FF ĐẠI HỌC HUẾ Trần Thị Ái Luyến NGHIÊN CỨU THU NHẬN, …hueuni.edu.vn/sdh/attachments/article/1307/NOIDUNGLA.pdf · 2019-11-18 · FF ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG

FF ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

Trần Thị Ái Luyến

NGHIÊN CỨU THU NHẬN, KHẢO SÁT CẤU TRÚC VÀ TÍNH

CHẤT CỦA EXOPOLYSACCHARIDE SINH TỔNG HỢP TỪ

Lactobacillus fermentum

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HUẾ - NĂM 2019

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC


NGHIÊN CỨU THU NHẬN, KHẢO SÁT CẤU TRÚC VÀ TÍNH

CHẤT CỦA EXOPOLYSACCHARIDE SINH TỔNG HỢP TỪ

Lactobacillus fermentum

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 9440114

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. Đỗ Thị Bích Thủy

HUẾ - NĂM 2019

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa

học độc lập của riêng tôi. Các số liệu sử dụng phân tích

trong luận án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo

đúng quy định. Các kết quả nghiên cứu trong luận án do

tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách

quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam. Các kết

quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu

nào khác.

Nghiên cứu sinh


ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tiếng anh hoặc tên khoa học Tiếng việt

BMM basal minimum medium Môi trường tối ưu cơ bản

C Carbon Cacbon

CFU/mL colony-forming unit/Ml số lượng tế bào/mL

COSY Correlated Spectroscopy

DMSO Dimethyl sulfoxide

DPPH 1, 1-diphenyl-2-

picrylhydrazyl

EPS Exopolysaccharide

EPS-TC13 Exopolysaccharide sinh tổng hợp

từ Lb. fermentum TC13





EPS-MC3 Exopolysaccharide sinh tổng hợp

từ Lb. fermentum MC3

EtOH Ethanol Cồn etylic

FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và Dược

phẩm Hoa Kỳ

Fruc Fructose

FTF fructosyltransferase

HePS heteropolysaccharide Polysaccharide phức tạp

HMBC Heteronuclear multiple - Bond

Correlation

HoPS homopolysaccharide Polysaccharide thuần

HPLC High-performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HSQC Heteronuclear Spectroscopy-

Quantum Coherence

Gal galactose

GalNAc N-acetyl-D-galactosamine

GalT galactose 1-phosphate-

uridyltransferase

GC-MS Gas Chromatrography Mass

Spectometry

Sắc ký khí ghép khối phổ

GDP guanosine diphosphate

Glc glucose

Glc-1-P glucose-6-phosphate

Glc-6-P glucose-1-phosphate

GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine

iii

GlcA glucuronic acid

GRAS Generally Recognized As Safe Vi sinh vật an toàn

GTF glycosyltransferase

La. Lactococcus

LAB Lactic Acid bacteria Vi khuẩn lactic

Lac Lactose

Lb. Lactobacillus

Leu. Leuconostoc

Man-6-P Mannose-6-Phosphate

Man-1-P Mannose-1-Phosphate

MeOH Methanol

MRS Man Rogosa Sharpe

MTTH Môi trường thích hợp

N Nitrogen Nitơ

NDP diphosphate nucleoside

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

NOESY Nuclear Overhauser Effect

Spectroscopy

P. Pediococcus

PEP-PTS phosphoenolpyruvate-

phosphotransferase

PGM phosphoglucomutase

PMM phosphomannomutase

PS Polysaccharide

Rha Rhamnose

S. Streptococcus

Suc Sucrose

TCA trichloroacetic acid

TDP tyrosine diphosphate

TFA Trifluoroacetic acid

TGP TDP-glucose

pyrophosphorylase

TMS Tetramethylsilan

UDP Uridine diphosphate

WPC whey protein concentration

iv

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................................... i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................... ii

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ......................................................................................... vi

DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................................... vii

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIÊU ........................................................................... 3

1.1. Tổng quan về polysaccharide ........................................................................... 3

1.1.1. Giới thiệu chung về polysaccharide .......................................................... 3

1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide ................................................................... 4

1.2. Tổng quan về Lactobacillus fermentum ........................................................... 5

1.3. Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic ........................................ 6

1.3.1. Khái niệm .................................................................................................. 6

1.3.2. Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa .......................................... 6

1.3.3. Tính chất chức năng và ứng dụng ........................................................... 14

1.4. Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB .................................... 20

1.4.1. Về điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS ....................................................... 20

1.4.2. Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS .................................................. 23

1.4.3. Về đặc tính hóa lý: khối lượng phân tử, thành phần, liên kết và cấu trúc ..

........................................................................................................................... 24

1.4.4. Về tính chất công nghệ và các tác dụng về sức khỏe ................................ 34

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 37

3.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 37

3.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ ....................................................................... 37

2.2.1. Hóa chất ................................................................................................... 37

2.2.2. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................. 37

3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 38

2.3.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật

độ quang (OD)................................................................................................... 38

2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối [6] ........................................ 38

2.3.3. Phương pháp thu nhận và tách EPS ........................................................ 39

2.3.4. Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận

EPS từ một số chủng Lb. fermentum ................................................................ 40

2.3.5. Xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol-sulfuric [37] ........ 43

2.3.6. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [5] ........ 44

v

2.3.7. Phương pháp khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công

nghệ thực phẩm ................................................................................................. 45

2.3.8. Phương pháp xác định khối lượng phân tử và đặc điểm cấu trúc của EPS

........................................................................................................................... 47

2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 50

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ......................................... 52

3.1. Kết quả nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb.

fermentum .............................................................................................................. 52

3.1.1. Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb. fermentum sinh tổng hợp EPS cao .

........................................................................................................................... 52

3.1.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình sinh

tổng hợp EPS từ các chủng Lb. fermentum tuyển chọn ................................... 54

3.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp EPS của

các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 ........................................ 66

3.1.4. Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men ............................ 82

3.2.1. Khả năng hòa tan trong nước .................................................................. 89

3.2.2. Khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu .................................................. 91

3.2.3. Khả năng chống oxy hóa ......................................................................... 95

3.3. Kết quả phân tích khối lượng phân tử và một số đặc điểm về cấu trúc của các

EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 ........................................................... 99

3.3.1. Khối lượng phân tử ................................................................................. 99

3.3.2. Đặc điểm về cấu trúc của EPS-MC3 ..................................................... 103

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 128

1. Kết luận ........................................................................................................... 128

2. Kiến nghị ......................................................................................................... 130

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ

................................................................................................................................................. 131

TÀI LIÊU THAM KHẢO ................................................................................................. 133

PHỤ LỤC

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Tổng quan về một số điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận EPS cao từ các

loài Lactobacillus đã được công bố .......................................................................... 22

Bảng 1.2. Thông tin về cấu trúc và các phương pháp NMR tương ứng ................... 27

Bảng 1.3. Tổng quan các nghiên cứu về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã

được công bố ............................................................................................................. 29

Bảng 1.4. Tổng quan các nghiên cứu liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp

từ LAB đã được công bố ........................................................................................... 35

Bảng 2.1. Chương trình nhiệt độ phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký GC-MS .......... 50

Bảng 3.1. Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb. fermentum nghiên cứu trong

luận án ....................................................................................................................... 81

Bảng 3.2. Các điều kiện tách EPS từ dịch nuôi cấy thích hợp của các chủng Lb.

fermentum trong luận án ............................................................................................ 89

Bảng 3.3. Độ hòa tan trong nước của EPS từ các chủng Lb. fermentum ................. 90

Bảng 3.4. Khả năng giữ nước của các EPS từ các chủng Lb. fermentum ................ 92

Bảng 3.5. Khả năng giữ dầu của EPS từ các chủng Lb. fermentum ......................... 93

Bảng 3.6. Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) của các EPS thu được từ các chủng Lb.

fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) .................................................................... 96

Bảng 3.7. Các dẫn xuất monosaccharide thu được từ EPS sinh tổng hợp bởi Lb.

fermentum MC3 ...................................................................................................... 103

Bảng 3.8. Tỷ lệ, thành phần (%) các monosaccharide trong cấu trúc EPS sinh tổng

hợp bởi Lb. fermentum MC3 ................................................................................... 103

Bảng 3.9. Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide thu được và liên kết

glycoside tương ứng của EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3................... 110

Bảng 3.10. Độ chuyển dịch hóa học 1H –NMR và 13C – NMR của EPS-MC3 đo trong

DMSO ..................................................................................................................... 118

Bảng 3.11. Các dạng liên kết trong cấu trúc của EPS-MC3 qua phổ NOESY, HMBC

................................................................................................................................. 119

Bảng 3.12. Đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ chi Lactobacillus đã

công bố và của EPS-MC3 của luận án .................................................................... 123

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose

(b) của fructose ............................................................................................................ 3

Hình 1.2. Hình dạng khuẩn lạc Lb. fermentum .......................................................... 5

Hình 1.3. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS .............. 7

Hình 1.4. Mô hình về quá trình sinh tổng hợp glucan và fructan .............................. 7

Hình 1.5. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của HoPS sinh tổng hợp từ LAB ..... 9

Hình 1.6. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS ............ 10

Hình 1.7. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp HePS trong tế bào LAB ........................... 11

Hình 1.8. Cấu tạo của UDP-glucose và TDP-glucose, TDP-rhamnose và UDP-

glactose ...................................................................................................................... 12

Hình 1.9. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của các HePS sinh tổng hợp từ LAB

................................................................................................................................... 14

Hình 1.10. Sơ đồ biểu diễn các tính chất tăng cường sức khỏe của EPS từ LAB .... 15

Hình 2.1. Sơ đồ nuôi cấy thu nhận sinh khối ........................................................... 38

Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận và tách EPS ..................................................................... 39

Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu khảo sát cải thiện hiệu suất thu nhận EPS ................... 40

Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu một số tính chất có tiềm năng ứng dụng

trong công nghệ thực phẩm ....................................................................................... 45

Hình 2.5. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC-MS để xác định liên kết glycoside

................................................................................................................................... 48

Hình 2.6. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC – MS ........................................ 49

Hình 3-1. Khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng vi khuẩn lactic .............. 53

Hình 3.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ bổ sung của chúng vào môi

trường MRS đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum ................. 55

Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn N và nồng độ bổ sung của chúng vào MTTH đến

khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum ............................................. 61

Hình 3.4. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp

EPS bởi các chủng Lb. fermentum ............................................................................ 66

Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng

Lb. fermentum ........................................................................................................... 69

Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các

chủng Lb. fermentum ................................................................................................. 72

viii

Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các

chủng Lb. fermentum ................................................................................................. 77

Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và

lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC13 ............................................. 83






lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum MC3 .............................................. 84

Hình 3.12. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS

................................................................................................................................... 87

Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS ....... 88

Hình 3.14. Sắc kí đồ khối lượng phân tử của EPS-MC3 bằng phương pháp sắc ký

thẩm thấu gel ........................................................................................................... 100

Hình 3.15. Sơ đồ xử lý mẫu cho phân tích NMR ................................................... 111

Hình 3.16. Phổ 1H-NMR của EPS-MC3 ............................................................... 112

Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của EPS-MC3 .............................................................. 113

Hình 3.18. Phổ HSQC (a, b, c) của EPS-MC3 ....................................................... 116

Hình 3.19. Phổ đồ COSY của EPS-MC3 ............................................................... 117

Hình 3020. Phổ đồ HMBC của EPS-MC3 ............................................................. 118

Hình 3.21. Phổ đồ NOESY của EPS-MC3 ............................................................ 119

Hình 3.22. Các đơn vị lặp lại trong cấu trúc của EPS-MC3 đã được thủy phân một

phần ......................................................................................................................... 120

1

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, khuynh hướng ứng dụng polymer tự nhiên trong

nhiều lĩnh vực tăng lên đã dẫn đến sự phát triển nghiên cứu thu nhận

exopolysaccharide (EPS) từ vi khuẩn. Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các

polysaccharide (PS) ngoại bào và tiết chúng ra bên ngoài môi trường [115]. Các PS

tách chiết được có sự đa dạng về cấu trúc và các tính chất chức năng. Chính vì vậy,

nguồn EPS này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm cũng

như mỹ phẩm. Chúng là những tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel,

... Hơn nữa, gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS như khả

năng chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic cũng

được nghiên cứu phổ biến [88], [125], [139] …

Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng trong công nghiệp và trong y học

nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp. Đây

là lý do chính khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ

vi khuẩn lactic (LAB-Lactic acid bacteria) nói riêng còn khá hạn chế. Từ khi LAB

được "công nhận là vi sinh vật an toàn” (GRAS-Generally Recognized As Safe), việc

cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích để

sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng trong thực phẩm [59]. Nhiều chủng

LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS – với những tác động liên quan đến việc

cải thiện cấu trúc của các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat,... Bên cạnh đó,

nhờ những đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng như sự an toàn đối với sức khỏe con

người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic (LAB) được quan tâm nhiều hơn so

với EPS từ các loài khác.

Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng, thành phần monosaccharide, vị trí liên kết

trong cấu trúc và những tính chất có tiềm năng ứng dụng của các EPS sinh tổng hợp

bởi các chủng thuộc LAB khác nhau phụ thuộc vào loại chủng, điều kiện nuôi cấy và

thành phần môi trường [74], [102], [104], [126],….

Như vậy, sự đa dạng trong cấu trúc của các loài vi khuẩn khác nhau có thể liên

quan đến nguồn phân lập vi khuẩn, thành phần các chất dinh dưỡng trong quá trình

2

lên men cũng như điều kiện nuôi cấy và thu nhận. Sự đa dạng này sẽ tạo nên những

ảnh hưởng không nhỏ đến các hoạt tính sinh học cũng như những tính chất chức năng

trong công nghệ thực phẩm. Chính vì vậy, để nâng cao hiệu quả thu nhận EPS và đặc

biệt là cung cấp một số thông tin chi tiết hơn về các đặc tính cấu trúc của các EPS

sinh tổng hợp từ một trong các chủng LAB nói chung và một số chủng Lactobacillus

fermentum nói riêng, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận, khảo sát

cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus

fermentum”.

Với đề tài trong luận án này, chúng tôi sẽ xác định được:

1) Điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum hiệu quả nhất;

2) Một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm;

3) Một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một

số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu.

Với những đặc tính mới được phát hiện, chúng có thể là tiền đề cho các nghiên

cứu ứng dụng trong y dược, trong thực phẩm thay thế cho các hợp chất được tổng

hợp hóa học.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIÊU

1.1. Tổng quan về polysaccharide

1.1.1. Giới thiệu chung về polysaccharide

Polysaccharide (PS) là polyme thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate và thường

được coi là các polyme sinh học đa năng với các chức năng được biết đến như là

nguồn năng lượng dự trữ (tinh bột, glycogen); tạo nên cấu trúc vững chắc cho thực

vật hoặc động vật (cellulose, chitin); chất bảo vệ (exopolysaccharide của vi sinh

vật),... [29].

Trong chuỗi PS, các monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết glycoside.

Sự khác nhau giữa các PS thường liên quan đến các monosaccharide cấu tạo nên

chúng. Các PS chỉ chứa một loại monosaccharide được gọi là homopolysaccharide

hoặc homoglycan. Các PS chứa nhiều hơn một loại monosaccharide được gọi là

heteropolysaccharide hoặc heteroglycan.

Các monosaccharide có cấu trúc dị vòng được cấu tạo bởi các nguyên tử oxy,

hydro, carbon. Sự phân loại các monosaccharide dựa vào số lượng nguyên tử carbon

dạng vòng 7, 6, 5 cạnh hoặc dạng mạch hở. Các PS thường được tạo nên bởi các đơn

vị lặp lại, bao gồm một hoặc nhiều monosaccharide và phổ biến nhất trong tự nhiên

thường có cấu trúc vòng 6 cạnh (pyranose). Các monosaccharide này có cấu trúc dạng

α và β. Trong đó, dạng β-D-glucopyranose là phổ biến nhất. β-D-glucopyranose có

thể chuyển đổi lẫn nhau tạo nên dạng cấu hình ghế (Hình 1.1a). Ngoài ra, vòng 5 cạnh

(furanose) cũng được coi là thành phần có vai trò quan trọng về mặt sinh học (Hình

1.1b) do chúng có mặt trong acid nucleic và một số PS từ vi sinh vật.

(b) (a)

a) b)

Hình 1.1. Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose

(b) của fructose [29]

4

Trong những năm gần đây, nhiều loại PS mới có vai trò quan trọng trong y học

và thương mại đã được thu nhận từ quá trình lên men vi sinh vật. Các PS này có thể

được sinh tổng hợp từ các loài vi sinh vật gây bệnh hoặc không gây bệnh. Trong đó,

các PS được tổng hợp từ các loài vi sinh vật không gây bệnh đã được khai thác vì

chúng có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp và trong công nghệ sinh học

với những tính chất độc đáo và mới lạ như tạo gel, khả năng tự phân hủy sinh học,

tính bám dính sinh học,... Một số PS phổ biến đã được thu nhận từ vi sinh vật có thể

kể đến như (i) xanthan, gellan, dextran, alternan, curdlan, exopolysaccharide (EPS)

của vi khuẩn lactic (LAB), levan, alginate (từ vi khuẩn); (ii) pullulan, scleroglucan,

schizophyllan và lentinan (từ nấm); và (iii) BYG (Beer’ yeast glucan) - các glucan

thương mại từ nấm men bia [67].

1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide

Với nguồn nguyên liệu thu nhận phổ biến, chi phí thu nhận thấp đã góp phần

giúp các hợp chất PS có thêm nhiều phạm vi ứng dụng hơn trong sản xuất thực phẩm,

dược phẩm, mỹ phẩm,…

Trong công nghệ thực phẩm: Các PS được sử dụng như những chất phụ gia

được bổ sung vào quá trình chế biến thực phẩm với vai trò giúp hoàn thiện cấu trúc

thực phẩm từ đó làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm: tạo gel, làm tăng độ nhớt,

từ đó tạo nên sự ổn định của nhũ tương hoặc giúp ngăn chặn hiện tượng tách nước

trong một số sản phẩm có bản chất cấu trúc gel đặc biệt là sữa chua [67].

Trong dược phẩm: PS được coi là những vật liệu sinh học phổ biến. Chúng đang

đóng góp vai trò quan trọng cho quá trình phát triển sản phẩm mới trong dược phẩm

và những ứng dụng y tế như các chất kết dính đơn giản hoặc là phương tiện phân phối

thuốc tinh vi [67], [114].

Trong công nghệ sinh học và phòng thí nghiệm: Nhờ các đặc tính tạo màng film,

tạo gel cùng khả năng gắn các ion đã giúp cho các PS được sử dụng như là các công

cụ vô giá trong công nghệ sinh học và trong công tác nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.

Chẳng hạn như, việc sử dụng agar tạo cho các khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển; sử

dụng các PS hòa tan, không hòa tan và dẫn xuất của chúng giúp cố định protein, cố

định enzyme và tế bào động vật hoặc sử dụng như dextran hoặc pullulan làm chất

5

chuẩn trong kỹ thuật phân tách các phân tử bằng phương pháp sắc ký như sắc ký khối

phổ (mass spectrometry (MS)), sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid

chromatography (HPLC)) [67], [114].

Nhìn chung, nhờ vào những tính chất chức năng công nghệ như khả năng tạo

gel, tạo độ nhớt, làm bền nhũ tương cũng như khả năng tự phân giải nên các hợp chất

PS càng ngày càng được quan tâm nghiên cứu khai thác bởi các nhà khoa học trong

nước cũng như trên thế giới [10], [19], [39], [136]. Một trong những nguồn cung cấp

các hợp chất PS đang được quan tâm nhiều nhất là LAB đặc biệt là các PS được chúng

tiết ra ngoài môi trường và được gọi là EPS.

1.2. Tổng quan về Lactobacillus fermentum

Lactobacillus fermentum là một loài vi khuẩn Gram dương thuộc chi

Lactobacillus (Lb.), các vi khuẩn này thường được tìm thấy trong các sản phẩm lên

men từ động vật và thực vật. Chúng là những vi khuẩn ưa ấm, có nhu cầu dinh dưỡng

phức tạp, lên men dị hình chặt chẽ, có thể lên men các đường như glucose (glc),

fructose (fruc), maltose, sucrose, lactose... Trong quá trình sinh trưởng và phát triển,

chúng chịu các tác động không nhỏ bởi các yếu tố vật lý (pH, nhiệt độ, thời gian, …),

các yếu tố hóa học (nguồn carbon (C) nguồn nitrogen (N),…). Lb. fermentum có thể

tạo thành các khuẩn lạc màu trắng xám với đường kính khoảng 1µm. Hình dạng khuẩn

lạc của chủng này có thể lồi lõm hoặc hơi lồi, bề mặt nhẵn (Hình 1.2a). Đặc điểm nổi

bật của khuẩn lạc Lb. fermentum là có cấu trúc vòng tròn đồng tâm ở trung tâm khi

được quan sát dưới kính hiển vi (Hình 1.2b). Hầu hết các tế bào vi khuẩn được sắp

xếp dưới dạng đơn lẻ hoặc theo cặp; chúng không có khả năng sinh bào tử và không

di động [143].

a) b)

Hình 1.2. Hình dạng khuẩn lạc Lb. fermentum [143]

6

Từ lâu, Lb. fermentum đã được sử dụng như là giống khởi đầu cho quá trình lên

men trong nhiều sản phẩm thực phẩm và đồ uống. Bên cạnh đó, cũng giống như các

loài thuộc LAB khác, trong quá trình lên men carbohydrate, ngoài sản phẩm chính là

acid lactic, Lb. fermentum còn tạo ra các hợp chất tạo hương (diacetyl/acetoin) và đặc

biệt là các PS ngoại bào (EPS) [59]. Chúng là những hợp chất có giá trị thương mại

lớn với các tính chất hóa lý có lợi như khả năng tạo gel, tạo kết cấu, tạo độ đặc trong

thực phẩm cùng những tác động có lợi liên quan đến sức khỏe như có tiềm năng

probiotic, làm giảm cholesterol, kích thích miễn dịch, chống ung thư [81], [89], [132].

Kể từ các chủng vi khuẩn lactic (LAB-Lactic Acid Bacteria) được Cục quản lý

Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA- Food and Drug Administration) công nhận

là vi khuẩn an toàn cho sức khỏe con người, sự quan tâm về EPS từ LAB nói chung

đặc biệt là từ các loài Lb. fermentum nói riêng nhằm thay thế cho các PS từ thực vật

ngày càng tăng trong xu hướng sản xuất, lưu thông các sản phẩm có tính chất tự nhiên

và an toàn.

Nhờ những tính chất ưu việt độc đáo và mới lạ riêng biệt, gần đây các chế phẩm

PS thương mại được khai thác từ vi sinh vật đã và đang nhận được sự quan tâm nhiều

hơn. Trong luận án này, chúng tôi tập trung nghiên cứu về EPS từ các chủng LAB

thuộc loài Lb. fermentum.

1.3. Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic

1.3.1. Khái niệm

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn có thể sinh tổng hợp nhiều

loại PS khác nhau. Tùy theo vị trí của chúng trên tế bào, các PS đó có thể là nội bào

hoặc ngoại bào. Những PS được tiết ra bên ngoài màng tế bào được gọi là PS ngoại

bào. Chúng có thể tạo thành một chất dính bám chặt và được gọi là PS dạng màng

bao hoặc cũng có thể được gắn lỏng lẻo hoặc được bài tiết hoàn toàn ra môi trường

như là các chất nhờn gọi là EPS [19], [87], [91]… Chúng là những PS chuỗi dài, phân

nhánh với các đơn vị lặp đi lặp lại của các monosaccharide hoặc các dẫn xuất của

chúng [87].

1.3.2. Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa

7

Căn cứ vào thành phần monosaccharide và đặc biệt là cơ chế sinh tổng hợp, các

EPS từ LAB được chia thành hai nhóm lớn là các heteropolysaccharide (HePS) và

các homopolysaccharide (HoPS) [13], [91], [115]. Quá trình sinh tổng hợp EPS bởi

các chủng vi khuẩn thuộc LAB có thể xảy ra ở bên trong hoặc ở bên ngoài tế bào.

Đây là một quá trình phức tạp với nhiều phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzyme

[69], [90].

- Nhóm thứ nhất: homopolysaccharide (HoPS)

HoPS là những PS được cấu tạo từ một loại monosaccharide (dạng hexose) như D-

glc hoặc D-fruc (Hình 1.3). Các chi thuộc LAB như Lactobacillus, Leuconostoc (Leu.),

Streptococcus (S.) được biết đến như là nguồn sinh tổng hợp HoPS.

a)

b)

Màng plasmid

Phần ngoại bào

Tế bào chất

Chất

xúc tác

Tín hiệu

xuất

Glc Fruc

Hình 1.3. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS [13]

Hình 1.4. Mô hình về quá trình sinh tổng hợp glucan và fructan [13]

8

Quá trình tổng hợp HoPS xảy ra ở bên ngoài tế bào nhờ sự xúc tác của các

enzyme đặc hiệu glycosyltransferase (GTF - glucansucrase) hoặc fructosyltransferase

(FTF - fructansucrase). Các enzyme này từ nội bào di chuyển ra bên ngoài tế bào nhờ

tín hiệu xuất. Sau đó chúng xúc tác thủy phân sucrose thành glc và fruc và tạo ra liên

kết glycoside của glc hoặc fruc với một phân tử chất nhận tạo nên chuỗi glucan hoặc

fructan. Đây chính là các HoPS ngoại bào (EPS) (Hình 1.4) [13], [59].

Như vậy, sucrose chính là cơ chất được LAB sử dụng để sinh tổng hợp EPS.

Trong quá trình này, sucrose được thủy phân thành glc và fruc như là những cơ chất

mới. Phản ứng này cũng có vai trò cung cấp năng lượng cho quá trình tổng hợp nên

các PS [27].

Các HoPS từ LAB thường có sự khác nhau về loại liên kết, mức độ phân nhánh,

độ dài của chuỗi glycan, khối lượng phân tử và cấu tạo của chúng [59], [106]. Tùy

vào thành phần monosaccharide tạo thành trong cấu trúc của HoPS là glc hoặc fruc

mà các HoPS có thể được phân thành hai nhóm chính: glucan và fructan (Hình 1.5)

[13], [92], [106].

Tóm lại, hai phân nhóm glucan và fructan là các HoPS được cấu tạo bởi các

monome là các phân tử glc và fruc. Sự khác nhau giữa chúng được thể hiện qua các

liên kết đặc trưng, khối lượng phân tử, độ dài và cấu tạo hóa học [28].

9

HoPS

105 – 106 Da

Fructan: liên kết β

- Lb. panis

- Lb. pontis

- Lb. frumenti

Glucan

Các liên kết α Các liên kết β

- Lb. suebicus

- Lb. G77

Mutan α-(1,3)

- Lb. reuteri ML1

Dextran α-(1,6)

- Lb. fermentum

- Lb. sakei

- Lb. parabuchneri

- Lb. hilgardii

Reuteran α-(1,4)

- Lb. reuteri 121

- Lb. reuteri ATCC

55730

Fructosyltransferase Glucansucrase

Inulin: liên kết β-

(1,2)

Mạch thẳng hoặc

phân nhánh

- Lb. reuteri

Levan: liên kết β-(2,6)

Mạch thẳng

- Lb. reuteri 121

- Lb. sanfranciscensis

Hình 1.5. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của HoPS sinh tổng hợp từ LAB [13]

10

- Nhóm thứ hai: heteropolysaccharide (HePS)

Khác biệt với các HoPS, các HePS có sự đa dạng về thành phần, tỷ lệ

monosaccharide và cấu trúc phân tử của các đơn vị lặp đi lặp lại cũng như đặc điểm

cấu tạo và khối lượng phân tử của polyme (Hình 1.6).

Các chủng vi khuẩn ưa ấm (mesophilic) Lactococcus (La) lactis subsp. lactis,

La. lactis subsp. cremoris, Lb. casei, Lb. sake, Lb. rhamnosus, v.v.) và các chủng ưa

nhiệt (Lb. acidophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. helveticus và S.

thermophilus) được biết đến như là nguồn tổng hợp nên các HePS từ LAB [18], [27]

[29]. Quá trình sinh tổng hợp của các HePS xảy ra trong tế bào (Hình 1.7). Đó là một

chuỗi phức tạp của các phản ứng liên quan đến hệ enzyme nội bào của LAB và thường

trải qua ba giai đoạn: (a) sự hấp thu cơ chất, (b) sự chuyển hóa đường trung gian và

(c) quá trình tổng hợp PS [59], [66].

(1) Sự hấp thụ cơ chất từ môi trường vào trong tế bào vi khuẩn (Hình 1.7a)

Đây là quá trình vận chuyển các nguồn C, chủ yếu là các monosaccharide và

disaccharide, từ bên ngoài môi trường vào tế bào chất. Sau khi vào trong tế bào, hầu

hết các nguồn C đều được chuyển thành glc. Quá trình này được thực hiện lặp đi lặp

lại. Tùy thuộc vào loại cơ chất mà nó có thể được đưa đến các tế bào thông qua một

hệ thống vận chuyển thụ động hoặc chủ động. Các hệ thống tham gia vào quá trình

vận chuyển đường thường là phosphoenolpyruvate - phosphotransferase (PEP-PTS)

của LAB [98].

(2) Sự chuyển hóa tạo nên các loại đường trung gian (Hình 1.7b): Quá trình chuyển

hóa này gồm hai giai đoạn: giai đoạn tổng hợp glucose-1-phosphate (Glc-1P) và giai

đoạn hoạt hóa, liên kết của các loại đường.

Hình 1.6. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS [13]

11

Hình 1.7. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp HePS trong tế bào LAB [59]

12

- Sự tổng hợp glucose-1-phosphate

Khi vào tế bào chất, glc trải qua quá trình glycolysis và phosphoryl hóa. Đây là

chìa khóa trung gian quan trọng gắn kết các quá trình đồng hóa trong sự tổng hợp

EPS và các quá trình dị hóa của sự phân giải đường. Trước hết, dưới tác dụng của

hexokinase, glc tạo thành glucose-6-phosphate (Glc-6P). Sau đó, dưới tác dụng của

phosphoglucomutase (PGM), Glc-6P được chuyển thành Glc-1P.

- Sự hoạt hóa và liên kết của các loại đường:

Glc-1P tiếp tục được chuyển hóa thành các nucleotide-đường (NDP) như

Uridine diphosphate glucose (UDP-glc) và Thymidine diphosphate glucose (TDP-

glc) (Hình 1.8) nhờ xúc tác của các enzyme tương ứng là UDP-glucose

pyrophosphorylase (UGP) và TDP-glucose pyrophosphorylase (TGP).

Sau đó, các loại đường này tiếp tục chuyển hóa tạo nên các NDP khác bao gồm

Uridine diphosphate galactose (UDP-Gal) do UDP-Glc chuyển thành dưới tác dụng

của UDP-Gal-4-epimerase (UGE) và TDP Rhamnose (TDP-Rha) do sự chuyển hóa

từ TDP-Glc dưới tác dụng xúc tác bởi TDP-glc dehydratase. Bên cạnh đó, Glc-1P

cũng có thể được chuyển hóa theo hướng tạo thành Mannose-6P (Man-6P) nhờ xúc

tác của enzyme phosphomannomutase (PMM). Từ Man-6P tiếp tục hình thành các

TDP-glucose UDP-glucose

TDP-rhamnose UDP-galactose

Hình 1.8. Cấu tạo của UDP-glucose và TDP-glucose, TDP-rhamnose và UDP-

glactose [27]

13

hợp chất Man-1P, GDP-Man và Guanosine di phosphate fructose (GDP-Fruc) nhờ sự

xúc tác lần lượt của các enzyme tương ứng là, man-1P guanylyltransferase, GDP-

mannose pyrophosphorylase (GMP) và GDP-mannose dehydratase; hoặc từ Glc-1P

thông qua bước gian là tạo thành fructose-6P (fruc-6P) dưới tác dụng của hexokinase.

Man-6P được hình thành từ fruc-6P nhờ sự xúc tác của enzyme

phosphomannoisomerase (PMI) và cuối cùng là GDP-fructose.

Sự tạo thành các NDP này (UDP-glc, TDP-Rha, UDP-Gal và GDP-Fruc) có vai

trò rất quan trọng trong quá trình tổng hợp EPS. Chúng chính là tiền thân của các đơn

vị lặp lại góp phần tạo nên sự đa dạng trong cấu trúc của các PS từ vi khuẩn.

Bên cạnh đó, Glc-6P còn được đồng phân hóa và hướng tới các sản phẩm của

quá trình đường phân tạo thành pyruvate trong điều kiện hiếu khí. Pyruvate này theo

chu trình Kreps và hình thành ATP (Adenosin Triphosphate) để cung cấp năng lượng

cho quá trình sinh tổng hợp các nucleotide-đường trong tế bào.

(3) Quá trình tổng hợp EPS (Hình 1.7c). Đây là sự lắp ráp của các đơn vị lặp đi

lặp lại monosaccharide. Dưới sự xúc tác của hệ enzyme GTF, các NDP gồm UDP-

glc, UDP-gal, TDP-rha, GDP-fruc kết hợp lại với nhau tạo thành một đơn vị lặp đi

lặp lại trong phân tử HePS. Các phân tử lặp đi lặp lại này được đẩy lên từ bề mặt tế

bào sau đó được polyme hóa để tạo thành một chất nhờn lỏng hoặc PS dạng

periplasmic gắn xung quanh các tế bào và chiết xuất ra bên ngoài.

Như vậy, quá trình sinh tổng hợp các HePS trước hết đòi hỏi sự tổng hợp nên

các tiền chất đã được kích hoạt. Đó là các monosaccharide giàu năng lượng, chủ yếu

là các loại NDP [42]. Các chủng thuộc LAB có thể sử dụng các monosaccharide và

các disaccharide khác nhau như nguồn năng lượng trong quá trình sinh tổng hợp của

chúng [27], [59].

Sự hình thành các HePS gồm một bộ khung của các đơn vị monosaccharide, các

dẫn xuất của monosaccharide và luôn luôn có sự phân nhánh. Nhìn chung, sự phân

nhánh cao trong HePS một phần là do các đơn vị lặp đi lặp lại tạo nên, một phần là

do số lượng các monosaccharide ở các mạch bên tạo thành (có thể là một, hai, hoặc

ba monosaccharide). Các monosaccharide trong HePS thường phân nhánh rất lớn với

các loại liên kết khác nhau (dạng α- hoặc β-) để tạo nên bộ khung khác nhau (có thể

14

là vòng 6 cạnh – pyranose hoặc vòng 5 cạnh – furanose). Trong đó, D-galactose (Gal)

có tần suất xuất hiện lớn nhất ở cả hai dạng pyranose và furanose. D-Glc chỉ có ở

dạng pyranose (Hình 1.9) [13], [27], [28], [29].

Như vậy, khác với các HoPS, ngoài glc và fruc, HePS còn được cấu tạo bởi các

monome đa dạng hơn như D-gal, L-rham, man, dạng acetyl,… và có sự phân nhánh

nhiều hơn. Thành phần của các tiểu đơn vị monosaccharide và cấu trúc của các đơn

vị lặp lại thường không cố định, trong đó, D-gal, D-glc và L-rham hầu như luôn luôn

có mặt, nhưng ở tỷ lệ khác nhau [29]. Sự khác biệt giữa HoPS và HePS không chỉ thể

hiện qua tính chất hoá học, bản chất của các mối liên kết mà nó còn thể hiện thông

qua các enzyme tổng hợp và vị trí tổng hợp nên chúng [18].

1.3.3. Tính chất chức năng và ứng dụng

HePS

Khối lượng phân tử:

từ 1x104 – 6x106 Da - Phân nhánh liên kết

α, β nhánh (ở vị trí

C2, C3, C4, C6)

- Không phân nhánh

Gồm 3 – 8 phân tử

monosaccharide cấu

tạo thành

Các monosaccharide

dạng: pyranose hoặc

furanose

Được tổng hợp từ các

loài Lactobacillus ưa

nhiệt và ưa ẩm

Các monosaccharide chủ yếu gồm:

- D-Glucose

- D-Galactose

- L-Rhamnose

Ngoài ra:

+ Mannose, fructose, glucuronic acid

+ Phosphate, glucosamine, dạng acetyl,

galactosamine

Hình 1.9. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của các HePS sinh tổng hợp từ

LAB [13]

15

Do có sự đa dạng trong cấu trúc, các EPS từ vi sinh vật, đặc biệt là từ LAB đã

tạo ra được những tiềm năng ứng dụng có giá trị cao, chất lượng sản phẩm hoàn toàn

vượt trội so với các PS từ thực vật, tảo [87]. Bên cạnh những tác dụng nổi bật liên

quan đến việc hỗ trợ về sức khỏe, các tính chất chức năng công nghệ, các ứng dụng

của EPS ngày càng được mở rộng trong các lĩnh vực khác như dược phẩm, dinh

dưỡng, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Chính vì vậy, chúng có tiềm năng để phát

triển và khai thác làm phụ gia thực phẩm hoặc thành phần của thực phẩm chức năng

về cả sức khỏe và lợi ích kinh tế [27].

1.3.3.1. Chức năng liên quan đến sức khỏe

Việc sử dụng các thực phẩm chứa EPS hoặc các vi khuẩn có khả năng tổng hợp

nên các EPS mang lại rất nhiều lợi ích khác nhau. Trong phạm vi tổng quan của luận

án này, một số chức năng liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp từ LAB

được giới thiệu chủ yếu như có tính probiotic và prebiotic; hoặc có hoạt tính chống

ung thư, chống viêm loét dạ dày, kích thích miễn dịch, hoặc các hoạt động làm giảm

cholesterol (Hình 1.10) [106], [107].

- EPS có chức năng như là prebiotic và probiotic

Ruột Prebiotic và

probiotic

Hoạt động chống

khối u (ung thư)

Tham gia hệ

miễn dịch

- Kích thích hoạt động của đại thực bào

- Giúp tăng nhanh tế bào bạch huyết

- Sản sinh tế bào

Chống viêm, loét

dạ dày

Làm giảm cholesterol

trong máu

Hình 1.10. Sơ đồ biểu diễn các tính chất tăng cường sức khỏe của EPS từ LAB [106]

16

Prebiotic được biết đến là những thành phần không phải dạng sống và không

tiêu hóa được, có tác dụng kích thích vi khuẩn trong ruột. Chúng thường là các

oligosaccharide với mức độ polyme hóa trong phạm vi giữa 2 và 20 monome; được

chuyển hóa bởi các vi khuẩn có lợi cho sức khỏe và cải thiện khả năng miễn dịch để

chống lại những mầm bệnh [13]. EPS là hợp chất PS. Vì vậy sự có mặt của EPS trong

đường ruột có vai trò như là prebiotic. Bên cạnh tính năng prebiotic, nhiều chủng vi

khuẩn thuộc LAB cũng đã được nghiên cứu và công bố về tiềm năng probiotic của

chúng bao gồm Lb. acidophilus, Lb. bulgaricus, Lb. lactis, Lb. plantarum, Lb. casei,

Lb. reuteri, Lb. rhamnosus, Lb. parasei, Lb. fermentum và Lb. helveticus. Đây cũng

chính là nguồn sinh tổng hợp nên các EPS [13], [90].

Như vậy, khi sử dụng các chủng LAB trong các sản phẩm lên men lactic, một

mặt chúng sinh ra EPS để làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm, mặt khác chúng

cũng góp phần tạo nên tính probiotic cho sản phẩm. Bên cạnh đó, sự có mặt của các

EPS này còn mang lại tính năng prebiotic giúp hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa [131].

- Chống viêm, loét dạ dày và tác động làm giảm cholesterol

Tác động chống viêm loét dạ dày trên chuột của các sản phẩm sữa lên men từ

các chủng S. thermophilus (CRL 1190 và CRL 804) có khả năng sinh tổng hợp EPS

đã được công bố khi so sánh với sản phẩm lên men bởi các chủng không sinh tổng

hợp EPS [105]. Tương tự, khả năng chống loét nhất định của EPS được sinh tổng hợp

từ các chủng Bifidobacteria, Lactobacilli, và Streptococcus cũng được công bố bởi

Nagaoka và cộng sự (1994) [84]; EPS tổng hợp từ Lb. rhamnosus GG có tác dụng

chống lại các yếu tố miễn dịch bẩm sinh trong ruột [70].

Sự hấp thụ cholesterol của các PS đã được ghi nhận trong điều kiện in vitro bởi

nhiều nhóm nghiên cứu độc lập khác nhau như Soh và cộng sự (2003) [113]; Tok và

Aslim (2010) [117]…

- Hoạt tính chống ung thư (kháng u), kích thích hệ miễn dịch

Một số LAB và các hợp chất tạo ra trong quá trình trao đổi chất của chúng được

chứng minh là có tác động làm tăng hệ miễn dịch của cơ thể nhờ khả năng sản sinh

tế bào T (là tế bào trung gian của miễn dịch tế bào) và hoạt động tiêu diệt khối u [24],

[50]. Tác động điều hòa hệ miễn dịch của các phân đoạn EPS gồm EPS trung tính và

17

EPS acid (APS) sinh tổng hợp bởi La. delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1 lên

chuột đã được Makino và cộng sự (2006) nghiên cứu [78]. Oda và cộng sự (1983) đã

kết luận rằng EPS sinh tổng hợp bởi Lb. helveticus ssp. jugurti có khả năng chống

ung thư khi thực hiện thử nghiệm trên chuột bằng cách tiêm các chế phẩm EPS vào

màng bụng của chuột đã xuất hiện tế bào ung thư. Kết quả cho thấy, tuổi thọ của loài

chuột này đã được tăng lên 144% khi tiêm 20 mg EPS/kg trong chín ngày liên tiếp.

Khi tăng liều lượng EPS tiêm tương ứng với 40 hoặc 80 mg EPS/kg, tuổi thọ của

chuột đã tăng lên hơn 233% [88]. Tương tự, kết quả nghiên cứu của Kitazawa và

cộng sự (1992) đã cho thấy rằng chất nhờn được tổng hợp từ La. Lactis ssp. cremoris

KVS20 có hoạt tính chống ung thư [64].

Như vậy, thông qua một số nghiên cứu trên động vật và trong thử nghiệm in

vitro đã gợi ý về tác dụng có lợi đến sức khỏe liên quan đến việc sử dụng thường

xuyên các EPS sinh tổng hợp từ LAB. Những nghiên cứu này đã cho thấy EPS xứng

đáng là mục tiêu nghiên cứu về tiềm năng ứng dụng nhằm phục vụ về sức khỏe của

con người cũng như các ứng dụng liên quan như về y tế, mỹ phẩm và dược phẩm,…

Đồng thời, các EPS từ LAB có thể mở ra một hướng mới cho việc phát triển các sản

phẩm thực phẩm chức năng góp phần mở rộng thị trường tiêu thụ các thực phẩm với

những đặc tính tự nhiên do chính các vi khuẩn này mang lại.

1.3.3.2. Tính chất chức năng công nghệ của EPS trong thực phẩm

Các polyme từ thực vật, động vật là những thành phần không thể thiếu trong

một số loại thực phẩm. Từ lâu, chúng đã được sử dụng như là những thành phần giúp

hoàn thiện kết cấu cho các sản phẩm thực phẩm như sự tạo gel, sự ổn định, sự nhũ

tương hóa, ngăn ngừa sự kết tinh. So với các PS phân lập từ nguồn thực vật (như

carrageenan, guar gum, tinh bột biến tính, glucan v.v), các PS từ vi sinh vật có lợi thế

hơn với quy trình kiểm soát tốt, được sản xuất với một quy mô lớn trong một không

gian và thời gian tương đối hạn chế, các đặc tính hóa học thu được ổn định và đặc

biệt là đáp ứng được những yêu cầu về tính an toàn của thị trường. Việc định hướng

sử dụng EPS từ LAB với mục đích làm phụ gia bổ sung vào thực phẩm hay sử dụng

trực tiếp LAB có khả năng sinh tổng hợp EPS làm giống khởi động cho quá trình sản

xuất sản phẩm thực phẩm lên men được coi là an toàn, thành phẩm thu được là tự

18

nhiên [90]. Bên cạnh đó, các EPS cũng có những tác động quan trọng đến sự phát

triển của các sản phẩm thực phẩm mới (cả về thực phẩm lên men và không lên men),

trong đó phải kể đến các sản phẩm thực phẩm cần được tăng cường các đặc tính lưu

biến, cải thiện kết cấu và sự ổn định cũng như khả năng giữ nước [29]. Đây là những

vấn đề cần giải quyết trong cấu trúc của thực phẩm và EPS từ LAB có thể giải quyết

được các vấn đề này.

- EPS là tác nhân tạo kết cấu

Các EPS được sử dụng trong thực phẩm với chức năng chính là tác nhân làm

đặc sinh học tạo nên sự ổn định và hạn chế hiện tượng tách nước của các thành phẩm

trong thực phẩm lỏng phổ biến nhất là sữa chua. Khả năng này của EPS có được là

nhờ sự tương tác của chúng với protein, các ion và những thành phần khác trong sản

phẩm do đó giúp làm giảm hiện tượng tách nước, tăng tính ổn định cho sản phẩm, từ

đó giúp thực phẩm có tính đồng nhất cao và tăng giá trị cảm quan. Bên cạnh đó, các

EPS từ một số chủng LAB cũng được kết luận là góp phần cải thiện kết cấu của bột

nhào trong quá trình chế biến các loại bánh sản xuất từ bột mì [16], [90]. Chính vì

vậy, nhiều nhà khoa học đã quan tâm đến việc nghiên cứu một số tính chất hóa lý của

EPS có ảnh hưởng đến các yếu tố tạo nên tính chất lưu biến cho sản phẩm thực phẩm.

- EPS giúp hoàn thiện tính lưu biến của các sản phẩm lên men [13].

Độ đàn hồi và độ nhớt là hai biến quan trọng trong tính chất lưu biến của thực

phẩm. Chúng có ảnh hưởng lớn đến các tính chất lý hóa của sản phẩm thực phẩm đặc

biệt là sản phẩm lên men. Việc sử dụng EPS nhằm cải thiện các tính chất lưu biến

của sản phẩm là điều rất cần thiết. Trong các chủng vi khuẩn sử dụng làm giống khởi

động quá trình lên men sữa, nhiều chủng LAB đặc biệt là các loài Lactobacilli được

biết đến là có khả năng sinh tổng hợp EPS. Do đó, dù lượng EPS sinh tổng hợp bởi

LAB là không cao, tuy nhiên chúng cũng đủ để tạo kết cấu cho sản phẩm sữa lên men

mà không cần bổ sung thêm các chất ổn định trong quá trình sản xuất [29].

Tác động hỗ trợ tích cực trong việc cải thiện kết cấu và giảm khả năng tách nước

của sản phẩm sữa chua tạo thành bởi các EPS sinh tổng hợp từ các chủng LAB sử

dụng để lên men sữa đã được kết luận như EPS từ Lb. delbrueckii bulgaricus và S.

thermophilus [14]; EPS từ L. lactis subsp. cremoris LC330 [79]; EPS từ Lb

19

delbrueckii ssp. bulgaricus [60]. Bên cạnh đó, nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra

rằng, các EPS được giải phóng ra bởi các loài Lactobacilli như Lb. delbrueckii

bulgaricus, Lb. helveticus và Lb. casei có tác dụng thúc đẩy khả năng giữ nước và cải

thiện kết cấu tổng thể của các loại pho mát khác nhau trong giai đoạn chín tới do đó

giúp cấu trúc sản phẩm tạo thành ổn định hơn [13], [92], [144]. Coeuret và cộng sự

(2003) kết luận rằng, quá trình hình thành pho mát phụ thuộc vào sự liên hệ giữa các

chủng Lactobacilli với nhau cũng như sự hiện diện hay vắng mặt của các EPS sinh

tổng hợp được [23].

Từ các công bố trên cho thấy rằng, có thể sử dụng các chủng vi khuẩn có khả

năng sinh tổng hợp EPS cao làm tác nhân vi sinh vật gây lên men trong chế biến thực

phẩm. Quá trình này được thực hiện trong điều kiện in situ. EPS được sử dụng theo

điều kiện này sẽ có tác động như là các tác nhân ổn định tự nhiên, có khả năng làm

đặc, tạo độ nhớt cao và giảm khả năng tách nước. Công nghệ này sẽ tạo ra những sản

phẩm bảo đảm tính an toàn thực phẩm cao do đó sẽ không cần sử dụng các chất phụ

gia tổng hợp từ bên ngoài vào.

1.3.3.3. Hoạt tính chống oxy hóa

Các gốc tự do như O.-, OH. và ROS được coi là các tác nhân oxy hóa mạnh,

chúng có thể phản ứng với tất cả các phân tử lớn trong tế bào dẫn đến gây ra các đột

biến và ung thư. Đặc tính chống oxy hóa của các PS từ thực vật, nấm đã được nghiên

cứu khá phổ biến và được sử dụng như các chất chống oxy hóa tự nhiên. Trong những

năm gần đây, EPS từ các vi khuẩn thuộc LAB đã nhận được nhiều sự quan tâm hơn

về tính chống oxy hóa. Các vi khuẩn có tiềm năng probiotic sinh tổng hợp EPS có thể

làm giảm ung thư bằng nhiều cơ chế khác nhau thông qua hoạt động quét các gốc tự

do và một phần của cơ chế đó có thể liên quan đến các EPS tổng hợp được.

Chủng vi khuẩn có tiềm năng probiotic tổng hợp các PS ngoại bào (EPS) với

những tác động sinh lý khác nhau có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp. Hoạt tính

sinh học quan trọng của EPS này được đặc trưng bởi khả năng loại bỏ các phản ứng

oxy hóa (ROS) - là dạng được hình thành trong ruột bởi các phản ứng trao đổi chất

khác nhau, chính vì vậy chúng đã thể hiện được hoạt tính chống oxy hóa. Hoạt tính

chống oxy hóa của EPS từ chủng vi khuẩn này được so sánh với chất chống oxy hóa

20

là vitamin C. Kết quả cho thấy, EPS sinh từ chủng này có hoạt tính loại bỏ gốc tự do

và chống oxy hóa đáng kể [65]. Khả năng loại bỏ gốc tự do 1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazyl (DPPH), gốc hydroxyl và chuỗi các gốc oxide của EPS sinh tổng hợp

bởi hai chủng Bifidobacterium bifidum WBIN03 (B-EPS) và Lactobacillus

plantarum R315 (L-EPS) và cả sự ức chế quá trình oxy hóa lipid cũng được đánh giá.

Kết quả cho thấy, cả B-EPS và L-EPS đều có khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH và

các chuỗi phản ứng ROS rất tốt ở nồng độ cao. Sự ức chế quá trình oxy hóa lipid cũng

được ghi nhận. Với các khả năng này, cả hai EPS tổng hợp được đều có thể được sử

dụng trong công nghiệp thực phẩm như là các tác nhân chống oxy hóa tự nhiên [72].

Như vậy, bên cạnh khả năng chống ung thư, giảm cholesterol, chống viêm loét

dạ dày cùng các chức năng tạo cấu trúc, giúp hoàn thiện tính lưu biến đối với các sản

phẩm lên men từ sữa, các EPS từ LAB cũng được biết đến với khả năng chống oxy

hóa cao. Với các tính chất chức năng quan trọng này, EPS sinh tổng hợp từ LAB

xứng đáng là nguồn nguyên liệu mới, tự nhiên, an toàn trong các ứng dụng công

nghiệp trọng yếu liên quan đến sức khỏe con người.

1.4. Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB

Trong những thập kỷ qua, đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới về EPS sinh tổng

hợp từ LAB được công bố [18], [22], [29]. Những nghiên cứu này chủ yếu tập trung

vào việc tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp và điều kiện thu nhận EPS; một số đặc tính

lý hóa của EPS như khối lượng phân tử, thành phần hóa học, cấu trúc cũng như một số

tính chất chức năng liên quan đến ứng dụng của chúng trong công nghiệp.

1.4.1. Về điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS

Mặc dù có vai trò quan trọng trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi

khuẩn vẫn còn có nhược điểm là năng suất tạo thành thấp. Đây là lý do khiến khả năng

thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ LAB nói riêng còn khá hạn chế.

Một phương pháp hữu ích để quá trình sinh tổng hợp EPS đáp ứng về phương diện ứng

dụng trong thực phẩm nếu LAB có thể được lên men trong môi trường ăn được và an

toàn là cải thiện quá trình lên men sinh tổng hợp EPS [59]. Năng suất của EPS từ LAB

chịu tác động bởi các yếu tố vật lý (nhiệt độ, pH, thời gian lên men,…), các yếu tố hóa

21

học (nguồn C, N, tỉ lệ C/N,…) do đó có thể điều chỉnh các điều kiện lên men nhằm tăng

quá trình hình thành các polyme sinh học này [19], [31], [66].

Grobben và cộng sự (1996) đã kết luận rằng, hàm lượng và thành phần của các

EPS sinh tổng hợp bởi Lb. delbruckii. subsp. bulgaricus NCFB 2772 trong các môi

trường chứa nguồn C khác nhau là không giống nhau [55]. Trong khi đó, công bố của

Degeest và De Vuyst (1999) chỉ ra rằng, thành phần EPS tổng hợp từ S. thermophilis

không có sự thay đổi khi chủng này được nuôi cấy trên các nguồn carbohydrate khác

nhau [32]. Quá trình phát triển và sinh tổng hợp EPS của LAB cũng được tăng lên

khi bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy các nguồn nitrogen (N) khác nhau. Việc

sử dụng các nguồn N hữu cơ dẫn đến những tác động tích cực trong việc tạo EPS có

thể liên quan đến tỷ lệ carbon /nitrogen (C / N) [83].

Bên cạnh những nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn C và N lên quá trình sinh tổng

hợp EPS của LAB, nhiều công bố liên quan đến sự tác động của nhiệt độ và pH lên

quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn khác nhau cũng

được đề cập. Garcia-Garibay và Marshall (1991) đã kết luận rằng, sự tổng hợp EPS

bởi Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus tăng lên khi tăng nhiệt độ [48]. Ngược lại, quá

trình sinh tổng hợp EPS bởi chủng S. thermophilus BN1 đạt được ở 37oC là cao hơn

so với 42oC [99]. Đã có nhiều công bố về giá trị pH thích hợp cho quá trình sinh tổng

hợp EPS từ các chủng LAB khác nhau là không giống nhau, tuy nhiên đa phần quá

trình sinh tổng hợp EPS của các chủng này đều xảy ra tốt hơn ở khoảng pH gần 6,0

[44], [51], [140], [141].

Trong những năm gần đây, số lượng các nghiên cứu về điều kiện lên men sinh

tổng hợp EPS có xu hướng tăng. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung cải thiện sản lượng

EPS sinh tổng hợp từ LAB và tối ưu hóa các điều kiện lên men tương ứng với các

nguồn vi khuẩn từ LAB có khả năng sinh tổng hợp EPS cao [44], [52], [124], [136],

[139],…. Đây cũng được coi là cơ sở quan trọng để làm nền tảng cho việc sử dụng

chúng một cách rộng rãi vào các mục đích công nghiệp khác nhau [115]. Các thông

tin về kết quả nghiên cứu cụ thể liên quan đến sự tác động của các yếu tố như thành

phần môi trường và điều kiện nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS từ loài thuộc

chi Lactobacillus thuộc LAB được tóm tắt ở Bảng 1.1.

22

Bảng 1.1. Tổng quan về một số điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận EPS cao từ

các loài Lactobacillus đã được công bố

STT

Chủng

vi khuẩn

thuộc chi

Lactobacillus

(Lb.)

Thành

phần môi

trường

Nhiệt

độ và

pH của

môi

trường

Thời

gian

nuôi

cấy

(giờ)

Hàm

lượng

EPS

(µg/ml)

Tác giả (năm)

[TLTK]

1 helveticus

ATCC 15807

MRS có bổ

sung

đường

lactose

pH=4,5 30 280

Torino và cộng

sự (2005)

[118]

2 fermentum

TDS030603

MRS có

chứa

frucose 1%

30oC,

pH=6,5 72 97,1

Fukuda và

cộng sự (2010)

[44]

3 johnsonii 142 MRS 37oC

48

Gorska và

cộng sự (2010)

[52]

4 plantarum

KF5

MRS bổ

sung whey

30oC,

pH=6,3 30 95,58

Wang và cộng

sự (2010)

[130]

5 fermentum F6

MRS bổ

sung 10%

sữa gầy,

2% glucose

370C

pH=6,5 32 44,49

Zhang và cộng

sự (2011)

[141]

6 fermentum

CFR 2195 MRS

370C,

pH=6,7 24 28820

Yadav và cộng

sự (2011)

[136]

7 confusus

TISTR 1498

nước dừa,

20 g/L

sucrose, 5

g/L pepton,

2,5 g/L cao

thịt, 2,5

g/L cao

nấm

350C,

pH=5,5 24 38200

Seesuriyachan

và cộng sự

(2011)

[111]

8 rhamnosus

KL37B MRS

37oC

48

Gorska và

cộng sự (2011)

[54]

23

STT

Chủng

vi khuẩn

thuộc chi

Lactobacillus

(Lb.)

Thành

phần môi

trường

Nhiệt

độ và

pH của

môi

trường

Thời

gian

nuôi

cấy

(giờ)

Hàm

lượng

EPS

(µg/ml)

Tác giả (năm)

[TLTK]

9 johnsonii 151 MRS 37oC

48

Gorska và

cộng sự (2013)

[53]

10 plantarum

YW32 MRS

37oC,

pH=6,6 32

90

Wang và cộng

sự (2015)

[124]

11

delbrueckii

subsp.

bulgaricus

OLL1073R-1

MRS bổ

sung 10%

sữa gầy

37oC 18

Calsteren và

cộng sự (2015)

[17]

Từ kết quả tổng hợp ở Bảng 1.1 chúng tôi nhận thấy rằng, thành phần môi trường

và điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp EPS của các

chủng vi khuẩn thuộc LAB. Hàm lượng EPS tổng hợp từ LAB phụ thuộc vào thành

phần môi trường (nguồn C, N) và các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, thời gian

nuôi cấy. Mỗi chủng vi khuẩn khác nhau thuộc LAB đều có khả năng phát triển và

sinh tổng hợp EPS trong những điều kiện khác nhau. Với sự đa dạng của các nguồn

cơ chất khác nhau được bổ sung thêm vào môi trường MRS thì tương ứng sẽ có sự

thay đổi tương ứng về các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH và thời gian. Bên cạnh

đó, các chủng vi khuẩn có thể giống nhau về loài nhưng được phân lập từ các nguồn

khác nhau thì quá trình thu nhận EPS cũng được thực hiện với các nguồn dinh dưỡng

và các điều kiện nuôi cấy không giống nhau. Như vậy, không có quy trình với những

chỉ số duy nhất về điều kiện nuôi cấy để đảm bảo hiệu suất thu nhận EPS cao.

1.4.2. Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS

Quá trình thu nhận các PS ngoại bào của vi khuẩn từ môi trường lỏng thường

được thực hiện qua nhiều công đoạn:

(1) Loại bỏ protein, tế bào bằng cách ly tâm hoặc lọc. Việc sử dụng acid

tricloroacetic (TCA) để loại bỏ protein hoặc peptide trong môi trường lên men đã

24

được đề xuất bởi Garcia- Garibay và Marshall (1991) [48]. Phương pháp này có ưu

điểm là nhanh hơn so với các kỹ thuật đã đề cập trước đó. Tuy nhiên, một tỷ lệ lớn

của EPS sẽ đồng kết tủa trong TCA và do đó cần phải rửa kết tủa ít nhất một hoặc hai

lần để thu nhận EPS được tốt nhất [19];

(2) Các polyme kết tủa từ dịch nổi được thu nhận bằng cách cho thêm tác nhân

kết tủa. Đó là một dung môi hòa tan được trong nước trong đó các polyme là không

hòa tan (chẳng hạn như methanol, ethanol, isopropanol hoặc acetone). Tỉ lệ dung môi

sử dụng có thể là một, hai hoặc ba so với dịch nuôi cấy;

(3) Thu polyme kết tủa bằng cách sấy đông khô (quy mô phòng thí nghiệm)

hoặc sấy trống (quy mô công nghiệp). Đầu tiên, các EPS kết tủa được thu nhận bằng

cách ly tâm, sau đó hòa tan lại với nước cất và tiến hành thẩm tích để loại bỏ các loại

đường còn lại hoặc các thành phần hòa tan khác trong môi trường. Các EPS này sau

đó được đông khô ở nhiệt độ lạnh và bảo quản ở 4 °C [66]. Các phương pháp tinh

chế EPS này có thể làm giảm hiệu suất thu nhận sản phẩm, vì thế việc lựa chọn quy

trình thu nhận thích hợp đặc biệt là các hóa chất cần dựa vào mối tương quan giữa

mức độ thu nhận sản phẩm, độ tinh khiết của sản phẩm và các tác động đến tính chất

của nó [42]. Các thông số liên quan cụ thể áp dụng trong từng phương pháp tách chiết

và tinh chế EPS từ LAB đã được nhiều nhóm tác giả sử dụng để thu nhận nhằm nghiên

cứu về quá trình sinh tổng hợp, về các đặc điểm lý hóa và cấu trúc của EPS như Doco

và cộng sự (1990) [36], Harding và cộng sự (2005) [58], Yuksekdag và cộng sự

(2008) [138], Rabha và cộng sự (2011) [99], Seesuriyachan và cộng sự (2011) [111].

1.4.3. Về đặc tính hóa lý: khối lượng phân tử, thành phần, liên kết và cấu trúc

Để xác định một cách đầy đủ về các đặc tính lý hóa của một PS cụ thể, việc xác

định các thông tin về khối lượng phân tử, thành phần hóa học, cấu hình các monomer

và các dạng liên kết của các monome đó trong phân tử đó là điều rất cần thiết. Đây

được xem là yếu tố quan trọng để hiểu rõ hơn về hoạt tính của các polyme sinh học

trong các môi trường khác nhau [42], [68].

Về khối lượng phân tử trung bình

Do tính chất đa phân tán, khối lượng phân tử của PS thường chỉ thể hiện là giá

trị trung bình của khối lượng phân tử. Có rất nhiều kỹ thuật khác nhau đã được sử

25

dụng để xác định khối lượng phân tử trung bình của các polymer thuộc PS như

phương pháp sắc ký trao đổi ion [21], sắc ký rây phân tử [91], phương pháp sắc ký

thẩm thấu gel [10], [32],… Nguyên tắc chung của các phương pháp là dựa vào thời

gian lưu của các PS được rửa giải kết hợp với mức độ khúc xạ của nó. Những phương

pháp này cũng tạo điều kiện cho việc ước tính được ngay khối lượng phân tử của PS.

Về thành phần hóa học

Việc đánh giá thành phần hóa học của EPS liên quan đến việc xác định các phân

tử đường, sự lặp lại của chúng và các nhóm phức đi kèm (nhóm acyl, nhóm

phosphate,…). Sắc ký khí là phương pháp truyền thống đã được sử dụng để xác định

thành phần monosaccharide, trong đó bao gồm các quá trình methyl hóa của tất cả

các nhóm hydroxyl, sau đó là sự thủy phân PS thành các monosaccharide, tiếp đến

quá trình alditol và acetyl hóa để tạo thành dẫn xuất alditol acetate và phân tích bằng

GC-MS [58], [126].

Về cấu trúc hóa học

Sự kết hợp nhiều đơn vị monome, cùng với các dạng stereo cụ thể của liên kết

glycoside (α hoặc β- anome), dẫn đến các cấu trúc hóa học rất phức tạp bao gồm từ

sự tuyến tính của các HoPS đến sự phân nhánh cao của các HePS. Phương pháp phân

tích và xác định cấu trúc của các PS hoàn chỉnh đã được tóm tắt bởi Kamerling và

Gerwig (2007) [62]. Các mô hình liên kết của các monome được phân tích bởi quá

trình methyl hóa tất cả các nhóm hydroxyl, sau đó thực hiện thủy phân PS thành

monosaccharide bằng acid (như TCA hoặc acid trifloroacetic (TFA)), tiếp đến là quá

trình khử, acetyl hóa và phân tích GC-MS. Kết quả của GC-MS không chỉ đưa ra

được thông tin về vị trí hình thành liên kết mà còn chỉ ra cấu hình hoặc các

monosaccharide trong chuỗi oligosaccharide [9]. Sự suy thoái Smith (Smith

degradation) cũng có thể được sử dụng để phân mảnh một cách có chọn lọc các PS.

Quá trình này dựa trên ba bước liên tiếp là: oxy hóa, tiếp theo là giảm đến một

polyalcohol với borohydride, và cuối cùng là thủy phân bằng acid yếu. Hơn nữa, việc

làm giảm khối lượng phân tử và độ phân nhánh và làm tăng khả năng hòa tan trong

dung môi của các chất cần phân tích có thể đạt được bằng cách thủy phân một phần

với acid không đặc hiệu, hoặc sử dụng các enzyme đặc hiệu cho các mối liên kết

26

glycoside khác nhau. Những phân đoạn có khối lượng phân tử thấp này sau đó có thể

được phân tích bằng một số kỹ thuật như GC-MS, MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted

Laser Desorption Ionization-Time of Flight - Mass Spectometry) và NMR [42].

Trong tất cả các phương pháp phân tích cấu trúc của các oligosaccharide, NMR là

phương pháp rất nhạy và có khả năng đưa ra những thông tin chi tiết về cấu trúc của

chất cần phân tích. Do đó, đây cũng là phương pháp được sử dụng phổ biến để xác

định về cấu hình anome của monosaccharide, loại liên kết, nhóm thế và cả những

thành phần có bản chất phi-carbohydrate mà cho đến nay chưa có một phương pháp

nào có thể so sánh được [9].

Phổ 1D-1H và 13C NMR thường được ghi lại ở nhiệt độ khoảng từ 70oC trở lên

với các PS hòa tan trong D2O hoặc trong DMSO. Độ chuyển dịch hóa học được biểu

diễn theo ppm với việc sử dụng acetone làm chất nội chuẩn ( của 1H là 2,225 và của

13C là 31,55) hoặc TMS làm chất nội chuẩn ( 0 ppm). Trong phổ proton, vùng từ

trường thấp bao gồm các cộng hưởng từ của các nguyên tử anomer và các proton

khác trong cấu trúc dạng vòng ở vùng có từ trường cao [68]. Sự kết hợp các kết quả

từ phổ 1H và 13C – NMR cho phép xác định số lượng các phân tử monosaccharide

trong cấu trúc phân tử. Các phổ 2D-NMR cho phép đánh giá mức độ tương tác của

mỗi C hoặc H với các nguyên tử lẫn cận hoặc xa nhau trong không gian và xác định

được các vị trí liên kết của chúng trong cấu trúc PS. Phổ COSY và TOCSY được sử

dụng để gán các hạt nhân proton trong cấu trúc vòng. Trong khi đó, với phổ 2D HSQC

và HMBC, 13C – 1H lại được sử dụng để gán các nguyên tử C và cung cấp các thông

tin về dạng liên kết trong cấu trúc của phân tử, cấu hình anomer (như phổ HMBC,

NOESY, ROESY).

Mô hình liên kết của các monome được xác định bằng sự kết hợp của quá trình

methyl hóa và sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Kết quả về cấu trúc của các PS

này được xác định bằng cách đối chiếu với các dữ liệu phổ thư viện đã được công bố

[42], [68]. Thông tin về cấu trúc và các phổ tương ứng giúp xác định chi tiết về cấu

trúc PS được cụ thể hóa ở Bảng 1.2 [9].

27

Bảng 1.2. Thông tin về cấu trúc và các phương pháp NMR tương ứng

Thông tin về

cấu trúc Các phương pháp NMR tương ứng

Số lượng phân tử

đường

Phổ một chiều 1H – NMR

Phổ 13C – NMR

Phổ tương tác hai chiều 1H – 1H giúp phân tích kết nối

Phổ tương quan hai chiều 1H – 13C

Các

monosaccharide

cấu thành

Độ chuyển dịch hóa học của 1H – NMR

Hằng số ghép JH,H trong 1H – NMR

Phổ tương quan của các hạt nhân trong cùng phân tử (COSY)

Độ chuyển dịch hóa học của 13C – NMR

Phổ tương quan giữa 1H – 13C

Cấu hình anomer Độ chuyển dịch hóa học 1H – NMR và hằng số ghép cặp

Độ chuyển dịch hóa học 13C – NMR và hằng số ghép cặp JH,H

Tương tác trong phổ NOESY

Vị trí liên kết và

chuỗi lặp lại

Độ chuyển dịch hóa học trong 1H và 13C – NMR


Sự tương quan gần hoặc xa của các nguyên tử

Vị trí của các

nhóm thế

Độ chuyển hóa học trong 1H và 13C – NMR


Sự tương quan gần hoặc xa của các nguyên tử

Có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng kết hợp quá trình methyl hóa và NMR

trong quá trình phân tích các đặc điểm cấu trúc của PS [11], [39], [74], [104],… Kết

quả công bố về các đơn vị monosaccharide chủ yếu thường gặp trong thành phần của

EPS là glc, gal và rha với tỷ lệ khác nhau [29], [87], [91]. Sự liên kết giữa các đơn vị

monome trong EPS đã tạo nên bộ khung của các polyme với sự thay đổi của các loại

liên kết 1,4-β- hay liên kết 1,3-β- và 1,2-α- hay các liên kết 1,6-α-glycoside. Đây cũng

là cơ sở chủ yếu được sử dụng để phân loại EPS [87].

Bằng phương pháp kết hợp phân tích các mối liên kết và giải phổ NMR 1D/2D

(1H và 13C), cấu trúc của một số EPS sinh tổng hợp bởi các chủng khác nhau thuộc

loài Lb. helveticus là khác nhau là kết quả được công bố bởi Yang và cộng sự (2000)

[137], Robijn và cộng sự (1995) [103]. EPS sinh tổng hợp bởi các chủng Lb.

helveticus 776 có cấu trúc lặp lại của các hexasaccharide D-gal và D-glc với tỷ lệ

28

phân tử là 1:2. Trong khi đó, EPS của chủng TY1-2 là một heptamer có chứa N-

acetyl-D-glucasamine. Nhóm tác giả này cũng đã công bố rằng EPS của Lb.

helveticus Aki4 và Lb161 chứa các hexa- và heptasaccharide và có lần lượt 1 và 2

mạch nhánh. Nhóm tác giả này cũng cho thấy rằng chủng Lb. helveticus K16 sinh

tổng hợp EPS ngoại bào là một hexasaccharide lặp lại và là một hetero-EPS của các

đường gal và glc và có cấu tạo mạch nhánh.

EPS từ LAB có thể là sự tổng hợp của các hỗn hợp và có cấu trúc khác nhau.

Bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp các phổ 1H, 13C, 1D và 2D NMR,

cấu trúc EPS sinh tổng hợp bởi Lactobacillus spp. G-77 được kết luận gồm hai PS có

cấu trúc đơn vị monosaccharide lặp lại khác nhau [38]. Grobben và cộng sự (1996)

đã sử dụng một môi trường xác định để nuôi cấy Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus

NCFB 2772. Khi nuôi cấy với glc hoặc fruc, có hai EPS đã được tách chiết: một PS

có khối lượng phân tử cao và một PS có khối lượng phân tử thấp nhờ phương pháp

sắc ký trao đổi ion. Thành phần monome và các liên kết trong PS có khối lượng phân

tử lớn thu nhận từ glc và fruc đều tương tự và xấp xỉ nhau (± 5%) đã được xác định

nhờ phương pháp GC-MS. Tuy nhiên, các PS có khối lượng phân tử thấp, được sinh

tổng hợp với số lượng nhỏ, và xuất hiện một thành phần monome khác nhau [55].

Một số nghiên cứu khác lại chỉ ra rằng, quá trình sinh tổng hợp các EPS có cấu trúc

tương tự nhau nhưng có khối lượng phân tử khác nhau. Degeest và de Vuyst (1999)

công bố kết quả về việc sinh tổng hợp một phân tử EPS có khối lượng cao (1,8x 106)

và một phân tử EPS có khối lượng thấp (4,1x105) từ S. thermophilus LY03 [32]. Quá

trình sinh tổng hợp hai PS bởi Lb. rhamnosus cũng đã được công bố bởi Pham và

cộng sự (2000). Các EPS có khối lượng phân tử thấp tạo thành được lý giải là từ quá

trình thủy phân các sản phẩm có khối lượng phân tử cao do enzyme glycosyl-

hydrolase xúc tác [95].

Sự đa dạng về đặc điểm lý hóa của các EPS từ các chủng vi khuẩn khác nhau

thuộc LAB từ các công trình nghiên cứu đã công bố được tóm tắt ở Bảng 1.3

29

Bảng 1.3. Tổng quan các nghiên cứu về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố

Chủng vi

khuẩn thuộc

chi

Lactobacillus

(Lb.)

Khối

lượng

phân tử

(Da)

Thành phần, tỉ lệ

phân tử tương

ứng

Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…)

Tác giả

(năm)

[TLTK]

Lb.

acidophilus

LMG9433

D-glc: D-gal:

D-glcA :2-

acetamido-2-

deoxy-D-glc =

2:1:1:1

β-D-GlcpNAc

4)-β-D-GlcpA-(16)-α-D-Glcp-(14)- β-D-Galp-(14)- β-

D-Glcp-(1

Robijn và

cộng sự

(1996)

[102]

Lb. helveticus

K16

D-glc:D-gal = 2:1

β-D-Galp

β-Glcp-(12- β-D-Glcp

4)-β-Glcp-(14)-α-Glcp-(14)- β-D-Galp-(1

Yang và

cộng sự

(2000)

[137] 1

4

1

6

1

3

30

Chủng vi

khuẩn thuộc

chi

Lactobacillus

(Lb.)

Khối

lượng

phân tử

(Da)


phân tử tương

ứng


Tác giả

(năm)

[TLTK]

Lb. delbrueckii

subsp.

bulgaricus 291

1,4 x 106

β-D-Galp-(14)- β-D-Glcp

4)-β-Glcp-(14)-α-Glcp-(14)- β-D-Galp-(1

Faber và

cộng sự

(2001) [39]

Lb. rhamnosus

KL37C

D-glc:D-gal = 1:3 3)-α-Glcp-(12)-β-D-Galp-(16)-α-D-Galp-(16)-α-D-

Glcp-(13)-β-D-Galf(1

Lipin’ski

(2003) [74]

Lb. delbrueckii

ssp. bulgaricus

LBB.B332

D-glc:D-gal:L-rha

= 1:2:2 3)-α-D-Glcp-(13)-α -D-Galp-(13)-α-L-Rhap -(12)-α-L-

Rhap 12)- α-D-Galp-(1

Sanchez-

Medina

(2007)

[108]

Lb. delbrueckii

ssp. bulgaricus

LBB.B26

D-glc:D-gal = 2:3

α-D-Glcp

3)-α-Galp-(13)-β-Galp-(14)- β-D-Glcp-(13)- β-D-Galf-

(1

Sanchez-

Medina

(2007)

[108]

1

6

1

6

31

Chủng vi

khuẩn thuộc

chi

Lactobacillus

(Lb.)

Khối

lượng

phân tử

(Da)


phân tử tương

ứng


Tác giả

(năm)

[TLTK]

Lb. pentosus

LPS26

2,0 x 106 D-glc:D-GlcA:L-

rha = 1:2:2 4)-α-D-Glcp-(13)-α -D-GlcpA4Ac-(13)-α-L-Rhap-

(14)-α-D-GlcpA-(13)-β-L-Rhap2Ac-(1

Rodríguez-

Carvajal và

Gil-Serran

(2008)

[104]

Lb. johnsonii

142

1,0 x 105 D-glc:D-gal = 1:4 3)-α-Glcp-(12)-β-D-Galp-(16)-α-D-Galp-(16)-α-D-

Glcp-(13)-β-D-Galf(1

Górska và

cộng sự

(2010) [52]

Lb. rhamnosus

KL37B

4)-α-D-Galp-(16)- α-D -Galp-(16)- β-

D-Galp-(16)- β -D-Galf-(1 3)- β -Glcp-(1 6)- β -Galf-

(16)- β -Galf-(1

α-D-Glcp-(12)- β -Glcp

Górska-Fra˛

czek và

cộng sự

(2011) [54]

Lb. johnsonii

FI9785

6)-α-Glcp-(13)- β -Glcp-(15) β -Galf-(16)- α -Glcp-(1

4)- β -Galp-(1 4)- β -Glcp-(1

Dertli và

cộng sự

(2013) [33]

3

1

32

Chủng vi

khuẩn thuộc

chi

Lactobacillus

(Lb.)

Khối

lượng

phân tử

(Da)


phân tử tương

ứng


Tác giả

(năm)

[TLTK]

Lb. fermentum

TDS030603

D-glc:D-gal =

2,6:1,0

[3)-β-D-Glcp-(13)-α -D-Glcp-(1]n

Gerwig và

cộng sự

(2013) [49]

Lb. plantarum

70810

r-EPS1: D-glc:D-

man:D-gal =

18,21:78,76:3,03

r-EPS2: D-glc:D-

man:D-gal =

12,92:30,

89:56,19

Wang và

cộng sự

(2014)

[126]

Lb. plantarum

YW32

D-man:D-fruc: D-

gal: D-glc =

8,2:1,0:4,1:4,2

Wang và

cộng sự

(2015)

[124]

2

1

α-D-Galp

6

1

α-Glcp

33

Chủng vi

khuẩn thuộc

chi

Lactobacillus

(Lb.)

Khối

lượng

phân tử

(Da)


phân tử tương

ứng


Tác giả

(năm)

[TLTK]

Lb. delbrueckii

subsp.

bulgaricus

OLL1073R-1

5,0 x 106 D-glc:D-gal =

1,0:1,5

β-D-Galp

[2)-α-D-Glcp-(13)-β-D-Glcp-(13) β-D-Galp-(14)- α-D-

Galp-(1]n

Calsteren và

cộng sự

(2015) [17]

Lb. fermentum

Lf2

D-glc:D-gal = 2:1 Ale và cộng

sự (2016)

[12]

1

4

34

Từ kết quả tổng hợp trên Bảng 1.3 cho thấy các EPS được sinh tổng hợp từ các

chủng thuộc LAB có sự đa dạng về thành phần, mối liên kết, tỉ lệ các monosaccharide

trong cấu trúc của chúng. Cùng một loài vi khuẩn giống nhau nhưng khả năng sinh

tổng hợp EPS có thể khác nhau (có thể là HoPS hoặc là HePS). Sự khác nhau giữa

các EPS tổng hợp được có thể do nguồn thu nhận các vi khuẩn này khác nhau, điều

kiện nuôi cấy và thành phần môi trường nuôi cấy không giống nhau. Trong luận án

này, để xác định cấu trúc của EPS thu được chúng tôi cũng tiến hành sử dụng phương

pháp phân tích GC-MS để xác định thành phần monosaccharide, dạng liên kết và các

phổ NMR nhằm khẳng định lại một số thông tin chi tiết trong cấu trúc như cấu hình

anomer, thành phần monosaccharide, loại liên kết,…

Ở Việt Nam, các công bố về EPS từ LAB nói chung và từ chủng Lb. fermentum

nói riêng còn rất hạn chế. Đa số các nguồn cung cấp PS trong các nghiên cứu tại Việt

Nam mà chúng tôi đã cập nhật được chủ yếu là từ các loài nấm [1], [8], [3], tảo [4],

các loại rong [7],.. Các công trình này nghiên cứu đa phần tập trung vào điều kiện

tách chiết, thu nhận, các tính chất hóa lý,…Chính vì vậy, để góp phần tạo nên sự đa

dạng và phong phú hơn về nguồn thu nhận các PS, đặc biệt là các PS từ LAB, trong

các nội dung của luận án, chúng tôi đã tiến hành thực hiện các nghiên cứu về điều

kiện thu nhận, quá trình tách chiết cùng các tính chất có tiềm năng ứng dụng trong

công nghệ thực phẩm cũng như xác định một số đặc điểm lý hóa về cấu trúc của các

EPS mới thu nhận được này.

1.4.4. Về tính chất công nghệ và các tác dụng về sức khỏe

Xuất phát từ nhu cầu ngày càng tăng về các polyme tự nhiên sử dụng với nhiều

ứng dụng khác nhau đã dẫn đến sự quan tâm và nghiên cứu về EPS từ vi sinh vật nói

chung và từ LAB nói riêng được phát triển mạnh mẽ. Bên cạnh những tác dụng chức

năng trong thực phẩm như tạo gel, tạo độ đặc, ổn định cấu trúc sản phẩm, hạn chế sự

tách nước…đã được ứng dụng từ lâu, một khía cạnh khác của EPS từ LAB cũng đã

được nghiên cứu phổ biến trong những năm trở lại đây như khả năng chống oxy hóa,

chống ung thư, kích thích khả năng miễn dịch và làm giảm cholesterol.

1.4.4.1. Các tác động liên quan đến sức khỏe của EPS

35

Hoạt động chống oxy hóa của EPS (LPC-1) tách chiết từ Lb. plantarum C88 đã

được nghiên cứu bởi Zhang và cộng sự (2013). Kết quả nghiên cứu cho thấy, EPS từ

Lb. plantarum C88 có khả năng loại bỏ tốt đối với các gốc hydroxyl. Mặt khác, hiệu

quả bảo vệ của LPC-1 đối với H2O2 – là tác nhân gây ra sự tổn thương do oxy hóa tế

bào Caco-2 đã được khảo sát. Kết quả cũng đã chỉ ra rằng tổng hoạt lực chống oxy

hóa (T-AOC) của LPC-1 phụ thuộc vào nồng độ; tác dụng chống oxy hóa liên quan

đến khả năng làm tăng hoạt lực của enzyme và các hoạt động chống oxy hóa phi

enzyme cũng như giảm sự hình thành peroxy của lipid [139]. Hoạt động chống oxy

hóa của EPS sinh tổng hợp từ các chủng vi khuẩn khác nhau thuộc LAB cũng được

công bố bởi Kodali và cộng sự (2008) [65], Li và cộng sự (2014) [73], Polak và cộng

sự (2013) [96] … Một số tác động khác liên quan đến sức khỏe cũng được tổng hợp

ở Bảng 1.4.

Bảng 1.4. Tổng quan các nghiên cứu liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp

từ LAB đã được công bố

EPS từ các chủng vi

khuẩn thuộc LAB

Tác động liên quan đến sức khỏe Tác giả (năm)

[TLTK]

Lb. lactis subsp.

cremoris SBT 0495 Hỗ trợ quá trình chuyển hóa cholesterol Nakajima và cộng

sự (1992) [85]

Lb. acidophilus - Giúp làm giảm sự hình thành màng sinh

học từ E. coli O157:H7 Kim và cộng sự

(2009) [63]

Lb. reuteri Ức chế enterotoxigenic Escherichia coli

gây ra sự ngưng kết hồng cầu Wang và cộng sự

(2010) [129]

Lb. plantarum 70810 - Ức chế chống lại các tế bào ung thư

HepG-2, BGC-823 và HT-29 Wang và cộng sự

(2014) [125].

Bifidobacterium

bifidum WBIN03 (B-

EPS) và Lb.

plantarum R315 (L-

EPS)

- Chống oxy hóa

- Có hoạt tính kháng khuẩn chống lại tác

nhân gây bệnh như Escherichia coli,

Staphyloccocus aureus, Candida

albicans, Bacillus cereus, Salmonella

typhimurium, và Shigella sonnei,…

Li và cộng sự

(2014) [72]

36

1.4.4.2. Các tác dụng liên quan đến các sản phẩm thực phẩm

Trong thời gian qua, đã có rất nhiều nghiên cứu khai thác tác dụng có lợi của

EPS sinh tổng hợp từ LAB được tiến hành trong điều kiện in vitro. Các nghiên cứu

này chủ yếu tập trung quanh sữa và các sản phẩm từ sữa với vai trò của EPS tác động

lên những tính chất chức năng của sản phẩm: EPS từ S. thermophiles giúp làm tăng

độ ẩm, cải thiện được những đặc tính tan chảy của pho mát Mozzarella [93], làm tăng

khả năng giữ ẩm [76], [92]; EPS từ S. thermophilus, S. cremoris, và Lb. bulgaricus

giúp làm giảm khả năng tách nước, giảm độ cứng tương đối và độ nhớt biểu kiến

[110].

Những tính chất chức năng được tạo nên nhờ có sự có mặt của các EPS (có thể

được bổ sung vào hoặc được tổng hợp trực tiếp trong quá trình sản xuất sản phẩm)

đã góp phần hạn chế được việc sử dụng các phụ gia tổng hợp. Từ đó giúp duy trì tính

chất tự nhiên, nâng cao chất lượng sản phẩm đáp ứng được yêu cầu về mức độ an

toàn cần thiết và nâng cao lòng tin của người tiêu dùng khi sử dụng những sản phẩm

có sự có mặt của hợp chất này.

Tóm lại, các EPS sinh tổng hợp từ các chủng LAB đã mang lại rất lớn những

tiềm năng quan trọng trong các ngành công nghiệp và đối với sức khỏe con người.

Tuy nhiên, với sự đa dạng về các chủng loài các vi khuẩn, cũng như sự phong phú về

nguồn phân lập các vi khuẩn này, sẽ không có sự giống nhau về điều kiện thu nhận,

các đặc tính lý hóa giữa các EPS tổng hợp được. Do đó, để quá trình tổng hợp EPS

từ mỗi vi khuẩn hiệu quả hơn, việc tìm ra các thông số lý hóa thích hợp như thành

phần môi trường, nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy là hết sức cần thiết. Bên cạnh đó,

việc xác định các điều kiện tách chiết, các tính chất lý hóa tương ứng với mỗi loại

EPS thu nhận khác nhau cũng như các đặc điểm về cấu trúc của các EPS này sẽ là cơ

sở và nền tảng giúp chúng ta có thể sử dụng chúng trong thực tiễn tốt hơn. Đây cũng

là những nội dung chính sẽ được nghiên cứu và làm sáng tỏ trong luận án.

37

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

- Các chủng vi khuẩn lactic được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này bao

gồm: Lb. fermentum TC12, Lb. fermentum TC13, Lb. fermentum TC14, Lb.

fermentum TC15, Lb. fermentum TC16, Lb. fermentum TC18, Lb. fermentum TC19,

Lb. fermentum TC20, Lb. fermentum TC21, Lb. fermentum MC2, Lb. fermentum

MC3, Lb. fermentum N9 và Lb. fermentum N10. Các chủng này được cung cấp bởi

phòng thí nghiệm vi sinh, Đại học Ghent, Bỉ (BCCM/LMG: Belgian Co-ordinated

Collections of Microorganisms/ Laboratory for Microbiology).

- Các EPS được sinh tổng hợp từ các chủng Lb. fermentum được chọn.

2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

2.2.1. Hóa chất

- MeOH, CHCl3,, NaBH4, TFA, TCA (hãng Merck - Đức).

- (CH3)2SO, (CH3CO)2O, C6H6, CH3COOC2H5 (hãng Daejung Chemicals &

Metals - Hàn Quốc).

- NaOH, HCl, NH3 đậm đặc, CH3COOH, D-glucose, H2SO4 đậm đặc, (CH3)2SO4

(Trung Quốc).

- EtOH tuyệt đối 99,9% của công ty cổ phần hóa chất Đức Giang (Việt Nam).

- MRS lỏng (hãng Scharlau – Tây Ban Nha) (Phụ lục 2.1) và môi trường MRS

agar: có thành phần là môi trường MRS có bổ sung 10 – 15 g agar/l.

2.2.2. Thiết bị và dụng cụ

Máy quét phổ tử ngoại - khả kiến mẫu lỏng (UV-Vis DRS-Jacos V630, Nhật

Bản).

Thiết bị Bruker Avance 500MHz.

Thiết bị GC-MS (Shimadzu, Nhật Bản, 2010).

Hệ thống sắc ký lỏng của hãng Agilent (USA).

Máy ly tâm Universal R320, Máy li tâm để bàn K241R (Hettich-Đức).

Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật khác: tủ sấy, tủ cấy,

tủ ấm, tủ lạnh, nồi hấp khử trùng,…

38

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ

quang (OD)

Nguyên tắc: Khi ánh sáng đi qua môi trường lỏng có nhiều hạt rắn lơ lửng sẽ

bị tán xạ trở lại và dẫn đến cường độ tia sáng ló ra thấp hơn so với cường độ tia sáng

đi vào, việc so sánh độ chênh lệch cường độ tia sáng sẽ phản ánh một cách tương đối

lượng chất rắn lơ lửng trong môi trường. Ngoài ra, chính bản thân chất lỏng cũng hấp

thụ một phần ánh sáng. Do đó, lượng ánh sáng đi qua cũng bị ảnh hưởng bởi bản chất

của môi trường lỏng. Để đánh giá mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy, ta có thể xem tế

bào như các hạt rắn lơ lửng, và tiến hành đo mức hấp thụ của dịch tế bào nuôi cấy,

đối chiếu với môi trường lỏng không có sinh khối sẽ cho ra lượng tương đối của sinh

khối vi khuẩn.

Để xác định mật độ tế bào vi khuẩn, canh trường được đo OD ở bước sóng

600nm. Tham chiếu giá trị OD 600nm = 1 tương ứng với mật độ tế bào là 8*108

CFU/ml (http://www.genomics.agilent.com/biocalc…/calcODBacterial.jsp).

Số ml môi trường cần hút =Số ml môi trường lên men x mật độ tế bào cần bổ sung

𝑂𝐷𝑐𝑎𝑛ℎ 𝑡𝑟ườ𝑛𝑔 x 8 x 108

Đo mật độ quang trên thiết bị Thermo Spectronic Genesys 10 UV/Vis.

2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối [6]

Chủng Lb. fermentum

từ ống giống gốc

MRS agar

- Cấy ria

Khuẩn lạc thuần

- Ủ ở 37oC, 24 giờ

MRS lỏng

- Ủ ở 37oC, 24 giờ

- Ly tâm 5000 vòng/phút, 4oC, 5 phút

- Rửa hai lần bằng 1% pepton + 0,85% NaCl (tái huyền phù)

Sinh khối (điều chỉnh OD600nm = 1)

(1)

Hình 2.1. Sơ đồ nuôi cấy thu nhận sinh khối

http://www.genomics.agilent.com/biocalculators/calcODBacterial.jsp

39

Các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 từ ống giống gốc được cấy

ria trên môi trường MRS agar, và ủ trong tủ ấm ở 37oC, 24 giờ. Khuẩn lạc thuần sau

đó được cấy vào môi trường MRS lỏng, ủ trong tủ ấm ở 37oC, 24 giờ. Sinh khối được

thu nhận sau khi ly tâm 5000 vòng/phút ở 4oC, trong 5 phút và rửa lại 2 lần bằng dung

dịch 1% pepton + 0,85% NaCl được tái huyền phù và xác định mật độ tế bào bằng

phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm.

2.3.3. Phương pháp thu nhận và tách EPS

Quá trình thu nhận và tách chiết EPS được thực hiện như Yuksekdag và Aslim

có sửa đổi [138]. Sinh khối tế bào thu nhận theo sơ đồ Hình 2.1 của các chủng Lb.

fermentum được bổ sung vào các môi trường cần khảo sát. Tiến hành lên men ở 37oC

trong 24 giờ sau đó tủa protein bởi acid trichloroacetic 30% (TCA). Dịch nổi thu được

sau khi ly tâm, kết tủa EPS bởi ethanol lạnh lần 1 (tỷ lệ dịch nổi: ethanol = 1: 2). Hòa

tan tủa trong nước cất 50oC (khoảng 2 ml). EPS trong dịch nổi thu được sau khi ly

Dịch lên men từ các chủng

Lb. fermentum

- Xử lý nhiệt (1000C, 15 - 20 phút)

- Làm nguội

- Bổ sung 30% TCA, giữ trong 24 giờ

- Ly tâm (13000 vòng/phút, 10 phút, 4oC)

Dịch nổi chứa EPS

EPS tủa

Phương pháp phenol-sulfuric

- Nước cất 50oC

- Bổ sung ethanol lạnh, giữ ở 4oC


Môi trường dinh dưỡng

- Bổ sung sinh khối tế bào

- Ủ ở 37oC trong 24 giờ

Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận và tách EPS

40

tâm được kết tủa bởi ethanol lạnh lần 2 (tỷ lệ dịch nổi: ethanol = 1: 2). Kết tủa được

tiếp tục hòa tan trong nước cất 50oC. Dung dịch này được xác định hàm lượng EPS

bằng phương pháp phenol – sulfuric.

2.3.4. Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS

từ một số chủng Lb. fermentum

Các chủng Lb. fermentum khác

nhau từ ống giống gốc

Nuôi cấy thu nhận sinh khối

- Điều chỉnh OD600nm=1

- Lên men trong môi trường MRS, 37oC, 48 giờ

Thu nhận và tách chiết EPS

Phương pháp phenol-sulfuric

Chọn chủng có khả năng sinh

tổng hợp EPS cao

- Nuôi thu nhận sinh khối

- Lên men trong các điều kiện khác nhau

Làm lạnh

- Bổ sung TCA ở các nồng độ khác nhau

- Giữ 24 giờ

Ly tâm (13000 vòng/phút, 10

phút, 4oC)

- Bổ sung ethanol lạnh với các tỉ lệ khác nhau,

- Giữ ở 4oC

Protein

Ly tâm (6000 vòng/phút,

10 phút, 4oC) EPS tủa Phương pháp

phenol-sulfuric

Phương pháp kjeldahl

Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu khảo sát cải thiện hiệu suất thu nhận EPS

41

Hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum sau khi cải thiện các điều

kiện của quá trình lên men so với môi trường ban đầu (MRS) là lượng EPS thu được

trong môi trường lên men với các điều kiện thích hợp nhất (về thành phần môi trường,

điều kiện lên men) so với lượng EPS thu được trong điều kiện lên men ban đầu với

môi trường MRS và được xác định bằng %, theo công thức số 2:

2.3.4.1. Phương pháp tuyển chọn các chủng Lb. fermentum có khả năng sinh tổng

hợp EPS cao

Các chủng Lb. fermentum (TC12, TC13, TC14, TC15, TC16, TC18, TC19,

TC20, TC21, MC2, MC3, N9, N10) được nuôi thu nhận sinh khối theo Hình 2.1 sau

đó tiến hành lên men trong 48 giờ ở 37oC trong môi trường MRS. Thực hiện tách, thu

nhận EPS theo Hình 2.2 và xác định hàm lượng EPS để chọn ra các chủng có khả

năng sinh tổng hợp EPS cao.

2.3.4.2. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng (nguồn carbon

và nitrogen)

Bổ sung thêm lần lượt vào môi trường MRS chứa (g/l): pepton 10, cao thịt 8,0,

cao nấm 4,0, glucose 20, K2HPO4 2,62, MgSO4 0,2, MnSO4 0,038, NH4 2,0,

CH3COONa 5,0, Tween 1,0 các nguồn C và nguồn N ở các nồng độ khác nhau. Các

nguồn C sử dụng để khảo sát bao gồm suc, lac, glc với nồng độ (2%, 3%, 4%, 5%,

6%) và các nguồn N bao gồm pepton, cao thịt, cao nấm với các nồng độ 0,2%; 0,4%;

0,6%; 0,8%; 1,0% cho cả pepton và cao thịt; 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5% cho cao

nấm. Mẫu đối chứng là môi trường MRS không bổ sung thêm nguồn C và nguồn N.

Tiến hành nuôi các chủng Lb. fermentum được tuyển chọn (kết quả mục 2.3.4.1) với

các điều kiện lên men khác như pH, nhiệt độ, thời gian và tách EPS được thực hiện

như mục 2.3.3. Hàm lượng EPS được xác định bằng phương pháp phenol-sulfuric

[37].

Hiệu suất thu nhận EPS (%) =

Hàm lượng EPS thu được trong môi trường

lên men thích hợp nhất được chọn

Hàm lượng EPS thu được trong môi

trường ban đầu MRS

x 100 (2)

42

2.3.4.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu

Thực hiện nuôi cấy các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 trong

môi trường MRS có chứa nguồn C và N bổ sung ở nồng độ thích hợp (kết quả mục

2.3.4.2) với mật độ tế bào ban đầu khác nhau (104, 105, 106, 107, 108 CFU/mL). EPS

được thu nhận và tách (theo mục 2.3.3) và xác định hàm lượng bằng phương pháp

phenol-sulfuric.

2.3.4.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường

Các chủng LAB được nuôi cấy trong môi trường MRS chứa nguồn C và N ở

nồng độ thích hợp với mật độ tế bào ban đầu đã khảo sát (kết quả của các mục 2.3.4.2

và 2.3.4.3) ở các giá trị pH ban đầu của môi trường khác nhau (4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0;

6,5). EPS được thu nhận và tách như đã trình bày ở mục 2.3.3 và xác định hàm lượng

bằng phương pháp phenol-sulfuric.

Sử dụng HCl 1N và NaOH 1N để điều chỉnh pH môi trường về 6,0 – 6,2. Độ

pH được đo bằng thiết bị Thermo Scientific Orion 1112001 3-star benchtop.

2.3.4.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên men

Với kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn C, N và của mật độ tế bào nuôi cấy

ban đầu ở mục 2.3.4.2, 2.3.4.3, các chủng LAB được nuôi cấy ở các mức nhiệt độ

khác nhau (30oC, 35oC, 40oC, 45oC) với pH ban đầu thích hợp tương ứng (kết quả

mục 2.3.4.4). EPS được thu nhận và tách như đã trình bày ở mục 2.3.3 và xác định

hàm lượng bằng phương pháp phenol-sulfuric.

2.3.4.6. Phương pháp khảo sát đường cong sinh trưởng và ảnh hưởng của thời gian

lên men

Tiến hành nuôi cấy các tế bào của các chủng Lb. fermentum được tuyển chọn

trong môi trường MRS có bổ sung thêm các thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuôi

cấy thích hợp đã được xác định theo kết quả từ mục 2.3.4.2 đến mục 2.3.4.5. Để khảo

sát đường cong sinh trưởng bao gồm các chỉ tiêu về sự biến đổi của mật độ tế bào, sự

biến đổi của pH môi trường theo thời gian lên men, chúng tôi đã thực hiện lấy mẫu ở

các mốc thời gian lên men khác nhau (0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ và

72 giờ). Các mẫu thu được sử dụng để đo các chỉ số về mật độ tế bào, pH, tiến hành

tách EPS (theo mục 2.3.3) và xác định hàm lượng bằng phương pháp phenol-sulfuric.

43

2.3.4.7. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TCA lên khả năng loại bỏ

protein trong dịch lên men

Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung vào dịch lên men thu được sau quá trình

nuôi cấy các chủng Lb. fermentum nhằm loại bỏ protein đã được thực hiện với các

nồng độ bổ sung khác nhau so với dịch lên men bao gồm: 10%, 15%, 20%, 25%,

30%, 35%, 40%. Trình tự khảo sát được thực hiện theo sơ đồ Hình 2.3. Các protein

kết tủa được tách khỏi dịch nổi bằng cách ly tâm. Hàm lượng protein còn lại trong

dịch nổi sẽ được thông qua lượng nitơ tổng số bằng phương pháp kjeldahl [5].

2.3.4.8. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của thể tích ethanol và thời gian tủa lên

quá trình thu nhận EPS tủa từ dịch nổi

Dịch nổi thu được sau khi ly tâm tách bỏ protein (kết quả mục 2.3.4.7) sẽ tiếp

tục được kết tủa bằng ethanol với thể tích bổ sung vào so với dịch nổi theo tỉ lệ khác

nhau (ethanol: dịch nổi bao gồm: 1:1; 1,5:1; 2:1; 2,5:1; 3:1). Thời gian tủa bằng

ethanol được khảo sát sau khi xác định được thể tích ethanol bổ sung vào. Các mức

thời gian khảo sát là: 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ. Lượng EPS kết tủa thu được

sau khi ly tâm tiếp tục được hòa tan vào nước cất khoảng 50oC và xác định hàm lượng

bằng phương pháp phenol-sulfuric. Quá trình khảo sát được thực hiện theo sơ đồ Hình

2.3.

2.3.5. Xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol-sulfuric [37]

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng thuỷ phân polysaccharide thành monosaccharide,

monosaccharide tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bước

sóng λ = 490 nm. Xây dựng đường chuẩn glucose sau đó đo mẫu thực và tính ra lượng

EPS.

1 ml dung dịch có chứa EPS được trộn với 1 ml phenol 5% và 5 ml H2SO4 đậm

đặc, votex và hấp cách thủy 2 phút. Làm nguội về nhiệt độ phòng trong 30 phút. Đo

OD490nm. Tính hàm lượng EPS dựa trên đường chuẩn glucose.

Cách xây dựng đường chuẩn:

+ Cân chính xác 0,2500 (g) D-glucose cho vào bình định mức 250 ml rồi định

mức bằng nước cất ta được dung dịch A. Như vậy, nồng độ dung dịch D-glucose là

1 mg/ml (1000 μg/ml).

44

- Lấy 50 ml dung dịch A pha thành 500 ml thu được dung dịch D-glucose có

nồng độ 100 μg/ml (dung dịch B).

- Lần lượt lấy 0; 25; 50; 75; 100 ml dung dịch B pha thành 100 ml thu được

dung dịch D-glucose có nồng độ là 0; 25; 50; 75; 100 μg/ml.

- Lấy 125 ml dung dịch A pha thành 500 ml thu được dung dịch D -glucose có

nồng độ 250 μg/ml (dung dịch C).

- Lần lượt lấy 50; 60; 70; 80 ml dung dịch C pha thành 100 ml thu được dung

dịch D-glucose có nồng độ là 125; 150; 175; 200 μg/ml.

- Mỗi mẫu lấy 1 ml cho vào ống nghiệm có nút, thêm vào mỗi ống nghiệm

1ml dung dịch phenol 5%, 5 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm.

- Đặt các ống nghiệm vào cốc nước sôi trong 2 phút, sau đó làm lạnh các ống

nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.

- Đo độ hấp thụ quang (A) của các dung dịch này ở bước sóng 490 nm, thu

được các giá trị độ hấp thụ quang.

- Từ các kết quả thu được, xây dựng đường chuẩn glucose (phụ lục 1).

2.3.6. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [5]

Nguyên tắc: Chuyển hóa các hợp chất nitơ trong mẫu về dạng muối amoni

(NH+4) bằng cách đun nóng trong dung dịch acid sulfuric đậm đặc (H2SO4) với sự có

mặt của chất xúc tác đồng sulfat (CuSO4), sau đó chưng cất amoniac (NH3) trong môi

trường kiềm (NaOH) và hấp thụ bằng dung dịch acid boric (H3BO3). Tiến hành chuẩn

độ amoni tetraborat [(NH4)2B4O7] bằng dung dịch acid tiêu chuẩn (H2SO4 0,1N) từ

đó tính hàm lượng nitơ trong mẫu.

Tính kết quả: Hàm lượng nitơ tổng có trong mẫu được tính theo công thức:

Nmg% = w

V 10042,1

trong đó: V- số ml H2SO4 0,1N chuẩn độ

1,42 – số mg nitơ tương ứng với 1ml H2SO4 0,1N

100 – hệ số chuyển thành %

w – khối lượng mẫu (mg)

(3)

45

2.3.7. Phương pháp khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công

nghệ thực phẩm

2.3.7.1. Phương pháp khảo sát khả năng hòa tan trong trong nước [10]

Khả năng hòa tan trong nước của các EPS tách chiết từ dịch nuôi cấy các chủng

Lb. fermentum được thực hiện theo Ahmed và cộng sự có sửa đổi [10]. Cụ thể là chế

phẩm EPS (50 mg) (thu nhận theo sơ đồ Hình 2.4) được hòa tan trong 1ml nước và

khuấy liên tục ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau đó, dung dịch được ly tâm ở 13000

vòng/phút trong 15 phút để tách EPS không tan. Lượng EPS hòa tan trong nước được

xác định bằng phương pháp phenol – sulfuric acid.

Khả năng hòa tan được tính theo công thức sau:

Khả năng hòa tan (%) = Khối lượng của EPS trong dịch nổi

Khối lượng mẫu EPS

x 100 (4)

Dịch nuôi cấy các chủng Lb. fermentum

(TC13, TC16, TC21, MC3)

- Xử lý nhiệt (1000C, 15 - 20 phút)

- Làm lạnh

- Bổ sung TCA, giữ 24 giờ


- Bổ sung ethanol lạnh, giữ 4oC


EPS tủa

- Thẩm tích với nước, giữ qua đêm

Chế phẩm EPS

Xác định một số tính chất

của EPS

Đông khô

Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu một số tính chất có tiềm năng

ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

46

Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tránh sai số.

2.3.7.2. Phương pháp khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu [10]

Huyền phù gồm 0,2 g mẫu (thu nhận theo sơ đồ Hình 2.4) và 10 ml nước cất

được ly tâm 5.000 vòng/phút trong 25 phút để tách lượng nước không được giữ bởi

EPS. Sau đó, giọt toàn bộ lên giấy lọc đã biết trước khối lượng để thấm hết lượng

nước bị tách ra. Cân lại khối lượng của EPS đã hấp thụ bởi nước và tính theo công

thức 5.

Dầu được sử dụng trong khảo sát là dầu Đậu nành Simply, sản xuất bởi Chi

nhánh Công ty tinh dầu thực vật Cái lân tại Hiệp Phước, thành phố Hồ Chí Minh.

Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tránh sai số.

2.3.7.3. Phương pháp khảo sát khả năng chống oxy hóa thông qua khả năng bắt gốc

tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl) [65]

Nguyên tắc: Dựa vào khả năng các chất kháng oxy hóa chuyển hóa gốc tự do

1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl thành sản phẩm phân tử làm cho dung dịch chuyển từ

màu tím sang vàng. Chất đối chứng là vitamin C (acid L-ascorbic)

Cách tiến hành

Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH xác định khả năng cho hydro của mẫu thử có khả

năng kháng oxy hóa. Pha dung dịch DPPH nồng độ 100 µM trong ethanol tuyệt đối

99,9% ngay trước khi dùng. Hỗn hợp phản ứng có thể tích 3000 µL, gồm 2000 µL

mẫu chế phẩm EPS khảo sát ở các nồng độ khác nhau và 1000 µL dung dịch DPPH

nồng độ 100 µM. Các hỗn hợp phản ứng được lắc trong 1 phút và ủ ở nhiệt độ phòng

trong 30 phút, rồi tiến hành đo quang ở bước sóng 517 nm.

Khả năng bắt gốc tự do của DPPH được xác định bằng công thức 6:

Trong đó:

SA DPPH (%): khả năng bắt gốc tự do (Scavenging Activity) của DPPH

AS : mật độ quang của mẫu khảo sát

AC: mật độ quang của mẫu trắng không chứa mẫu

SADPPH (%) = AC –AS

AC x 100 (6)

WHC (%) = Khối lượng của EPS sau khi hấp thụ nước /dầu

Khối lượng mẫu EPS

x 100 (5)

47

Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tránh sai số. Khả năng bắt gốc tự do được

đánh giá qua giá trị IC50. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do DPPH

càng cao.

2.3.8. Phương pháp xác định khối lượng phân tử và đặc điểm cấu trúc của EPS

2.3.8.1. Phương pháp xác định khối lượng phân tử bằng sắc ký thẩm thấu gel [44]

Khối lượng phân tử của các EPS được xác định bằng phương pháp sắc kí thẩm

thấu gel với hệ thống sắc kí lỏng 1100 của hãng Agilent (USA) tại Phòng thí nghiệm

phân tích trung tâm, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí

Minh. Chất chuẩn sử dụng là các phân tử pullulan có phân tử lượng khác nhau (5, 10,

20, 50 và 100, 200, 400 và 800 kDa) được cho chạy qua cột sắc ký ultrahydrogen 500

(7,8 mm x 300 mm, 10 µm) và rửa giải với NaNO3 0,1M pha trong nước khử ion,

chạy đẳng dòng với tốc độ 1mL/phút. Nhiệt độ đầu dò được ổn nhiệt ở 35oC, lò cột

được ổn nhiệt tại 40oC. Thể tích rửa giải được minh họa bằng đồ thị tương ứng với

khối lượng phân tử của chúng. Tương tự, EPS đã được hòa tan trong NaNO3 0,1M sẽ

được bơm vào cột và rửa giải với tốc độ như trên. Thể tích rửa giải được phác thảo

trên cùng đồ thị với chất chuẩn và xác định khối lượng phân tử.

2.3.8.2. Phương pháp methyl hóa – thủy phân cắt mạch – khử hóa – tạo dẫn xuất -

phân tích GC-MS để xác định vị trí liên kết glycoside của EPS [7]

* Nguyên tắc

- Methyl hóa sau đó thủy phân cắt mạch, khử hóa, acetyl hóa và xác định thành

phần dẫn xuất monosaccharide bằng GC-MS

- Methyl hóa các nhóm –OH tự do của PS thành –OCH3.

- Thủy phân cắt mạch dẫn xuất methyl-PS thành monosaccharide, do đó các vị

trí tạo liên kết O=glycoside sẽ tạo thành -OH tự do.

- Acetyl hóa: các vị trí –OH tự do của liên kết O-glycoside ban đầu sẽ bị O-

acetyl hóa, các vị trí đã bị O-methyl hóa thì không xảy ra phản ứng.

- GC-MS: xác định các dẫn xuất O-methyl O-acetyl của monosaccharide, vị trí

nào bị acetyl hóa thì vị trí đó tạo liên kết glycoside trong PS.

* Cách tiến hành

48

Quá trình methyl hóa EPS, thủy phân tạo dẫn xuất acetyl hóa sau đó phân tích

GC-MS được chỉ ra ở Hình 2.5.

2.3.8.3. Phương pháp tạo dẫn xuất của monosaccharide và phân tích GC-MS để xác

định thành phần các monosaccharide [7]

* Nguyên tắc:

Thủy phân PS thành các monosaccharide, chuyển các monosaccharide sang dẫn

xuất alditol acetate và định tính và định lượng bằng GC-MS.

* Cách tiến hành:

Quá trình tạo dẫn xuất của monosaccharide và phân tích GC-MS để xác định

thành phần các monosaccharide được thể hiện ở Hình 2.6

Hỗn hợp phản ứng

0,3 g mẫu EPS

Dung dịch EPS

EPS đã methyl hóa

1. 15 mL (CH3)2SO

2. Khấy từ 600C bằng dòng N2

1. 7,5g NaOH

2. 12 mL(CH3)2SO4

3. Khuấy từ bằng dòng N2 16 giờ

1. Chiết qua CHCl3:H2O =2:1

2. Cô đuổi dung môi

Methyl hóa

Hình 2.5. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC-MS để xác định liên kết

glycoside

49

* Hệ thống GC-MS sử dụng: GCMS – Shimadzu (2010)

Điều kiện làm việc của thiết bị sắc ký:

Cột tách: cột mao quản DB-5 (chiều dài: 30 m, đường kính trong: 0,32 mm, độ

dày lớp pha tĩnh: 0,25 μm).

Khí mang: He (độ tinh khiết đạt 99,9999%).

Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 275oC.

Điều kiện làm việc của thiết bị khối phổ:

Nguồn ion hoá: nguồn EI (Ion hoá trên cơ sở bắn phá điện tử)

Thủy phân PS

Khử monosaccharide

Acetyl hóa

alditol

alditol

alditol acetate

Phân tích GC-MS

5 (mg) mẫu EPS methyl hóa

4 mL TFA 2 M/ 2 giờ, 120 0C

Bay hơi bằng dòng N2/ 2 lần

5 mL MeOH

monosaccharide

4 mL NaBH4 0,25 M/

NH4OH 1M

5 mL CH3COOH 10%/MeOH


2 mL anhydride acetic : pyridine =

1:1 (v/v)/1000C, 20 phút

5 mL MeOH


Hình 2.6. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC – MS

50

Nhiệt độ nguồn MS: 230oC

Thời gian cắt dung môi: 5 phút

Chế độ phân tích: Scan

Nhiệt độ lò: 65oC

Tốc độ dòng: 2 mL/phút

Chương trình nhiệt độ được cho ở Bảng 2.1.

Bảng 2.1. Chương trình nhiệt độ phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký GC-MS

Tốc độ (oC/phút) Nhiệt độ cuối (oC) Thời gian giữ

(phút)

-

8,00

2,00

65

250

280

1,00

10,00

5,00

Tổng thời gian : 54 phút

2.3.8.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Các mẫu EPS thu được sau khi ly tâm được thẩm tích trong 4 - 5 ngày bằng máy

khuấy từ nhằm loại bỏ các phân tử có khối lượng thấp. Tiến hành thu mẫu bằng

phương pháp đông khô. Để tăng khả năng hòa tan của mẫu, mẫu tiếp tục được xử lý

bằng cách thủy phân với TFA 2M ở 80oC trong 8giờ. TFA dư thừa được loại bỏ bằng

cách đông khô và thu mẫu nhằm phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân.

Phổ NMR (1H-NMR, 13C-NMR) của EPS-MC3 được đo trên thiết bị Bruker

Avance 500MHz trong dung môi DMSO với nồng độ mẫu là 10 mg/ml tại Viện Hóa

học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nhiệt độ đo là 79,85 oC, trừ

trường hợp peak HOD chuyển về trường cao hơn hay độ nhớt của mẫu thấp thì có thể

tăng nhiệt độ để nhận được phổ rõ nét hơn. Độ chuyển dịch hóa học được biểu diễn

theo ppm, sử dụng TMS làm chất nội chuẩn ( 0 ppm).

Phổ một chiều 1H-NMR, 13C-NMR được ghi ở 79,85 oC với các chế độ ghi khác

nhau. Các phổ tương tác hai chiều HSQC, HMBC, COSY, NOESY cũng được ghi

nhận ở các chế độ ghi tương ứng.

2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu

2.3.9.1. Xác định khoảng tin cậy của số liệu thực nghiệm

Khoảng tin cậy của số liệu kết quả nghiên cứu thể hiện như sau:

51

𝑋 ± 𝜀 = �� ± 𝑡(𝑃, 𝑓). 𝑆

√𝑛

Trong đó:

��: là giá trị trung bình của kết quả nghiên cứu sau n thí nghiệm

t(P,f): là giá trị của chuẩn Student với độ tin cậy P=0,95 và bậc tự do f = n-1

S: là độ lệch chuẩn (S) và được tính theo công thức (7):

𝑆 = √∑ (𝑥𝑖 − ��)2𝑛

𝑖=1

𝑛 − 1

2.3.9.2. Sự sai khác của các số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 22.0, sai số giữa các thí nghiệm với

mức ý nghĩa (p<0,05).

- Sử dụng One way ANOVA để chỉ ra có hay không sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê giữa các giá trị trung bình.

- Sử dụng One way ANOVA (Options Homogeneity of variance test) chỉ ra có

hay không sự đồng nhất giữa các phương sai của các nhóm.

Kết quả thể hiện:

- Dựa vào giá trị Sig trong bảng ANOVA để biết có hay không sự khác biệt các

giá trị trung bình:

+ Sig ≤ α (0,05): có sự khác biệt giữa các giá trị trung bình

+ Sig > α: không có sự khác biệt giữa các giá trị trung bình

Các số liệu trong biểu đồ sẽ được kí hiệu bằng các chữa cái a, b, c để phân biệt

sự khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa các cặp giá trị trung bình.

(6)

(7)

52

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb.

fermentum

3.1.1. Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb. fermentum sinh tổng hợp EPS cao

LAB là một nhóm các vi khuẩn đã được công nhận là vi khuẩn an toàn cho thực

phẩm, các sản phẩm thứ cấp do chúng sinh ra đặc biệt là EPS được kết luận là có

nhiều chức năng khác nhau trong công nghệ thực phẩm cũng như trong y học. Tuy

nhiên, nhược điểm chủ yếu của EPS tổng hợp từ LAB là năng suất tạo thành thấp do

đó đã khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ LAB còn hạn chế. Quá trình tổng

hợp EPS liên quan đến rất nhiều yếu tố như chủng vi khuẩn sử dụng ban đầu, nguồn

phân lập, thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy nhất định. Do đó, để tuyển

chọn được các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp EPS tốt, đầu tiên chúng tôi

tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn này (đã được trình bày ở phần đối tượng

nghiên cứu) trong cùng một điều kiện không thay đổi về thành phần môi trường và

các yếu tố như nhiệt độ, pH, mật độ tế bào gieo cấy ban đầu ở một thời gian xác định.

Quá trình khảo sát được thực hiện theo sơ đồ Hình 2.3

Sau 48 giờ lên men, khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng Lb.

fermentum thể hiện ở Hình 3.1.

Trong cùng một điều kiện nuôi cấy, mỗi chủng vi khuẩn thuộc LAB có khả năng

sinh tổng hợp EPS khác nhau (Hình 3.1). Trong số các chủng vi khuẩn được khảo sát,

Lb. fermentum TC13, Lb. fermentum TC16, Lb. fermentum TC21 và Lb. fermentum

MC3 là những chủng có khả năng sinh tổng hợp EPS vượt trội hơn so với các chủng

còn lại (Lb. fermentum TC12, TC14, TC15, TC18, TC19, TC20, MC2, N9, N10).

Lượng EPS đạt được trong điều kiện này lần lượt là 119,142 µg/ml cho chủng Lb.

fermentum TC13; 116,744 µg/ml cho chủng Lb. fermentum TC16; 100,768 µg/ml cho

chủng Lb. fermentum TC21 và 88,776 µg/ml cho chủng Lb. fermentum MC3.

53

Hình 3.1. Khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng vi khuẩn lactic

Ở cùng một điều kiện lên men giống nhau, khả năng sinh tổng hợp EPS của các

chủng vi khuẩn Lb. fermentum có sự khác nhau. Điều này có thể liên quan đến giai

đoạn sinh trưởng và phát triển ban đầu của chính các vi khuẩn đó trước khi được gieo

cấy vào môi trường lên men. Chính vì vậy, trong môi trường mới, một số chủng có

khả năng thích nghi và sinh trưởng tốt hơn sẽ thực hiện quá trình sinh sản sớm hơn

do đó lượng sản phẩm tạo thành từ quá trình trao đổi chất có thể nhiều hơn so với các

chủng khác. Quá trình sinh tổng hợp EPS của một số vi khuẩn có thể xảy ra ở giai

đoạn phát triển, một số khác được tổng hợp trong giai đoạn logarid hoặc giai đoạn ổn

định và đạt các giá trị cực đại ở tại các giai đoạn đó [66].

Như vậy, lượng EPS sinh tổng hợp từ các chủng vi khuẩn khác nhau là không

giống nhau, mặc dù các chủng vi khuẩn này cùng loài. Sự biến động về hàm lượng

35,484i

119,142a

62,516e68,980d

116,744a

68,370d

43,248h50,728g

100,768b

56,581f

88,776c

58,939ef

69,508d

0

20

40

60

80

100

120

140

TC12 TC13 TC14 TC15 TC16 TC18 TC19 TC20 TC21 MC2 MC3 N9 N10

EP

S (

µg/m

l)

Chủng vi khuẩn lactic

(Trong đó: - TC12: Lb. fermentum TC12 - TC20: Lb. fermentum TC20

- TC13: Lb. fermentum TC13 - TC21: Lb. fermentum TC21

- TC14: Lb. fermentum TC14 - MC2: Lb. fermentum MC2

- TC15: Lb. fermentum TC15 - MC3: Lb. fermentum MC3

- TC16: Lb. fermentum TC16 - N9: Lb. fermentum N9

- TC18: Lb. fermentum TC18 - N10: Lb. fermentum N10

- TC19: Lb. fermentum TC19

Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các

chủng

54

EPS sinh tổng hợp bởi các chủng thuộc LAB cũng là kết quả công bố của nhiều tác

giả [44], [118], [136], [141].

Lượng EPS của các chủng còn lại (TC12, TC14, TC15, TC18, TC19, TC20,

MC2, N9, N10) đạt được tương đối thấp, chỉ đạt dưới 70 µg/ml. Từ kết quả này, các

chủng được lựa chọn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo trong luận án sẽ là Lb.

fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3).

3.1.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình sinh

tổng hợp EPS từ các chủng Lb. fermentum tuyển chọn

Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật luôn luôn đòi hỏi một số chất

dinh dưỡng cần thiết với nồng độ phù hợp. Các nguồn C và N là những chất dinh

dưỡng thường sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Việc sử dụng nguồn C

trong môi trường ngoài việc tạo ra năng lượng cho hoạt động sống của vi sinh vật, nó

còn tham gia vào quá trình biến đổi góp phần tạo thành các sản phẩm cuối cùng. Các

nguồn C thường được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật bao gồm glc, suc, rỉ đường,

tinh bột (bột ngô, bột khoai sắn...), cám gạo, … Trong khi đó, nguồn N thường tham

gia vào quá trình tổng hợp các hợp chất chứa N trong tế bào. Một số nguồn N thường

được vi sinh vật sử dụng là protein và các sản phẩm chuyển hóa của protein (peptone,

peptide, amino acid...), muối amoni, nitrate, ... Mỗi loại vi sinh vật khác nhau có nhu

cầu về một chất dinh dưỡng bất kỳ không giống nhau, hơn nữa, chúng cũng có khả

năng đáp ứng với sự biến hóa của nồng độ chất dinh dưỡng, nhất là các chất dinh

dưỡng hạn chế. Do đó, việc khảo sát để bổ sung nguồn dinh dưỡng phù hợp cho các

vi sinh vật có thể sinh trưởng và phát triển thích hợp nhất là điều kiện tất yếu đầu tiên

của nhiều nghiên cứu nhằm thu nhận sản phẩm thứ cấp từ quá trình trao đổi chất của

chúng.

3.1.2.1. Ảnh hưởng của nguồn C và nồng độ của chúng lên khả năng sinh tổng hợp

EPS

Một số công trình nghiên cứu đã kết luận rằng, hàm lượng và kích thước của

EPS có thể thay đổi theo các nguồn C [31], [55], [94]. Do đó, để thực hiện việc khảo

sát ảnh hưởng của nguồn C đến khả năng sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb.

fermentum, trước hết chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng này trong các môi trường

55

MRS có sự bổ sung thêm nguồn C khác nhau bao gồm glc, lac, suc với nồng độ bổ

sung lần lượt là 2%; 3%; 4%; 5%; 6% (chi tiết được mô tả ở mục 2.3.3.2). Thực hiện

lên men ở 37oC trong 48 giờ. Môi trường đối chứng là môi trường MRS không bổ

sung thêm các loại đường. Kết quả thể hiện ở Hình 3.2

Kết quả từ Hình 3.2 cho thấy rằng, so với môi trường đối chứng, các loại đường

khác nhau khi bổ sung vào môi trường MRS phần lớn đều có những ảnh hưởng nhất

định đến khả năng sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn nghiên cứu. Kết quả

Hình 3.2 cũng cho thấy rằng, so với lac và suc, glc là nguồn C có tác dụng kích thích

sớm hơn lên quá trình sinh tổng hợp bởi các chủng này. Hàm lượng EPS tạo thành có

sự thay đổi theo chủng và nguồn C bổ sung. Cụ thể là, lượng EPS tổng hợp bởi Lb.

fermentum TC13 và Lb. fermentum MC3 tăng nhanh và đạt được tốt hơn khi glc được

bổ sung vào; trong khi đó khả năng sinh tổng hợp EPS của Lb. fermentum TC16 và

Lb. fermentum TC21 đạt được cao hơn trong môi trường chứa nguồn C tương ứng là

suc và lac. Lý giải cho kết quả này có thể là do, khi môi trường chứa nhiều nguồn C

Hình 3.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ bổ sung của chúng vào môi trường

MRS đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 4.1

56

khác nhau, ban đầu vi sinh vật sẽ ưu tiên đồng hóa các cơ chất mà chúng thích hợp

nhất để thực hiện quá trình trao đổi chất. Sự đồng hóa các cơ chất còn lại sẽ xảy ra

chậm hơn. Đây có thể là lý do khiến lượng EPS thu được trong các môi trường chứa

các loại đường còn lại thấp hơn. Kết quả tác động tích cực hơn của glc lên khả năng

tổng hợp EPS của hai chủng Lb. fermentum TC13 và Lb. fermentum MC3 trùng khớp

với công bố của Yuksekdag và cộng sự (2008) [138]; Zhang và cộng sự (2011) [141]

khi nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đường bổ sung lên quá trình hình thành EPS

bởi Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus (B3, G12); S. thermophilus (W22) và Lb.

fermentum F6.

Sự tác động của các loại đường lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi LAB còn

liên quan đến các nồng độ bổ sung vào. Hàm lượng EPS đạt cực đại đối với các chủng

Lb. fermentum TC13, TC21 và MC3 đều ở nồng độ đường bổ sung là 4%. Cụ thể như

sau, lượng EPS sinh ra trong MRS có bổ sung thêm 4% glc là 238,817 µg/ml cho

chủng Lb. fermentum TC13; MRS có bổ sung thêm 4% lac là 179,752 µg/ml cho

chủng Lb. fermentum TC21 và MRS có bổ sung thêm 4% glc là 178,207 µg/ml cho

chủng Lb. fermentum MC3. Đối với chủng Lb. fermentum TC16, lượng EPS thu được

cao nhất khi nồng độ đường suc bổ sung là 3% (231,988 µg/ml). Ở nồng độ bổ sung

khác (2% hoặc 3%), khả năng sinh tổng hợp EPS của các chủng nghiên cứu có tăng

nhưng tăng không đáng kể. Tuy nhiên, ở các nồng độ đường bổ sung cao (5%, 6%)

lượng EPS tạo thành của tất cả các chủng này đều có xu hướng giảm. Điều này có thể

được giải thích là do khi nồng độ đường cao làm tăng áp suất thẩm thấu, do đó làm

ức chế sự phát triển của vi khuẩn vì vậy mà lượng EPS tạo thành bị giảm.

Ảnh hưởng của các loại đường ở các nồng độ khác nhau lên quá trình sinh tổng

hợp EPS của các chủng LAB thường không giống nhau đã được nhiều tác giả công

bố. Quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus (B3,

G12) và S. thermophilus (W22) trong môi trường chứa các nguồn C khác nhau (gồm

glc, fruc, suc, lac) đã được nghiên cứu [138]. Kết quả cho thấy, glc là nguồn C có tác

động tốt nhất đến quá trình tổng hợp EPS đối với các chủng B3, G12 và W22. Lượng

EPS tổng hợp được đạt cực đại khi môi trường chứa 30 g/L glc (đạt 255 mg/L đối với

G12, 225 mg/L đối với B3 và 174 mg/L đối với W22). Bên cạnh đó, nhóm tác giả

57

cũng đã ghi nhận được rằng việc bổ sung fruc trong môi trường nuôi cấy đối với hai

chủng Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus và suc cho chủng S. thermophilus đều không

có hiệu quả. Zhang và cộng sự (2011) [141] đã kết luận về khả năng sinh tổng hợp

EPS của chủng Lb. fermentum F6 đạt được cao nhất trong môi trường MRS có bổ

sung thêm 2% glc ở nhiệt độ 37oC, pH 6,5. Hàm lượng EPS sinh tổng hợp bởi chủng

này được ghi nhận tiếp tục tăng gấp đôi khi bổ sung thêm 0,5% whey protein (44,49

mg/L). Trong khi đó, với chủng S. thermophilus ST1, việc bổ sung 2% suc kết hợp

với whey protein vào môi trường chứa 10% sữa tách béo có tác dụng làm tăng tốt

nhất lượng EPS tạo thành so với các loại đường glc, lac, gal và fruc ở cùng nồng độ

[140]. Kết quả nghiên cứu của Cerning và cộng sự (1994) đã kết luận về lượng EPS

tổng hợp bởi chủng Lb. casei CG11 tăng dần theo chiều tăng của nồng độ các loại

đường bổ sung (bao gồm glc, gal, lac, suc, maltose, melibiose với các nồng độ là 2,

5, 10, 20 g/l) trong môi trường tối ưu cơ bản (BMM- basal minimum medium). Lượng

EPS đạt được cao nhất với 160 mg/L khi glc được bổ sung vào. Bên cạnh đó, nghiên

cứu cũng cho thấy rằng, lac và gal là hai loại đường có tác động kích thích kém hiệu

quả nhất đến quá trình sinh tổng hợp EPS của chủng này [22]. Quá trình sinh tổng

hợp PS ngoại bào của chủng Lb. rhamnosus C83 trong BMM có chứa các nguồn C

khác nhau là glc, fruc, glc + fruc, mannose hoặc maltose với các nồng độ 20, 40 và

60g/l cũng được nghiên cứu bởi Gamar và cộng sự (1998) [45]. Kết quả nghiên cứu

cho thấy quá trình sinh tổng hợp EPS của chủng Lb. rhamnosus C83 đạt tốt nhất trong

môi trường có chứa 4% mannose. So với môi trường đối chứng là MRS có chứa 2%

glc, lượng EPS tạo thành trong môi trường này đạt 132 mg/L (tăng gấp bốn lần) và

tiếp theo là trong môi trường có bổ sung 2% hỗn hợp glc + fruc (tỉ lệ 1:1) là 111 mg/L

(tăng gấp ba lần). Trong một nghiên cứu khác, Torino và cộng sự (2005) đã kết luận

về ảnh hưởng tích cực của việc sử dụng lac thay thế cho glc trong MRS lên quá trình

sinh tổng hợp EPS của chủng Lb. helveticus ATCC 15807. Lượng EPS thu được

trong môi trường chứa lac tăng lên khoảng 450 % (208 mg/L) so với môi trường chứa

glc (46 mg/L) [118].

Sự tác động khác nhau của các nguồn C không giống nhau lên quá trình sinh

tổng hợp EPS bởi các chủng LAB có thể liên quan đến các phản ứng chuyển hóa xảy

58

ra trong tế bào vi khuẩn và hoạt độ của các enzyme nội bào do vi khuẩn tiết ra (Sơ đồ

Hình 1.7). Gần đây, một số công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng, với sự sinh

tổng hợp EPS trong quá trình sinh trưởng của L. lactis, một phần nguồn C sử dụng

phải được chuyển thành Glc-6-P sau đó chuyển thành Glc-1-P và tham gia vào sự

tổng hợp và hình thành EPS [69], [100]. Có nhiều con đường khác nhau để tạo thành

Glc-1-P. Quá trình này phụ thuộc vào nguồn C được sử dụng trong môi trường nuôi

cấy và hệ thống vận chuyển có sẵn trên màng tế bào (PEP-PTS) của vi khuẩn.

Grobben và cộng sự (1996) cho rằng khi chủng Lb. bulgaricus được nuôi cấy trong

môi trường chứa fruc, đường này phải trải qua nhiều phản ứng chuyển hóa khác nhau

để tạo thành Glc-1-P. Sự chuyển hóa qua nhiều giai đoạn khác nhau đã dẫn đến quá

trình sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn

xảy ra chậm hơn. Nghiên cứu này cũng chỉ ra một con đường khác ngắn hơn để hình

thành Glc-1-P là tiến hành nuôi cấy chủng này trong môi trường chứa glc. Lúc đó,

thông qua PEP-glc PTS, glc sẽ nhanh chóng tạo thành Glc-6-P và hợp chất này được

trực tiếp chuyển thành Glc-1-P [55]. Công bố của de Vos và Vaughan (1994) kết luận

rằng, khi L. lactis được nuôi cấy trong môi trường chứa lac, lac sẽ được chuyển qua

màng tế bào nhờ hệ thống vận chuyển phosphotransferase lac và tạo lac-6-phosphate

ở bên trong màng tế bào. Ở bên trong tế bào, lac-6-phosphate được tạo thành gal-6-

P, α- Glc-6-P và glc dưới sự xúc tác của các enzyme khác nhau (phospho –β-

galactosidase, glucokinase) [26]. Ngược lại, chủng S. thermophilus âm tính với gal,

nó sẽ sử dụng đường lac bằng cách kết hợp lac permease trong một hệ thống vận tải

trung gian antiport và tạo ra Glc-6-P trong tế bào nhờ sự xúc tác đồng thời của các

enzyme glycosidase và glycokinase [97]. Ảnh hưởng của fruc và glc lên quá trình

sinh tổng hợp EPS và hoạt tính của các enzyme liên quan đến sự tổng hợp các

nucleotide đường của chủng Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB2772 cũng được

chứng minh bởi Grobben và cộng sự (1996). Khi được nuôi cấy trong môi trường có

bổ sung fruc, chủng này sinh tổng hợp EPS với lượng khá thấp, chỉ đạt khoảng 25

mg/L. Khi nguồn C được sử dụng là hỗn hợp của glc và fruc hoặc chỉ chứa glc, quá

trình sinh tổng hợp EPS đạt 80 mg/L. Kết quả phân tích các enzyme liên quan đến

quá trình tổng hợp các nucleotide đường khi nuôi cấy chủng Lb. delbrueckii subsp.

59

bulgaricus NCFB2772 trong các môi trường chứa 167 mM fruc, 83 mM fruc + 83

mM glc hoặc 167 glc chỉ ra rằng, hoạt độ của các enzyme tham gia vào con đường

đường phân và tổng hợp nên các nucleotide đường (UDP-glc pyrophosphorylase) có

sự khác biệt rõ rệt. Hoạt độ của các enzyme này trong môi trường chứa fruc thấp hơn

so với glc. Điều này cho thấy, nguyên nhân khiến lượng EPS tạo thành trong môi

trường chứa glc cao hơn so với fruc là do quá trình tổng hợp các nucleotide đường

như UDP-glc và UDP-gal xảy ra chậm hơn trong môi trường chứa fruc. Bên cạnh đó,

hoạt độ của fruc 1,6-bisphosphate cũng thấp hơn so với glc 1,6-bisphosphate. Chính

vì thế đã dẫn đến sự khác nhau về hàm lượng EPS tổng hợp được trong một thời gian

nhất định [55].

Như vậy, sự chuyển hóa các cơ chất xảy ra trong tế bào để hình thành nên các

đơn vị lặp lại của EPS có liên quan đến một loạt các enzyme của vi khuẩn, đặc biệt

là tính đặc hiệu của từng loại enzyme. Khi nguồn cơ chất sử dụng cho quá trình sinh

trưởng và phát triển của vi khuẩn không phù hợp, hoạt độ của enzyme đó có thể bị

bất hoạt hoặc thể hiện hoạt độ rất kém do đó lượng EPS tạo thành sẽ ít hơn. Trong

thành phần môi trường nuôi cấy các chủng Lb. fermentum TC13 và Lb. fermentum

MC3 chứa nguồn C là glc – chính nguồn này là cơ chất chủ yếu cho quá trình sinh

tổng hợp EPS ngoại bào. Từ các lý giải này, kết hợp với kết quả đạt được trong nghiên

cứu cho phép chúng tôi kết luận rằng hoạt độ của hệ enzyme hexokinase (chuyển hóa

Glc thành Glc-6-P), PGM (chuyển hóa Glc-6-P thành Glc-1-P) trong tế bào vi khuẩn

Lb. fermentum TC13 và Lb. fermentum MC3 là rất mạnh.

Trong khi đó, với Lb. fermentum TC21, hoạt độ của PGM tham gia chuyển hóa

Gal-1-P thành Glc-1-P có thể lớn hơn so với hoạt độ của PGM (tham gia chuyển hóa

Glc-6-P thành Glc-1-P) do đó, với chủng vi khuẩn này, lac là nguồn cơ chất phù hợp

hơn cho chủng này sử dụng trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Tương tự, với

Lb. fermentum TC16, hoạt độ của hexokinase tham gia chuyển hóa fruc thành fruc-

6-P cao hơn so với hoạt độ của hexokinase chuyển hóa glc thành Glc-6-P nên cơ chất

được ưu tiên sử dụng hơn trong quá trình phát triển của chủng này là suc (Hình 1.7).

Sự liên quan của hoạt độ enzyme nội bào đến quá trình sinh tổng hợp EPS bởi LAB

cũng đã được làm sáng tỏ trong nghiên cứu của Torino và cộng sự (2005) khi nhóm

60

tác giả này đã kết luận rằng, quá trình sinh tổng hợp enzyme α-phosphoglucomutase

(α-PGM) có liên quan đến sự tổng hợp EPS. Khi glc được sử dụng như là nguồn C

cho sự phát triển của vi khuẩn, quá trình sinh tổng hợp EPS đạt thấp hơn đã được

quan sát cùng với sự giảm hoạt tính của các enzyme α-PGM và gal 1-phosphate-

uridyltransferase (GalT). Ngược lại, hoạt tính của hai enzym này đã tăng lên đáng kể

khi thay thế glc bằng lac, từ đó dẫn đến lượng EPS tạo thành cũng được cải thiện tốt

hơn. α- PGM và GalT là hai enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp nên các

nucleotide đường UDP-glc and UDP-gal EPS. Đây chính là tiền thân của các monome

tổng hợp nên EPS [118]. Một công bố tương tự của Levander và cộng sự (2002) đã

cho thấy, lượng EPS tạo thành từ S. thermophilus có thể được cải thiện nhờ sự thay

đổi vị trí của các enzyme trong quá trình trao đổi chất mà quá trình này có liên quan

đến các nucleotide đường [71].

Như vậy, ảnh hưởng của nguồn carbohydrate lên quá trình sinh tổng hợp EPS

của các chủng thuộc LAB còn phụ thuộc vào các chủng cụ thể, các thành phần khác

có trong môi trường, những đặc điểm về khả năng đồng hóa nguồn carbohydrate của

tế bào cũng như hoạt độ của các enzyme xúc tác [86].

Tóm lại, với sự đa dạng của các con đường tạo nên Glc-1-P trong quá trình sinh

tổng hợp EPS của vi khuẩn, việc sử dụng các loại đường có sẵn để tổng hợp nên hợp

chất này sẽ dễ dàng hơn cho quá trình hình thành sản phẩm khi hoạt độ của hệ enzyme

tham gia vào quá trình chuyển hóa đó thể hiện nổi trội hơn. Bên cạnh đó, các

monosaccharide sẽ được chuyển hóa nhanh hơn so với các dạng disaccharide hoặc

PS. Điều này cũng tương đối phù hợp với kết quả khảo sát ảnh hưởng của các loại

đường với các nồng độ khác nhau khi mà glc có tác động kích thích sớm và đều hơn

so với lac và suc. Chính lý do này khiến lượng lượng sản phẩm tạo thành trong môi

trường chứa glc đã được ổn định khi ở các nồng độ thấp. Trong khi đó, với lac và suc

khả năng đồng hóa của vi khuẩn xảy ra chậm do đó, lượng sản phẩm tổng hợp được

ban đầu sẽ ít hơn. Tuy nhiên trong quá trình lên men, sự thủy phân của hai loại đường

này có thể sẽ có lợi hơn cho sự phát triển và sinh tổng hợp EPS, do đó hiệu quả của

hai loại đường này thường thể hiện rõ rệt hơn khi ở nồng độ bổ sung lớn hơn. Với

61

môi trường MRS có bổ sung thêm các loại đường phù hợp nhất và có sự khác nhau

tùy vào từng chủng, chúng tôi quy ước gọi tên là môi trường thích hợp (MTTH).

3.1.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen và nồng độ của chúng lên khả năng sinh tổng

hợp EPS

Ảnh hưởng của nguồn N lên quá trình sinh EPS của các chủng này đã được khảo

sát. Các chủng vi khuẩn Lb. fermentum được lên men ở 37oC, 48 giờ trong MTTH

tương ứng của chúng, đồng thời có bổ sung thêm các nguồn N như peptone, cao thịt,

cao nấm với các nồng độ khác nhau theo mô tả ở mục 2.3.3.2.

Lượng EPS sinh tổng hợp đạt cao nhất bởi các chủng Lb. fermentum TC16,

TC21 đều ở trong môi trường chứa 0,8% cao thịt. Cụ thể, lượng EPS đạt được trong

môi trường này là 344,305 µg/ml cho Lb. fermentum TC16 và 301,988 µg/ml cho Lb.

fermentum TC21. Đối với chủng Lb. fermentum TC13 và MC3, khả năng sinh tổng

Các mức

bổ sung Các mức

bổ sung

Các mức

bổ sung

Các mức

bổ sung

Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn N và nồng độ bổ sung của chúng vào MTTH đến

khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum * Các mức 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng với các nồng độ pepton, cao thịt là 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1,0% và

cao nấm là 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5% bổ sung vào MTTH

* Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 4.2

62

hợp EPS của cả hai chủng này đạt cực đại trong môi trường có bổ sung thêm cao nấm.

Trong đó, với nồng độ cao nấm bổ sung là 0,4%, chủng Lb. fermetum TC13 sinh EPS

lớn nhất với 357,354 µg EPS/ml. EPS thu được từ chủng Lb. fermentum MC3 cao

nhất là 382,963 µg/ml khi chủng này phát triển trong điều kiện có bổ sung thêm 0,3%

cao nấm (Hình 3.3).

Từ kết quả Hình 3.3 cũng cho thấy rằng, việc bổ sung thêm các nguồn N khác

nhau ở các nồng độ không giống nhau vào MTTH đã được khảo sát có ảnh hưởng rõ

rệt đến khả năng sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn Lb. fermentum TC13,

TC16, TC21, MC3.

Bên cạnh sự tác động theo chiều hướng tích cực khi bổ sung cao nấm và cao

thịt vào MTTH của chúng thì sự tác động của pepton được ghi nhận là chậm hơn,

thậm chí ở một số chủng, lượng EPS tạo thành còn thấp hơn so với môi trường đối

chứng. Cụ thể là, khả năng kích thích của thành phần này lên quá trình sinh tổng hợp

EPS của chủng Lb. fermentum TC13 đã không thể hiện rõ rệt ở các nồng độ bổ sung

là 0,2%, 0,4%. Lượng EPS quan sát được trong các điều kiện lên men này không có

sự sai khác so với môi trường đối chứng – là môi trường không bổ sung thêm nguồn

pepton khi xử lý thống kê với mức ý nghĩa p < 0,05. Ở nồng độ bổ sung cao hơn là

0,6%, 0,8%, 1,0%, lượng EPS tạo ra nhiều hơn với sự sai khác có ý nghĩa thống kê

(Hình 3.3). Với chủng Lb. fermentum TC16, khả năng kích thích của pepton đã không

xảy ra khi nồng độ pepton bổ sung vào ở các mức 0,2%, 0,4% và 0,6%. Hàm lượng

EPS đạt được trong các môi trường được bổ sung các nồng độ này đều thấp hơn so

với đối chứng. Lượng EPS thu được ở các nồng độ này chỉ dao động từ 183,207 µg/ml

đến 196,134 µg/ml trong khi môi trường đối chứng là 239,305 µg/ml. Quá trình kích

thích của pepton lên khả năng sinh tổng hợp EPS chỉ xảy ra khi nồng độ pepton bổ

sung vào cao. Và lượng EPS cũng tăng lên tương tự như chủng Lb. fermentum TC13.

Lượng EPS sinh tổng hợp được từ Lb. fermentum TC16 đạt 314,305 µg/ml và 264,427

µg/ml khi nồng độ pepton bổ sung vào tăng tương ứng là 0,8% và 1%. Dữ liệu trên

bảng 3.2 cũng cho thấy, tác dụng kích thích của pepton đến lượng EPS sinh tổng hợp

bởi Lb. fermentum TC21 và MC3 không hiệu quả khi thành phần này được bổ sung

ở các nồng độ thấp (0,2% và 0,4%). Hàm lượng EPS thu được thực sự cao hơn nhiều

63

khi nồng độ pepton bổ sung là 0,6%, 0,8%, 1,0% đối với chủng Lb. fermentum TC21

và 0,8%, 1,0% đối với chủng Lb. fermentum MC3. Ở các nồng độ còn lại, lượng EPS

tạo thành tương đối ít, đặc biệt đối với chủng Lb. fermentum MC3, hàm lượng EPS

thu được thấp hơn hẳn so với môi trường đối chứng khi nồng độ pepton thêm vào là

0,2%.

Đối với nguồn cao thịt, ngoại trừ chủng Lb. fermentum MC3, quá trình sinh tổng

hợp EPS bởi Lb. fermentum TC13, TC16, TC21 chịu ảnh hưởng nhiều hơn và có sự

tăng vượt trội về lượng EPS tạo thành so với các nguồn N bổ sung còn lại. Lượng

EPS tạo thành của hai chủng Lb. fermentum TC13 và TC21 có sự tăng lên theo chiều

tăng của nồng độ cao thịt bổ sung và đều đạt tốt nhất ở nồng độ bổ sung là 0,8% (đạt

347,476 µg/ml cho Lb. fermentum TC13 và 136,500 µg/ml cho Lb. fermentum TC21).

Sự kích thích quá trình sinh tổng hợp EPS cũng xảy ra tương tự đối với chủng Lb.

fermentum TC16, chỉ khác là lượng EPS tạo thành chỉ đạt cao hơn nhiều khi nồng độ

cao thịt bổ sung lớn (0,6%, 0,8%, 1,0%). EPS tạo thành đều rất thấp, thấp hơn môi

trường đối chứng của chủng này được ghi nhận ở hai nồng độ cao thịt bổ sung là

0,2% và 0,4% với EPS tương ứng là 195,159 µg/ml và 219,793 µg/ml. Với chủng

MC3, sự kích thích của cao thịt lên quá trình sinh tổng hợp EPS hầu như không xảy

ra. Lượng EPS thu được ở tất cả các nồng độ bổ sung được nghiên cứu đều thấp hơn

nhiều so với môi trường đối chứng. Với chủng MC3, sự kích thích của cao thịt lên

quá trình sinh tổng hợp EPS hầu như không xảy ra. Lượng EPS thu được ở tất cả các

nồng độ bổ sung được nghiên cứu đều thấp hơn nhiều so với môi trường đối chứng.

Đối với nguồn N là cao nấm, chủng chịu ảnh hưởng nhiều nhất là MC3, tiếp đến

là chủng TC13. Với Lb. fermentum MC3, lượng EPS đã tăng mạnh khi nồng độ cao

nấm bổ sung thêm vào chỉ mới 0,1% (tăng 171,21% so với môi trường đối chứng) và

sau đó tăng nhanh ở các nồng độ 0,2%, 0,3% và chỉ giảm nhẹ ở các nồng độ 0,4%,

0,5%. EPS tại các nồng độ cao nấm cao 0,4% và 0,5% lần lượt là 329,793 µg/ml và

280,199 µg/ml trong khi môi trường đối chứng là 174,915 µg/ml. Sự kích thích tốt

lên quá trình tổng hợp EPS của cao nấm cũng xảy ra đối với chủng TC13. Hàm lượng

EPS tạo thành tăng cao khi nồng độ cao nấm bổ sung là 0,3%, 0,4% và chỉ giảm nhẹ

ở 0,5% (Hình 3.3). Khả năng kích thích của cao nấm lên quá trình tổng hợp EPS của

64

Lb. fermentum TC21 là tương đối chậm. EPS tạo thành chỉ dao động từ 211,256 µg/ml

ở nồng độ cao nấm bổ sung là 0,5% đến 281,378 µg/ml ở nồng độ cao nấm bổ sung

là 0,4%, trong khi EPS sinh ra từ môi trường không bổ sung cao nấm của chủng này

đã đạt 180,525 µg/ml. Với chủng TC16, sự hình thành EPS trong môi trường được

bổ sung thêm cao nấm ở nồng độ 0,1% và 0,2% đều thấp hơn nhiều so với mẫu đối

chứng. Sau đó có xu hướng tăng nhẹ ở các nồng độ cao hơn. Sự tác động khác nhau

của các nguồn N lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum trong

nghiên cứu này cũng được làm sáng tỏ khi xử lý thống kê (p<0,05) (Phụ lục 4.2).

Từ các kết quả thu được chúng tôi nhận thấy rằng, việc bổ sung thêm nguồn N

vào MTTH đã có tác dụng kích thích rõ rệt và đa phần đều có tác dụng tích cực. Hiệu

quả kích thích mạnh mẽ của các nguồn N bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy có

lẽ do chúng chứa các hợp chất ở dạng đơn giản dễ đồng hóa như các peptide, các acid

amin, vitamin và các khoáng chất cần thiết cho tế bào trong quá trình sinh trưởng và

phát triển đặc biệt là cao nấm và cao thịt. Khi khả năng đồng hóa của tế bào tăng lên

trong quá trình trao đổi chất sẽ dẫn đến lượng sản phẩm tạo thành cao hơn. Mặt khác,

có lẽ các nguồn N này có thể có chứa các thành phần có tác dụng kích thích sự phát

triển dưới dạng vết nhờ đó mà làm tăng lượng EPS thu được cao hơn so với môi

trường không chứa nguồn N [66]. Bên cạnh sự tăng lên của các sản phẩm tạo thành

trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn thì một số nguồn N lại không có khả năng

kích thích tích cực đối với sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn đặc biệt là ở

những nồng độ bổ sung thêm vào thấp. Điều này có thể là do các cơ chất này không

phải là nguồn dinh dưỡng phù hợp cho sự phát triển của vi khuẩn đặc biệt là khi các

chất này ở nồng độ thấp.

Những công bố khác nhau về ảnh hưởng của nguồn N lên quá trình tổng hợp

EPS từ các chủng thuộc LAB cũng đã được công bố. Seesuriyachan và cộng sự (2011)

đã nghiên cứu về sự ảnh hưởng của các nguồn N (pepton, cao thịt, cao nấm) lên quá

trình sinh EPS của Lb. confusus TISTR 1498 trong môi trường có chứa nước dừa như

là một nguồn C thay thế. Kết quả chỉ ra rằng, trong môi trường MRS với việc thay

thế hoàn toàn nước cất bằng nước dừa có bổ sung thêm 2% suc, sự giảm hàm lượng

ba thành phần pepton, cao thịt, dịch chiết nấm men được coi là có hiệu quả tốt đối

65

với quá trình sinh tổng hợp EPS của chủng này. Quá trình tổng hợp EPS đạt tốt nhất

khi hàm lượng pepton, cao thịt, dịch chiết nấm men giảm xuống 1/2 so với ban đầu

(5 g/l pepton, 2,5 g/l cao nấm, 2,5 g/l cao nấm). Lượng EPS tạo thành trong trường

hợp này là 12,3 g/L (tăng hơn 3 lần so với việc giữ nguyên hàm lượng của các thành

phần này trong MRS) [111]. Nghiên cứu của Rabha và cộng sự (2011) về ảnh hưởng

của thành phần môi trường và nhiệt độ nuôi cấy lên quá trình sinh EPS của chủng S.

thermophilus BN1 đã được thực hiện. Các nguồn N được sử dụng để khảo sát trong

nghiên cứu này là sữa tách béo, sữa nguyên kem và dịch whey từ quá trình chế biến

pho mát. Kết quả cho thấy, chủng S. thermophilus BN1 có khả năng sinh tổng hợp

EPS trong tất cả các điều kiện được khảo sát, tuy nhiên đã có sự khác biệt đáng kể về

lượng EPS tạo thành trong các điều kiện nuôi cấy với nguồn dinh dưỡng khác nhau.

Quá trình sinh tổng hợp EPS đạt giá trị cao nhất trong môi trường chứa sữa tách béo

với hàm lượng 548 PDM/mg (PDM- polymer dry mass), tiếp theo là môi trường chứa

whey từ quá trình sản xuất pho mát 375 PDM/mg và cuối cùng là 325 PDM/mg trong

môi trường chứa sữa nguyên kem [99]. Chủng S. thermophilus ST1 có khả năng sinh

tổng hợp EPS ở tất cả các môi trường được khảo sát là kết luận của Zhang và cộng

sự (2011). Lượng EPS đạt được giá trị cao nhất (135,80 mg/l) trong môi trường có

bổ sung 2% suc và 0,5% WPC [140]. Trong khi đó, ở điều kiện 37oC, pH ban đầu

6,5, khả năng phát triển và sinh tổng hợp EPS của chủng Lb. fermentum F6 trong môi

trường sữa tách béo đều được kích thích khi bổ sung thêm 2% glc và 0,5% WPC.

Lượng EPS đạt được sau 32 giờ nuôi cấy trong trường hợp này tăng lên khoảng

134,61 % so với môi trường không chứa WPC (đạt 33,05 mg/l) [141]. Việc bổ sung

dịch whey protein có tác dụng kích thích khả năng sinh tổng hợp EPS của S.

thermophilus ST111 cũng là công bố của Vaningelgem và cộng sự [120]. Trong môi

trường chứa 4% fruc và 2,5% bột pepton cao nấm, Pleurotus citrinopileatus sinh tổng

hợp EPS đạt được là cao nhất (1,87 g/l) là công bố của Wu và cộng sự (2008) [134].

Như vậy, có thể nói sự sinh trưởng của vi sinh vật chịu tác động không phải chỉ

bởi một chất dinh dưỡng nhất định mà có thể bởi sự kết hợp của hai hay nhiều chất

dinh dưỡng đồng thời. Việc tăng khả năng sinh tổng hợp EPS trong các điều kiện

nuôi cấy có chứa các nguồn C và N khác nhau có thể còn liên quan đến tỉ lệ của chúng

trong môi trường. Một tỉ lệ C: N thích hợp có khả năng kích thích tốt hơn đến quá

trình sinh trưởng và trao đổi chất của tế bào vi khuẩn. Do đó, ngoài sự tác động của

66

các nguồn dinh dưỡng khác nhau thì nồng độ của chúng cũng có ảnh hưởng không

nhỏ đến sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong môi trường nuôi cấy. Trong một

số trường hợp nuôi cấy, nguồn C được tìm thấy trong nguồn N có thể xem như là một

chất nền cho quá trình sinh tổng hợp EPS [25]. Điều này góp phần tăng tỷ lệ C: N, do

đó thúc đẩy quá trình tổng hợp EPS. Theo công bố của Vermani và cộng sự (1997)

thì việc bổ sung lượng nhỏ N có tác dụng kích thích năng suất EPS tạo thành [122]

và nồng độ sinh khối đạt được cao hơn khi tăng nồng độ N trong một giới hạn nhất

định [121]. Những kết quả thu được trong nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp với

những lý giải từ các công bố của các tác giả trên. Vì thế, chúng tôi đã chọn ra được

thành phần môi trường chứa nguồn C và N thích hợp cho các chủng Lb. fermentum

TC13, TC16, TC21, MC3 sinh tổng hợp EPS lần lượt tương ứng là 4% glc + 0,4%

cao nấm; 3% suc + 0,8% cao thịt; 4% lac + 0,8% cao thịt; và 4% suc + 0,3% cao nấm.

3.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp EPS của các

chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3

3.1.3.1. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu

Mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu ảnh hưởng đến quá trình phát triển và sinh tổng

hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 trong môi trường

chứa các nguồn dinh dưỡng bổ sung được khảo sát ở các mức 104, 105 106, 107 và 108

cfu/ml với điều kiện nuôi cấy ban đầu là 37oC, pH 6,0 – 6,2.

391,338348,898304,508

383,980

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

4 5 6 7 8

EP

S (

µg

/ml)

Mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu (lg cfu/ml)

TC13

TC16

TC21

MC3

Các chủng Lb.

fermentum

104 105 106 107 108

Hình 3.4. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu lên quá trình sinh

tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum

* Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 4.3

67

Quá trình sinh tổng hợp EPS đạt cao nhất đối với các chủng Lb. fermentum

TC16, TC21, MC3 khi mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu là 106 cfu/ml. EPS đạt được ở

nồng độ này lần lượt của TC16 là 348,898 µg/ml, của TC21 là 304,508 µg/ml, của

MC3 là 383,98 µg/ml . Khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng TC13 xảy ra mạnh

và đạt cực đại ở mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu là 107 cfu/ml với hàm lượng là

391,338 µg/ml. Hàm lượng EPS tại các môi trường có các mật độ tế bào cao hơn hoặc

thấp hơn đều thấp (Hình 3.4)

Kết quả xử lý thống kê cho thấy rằng, ở chủng Lb. fermentum T13, lượng EPS

thu được trong hai môi trường có mật độ gieo cấy ban đầu là 104 cfu/ml và 108 cfu/ml

là không có sự sai khác; ở chủng Lb. fermentum TC21, sự sai khác đã không xảy ra

ở mật độ nuôi cấy ban đầu là 105 cfu/ml và 106 cfu/ml; ở chủng Lb. fermentum TC21,

sự giống nhau về lượng sản phẩm của quá trình trao đổi chất ở các nồng độ 105 cfu/ml,

106 cfu/ml và 107 cfu/ml (với p<0,05) (Phụ lục 4.3).

Sự tạo thành EPS trong quá trình phát triển của vi khuẩn có liên quan rất lớn

đến mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu. Ở mật độ tế bào nuôi cấy quá cao (107, 108 cfu/ml

đối với các chủng Lb. fermentum TC16, TC21, MC3 và 108 cfu/ml đối với TC13)

hoặc quá thấp (104, 105 cfu/ml đối với các chủng Lb. fermentum TC16, TC21, MC3

và 104, 105, 106 cfu/ml đối với TC13), khả năng phát triển của vi khuẩn có thể bị giảm

dẫn đến khả năng tạo thành sản phẩm bị thấp hơn.

Điều này có thể được giải thích là khi lượng tế bào gieo cấy vào môi trường quá

ít (mật độ pha loãng cao) sự sinh trưởng xảy ra tốt nhưng do số lượng tế bào vi khuẩn

được gieo cấy vào môi trường ít hơn do đó khả năng tạo ra sản phẩm của quá trình

trao đổi chất trong một thời gian nhất định lại ít hơn. Điều này dẫn đến sản phẩm tạo

thành sẽ thấp. Ngược lại, khi lượng tế bào ban đầu gieo cấy vào môi trường quá nhiều

(mật độ pha loãng ít) và lượng chất dinh dưỡng được cố định lúc này sẽ xuất hiện sự

cạnh tranh cao về nguồn dinh dưỡng trong môi trường do đó khả năng sử dụng cơ

chất trong quá trình trao đổi chất của các tế bào bị giảm, tế bào phải dùng phần lớn

năng lượng để duy trì sự sống nên sự sinh trưởng và phát triển bị hạn chế do đó làm

giảm khả năng hình thành sản phẩm trao đổi chất của chúng. Hay nói cách khác, quá

trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn thực sự có hiệu quả khi tế bào có thể sử

68

dụng năng lượng vượt quá mức năng lượng để duy trì sự sống của chúng. Chính vì

vậy, để quá trình sinh tổng hợp của tế bào vi khuẩn trong cùng một điều kiện về dinh

dưỡng, cùng một thời gian cố định được tốt, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu cần phù

hợp, không quá thấp và cũng không nên quá cao. Bên cạnh đó, sự tác động không

giống nhau về mật độ tế bào gieo cấy ban đầu đến lượng EPS tạo thành của các chủng

vi khuẩn khác nhau còn liên quan đến giai đoạn sinh trưởng, phát triển của các tế bào

được gieo cấy vào môi trường. Quá trình phát triển và sinh tổng hợp EPS của vi khuẩn

có thể xảy ra nhanh hơn nếu giai đoạn thích nghi (pha tiền phát) với môi trường của

tế bào vi khuẩn ngắn và ngược lại, khi giai đoạn này kéo dài, quá trình sinh tổng hợp

EPS xảy ra chậm hơn.

Từ kết quả khảo sát trên chúng tôi kết luận rằng, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu

thích hợp nhất là 107 cfu/ml cho chủng TC13 và 106 cfu/ml cho các chủng Lb.

fermentum TC16, TC21, MC3.

3.1.3.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu

pH là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh

tổng hợp các sản phẩm thứ cấp của các loại vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn lactic.

Nhiều vi khuẩn sản xuất EPS trong điều kiện môi trường pH trung tính, một số có thể

sinh tổng hợp tại các giá trị pH có tính acid [18]. Như vậy, các chủng vi khuẩn khác

nhau có thể có sự thích ứng với các giá trị pH không giống nhau. Tác động của pH

ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16,

TC21, MC3 được thực hiện sau khi xác định được thành phần môi trường và mật độ

tế bào nuôi cấy ban đầu thích hợp.

Ảnh hưởng của pH ban đầu (bao gồm 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5) lên quá trình

sinh EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 đã được khảo sát

khi tiến hành lên men các chủng này ở 37oC trong môi trường chứa nguồn C, N và

mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu thích hợp đã được xác định. Thí nghiệm được mô tả

chi tiết ở mục 2.3.3.4. Kết quả là trung bình của 3 lần lặp lại sau khi đã xử lý thống

kê.

Quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21,

MC3 đều chịu ảnh hưởng rõ rệt bởi pH ban đầu của môi trường. Lượng EPS sinh ra

69

của các chủng TC16, TC21, MC3 đều đạt cực đại tại pH 6,0 và tại pH 5,5 đối với

chủng TC13. Hàm lượng EPS thu được tương ứng tại các giá trị pH này của các chủng

lần lượt là 380,484 µg/ml; 382,654 µg/ml; 420,809 µg/ml và 405,037 µg/ml (Hình

3.5).

Hàm lượng EPS đạt được của chủng TC13 trong môi trường có giá trị pH 5,5;

6,5 và môi trường tự nhiên (ĐC)– là môi trường không điều chỉnh pH đều không có

sự sai khác khi xử lý thống kê (p<0,05) (Phụ lục 4.4). Quá trình tổng hợp EPS của

chủng TC16 xảy ra tương tự nhau ở các mức pH 5,0; 5,5 và thấp hơn ở mức pH 6,5

và dưới 5,0. Trong khi đó, với chủng TC21, lượng EPS thu được ở các mức pH còn

lại (pH 5,5; 5,0; 4,5; và 4,0) đều đạt thấp hơn rất nhiều so với giá trị cực đại. Phần

trăm EPS dao động ở các mức pH này chỉ chiếm khoảng 54,25 – 74,27% so với giá

trị cực đại tại pH 6,0. Khi tăng pH ban đầu lên 6,5, quá trình sinh EPS giảm nhẹ, EPS

còn lại khoảng 91,22%. Đối với chủng MC3, ngoài hai mức pH 5,5 và 5,0 chủng này

sinh tổng hợp EPS cao. Ở các mức pH còn lại (4,0; 4,5; 6,0; 6,5), khả năng sinh EPS

giảm dần và đặc biệt là đạt thấp nhất khi pH ban đầu là 6,5. Như vậy, khoảng pH ban

đầu thích hợp cho các chủng khác nhau có thể giống nhau hoặc khác nhau. Tuy nhiên,

nó chủ yếu dao động trong khoảng pH 5,5 - 6,0. Việc nuôi cấy trong môi trường có

giá trị pH nằm ngoài khoảng này thì khả năng phát triển đều bị giảm và số lượng sản

phẩm tạo thành sẽ ít hơn.

405,037380,484

328,654

420,809

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

4 4.5 5 5.5 6 6.5 ĐC

EP

S (

µg

/ml)

pH ban đầu

TC13

TC16

TC21

MC3

Các chủng Lb.

fermentum

4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 ĐC

Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi

các chủng Lb. fermentum

Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 4.4

70

pH có ảnh hưởng rõ rệt đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Sự tác động trực

tiếp của pH lên vi sinh vật có thể thông qua việc các ion H+ trong môi trường làm

thay đổi trạng thái điện li của thành tế bào. Mặt khác, sự thay đổi về giá trị pH cũng

có thể làm ức chế một phần nào đó các enzyme có mặt trên thành tế bào trong đó đặc

biệt phải kể đến là các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn.

Khả năng sinh tổng hợp tốt trong khoảng pH trung tính của các chủng Lb.

fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu về ảnh

hưởng của điều kiện nuôi cấy lên một số chủng thuộc LAB đã được công bố.

Khả năng sinh tổng hợp EPS của Lb. plantarum KF5 trong môi trường MRS có

bổ sung thêm dịch whey đạt cao nhất tại pH 6,3 [130]. Trong khi Lb. confusus TISTR

1498 sinh EPS trong môi trường có sự thay thế 100% nước cất bằng nước dừa đạt

cao nhất tại pH 5,5 [111]. Sự phát triển và sinh tổng hợp EPS bởi Lb. fermentum F6

phân lập từ các sản phẩm sữa truyền thống của Trung Quốc đã được nghiên cứu khi

chủng này được nuôi cấy trong môi trường chứa 10% (w/v) sữa tách béo với điều

kiện lên men khác nhau. Kết quả cho thấy rằng khi nuôi cấy Lb. fermentum F6 ở nhiệt

độ 37°C và pH 6,5 thì sự phát triển đạt được là tối ưu và đây cũng là điều kiện thuận

lợi cho sự sinh tổng hợp EPS. Với điều kiện về nhiệt độ và pH này, quá trình sinh

tổng hợp EPS của chủng Lb. fermentum F6 tiếp tục được cải thiện tăng lên gấp hai

lần khi thực hiện bổ sung vào môi trường ban đầu 2% (w /v) glc và 0,5% (w/v) WPC.

Hàm lượng EPS thu được trong điều kiện này đạt 44,49 mg/l so với môi trường đối

chứng (15,11 mg/l) [141]. Giá trị pH ban đầu 6,5 phù hợp nhất cho chủng Lb.

fermentum F6 sinh tổng hợp EPS và cũng là kết quả công bố của Fukuda và cộng sự

(2010) [44], Zhang và cộng sự (2011) [140] khi thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của

pH đến khả năng sinh EPS của một số chủng thuộc LAB tương ứng là Lb. fermentum

TDS030603, S. thermophilus ST1. Mặc dù pH thích hợp cho quá trình sinh EPS có

sự khác nhau trong các chủng LAB khác nhau, tuy nhiên, nó thường nằm trong

khoảng gần pH 6,0 [30], [35].

Ở các mức pH thấp (pH 4,0; 4,5), quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp EPS

của các chủng đều bị hạn chế. Nguyên nhân có thể là do trong môi trường có tính acid

sẽ làm thay đổi trạng thái điện li của phân tử các chất dinh dưỡng, làm hạ thấp khả năng

71

sử dụng chúng của vi sinh vật. Hơn nữa, khi môi trường càng acid (pH thấp), khả năng

gây ra sự biến tính đối với các enzyme tham gia vào quá trình xúc tác tổng hợp EPS

trong tế bào vi khuẩn như hệ enzyme pyrophosphorylase, guanylytransferase,

dehydrogenase, epimerase,… xảy ra càng dễ dàng. Kết quả là các enzyme này bị bất

hoạt một phần do đó, sản phẩm tạo thành sẽ bị giảm.

Bên cạnh đó, trong quá trình sinh trưởng và phát triển, các vi sinh vật thường

sinh ra các chất thải có tính acid hoặc kiềm nên sẽ làm thay đổi pH của môi trường

như sự lên men carbohydrate tạo ra các acid hữu cơ hoặc sự phân giải các acid amin

sinh ra NH3…. Những chất này có thể làm ức chế quá trình sinh trưởng của vi sinh vật;

do đó làm giảm khả năng tổng hợp của tế bào để tạo thành các sản phẩm thứ cấp của

chúng. Khi nồng độ ion H+ trong dung dịch vượt quá mức độ bình thường đối với vi

sinh vật thì sự sống của chúng sẽ bị ức chế, quá trình trao đổi chất có thể xảy ra theo

một hướng khác. Lí do này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu khi khoảng pH

thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn Lb. fermentum

TC13, TC16, TC21, MC3 này đều nằm trong khoảng pH 5,5 – 6,0. Đây cũng là mức

pH thường gặp chủ yếu trong môi trường tự nhiên, do đó đây có thể là một lợi thế

nếu sử dụng trực tiếp các chủng vi khuẩn này khi ứng dụng trong các sản phẩm thực

phẩm.

3.1.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Cũng giống như các sinh vật khác, nhiệt độ của môi trường cũng có ảnh hưởng

rất lớn đối với vi sinh vật. Để phát triển, mỗi vi sinh vật đều có một khoảng nhiệt độ

tối ưu nhất định và ở nhiệt độ này sự phát triển của vi sinh vật xảy ra thuận lợi nhất.

Trên thực tế, do vi sinh vật thường là các sinh vật đơn bào cho nên chúng rất mẫn

cảm với sự biến hóa của nhiệt độ, và thường bị biến hóa cùng với sự thay đổi về nhiệt

độ của môi trường xung quanh. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ban đầu lên khả

năng sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21 và MC3

đã được khảo sát khi tiến hành nuôi cấy các chủng này phát triển ở các mức nhiệt độ

lần lượt là 30, 35, 40 và 45oC trong 48 giờ với mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu và các

giá trị pH thích hợp đã được nghiên cứu ở trên.

72

Kết quả từ Hình 3.6 cho thấy, khả năng sinh trưởng và tổng hợp EPS của các

chủng vi khuẩn khảo sát đạt tích cực đều nằm trong khoảng nhiệt độ từ 35 – 40 oC và

giá trị EPS đạt cực đại tại các mức nhiệt khác nhau tùy thuộc vào từng chủng vi khuẩn.

Hàm lượng EPS tăng mạnh và đạt giá trị cao nhất đối với các chủng Lb. fermentum

TC16, TC21, MC3 đều ở 35 oC, trong khi chủng TC13 là ở 40 oC. Lượng EPS thu

được tại các mức nhiệt độ này tương ứng là 405,402 µg/ml; 376,134 µg/ml; 421,947

µg/ml và 419,183 µg/ml.

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng thuộc

LAB cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu. Nhiều tác giả đã kết luận rằng, nhiệt độ

phát triển là một thông số có tác động rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp EPS. Rabha

và cộng sự (2011) đã thực hiện khảo sát ảnh hưởng của điều kiện lên men bao gồm

môi trường nuôi cấy, nhiệt độ ủ lên quá trình sinh EPS của chủng S. thermophilus

BN1 [99]. Theo đó, các tác giả đã tiến hành nuôi cấy chủng này trong môi trường

chứa sữa tách béo, sữa hoàn nguyên và dịch whey pho mát ở hai mức nhiệt độ là 37oC

và 42oC. Kết quả cho thấy, quá trình sinh EPS xảy ra ở cả hai mức nhiệt độ khảo sát,

tuy nhiên lượng EPS thu được đạt cao hơn ở 37oC trong cả ba môi trường. Zhang và

cộng sự (2011) đã khảo sát quá trình sinh trưởng và tổng hợp EPS bởi Lb. fermentum

F6 ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau. Kết quả chỉ ra rằng, quá trình tổng hợp EPS

của chủng Lb. fermentum F6 đạt tốt nhất ở 37oC trong môi trường chứa 10% sữa tách

Các chủng Lb.

fermentum

Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi

các chủng Lb. fermentum


73

béo, 2% glc và 0,5% whey protein với pH ban đầu là 6,5. Lượng EPS thu được cao

nhất trong điều kiện này là 44,49 mg/l [141]. Quá trình sinh tổng hợp EPS đạt cực

đại tại 37oC cũng được chỉ ra bởi các tác giả Yadav và cộng sự (2011) [136], Gorska-

Fra˛czek và cộng sự (2011, 2013) [53], [54], Wang và cộng sự (2015) [124], Calsteren

và cộng sự 2015) [17]. Thông số nhiệt độ có sự khác nhau tùy thuộc vào từng chủng

vi khuẩn, điều kiện nuôi cấy. Gorret và cộng sự (2001) đã công bố rằng, quá trình

tổng hợp EPS bởi chủng Propionibacterium acidipropionici đạt được tốt hơn khi nuôi

cấy ở nhiệt độ dưới 37oC. Ở cùng điều kiện nuôi cấy, lượng EPS sinh tổng hợp bởi

chủng này đạt tốt hơn ở 23oC (0,25g/L), trong khi đó, ở 37oC, quá trình tổng hợp EPS

gần như bị ức chế hoàn toàn (0g/L) [51]. Kết quả này có thể được giải thích bằng các

cơ chế do Sutherland (1972) đề xuất, tức là khi giảm nhiệt độ dẫn đến sự sụt giảm tốc

độ sinh trưởng và sinh tổng hợp polyme ở thành tế bào, tạo ra nhiều tiền chất có sẵn

để tổng hợp EPS [115].

Ở 42oC, chủng S. thermophilus ST1 có khả năng phát triển tối ưu và tạo được

lượng EPS cao nhất sau 32 giờ nuôi cấy là công bố của Zhang và cộng sự (2011) khi

nghiên cứu về sự phát triển và quá trình tổng hợp EPS bởi chủng này trong môi trường

chứa sữa tách béo. Lượng EPS thu được trong điều kiện này là 59,06 mg/l; ở các mức

nhiệt độ là 30 và 37oC, lượng EPS tổng hợp được là ít hơn (khoảng 18 – 20 mg/l).

Khi bổ sung các nguồn dinh dưỡng vào môi trường chứa 10% sữa tách béo gồm 2%

suc, 0,5% dịch whey protein thì lượng EPS tạo thành tăng mạnh, đạt 135,80 mg/l

[140].

Với các chủng Lb. fermentum TC16, TC21, MC3, ở nhiệt độ 40oC lượng EPS

tạo thành đã giảm nhiều so với mức nhiệt cực đại (35oC), sau đó tiếp tục giảm khi

tăng nhiệt độ lên 45oC. Lượng EPS chỉ còn lại tương ứng đối với các chủng Lb.

fermentum TC16, TC21 và MC3 là 90,19%, 78,22% và 71,45% so với giá trị cực đại.

Sự sai khác về lượng EPS thu được phần lớn đã không xảy ra ở hai mức nhiệt 30 và

45oC khi phân tích phương sai (p < 0,05) (Phụ lục 4.5). Đối với chủng MC3, tại mức

nhiệt 30oC, lượng EPS đạt được là thấp nhất, giảm trên 50% so với mức nhiệt cực đại

(khoảng 236,134 µg/ml). Đối với chủng TC13, lượng EPS tạo thành tăng dần khi

nhiệt độ tăng sau đó giảm mạnh ở mức nhiệt 45oC. Hàm lượng EPS tại mức nhiệt độ

74

này chỉ đạt 360,362 µg/ml (đã giảm 14,03% so với mức cao nhất ở 40 OC). Từ kết

quả phân tích thống kê cho thấy, giá trị EPS thu được ở hai mức nhiệt độ 30 và 45 oC

đối với chủng này là không có sự sai khác (p < 0,05) (Phụ lục 4.5). Ở các mức nhiệt

độ thấp (30oC) và nhiệt độ cao 45oC, khả năng sinh tổng hợp EPS của các chủng đều

ở mức thấp. Điều đó cho thấy rằng, các chủng vi khuẩn này là những chủng vi khuẩn

ưa ấm; do đó, với khoảng nhiệt độ trung bình sẽ kích thích cho quá trình tổng hợp các

hợp chất thứ cấp như EPS tốt hơn.

Quá trình sinh tổng hợp HoPS và HePS đều có liên quan đến các enzyme đặc

hiệu có ở bên trong hoặc ngoài tế bào vi khuẩn. Vi sinh vật thường rất mẫn cảm với

sự thay đổi của nhiệt độ. Tính mẫn cảm này được thể hiện qua sự tác động lên các phản

ứng xúc tác của enzyme. Khi các cơ chất được vận chuyển vào tế bào, dưới tác dụng

của các enzyme đặc hiệu, các sản phẩm lần lượt của quá trình xúc tác này được tạo

thành – đây cũng chính là tiền thân của các đơn vị lặp lại trong phân tử EPS. Chính vì

thế, lí do liên quan đến lượng sản phẩm tạo thành thấp trong các điều kiện này có lẽ

liên quan đến tác động của nhiệt độ lên các phản ứng do enzyme xúc tác. Với phản ứng

có sự xúc tác của enzyme, khi nhiệt độ tăng sẽ làm tăng tốc độ phát triển của vi sinh

vật do đó hoạt động trao đổi chất của chúng cũng tăng lên. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng

lên đến một mức độ nhất định thì tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lại có xu hướng

ngược lại với sự tăng nhiệt độ và khi nhiệt độ tăng quá cao vi sinh vật sẽ chết. Nhiệt độ

tăng quá cao có thể gây ra sự biến tính của enzyme và các protein khác trong môi

trường do đó làm giảm khả năng xúc tác sự chuyển hóa các chất dinh dưỡng hoặc các

hệ enzyme tham gia tổng hợp PS có thể không hoạt động được. Ngoài ra, nhiệt độ tăng

cao có thể làm tổn thương màng tế bào vi sinh vật đến mức khó phục hồi và dẫn đến

ức chế sự sinh tổng hợp EPS của vi khuẩn [6].

Khả năng tạo thành EPS thấp hơn ở mức nhiệt thấp có thể giải thích rằng, ở mức

nhiệt này, vi khuẩn vẫn tồn tại và phát triển. Tuy nhiên, khả năng phát triển thường

rất yếu do đó khả năng chuyển hóa các chất dinh dưỡng trong quá trình trao đổi chất

cũng chậm lại. Kết quả của quá trình này là gây nên sự ức chế hoạt động của các hệ

enzyme, làm thay đổi khả năng trao đổi chất của chúng dần dần khiến khả năng sinh

trưởng và phát triển của vi khuẩn mất dần.

75

Như vậy, ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc

vào từng loài vi sinh vật. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của cùng một loài vi

sinh vật không phải là cố định mà có thể phụ thuộc vào pH, nguồn dinh dưỡng và các

nhân tố khác.

3.1.3.4. Đường cong sinh trưởng và ảnh hưởng của thời gian lên men lên khả năng

sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum

Quá trình sinh trưởng và phát triển là đặc tính của vi sinh vật sống. Quá trình

sinh trưởng và phát triển này thường xảy ra qua bốn giai đoạn khác nhau. Giai đoạn

đầu tiên là giai đoạn vi sinh vật chưa sinh sản mà chỉ xảy ra quá trình thích nghi với

môi trường mới (pha lag – pha tiền phát); giai đoạn thứ hai (pha log), giai đoạn này

tế bào bắt đầu phát triển mạnh, chất dinh dưỡng giảm nhanh do sự đồng hóa của vi

sinh vật để tạo thành các sản phẩm thứ cấp. Vì thế, để tận thu được tốt lượng sản

phẩm tạo thành từ quá trình trao đổi chất của chúng thì việc kết thúc quá trình nuôi

cấy ở cuối giai đoạn này là phù hợp nhất. Giai đoạn thứ ba (pha ổn định) là giai đoạn

mà quần thể vi sinh vật ở trạng thái cân bằng động. Tổng số tế bào mới sinh ra bao

giờ cũng gần bằng tổng số tế bào chết đi. Và giai đoạn cuối cùng được coi là giai

đoạn suy vong, số lượng tế bào chết sẽ tăng lên. Chính vì vậy, trong quá trình nuôi

cấy thu các sản phẩm thứ cấp, chúng ta cần xác định thời gian tương ứng với các pha

sinh trưởng của vi khuẩn để thu được lượng sản phẩm một cách tối đa. Quá trình phát

triển và sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có thể xảy ra sớm hoặc muộn hơn tùy loại

vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy của chúng (như thành phần dinh dưỡng, nhiệt độ, pH,

…). Chính vì thế, để khảo sát quá trình thu nhận EPS hiệu quả từ các chủng Lb.

fermentum TC13, TC16, TC21 và MC3, bốn chủng này được nuôi cấy ở các khoảng

thời gian khác nhau trong môi trường đã được xác định về nguồn C, N, mật độ tế bào,

pH và nhiệt độ thích hợp đối với mỗi chủng để xác định ảnh hưởng của yếu tố thời

gian lên quá trình sinh tổng hợp EPS của chúng. Thực hiện lấy mẫu tại các thời điểm

0, 12, 24, 36, 48, 60 và 72 giờ để xác định thời điểm kết thúc quá trình lên men nhằm

tận thu lượng sản phẩm cao nhất trong môi trường.

Kết quả Hình 3.7a, Hình 3.7b, Hình 3.7d cho thấy rằng, sau 48 giờ lên men, quá

trình sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16 và MC3 đều đạt

76

được là cao nhất với hàm lượng thu được lần lượt là 421,378 µg/ml; 406,703 µg/ml;

422,638 µg/ml. Lượng EPS thu được cực đại sau 48 giờ lên men các chủng Lb.

fermentum TC13, TC16 và MC3 cũng là điều kiện mà rất nhiều nghiên cứu đã sử

dụng như một điều kiện tối ưu để nghiên cứu các khía cạnh liên quan đến EPS tiết ra

từ các chủng thuộc LAB [52], [54], [118]. Từ 12 đến 36 giờ lên men, lượng EPS tạo

ra có tăng nhưng tăng chậm. Sau khi đạt cực đại tại 48 giờ, lượng EPS đo được trong

các môi trường giảm mạnh ở 60 và 72 giờ. Lượng EPS của cả ba chủng tại thời điểm

60 giờ nuôi cấy chỉ còn khoảng 85 – 88% và tại 72 giờ khoảng 64 – 88% so với thời

điểm cực đại. Kết quả phân tích thống kê cho thấy lượng EPS thu được từ quá trình

sinh tổng hợp bởi chủng TC13 không có sự sai khác ở thời điểm 12 và 24 giờ; giữa

36 và 60 giờ (p<0,05) (Phụ lục 4.6). Trong khi sự sai khác lại không xảy ra với lượng

EPS tạo thành bởi chủng TC16 giữa các thời điểm 12, 24, 36 giờ và giữa 60 và 72

giờ.

a) pH

0 12 24 36 48 60 72

Thời gian (giờ)

pH b)

0 12 24 36 48 60 72

Thời gian (giờ)

77

So với các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, MC3, quá trình tổng hợp của Lb.

fermentum TC21 xảy ra sớm hơn. Lượng EPS đạt cực đại chỉ sau 36 giờ lên men

(405,728 µg/ml), sau đó giảm dần theo thời gian với các giá trị lần lượt là 382,395

µg/ml ở 48 giờ, 382,760 µg/ml ở 60 giờ và 341,175 µg/ml ở 72 giờ (Hình 3.7c).

Nguyên nhân của sự tăng giảm trong quá trình lên men các chủng vi khuẩn này

có lẽ liên quan đến các giai đoạn trong quy luật phát triển của các vi sinh vật. Sau khi

được nuôi cấy vào môi trường, các chủng vi khuẩn thích nghi dần và bắt đầu phát

triển (từ 12 giờ đến 36 giờ). Tốc độ sinh sản của vi sinh vật được tăng lên cực đại,

chỉ số OD trong các môi trường tương ứng tăng mạnh cùng với lượng chất dinh dưỡng

giảm (từ 36 giờ đến 48 giờ). Từ sau 48 giờ, lượng sản phẩm tạo thành sẽ không tăng

pH d)

0 12 24 36 48 60 72

Thời gian (giờ)

c) pH

0 12 24 36 48 60 72

Thời gian (giờ)

Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình sinh tổng hợp

EPS bởi các chủng Lb. fermentum


78

nữa mà bắt đầu có xu hướng giảm. Sự giảm sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật

trong môi trường có thể là do lượng chất dinh dưỡng trong môi trường giảm, một số

enzyme có thể phân giải chính sản phẩm tạo thành của chúng để làm nguồn thức ăn.

Mặt khác, trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, bên cạnh việc sử dụng các chất

dinh dưỡng trong môi trường thì đồng thời chúng cũng thải ra một số chất gây ức chế

quá trình hấp thụ chất dinh dưỡng của chính bản thân nó, hoặc có thể ức chế hoạt

động của enzyme tổng hợp do đó vi sinh vật phát triển chậm lại và sẽ chuyển sang

trạng thái cân bằng và dần dần sẽ suy vong. Những nguyên nhân này sẽ làm cho lượng

EPS thu được cũng giảm xuống khi thời gian nuôi cấy kéo dài.

Bên cạnh đó, quá trình sử dụng các hợp chất thuộc nhóm carbohydrate của vi

khuẩn sẽ tạo thành các sản phẩm khác nhau trong đó có các acid hữu cơ. