EVOLUZIONE MOLECOLARE

L’evoluzione molecolare studia la velocità e i tipi di

cambiamenti che hanno luogo nel materiale genetico o nei

suoi prodotti.

Gli studi di evoluzione molecolare si basano essenzialmente

su analisi comparative e quindi presuppongono la

conoscenza delle macromolecole biologiche almeno a livello

della struttura primaria.

DIMENSIONE

TEMPO

CINEMATICA DINAMICA

OBIETTIVI

individuazione delle costrizioni funzionali

comprensione dei processi evolutivi

studi filogenetici, relazioni tassonomiche

pura descrizione meccanismi evolutivi

EVOLUZIONE MOLECOLARE

Livelli di analisi

inter taxa

inter phyla

inter specie

intra specie

EVOLUZIONE MOLECOLARE

Scelta delle

sequenze

geni ortologhi

geni paraloghi

altre regioni

(non codificanti, regolatorie)

genomi completi

EVOLUZIONE MOLECOLARE

speciazione

duplicazione genica ba

specie 1

specie 2

gene β 1gene α 1 gene α 2 gene β 2

speciazione

ort

olo

gia

e p

ara

logia

Evoluzione della famiglia genica della

beta-globina umana

5’ 3’

e g1 g2 yh d b

Embrionale Fetale Pseudogene Adulta

0

100

200

Myaduplicazione genica

Mutazioni Puntiformi: Sostituzioni nucleotidiche

•Transizioni

•Transversioni

Per capire le dinamiche della sostituzione nucletidica

dobbiamo capire la probabilità di sostituzione di un

nucleotide con un altro (diversi modelli matematici).

A

G

C

T

Sulla base delle distanze genetiche è possibile ricostruire la storia

evolutiva delle molecole, e quindi anche degli organismi.

Solitamente il numero di sostituzioni tra due sequenze è espresso in

termini di sostituzioni per sito (k) e non di sostituzioni totali. Questo

permette di confrontare sequenze di lunghezza diverse.

Generalmente il numero di sequenze che viene osservato tra coppie di

sequenze è sempre inferiore rispetto al numero di sostituzioni che

hanno effettivamente avuto luogo (sostituzioni multiple, retromutazioni

e sostituzioni convergenti). Per cui sono necessarie delle correzioni

matematiche.

A

C

T

G

A

A

C

G

T

A

A

C

G

C

A

C

T

G

A

A

C

G

T

A

A

C

G

C

A

C

T

G

A

A

C

G

T

A

A

C

G

C

T AT

G G

T A

Confronto delle

sequenze attuali

sostituzione singolasostituzione multipla

sostituzione convergente

sostituzioni coincidenti

A a T G g A C G T A a C G C

t C T G g A C G T A A C G C

Sequenza ancestrale

tempo

Sequenze discendenti

Tipi di sostituzioni nucleotidiche

sostituzione singola1 cambio, 1 differenza

A C

A C

A

T A

A C

A

C T

G C

A C

A

A G

C C

A C

A

A C

T T

A T

A

C T

A C

A A

A C

A

C A

sostituzione multipla2 cambi, 1 differenza

sostituzione coincidente2 cambi, 1 differenza

sostituzione parallela2 cambi, 0 differenze

sostituzione convergente3 cambi, 0 differenze

retro-sostituzione2 cambi, 0 differenze

Modelli

deterministici: basati sulla

osservazione dei caratteri

EVOLUZIONE MOLECOLARE

stocastici (probabilistici

dipendenti dal tempo):

basati sulla misura delle

diversità

Modelli Stocastici

Markov

Jukes Cantor

Kimura

Modello di Jukes e Cantor a un parametro

Il modello più semplice, proposto nel 1969: tutte le sostituzioni

nucleotidiche avvengono con la stessa probabilità.

Ad es., A potrà mutare in T, C o G con la stessa probabilità.

Il tasso di sostituzione in ognuna delle tre possibili direzioni è lo stesso (a)

e il tasso di sostituzione complessivo per ogni nucleotide sarà 3a

L’unico parametro da stimare è a, per cui modello a un parametro

Probabilità che un dato nucleotide i rimanga al tempo t:

Pii(t)= ¼ + ¾ e-4at

Probabilità che un dato nucleotide i diventi j al tempo t:

Pij(t)= ¼ - ¼ e-4at

Modello di Kimura a due parametri

E’ stato osservato che le transizioni sono più frequernti delle

transversioni. Per Kimura nel 1980 propone diverse velocità

per transizioni e transversioni, adottando due parametri (=

due diversi tassi di sostituzione: a e b)

Probabilità che un dato nucleotide non cambi nel tempo t:

X(t)= ¼ + ¾ e-4bt + ½ e-2(a+b)t

Indipendentemente da quale sia il nucleotide, poiché anche per

Kimura i 4 nucleotidi sono equivalenti.

