentración adecuada de ácido giberélico en la maduración de los embriones somáticos.

Evaluar el efecto del agua de coco y caseína hidrolizada como fuente de nitrógeno orgánico.

METODOLOGÍA METODOLOGÍA

Fase de maduración de embriones

somáticos

• M& S(1962) a la mitad de su concentración

• 0.1 mg L-1 ácido indol acético• 0.8 mg L-1 de benzilaminupurina• 2.5 mg L-1 sulfato de adenina• 40 g L-1 de sacarosa

Tratamientos GA3 (mg L-1) Fuente de nitrógeno

M1 1.5 Agua de coco (35 ml)

M2 3 Agua de coco (35 ml)

M3 1.5 Caseína hidrolizada (200 mg L-1)

M4Control

3-

Caseína hidrolizada (200 mg L-1)-

Fase de identificación embrionaria

Tratamientos de la maduración Tratamientos de la maduración

Fuente: (Muñoz, 2003; Jha et al., 2007; Sujatha et al., 2008).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN RESULTADOS Y DISCUSIÓN

(A) Embriones sembrados después de la desinfección, (B) Explante sin contaminación, (C) Explante

contaminado

(A) Embriones sembrados después de la desinfección, (B) Explante sin contaminación, (C) Explante

contaminado

Fase de desinfección Fase de desinfección

90 embriones sembrados

90 embriones sembrados

Contaminación del 1,11%

Contaminación del 1,11%

Sobrevivencia del 98,89%

Sobrevivencia del 98,89%

Fase de inducción de callo embriogénico

Fase de inducción de callo embriogénico

(A) Callos sembrados, (B) Porción de callo friable (A) Callos sembrados, (B) Porción de callo friable

Cinética celular Cinética celular

Conteo celular en Parajubaea cocoides Burret (A) fase de retraso, (B) fase exponencial, (C) fase logarítmica, (D) fase estacionaria.

Conteo celular en Parajubaea cocoides Burret (A) fase de retraso, (B) fase exponencial, (C) fase logarítmica, (D) fase estacionaria.

Fase de establecimiento de las suspensiones celulares

Fase de establecimiento de las suspensiones celulares

(a) Eliminación del medio de cultivo, (b) Reposición del medio en la suspensión,

(c) suspensión de color translucida

(a) Eliminación del medio de cultivo, (b) Reposición del medio en la suspensión,

(c) suspensión de color translucida

16 días

C1: 1.5 mg L-1 de GA3 y 35 ml de ACC1: 1.5 mg L-1 de GA3 y 35 ml de AC

C2: 3 mg L-1 de GA3 y 35 ml de ACC2: 3 mg L-1 de GA3 y 35 ml de AC

22 días

C3: 1.5 mg L-1 de GA3 y 200 mg L-1 de caseína hidrolizada

C3: 1.5 mg L-1 de GA3 y 200 mg L-1 de caseína hidrolizada

C4: 3 mg L-1 de GA3 y 200 mg L-1 de caseína hidrolizada

C4: 3 mg L-1 de GA3 y 200 mg L-1 de caseína hidrolizada

Curva de la cinética celularCurva de la cinética celular Ajuste del crecimiento celular Ajuste del crecimiento celular

Día 16

Suspensión uno Suspensión uno

Curva de la cinética celularCurva de la cinética celular Ajuste del crecimiento celular Ajuste del crecimiento celular

Suspensión dos Suspensión dos

Día 16

Curva de la cinética celularCurva de la cinética celularAjuste del crecimiento celular Ajuste del crecimiento celular

Día 22

Suspensión tres Suspensión tres

Curva de la cinética celularCurva de la cinética celularAjuste del crecimiento celular Ajuste del crecimiento celular

Suspensión cuatro Suspensión cuatro

Día 22

Mejor suspensionMejor suspension Formación de células Formación de células

Análisis de varianza paramétrica y prueba de LSD Fisher Análisis de varianza paramétrica y prueba de LSD Fisher

Fase de maduración de embriones somáticos

Fase de maduración de embriones somáticos

(A) embriones necrosados en el tratamiento testigo, (B) embriones en desarrollo

(A) embriones necrosados en el tratamiento testigo, (B) embriones en desarrollo

Sin fuentesSin fuentes

Nitrógeno Nitrógeno GA3 GA3

Necrosan Necrosan

Mueren Mueren

Prueba de Kruskal-Wallis Prueba de Kruskal-Wallis

Embrión globular Embrión globular

73.43%

53.43%

Porcentaje de formación de embriones Porcentaje de formación de embriones


Embrión corazón Embrión corazón


25.64%23.30%


Embrión torpedo Embrión torpedo


30.82%

26.34%


Embrión cotiledonar Embrión cotiledonar


45.36%

40.79%

Porcentajes de embriones en sus distintas fases Porcentajes de embriones en sus distintas fases

Número total de embriones formados en los cuatro tratamientos

Número total de embriones formados en los cuatro tratamientos


335

386429

486

CONCLUSIONES CONCLUSIONES

El mejor protocolo de desinfección para la inducción de callo, fue utilizando una concentración de NaClO al 2.5%, con un tiempo de inmersión de diez minutos.Se obtuvo un porcentaje de contaminación en la inducción del callo del 1,11%, por lo tanto la sobrevivencia de los embriones fue de 98,89%.El mejor tratamiento para la inducción de callo, fue el tratamiento con (60 mg L-1 2,4 D y 1 g L-1 carbón activado), ya que presentó viabilidad y formación de callos friables.El mejor tratamiento para el establecimiento de las suspensiones celulares, fue el tratamiento con (1.5 y 3 mg L-1 de ácido giberélico con 200 mg L-1 de caseína hidrolizada), ya que presentan la media más alta con respecto a la formación de células en relación al tiempo.El mejor tratamiento para la maduración de embriones, fue el tratamiento con (3 mg L-1 de ácido giberélico con 200 mg L-1 de caseína hidrolizada), ya que se observó embriones en todas las fases, y se obtuvo 45.36% de embriones en fase cotiledonar. El agua de coco como fuente de nitrógeno, no favoreció la obtención de embriones en fase cotiledonar, sin embargo, se obtuvo un 73,43% de embriones en fase globular.

RECOMENDACIONES RECOMENDACIONES

Para el proceso de maduración, se debería probar con la adición de 150 mg L -1 glutamina, que según varios autores incrementa los niveles de aminoácidos libres, y el porcentaje de proteínas; además de mejorar el tamaño de los embriones y su frecuencia de conversión.Para alcanzar un alto grado de sincronización en el crecimiento de los embriones somáticos en un mismo tejido o en suspensión celular, se debería utilizar ácido abcísico (ABA).Realizar un estudio histológico en cada etapa de la embriogénesis somática, para así, determinar los cambios estructurales y morfológicos de los embriones. Es necesario continuar con el proceso de germinación de los embriones y aclimatación de las plántulas, para de esta forma determinar la efectividad del protocolo.

AGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOS

Ingeniero Cristian Javier Peña PontónM.Sc. Grace Tatiana Páez Barrera

Ingeniero Pedro Romero

Ingeniera Maria Jose Basantes Ingeniero Segundo Aguilar

GRACIAS

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EVALUACIÓN DEL EFECTO DE ÁCIDO GIBERÉLICO CON AGUA DE COCO Y CASEÍNA HIDROLIZADA COMO FUENTES DE NITRÓGENO EN LA MADURACIÓN DE EMBRIONES DE PALMA COCO