Кому нужны трансгенныеживотные (GM) и почему их нужно изучать

Евгений Леонидович ЗавьяловЕжегодный научно-практический семинар

ООО «ФАРМБИОЛАЙН»

Новосибирск19 сентября 2019 г

ЦКП «SPF-виварий»ФИЦ ИЦиГ СО РАН

450 инбредных линий мышей!

Зачем создавать трансгенных животных?

- Модели патологий в биомедицинских исследованиях;

- Модели для изучения функций специфических генов на уровне всего организма. Более 95

процентов используемых моделей - генетически модифицированные грызуны;

- Создание и тестирование новых лекарственных средств, в том числе, получение человеческих

антител для использования в качестве терапевтических средств. Каждые два из трех препаратов

моноклональных антител, одобренных FDA были получены от трансгенных мышей;

- Получение большого количества сложных человеческих белков для лечения заболеваний

человека. Имеющиеся технологии производства таких белков в реакторах на основе клеток млекопитающих

является очень дорогостоящим - производственного комплекса для одного терапевтического белка оценивается в

500 миллионов долларов США!!!

- Источник органов для трансплантации…

0

5000

10000

15000

20000

25000

3000020

01

200

2

200

3

200

4

200

5

200

6

200

7

200

8

200

9

201

0

201

1

201

2

201

3

201

4

201

5

201

6

201

7

201

8

Количество публикаций в Pub Med – 337551

Ключевое слово: transgenic mice

Трансгенные мыши несут

зеленый флуоресцентный белок,

который светится зеленым при

голубом свете.

Ingrid Moen et al., BMC

Cancer, 12/21 (2012), 1-10.

Трансге́нный органи́зм — живой организм, в геном

которого искусственно введен ген, который не может быть приобретен при естественном скрещивании.

wikipedia.org

Генетически

модифицированные

организмы (GM)Knock-out

Дата Событие люди место

1891 г. Первый успешный перенос эмбрионов на ангорских кроликах Walter Hip

1963 г. Разработка принципов культивирования яйцеклеток in vitro Ральф Бринстера Пенсильванский университет

1966 г. Представлена методика микроинъеций оплодотворенные яйцеклеток

мышей, что открыло возможность введения чужеродную ДНК

Те Пинг Лин Калифорнийская медицинская школа

1974 г. Первая публикация о введении чужеродной ДНК мышам Jaenisch, Mintz Salk Institute, Fox Chase Institute for Cancer Research

1980 г. Сообщение о первом успешном развитии трансгенных мышей Barbosa, Gordon, Plotkin,

Ruddle, Scangos

Yale University

1980 г. Опубликована методика использования микрокапилляров из стекла

для инъекций ДНК в ядра культивируемых клеток млекопитающих

Capecchi University of Utah

1992 г. Первая модель трансгенной мыши, созданная для изучения связи

между метилированием ДНК и болезнями человека

Li, Bestor, Jaenisch Whitehead Institute for Biomedical Research

1994 г. Первые линии трансгенных мышей, полученные для продуцирования

человеческих моноклональных антител

Bruggemann, S.Green,

Lonsberg, Neuberger

Cell Genesys, GenPharm, Laboratory o Molecalar Biology

1996 г. Овечка Долли - первое клонированное млекопитающее Wilmut, Campbell Roslin Institute

2006 г. Впервые одобрен препарат на основе полностью человеческих

моноклональных антителAgensys, Amgen

2007 г. Нобелевская премия по физиологии в медицине за открытия

принципов проведения специфических генетический модификаций у

мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток

Capecchi, Evans, Smithies

2013 г. Опубликован революционный метод CRISPR-Cas9 редактирования,

открывший принципиально новые возможности в редактировании

геномов высших организмов

Cong, Ran, Cox, Lin,

Barretto, Habib, Hsu, Wu,

Jiang, Marraffini, Zhang

Science. 2013; 339 (6121): 819–823.

2019 г. Применение CRISPR-Cas9 технологии для генетического контроля у

мышей

University of California San Diego

GM животные: график ключевых событий

Технология получения трансгенных мышей

Микроинъекция ДНК

в оплодотворенную яйцеклетку

Яйцеклетка

Имплантация эмбриона

суррогатной матери

Пронуклеус

Рождение

трансгенных

мышат

Эмбрионалные

стволовые клетки

Химеризация

Трансгенное

животное

F1

F2Имплантация эмбриона

суррогатной матери

Введение ДНК

и генетическая

модификация

клеток

Введение

модифицированных

клеток в бластоцисту

Химера Дикий тип

Дикий тип Гетерозигота Гетерозигота

Микроинъекция

ДНК

ПЦР

диагностика

наличия трансгена

у родившихся

мышат

Изучение наследования трансгена в череде поколений, экспрессии рекомбинантного белка и его биологической активности, сохранение биологических свойств

рекомбинантного белка в сравнении с природным аналогом, соответствие уровня его продукции биотехнологическим задачам; и т.д.

Последствия IVF (ЭКО) на здоровье потомков

> 7 млн. IVF детей рождено

> 2 % новорожденных в EC и USA

1978

2015

Применение IVF (ЭКО) процедур в мире

Ожирение и IVF

“Low birth weight increases risk of metabolic disorder”(Ramírez-Vélez R, 2012)

Birth weight

730

740

750

760

770

780

Control IVF

0

5

10

15

20

25

Control IVF

16th day embryo 14-16 weeks offspring

Fat, %

body

mass

Body m

ass, m

g

p<0.05p<0.001

2015

KLH

Контроль

Эпигенетическое программирование

Спаривание

Критические этапы формирования и развития плода

Имплантация

Развитие эмбриона

650

700

750

800

850

900

NM Control Imm Control Imm

Масса эмбриона на 16 сутки, мг

Контроль

KLH

KLH

Контроль СперматозоидыKLHЕстественное

покрытие Вазэктомированный самецKLH

Пок

рыт

ие

сам

цом

Контроль

In vitro fertilization

(IVF)

Вазэктомированный

самец

Контроль

KLH (иммунизация)

Контроль

Масса эмбриона, мгA

AA

B

BB

B

C

Масса плаценты, мг

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

Control SVO SVZ IVF

720

740

760

780

800

820

840

860

880

Control SVO SVZ IVF

Репродуктивные эффекты дефицита фактора некроза

опухоли (TNF-) у мышейФа́ктор некро́за о́пухоли (ФНО, фактор некроза опухоли-альфа, кахексин, кахектин, англ. tumor necrosis factor, TNF) — внеклеточный белок,

многофункциональный провоспалительный цитокин. Влияет на липидный метаболизм, коагуляцию, устойчивость к инсулину, функционирование эндотелия,

стимулирует продукцию ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, интерферона-гамма, активирует лейкоциты, один из важных факторов защиты от внутриклеточных паразитов и вирусов.

Избыточная продукция ФНО вызывает расстройства гемодинамики (снижает сократимость миокарда, минутный объем крови, диффузно увеличивает проницаемость

капилляров), цитотоксический эффект на клетки организма. Нарушения регуляции ФНО у человека ассоциированы с различными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера, рак, клиническая депрессия, псориаз и воспалительные заболевания кишечника (болезнь Крона, язвенный колит) Википедия

До

Эм

бр

ио

на

ль

ны

е п

оте

ри

, %

После

имплантационные

Всего

Ген Функция Заболевание Мутация

1. Cntn5Контактин 5

Влияет на взаимодействие клеток при нейрогенезе

Аутизм,Нейродегенерация, Болезнь Гиршпрунга

Нокин

2. Cntn6 Формирование аксональных связей

Аутизм,Нейродегенерация, Гиперактивность, Слабоумие, Шизофрения, Биполярные расстройства и др.

Делеция

3. Cntn6 Дупликация

4. Cntn6 Инверсия

5. C-kit Цитокиновый рецепторглиальных клеток

Биполярные расстройства

Делеция

6. Panx1раннексин-1

Panx1 – компонент межклеточных щелевых контактов, широко представлен в ЦНС

Воспаление и отек мозга, гибель нейронов

Нокаут

7. Panx1 Нокин

8. Epb41L4aмембранный белок

Ген экспрессирован в клетках мозга

Нейробиологические эффекты неизвестны

Делеция

9. C-kit/kdr Оба гена – рецепторы тирозинкиназы, тип III

Слабоумие 3D мутации путем делециимежгенногоучастка ДНК

10. Unc5b/Slc29a3 UNC5B – рецептор нитрина; Slc29a3 – транспортернуклеозидов

Слабоумие

Фенотипирование мышей с целевыми мутациями, полученными в ИЦиГ СО РАН

3D мутации – новая область для анализа генетических ассоциаций с нейропатологиями

На мышах с контролируемой генетической и эпигенетической изменчивостью исследовать вклад наследственных и средовых факторов в индивидуальные вариации коннектома и глимфатической системы, а также оценить значение этих вариаций в формировании нейропатологий

Нейроимиджинг

Коннектом

Глимфатические потоки

Поведенческие тесты

http://www.findmice.org/

The International Mouse Phenotyping Consortium

The European Mouse Mutant Archive

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

20

01

20

02

20

03

20

04

20

05

20

06

20

07

20

08

20

09

20

10

20

11

20

12

20

13

20

14

20

15

20

16

20

17

20

18

Количество публикаций в Pub Med – 26346

Ключевое слово: Phenotyping mice

Мировые ресурсы лабораторной мыши и фенотипирование

Спасибо за внимание!