Probabilità che un dato nucleotide cambi al tempo t:

Y(t)= ¼ + ¼ e-4bt - ½ e-2(a+b)t

Modello Kimura più realistico di Jurk e Cantor, ma presenta notevole

restrizioni:

•Non è detto che i 4 tipi di transizioni avvengano con la stessa velocità;

•I tassi di sostituzione da i verso j può non essere lo stesso che da j verso

i;

•Il processo di sostituzione possono essere influenzati dalla composizione

nucleotidica;

Modello di Tamura a 3 parametri

Modello di Felsenstein a 5 parametri

Modello reversibile (REV) o modello generale di reversibilità

(GTR) a 9 parametri

Tiene conto di:

•Composizione delle basi

•Reversibilità delle sostituzioni

•Diverse probabilità per i 6 tipi di sostituzioni nucleotidiche

Proprietà

Nessuna assunzione “a priori” sulla matrice

delle distanze ma semplice verifica della

condizione di stazionarietà

Misura accurata delle fluttuazioni statistiche

(Simulazione con il metodo del Bootstrap)

C. Saccone, C. Lanave, G. Pesole and G. Preparata

Methods in Enzymology (1990). Vol. 183, pp. 570 - 583

Modello Stazionario di Markov

Modelli di mutazione per i microsatelliti

Il numero di ripetizioni possono aumentare o diminuire con uguale

probabilità.

La probabilità di retromutazioni è molto maggiore rispetto agli SNPs,

quindi il concetto di “modello degli alleli infiniti” (ogni mutazione

produce nuovi alleli) risulta non realistico.

Stepwise Mutation Model (SMM): Le mutazioni che aumentano o

diminuiscono la lunghezza avvengono con la stessa probabilità. E’

stato adattato anche per cambiamenti multipli.

Correlazione positiva tra lunghezza dei microsatelliti e tasso di

mutazione.

Negli alleli lunghi maggiore tendenza alla delezione piuttosto che

all’inserzione.

Zuckerkandl and Pauling (1962)

IPOTESI DELL’ OROLOGIO MOLECOLARE

Orologi molecolari 1

22

L‟idea di datare gli eventi evolutivi attraverso le differenzecalibrate fra le proteine fu espressa per la prima volta nel1965 da E. Zuckerkandl e L. Pauling, che rilevarono come levelocità di evoluzione molecolare per loci con vincolifunzionali simili siano pressoché costanti su lunghi periodi ditempoDa osservazioni fatte su differenti globine, Zuckerkandl ePauling postularono che la differenza genetica tra due speciediverse, espressa dalla sequenza aminoacidica, è funzionedel tempo di divergenza dall‟antenato comuneLa verifica di tale affermazione fu ottenuta confrontando lesequenze proteiche e, quindi, i tassi di sostituzione amino-acidica, di diverse specie, con i tempi di divergenza stimatisulla base di ritrovamenti fossili

Orologi molecolari 2

23

di battiti tra due proteineomologhe appare linearmentecorrelato con la quantità ditempo trascorso dal momentoin cui la speciazione le ha fattedivergere nel loro percorsoevolutivo

Le frequenze di sostituzione in proteine omologhe erano cosìcostanti su molte decine di milioni di anni, da suggerire unparagone diretto fra l‟accumulo di cambiamenti aminoacidicied il continuo ticchettio di un orologio molecolareL‟orologio molecolare può “battere” a diverse velocità perproteine distinte, ma il numero

tempo

sostituzioni/sito

OROLOGIO MOLECOLARE

Orologi molecolari 3

25

Secondo l‟ipotesi dell‟orologio molecolare, quindi, i geni e iprodotti genici evolvono con tassi che sono approssimati-vamente costanti nel tempo e lungo le differenti lineeevolutivePerciò, se la divergenza genetica si accumula in modoregolare con il passare del tempo, allora è possibile dedurrei tempi di divergenza anche in assenza di evidenze fossiliIn pratica, una frequenza costante di variazione faciliterebbenon solo la determinazione delle relazioni filogenetiche fraspecie, ma anche dei tempi di divergenza.

Orologi molecolari 4

26

La validità dell‟ipotesi di un orologio molecolare universale èstata subito molto discussa

E. Mayr, nel 1965, affermò: “Evolution is too complex and toovariable a process, connected too many factors, for the timedependence of the evolutionary process at the molecular levelto be a simple function”……mentre gli evoluzionisti classici argomentavano che l‟anda-mento irregolare dell‟evoluzione morfologica era incompatibilecon una velocità costante di cambiamento molecolare

Inizialmente ci si riferì ad un orologio molecolare proteico,dal momento che negli anni „60, i dati sul DNA erano ancoratroppo scarsi, ed intenso fu il dibattito fino agli anni „80, cheportò fino a mettere in discussione l‟essenza stessa dell‟ideadi Zuckerkandl e Pauling, ovvero la costanza delle velocitàevolutive

Orologi molecolari 5

27

Fin dal 1971 è stato chiaro che proteine diverse evolvonocon tassi ampiamente variabiliDi conseguenza venne esclusa, da subito, la possibilità diosservare un orologio proteico universaleTest statistici condotti da Ohta e Kimura (1971), da Fitch(1976) da Gillespie e Langley (1979) hanno restituito risul-tati contrastanti, suggerendo che l‟ipotesi dell‟orologiomolecolare proteico deve essere rifiutata per la maggiorparte delle proteine sia nei confronti fra vertebrati che frainvertebrati

Orologi molecolari 6

28

La quantità di dati disponibili per testare l‟ipotesi dell‟oro-logio molecolare sta crescendo in modo esponenzialeLe frequenze di sostituzione nei ratti e nei topi sono risultatemolto similiViceversa, l‟evoluzione molecolare dell‟uomo e della scimmiaantropomorfa (es. gorilla) ha una velocità pari alla metà diquella delle scimmie del vecchio mondo (es. babbuini) dalmomento della loro speciazioneInfatti, i test di frequenza relativa eseguiti su geni omologhinei topo e nell‟uomo indicano che i roditori hanno accumu-lato un numero di sostituzioni doppio rispetto ai primati,dall‟ultimo antenato comune (speciazione dei mammiferi) da80 a 100 milioni di anni fa

Orologio molecolare non costante: l‟uso della divergenzamolecolare per datare i tempi di esistenza di due specie hasenso solo se le specie “condividono l‟orologio”

Orologi molecolari 9

29

Cause di variazione di frequenza nelle discendenzeDiversità dei tempi di generazione (durata del periodoriproduttivo)Efficienza media di riparazione, tasso metabolicoNecessità di adattamento a nuove nicchie ecologiche

Difficili da quantificare:Conosciamo le differenze attualiSappiamo che nel momento della divergenza gli organi-smi avevano attributi simili ……ma abbiamo poche informazioni sulle differenze relati-ve durante tutto il corso dell‟evoluzione

A partire dai primi anni 80, lo sviluppo delle tecniche molecolari, ha

permesso il sequenziamento di molti geni di cui erano già state

analizzate le sequenze proteiche.

L’idea dell’orologio molecolare fu quindi applicata anche al DNA.

Nel 1980 Miyata et al. hanno ottenuto un tasso di mutazione molto

simile fra i diversi gruppi di mammiferi. Mentre Bonner et al. hanno

riscontrato un tasso significativamente più basso nei primati malgasci

rispetto a tutti gli altri primati. Wu e Li hanno dimostrato differenze

significative fra l’uomo e i roditori. Tali differenze furono attribuite al

tempo di generazione, alla diversa efficienza nei meccanismi di

riparazione del DNA, al differente tasso metabolico.

Sono stati proposti diversi orologi molecolari “universali”,

come l’orologio mtDNA, secondo cui il DNA mitocondriale

animale evolve con un tasso di divergenza pari al 2% per

sequenza per milione di anni.

Nel 2002 Kumar e Subramanian hanno potuto caratterizzare

le differenze nel tasso di mutazione all’interno e fra i principali

gruppi di mammiferi.

E’ chiaro, quindi che il tasso di mutazione

in differenti gruppi di mammiferi è piuttosto

diverso

In questo scenario di continui dibattiti, fu quindi

abbandonata l’idea di un orologio universale e si cominciò

a pensare agli orologi molecolari tassonomicamente

“locali”, ovvero che possono essere trovati in particolari

geni e in taxa strettamente affini.

Gli orologi molecolari locali sono più probabili degli

universali in quanto le principali fonti di eterogeneità fra

linee sono rappresentate da differenze

• nella dimensione di popolazione

• nel tasso metabolico

• nel tempo di generazione

• nell’efficienza di riparazione del DNA

Ci si aspetta che questi parametri siano più simili fra taxa

affini che quindi potranno presentare tassi di evoluzione

molecolare piuttosto simili

Stima del MRCA (most recent common ancestry)

Se si applica il concetto di orologio molecolare alle ricostruzioni

filogenetiche, si possono datare gli eventi che sono rappresentati negli

alberi filogenetici

In altre parole è possibile ottenere una cronologia dei cambiamenti e

quindi determinare dei tempi reali in cui quei cambiamenti sono

avvenuti.

E’ necessario conoscere il ritmo a cui l’orologio, cioè

bisogna calibrare il tasso di mutazione della regione

genomica oggetto di studio.

Ci baseremo solo su marcatori uniparentali

I metodi basati su modelli popolazionistici sono complessi, perché

richiedono l’elaborazione di molte simulazioni, es. simulatori di

coalescenza.

Teoria della coalescenza: l’evoluzione degli aplotipi viene simulata

dal presente verso il passato (dagli aplotipi osservati fino ad

arrivare a quello ancestrale)

La genetica studia la trasmissione ereditaria dal passato al presente

forward

Ma quando si lavora su popolazioni si raccolgono dati sul presente e si cerca di risalire al passato

? ?

backward

Costruiamo (procedendo verso il passato) la genealogia materna di un gruppo di individui

Due possibilità: o ogni individuo ha una madre diversa:

O due individui hanno la stessa madre:

Chiamo questo fenomeno coalescenza

Assunzioni del coalescente classico (Kingman 1982)

1. Neutralità

2. Siti infiniti

3. Se gli individui sono diploidi e le dimensioni della popolazione sono N, il modello vale per 2N copie aploidi e indipendenti

4. Unione casuale entro la popolazione

5. Dimensioni della popolazione costanti

Parliamo di caratteri a trasmissione uniparentale

Present

Time

22 individuals

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

16 ancestors

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

16 ancestors

14 ancestors

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

16 ancestors

14 ancestors

12 ancestors

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

16 ancestors

14 ancestors

12 ancestors

9 ancestors

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

16 ancestors

14 ancestors

12 ancestors

9 ancestors

8 ancestors

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

16 ancestors

14 ancestors

12 ancestors

9 ancestors

8 ancestors

8 ancestors

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

16 ancestors

14 ancestors

12 ancestors

9 ancestors

8 ancestors

8 ancestors

7 ancestors

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

16 ancestors

14 ancestors

12 ancestors

9 ancestors

8 ancestors

8 ancestors

7 ancestors

7 ancestors

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

16 ancestors

14 ancestors

12 ancestors

9 ancestors

8 ancestors

8 ancestors

7 ancestors

7 ancestors

5 ancestors

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

16 ancestors

14 ancestors

12 ancestors

9 ancestors

8 ancestors

8 ancestors

7 ancestors

7 ancestors

5 ancestors

5 ancestors

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

16 ancestors

14 ancestors

12 ancestors

9 ancestors

8 ancestors

8 ancestors

7 ancestors

7 ancestors

5 ancestors

5 ancestors

3 ancestors

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

16 ancestors

14 ancestors

12 ancestors

9 ancestors

8 ancestors

8 ancestors

7 ancestors

7 ancestors

5 ancestors

5 ancestors

3 ancestors

3 ancestors

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

16 ancestors

14 ancestors

12 ancestors

9 ancestors

8 ancestors

8 ancestors

7 ancestors

7 ancestors

5 ancestors

5 ancestors

3 ancestors

3 ancestors

3 ancestors

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

16 ancestors

14 ancestors

12 ancestors

9 ancestors

8 ancestors

8 ancestors

7 ancestors

7 ancestors

5 ancestors

5 ancestors

3 ancestors

3 ancestors

3 ancestors

2 ancestors

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

16 ancestors

14 ancestors

12 ancestors

9 ancestors

8 ancestors

8 ancestors

7 ancestors

7 ancestors

5 ancestors

5 ancestors

3 ancestors

3 ancestors

3 ancestors

2 ancestors

2 ancestors

Present

Time

22 individuals

18 ancestors

16 ancestors

14 ancestors

12 ancestors

9 ancestors

8 ancestors

8 ancestors

7 ancestors

7 ancestors

5 ancestors

5 ancestors

3 ancestors

3 ancestors

3 ancestors

2 ancestors

2 ancestors

1 ancestor

Present

Time

Present

Time

Most recent common ancestor

(MRCA)

Mutational events can now be added to

the genealogical tree, resulting in

polymorphic sites. If these sites are

typed in the modern sample, they can

be used to split the sample into sub-

clades (represented by different

colours)

Present

Time

mutation

Most recent common ancestor

(MRCA)

TCGAGGTATTAAC

TCTAGGTATTAAC

Present

Time

mutation

Most recent common ancestor

(MRCA)

TCGAGGTATTAAC

TCTAGGTATTAAC

Present

Time

Most recent common ancestor

(MRCA)

TCGAGGTATTAAC

TCTAGGTATTAAC

TCGAGGCATTAAC

Present

Time

Most recent common ancestor

(MRCA)

TCGAGGTATTAAC

TCTAGGTATTAAC

TCGAGGCATTAAC

Present

Time

Most recent common ancestor

(MRCA)

TCGAGGTATTAAC

TCTAGGTATTAAC

TCGAGGCATTAAC

TCTAGGTGTTAAC

Present

Time

Most recent common ancestor

(MRCA)

TCGAGGTATTAAC

TCTAGGTATTAAC

TCGAGGCATTAAC

TCTAGGTGTTAAC

Present

Time

Most recent common ancestor

(MRCA)

TCGAGGTATTAAC

TCTAGGTATTAAC

TCGAGGCATTAAC

TCTAGGTGTTAAC

TCGAGGTATTAGC

Present

Time

Most recent common ancestor

(MRCA)

TCGAGGTATTAAC

TCTAGGTATTAAC

TCGAGGCATTAAC

TCTAGGTGTTAAC

TCGAGGTATTAGC

Present

Time

Most recent common ancestor

(MRCA)

TCGAGGTATTAAC

TCTAGGTATTAAC

TCGAGGCATTAAC

TCTAGGTGTTAAC

TCGAGGTATTAGC

TCTAGGTATCAAC

Present

Time

Most recent common ancestor

(MRCA)

TCGAGGTATTAAC

TCTAGGTATTAAC

TCGAGGCATTAAC

TCTAGGTGTTAAC

TCGAGGTATTAGC

TCTAGGTATCAAC

Present

Time

Most recent common ancestor

(MRCA)

TCGAGGTATTAAC

TCTAGGTATTAAC

TCGAGGCATTAAC

TCTAGGTGTTAAC

TCGAGGTATTAGC

TCTAGGTATCAAC

* ** * *

Per confrontare le sequenze è necessario

prima di tutto allinearle

L’evoluzione delle parole

• Tutte le parole delle lingue moderne cheindicano lo “zucchero” discendono da unaparola antenata comune

• Tutte dalla stessa (“sukkar” - parola usatadagli arabi), alcune da un’antenata piùvicina nel tempo (“zuckre” in Francia)

Sukkar

Açucar Azucar

Zuckre

Sucre

Zucker

Zucchero

Sakari

SuikerSugar

Sokker

Europa, circa 700 dC

L’evoluzione delle parole

• Immaginiamo di non conoscere le parole “antenate” dello

zucchero, e di doverci chiedere se due parole moderne in

due lingue differenti sono “simili” tra loro

SUGAR

SUCRE

SUGR

SUCR

Allineamento

• L’allineamento” è un modo di rappresentare

schematicamente i legami evolutivi tra due

o più parole (o sequenze), indicando

sostituzioni, inserzioni e delezioni

S U G A R -

S U C - R E

Sostituzione(mutazione)

Inserzioni(delezioni)

Allineamento (multiplo)

S U G - A R -S U C – - R E

Z U C K E R -

S O K K E R -

A Z U C - A R -

S A K - A R I

A ç U C - A R -

--------------------- S U C(K)A R -

SSH_UOMO -MLLLARCLLLVLVSSLLVCSGLACGPGRGFGKRRHPKKLTPLAYKQFIPNVAEKTLGAS

SSH_TOPO MLLLLARCFLVILASSLLVCPGLACGPGRGFGKRRHPKKLTPLAYKQFIPNVAEKTLGAS

:******:*::*.******.***************************************

SSH_UOMO GRYEGKISRNSERFKELTPNYNPDIIFKDEENTGADRLMTQRCKDKLNALAISVMNQWPG

SSH_TOPO GRYEGKITRNSERFKELTPNYNPDIIFKDEENTGADRLMTQRCKDKLNALAISVMNQWPG

*******:****************************************************

SSH_UOMO VKLRVTEGWDEDGHHSEESLHYEGRAVDITTSDRDRSKYGMLARLAVEAGFDWVYYESKA

SSH_TOPO VKLRVTEGWDEDGHHSEESLHYEGRAVDITTSDRDRSKYGMLARLAVEAGFDWVYYESKA

************************************************************

SSH_UOMO HIHCSVKAENSVAAKSGGCFPGSATVHLEQGGTKLVKDLSPGDRVLAADDQGRLLYSDFL

SSH_TOPO HIHCSVKAENSVAAKSGGCFPGSATVHLEQGGTKLVKDLRPGDRVLAADDQGRLLYSDFL

*************************************** ********************

SSH_UOMO TFLDRDDGAKKVFYVIETREPRERLLLTAAHLLFVAPHNDSATGEPEASSGSGPPSGGAL

SSH_TOPO TFLDRDEGAKKVFYVIETLEPRERLLLTAAHLLFVAPHND-----------SGPTPG---

******:*********** ********************* ***..*

SSH_UOMO GPRALFASRVRPGQRVYVVAERDGDRRLLPAAVHSVTLSEEAAGAYAPLTAQGTILINRV

SSH_TOPO -PSALFASRVRPGQRVYVVAERGGDRRLLPAAVHSVTLREEEAGAYAPLTAHGTILINRV

* *******************.*************** ** *********:********

SSH_UOMO LASCYAVIEEHSWAHRAFAPFRLAHALLAALAPARTDRGGDSGGGDRGGGGGRVALTAPG

SSH_TOPO LASCYAVIEEHSWAHRAFAPFRLAHALLAALAPARTD----------GGGGGSIP-AAQS

************************************* ***** :. :* .

SSH_UOMO AADAPGAGATAGIHWYSQLLYQIGTWLLDSEALHPLGMAVKSS

SSH_TOPO ATEARGAEPTAGIHWYSQLLYHIGTWLLDSETMHPLGMAVKSS

*::* ** .************:*********::**********

ALLINEAMENTO DI SEQUENZE

A COPPIE

AGTTTGAATGTTTTGTGTGAAAGGAGTATACCATGAGATGAGATGACCACCAATCATTTC

||||||||||||||||||| |||||||| ||| | |||||| |||||||||||||||||

AGTTTGAATGTTTTGTGTGTGAGGAGTATTCCAAGGGATGAGTTGACCACCAATCATTTC

MULTIPLO

KFKHHLKEHLRIHSGEKPFECPNCKKRFSHSGSYSSHMSSKKCISLILVNGRNRALLKTl

KYKHHLKEHLRIHSGEKPYECPNCKKRFSHSGSYSSHISSKKCIGLISVNGRMRNNIKT-

KFKHHLKEHVRIHSGEKPFGCDNCGKRFSHSGSFSSHMTSKKCISMGLKLNNNRALLKRl

KFKHHLKEHIRIHSGEKPFECQQCHKRFSHSGSYSSHMSSKKCV----------------

KYKHHLKEHLRIHSGEKPYECPNCKKRFSHSGSYSSHISSKKCISLIPVNGRPRTGLKTs

Allineamento GLOBALE o LOCALE

GLOBALE considera la similarita’ tra due sequenze in tutta

la loro lunghezza (da N- a C-terminale)

LOCALE considera solo specifiche REGIONI simili tra alcune parti delle sequenze in analisi (solo regioni a ↑ densità di

similarità generando più sub-allineamenti)

Global alignment

LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK

||. | | | .| .| || || | ||

TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG

Local alignment

LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK

||||||||.||||

TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHK

ALLINEAMENTI DI SEQUENZA

• Per confrontare delle sequenze queste devono essere allineate

• ALLINEAMENTO: procedura per confrontare 2 o più sequenze residuo per

residuo in modo da massimizzare la similarità tra esse e ridurre il numero

di operazioni da effettuare per convertirle l’una nell’altra. E’ volto a stabilire

una relazione biunivoca tra le coppie di residui delle sequenze considerate.

• L’allineamento di sequenze è strumento indispensabile per:

- CONFRONTO tra due sequenze;

- RICERCA DI SEQ SIMILI a una in esame NELLE BANCHE DATI;

- Determinazione di PATTERN e DOMINI CONSERVATI;

- PREDIZIONE DI STRUTTURA 3D;

- Stimare L’APPARTENENZA a UN CERTO FOLD;

- COSTRUIRE UN ALBERO FILOGENETICO:

- PREDIZIONE DI STRUTTURA SECONDARIA

ALLINEAMENTO DI SEQUENZA

• PER ESEGUIRE UN ALLINEAMENTO DI SEQUENZA

SONO NECESSARI ESSENZIALMENTE 3 STRUMENTI:

- Avere a disposizione una MATRICE DI SOSTITUZIONE. La matrice

definisce la il GRADO di SIMILARITA’ tra amminoacidi;

- Avere a disposizione un ALGORITMO DI ALLINEAMENTO cercando

di massimizzare il punteggio dato dalla matrice e valutando quanti gap

(interruzioni) inserire;

- Avere a disposizione per evitare allineamenti senza senso una

PENALITA’ per l’introduzione dei GAP.

LLTTVRNN LLTTVRNN

LLVRNN LL--VRNN

I GAP riflettono

inserzioni/delezioni avvenute

durante l’evoluzione

Similarità e distanza

Esistono due modi per misurare il grado di omologia tra

due sequenze:

1. Calcolare la similarità contando i match

2. Calcolare la distanza contando mismatch e indels

Similarità elevata ↔ bassa distanza

Due sequenze identiche hanno una distanza pari a zero

Matrici di sostituzione

• Le matrici di sostituzione tengono conto dei criteri di similarità tra aminoacidi

• Comprendono 210 valori: • 20 (sulla diagonale) relativi al punteggio dell’appaiamento di

ciascun aminoacido con se stesso• 190 relativi a tutte le possibili sostituzioni aminoacidiche

• I 190 valori sono riportati anche nella loro parte speculare in modo che queste matrici hanno un formato 20 x 20 valori

• Le matrici di sostituzione più semplici considerano solo il criterio di identità e sono costituite da valori 0 o 1

• Altre matrici considerano la similarità chimica tra gli aminoacidi o il numero minimo di mutazioni per passare da un codon all’altro e attribuiscono un punteggio alle diverse sostituzioni

Similarità chimico-fisicaGli aminoacidi possono essere raggruppati in base alle caratteristiche fisico-chimiche delle loro

catene laterali. Su questa base un aminoacido può essere definito simile ad un altro

R K

basici

R K H D E

carichi

I V F L

idrofobici

R K N Q

polari

G A

poco ingombro

sterico

BLOSUM62 Amino Acid Log-odd Substitution

Matrix

Possiamo Valutare un

Allineamento

• Match = +2

• Mismatch = -1

• Gap = -2

G A T T C C G T

| | | | |

G A A T - C C T

+2 +2 -1 +2 -2 +2 -1 +2

=6 punti

- metodi di confronto per distanza.

-metodi filogenetici

L’albero filogenetico descrive la variabilità

riscontrata tra le popolazioni e le relazioni evolutive

tra di esse.

Terminologia

• Node/nodo: un punto di

ramificazione su un

albero filogenetico

Alberi filogenetici

E. coli

Arabidopsis

Riso

Danio

Uomo

Topo

Ratto

Ramo

• Taxon: Un livello di classificazione, una

specie, un genere, una famiglia. Usato

nella filogenesi molecolare anche per

descrivere un OTU.

• OTU (Operational Taxonomic Unit), una

“foglia” di un albero filogenetico, può

essere una specie oppure una

sequenzaE. coli

Arabidopsis

Riso

Danio

Uomo

Topo

Ratto

Ramo

Nodo

Taxon/OTU

Taxon

• Clade/Gruppo : un gruppo che contiene tutti gli OTU che sono discesi da un nodo.

E. coli

Arabidopsis

Riso

Danio

Uomo

Topo

Ratto

Nodo Ancestrale

Clade/Gruppo

monofiletico

Cladogrammi Cladogrammimostrano l‟ordine delle ramificazioni, lunghezze dei rami non significano

niente

E. coli

Arabidopsis

Riso

Danio

Uomo

Topo

Ratto

E. coli

Arabidopsis

Riso

Danio

Uomo

Topo Ratto

Filogrammile lunghezze dei rami indicano il

grado di divergenzaE. coli

Arabidopsis

Riso

Danio

Uomo

Topo Ratto

Filogrammi

Alberi senza radice o unrooted:

Alberi qualitativi

Descrivono semplicemente le

relazioni evolutive fra le OTU

Alberi filogenetici

Alberi basati sullo stato dei caratteri

- Massima Parsimonia

Alberi basati sulla misura delle distanze

- UPGMA

- Massima Verosimiglianza

- Neighbor - Joining

Alberi filogenetici

Metodi basati sulla Misura delle distanze

-UPGMA (albero con radice applicabile solo se rispettato

l’orologio molecolare)

UPGMA è un sistema di clustering basato su “Unweighted Pair Group Method

using aritmetic Average”. Raggruppa successivamente le sequenze o gli aplotipi a

partire dai più simili ed aggiungendo via via un nodo all’albero. Le distanze tra

due taxa, tra un nodo e un taxon, o tra due nodi (ovvero le lunghezze dei bracci)

sono dati dalla media aritmetica delle distanze.

- » Lunghezza dei rami proporzionale ai tempi di divergenza

- la velocità dell’evoluzione lungo tutti i rami è la stessa

Alberi filogenetici

UPGMA

A B C D E F G

A -

B 63 -

C 94 79 -

D 111 96 47 -

E 67 16 83 100 -

F 23 58 89 106 62 -

G 107 92 43 20 96 102 -

UPGMA

A B C D E F G

A -

B 63 -

C 94 79 -

D 111 96 47 -

E 67 16 83 100 -

F 23 58 89 106 62 -

G 107 92 43 20 96 102 -

GD

A B C E F DG

A -

B 63 -

C 94 79 -

E 67 16 83 -

F 23 58 89 62 -

DG 94 84 35 88 94 -

UPGMA

GD C

A B E F CDG

A -

B 63 -

E 67 16 -

F 23 58 62 -

CDG 61 64 61 74 -

UPGMA

GD C A F

UPGMA

AF B E CDG

AF -

B 98 -

E 106 16 -

CDG 112 64 61 -

B EGD C A F

UPGMA

AF BE CDG

AF -

BE 188 -

CDG 112 108 -

B E GD C A F

Root

B EGD C A F

A B C D E B 2C 4 4D 6 6 6E 6 6 6 4F 8 8 8 8 8

A B C D E B 2C 4 4D 6 6 6E 6 6 6 4F 8 8 8 8 8

dist(A,B),C = (distAC + distBC) / 2 = 4

dist(A,B),D = (distAD + distBD) / 2 = 6

dist(A,B),E = (distAE + distBE) / 2 = 6

dist(A,B),F = (distAF + distBF) / 2 = 8

Clusteriziamo le 2 seq più vicine, generiamo una nuova matrice dove queste seq. vengono considerate come un cluster unico.

A,B C D EC 4D 6 6E 6 6 4F 8 8 8 8

dist(D,E),C = (distDC + distEC) / 2 = 6

dist(D,E),F = (distDF + distEF) / 2 = 8

Dist(D,E)(A,B)= (distD(AB) + distE(AB)) / 2 = 6

AB C DEC 4DE 6 6F 8 8 8

dist(ABC),F = (dist(AB)F + distCF) / 2 = 8

dist(ABC),(DE) = (dist(AB)(DE) + distC(DE)) / 2 = 6

AB,C DEDE 6F 8 8

dist(ABC,DE)F = (dist(ABC)(F) + dist(DE)(F)) / 2 = 8

ABC,DEF 8

A B C D E B 2C 4 4D 6 6 6E 6 6 6 4F 8 8 8 8 8

-Neighbor Joining (albero senza radice quando

non è rispettato l’orologio molecolare)

Il sistema usato da neighbour-joining per trovare i

neighbour si basa sulla valutazione della distanza

tra due foglie sottraendo la distanza media di

ciascuna di queste rispetto a tutte le altre foglie. In

altre parole, neighbor-joining non considera

semplicemente la distanza tra le coppie per

costruire l’albero ma valuta la distanza rispetto a

tutti gli altri punti

- » Differente velocità nei diversi rami

si basa sul principio della minima evoluzione

Maximum Parsimony

Identifica l‟albero che richiede il minimo numero dicambiamenti evolutivi per spiegare le differenzeosservate tra le sequenze

Spesso non si può identificare un unico albero

per grandi set di dati una ricerca esaustiva non èpossibile

Metodi Deterministici

Massima Parsimonia

Sito

Sequenza1234

Sito 2

Sito 3

Sito 5

Sito7

Sito 9

Non utilizzano le distanze

Vengono costruiti più alberi, si

sceglie quello che richiede il mino

numero di sostituzioni

Maximum Parsimony (MP)

I

II

III

b

A

cA

dT

outgroupT

b

A

cA

dT

outgroupT

b

AcA

dT

outgroupT

T A/

TA/

T A/

TA/

T A/

TA/

outgroup

a

b

c

A

A

A A AA

A A

C

C

C

C C

G G G

G G G

G G G

G G G

T TT

T TT

T

outgroup

a

b

c

A AA

A

ACG G G

ACG G G

ACG G G

ACG G G

T TT

T TT

TC

- Valuta tutti I possibili alberi per ogni colonna

verticale dei caratteri delle sequenze (nucleotide

position)

- Vengono considerati solo i siti informativi

- ad ogni albero è assegnato un punteggio basato

sul numero dei cambiamenti evolutivi

- gli alberi che producono il minor numero di

cambiamenti (shortest trees) per tutte le posizioni

sono presi in considerazione

Maximum Likelihood (ML)

I

II

III

b

A

cA

dT

outgroupT

b

A

cA

dT

outgroupT

b

AcA

dT

outgroupT

T A/

TA/

T A/

TA/

T A/

TA/

outgroup

a

b

c

A

A

A A AA

A A

C

C

C

C C

G G G

G G G

G G G

G G G

T TT

T TT

T

outgroup

a

b

c

A AA

A

ACG G G

ACG G G

ACG G G

ACG G G

T TT

T TT

TC

- utilizza un calcolo delle probabilità basato su un

modello specifico di evoluzione delle sequenze

per trovare il miglior albero (minor numero di

mutazioni)

- sono considerati tutti gli alberi per ogni

nucleotide

- simile al MP, ma utilizza un modello evolutivo

- il metodo è adatto ad analizzare le relazioni tra

diversi taxa

Perche’ ?

– Per ricostruire la storia evolutiva delle

specie o delle popolazioni in esame

– Tempo di divergenza fra 2 specie = tempo

impiegato nel processo di speciazione ovvero

dell’isolamento riproduttivo

Alberi filogenetici

I dati per la costruzione degli alberi

filogenetici: un solo gene puo essere sufficiente?

Quasi mai

Soluzione:

– Analizzare piu’ di un gene

– Effettuare una stima della significatività

statistica degli alberi ottenuti

Alberi filogenetici

Alberi ottimali multipli• Parsimonia può generare piu di un

albero più parsimonioso

• Possiamo poi selezionare il

“migliore” con criteri addizionali

• Tipicamente relazioni comuni fra

tutti gli alberi ottimali vengono

riassunte in un albero consensus

Assegnare la significatività di un albero filogenetico

(robustezza dell’albero)

Si utilizza il metodo Bootstrap.

attraverso sottocampionamenti casuali dei dati

I valori in corrispondenza dei nodi rappresentano il

numero di volte che un dato raggruppamento è stato

ottenuto nei set campionati a partire dai dati originari.

Si usano di solito campionature da 100 a 1000 set.

bootstrap

+---------HUMAN

+100.0

! ! +----RHESUS

! +100.0

+-91.0 +----G MONKEY

! !

! ! +----COW

! ! +100.0

! +-40.0 +----SHEEP

+100.0 !

! ! +---------CAT

! !

! ! +----MOUSE

+-43.0 ! +100.0

! ! +------69.0 +----RAT

! ! !

+-66.0 ! +---------HAMSTER

! ! !

! ! +------------------------CHICKEN

! !

! +-----------------------------XENOPUS

!

+----------------------------------TROUT

Networks :

representation of character-state evolution amongst ancestors and descendants that have complex relationships due to non-dichotomous historical events

Network

Metodi per l’analisi di dati molecolari intraspecifici, che nonassumono uno schema evolutivo gerarchico strettamente dicotomico.

Permettono l’inclusione nell’albero e la rappresentazione grafica di processi quali la ricombinazione, il flusso

genico, le mutazioni ricorrenti

Formazione di reticolazioni

Maggior quantità di informazione

ALBERO FILOGENETICO NETWORK

ESEMPIO L1c RETICOLAZIONE

MEDIAN VECTORS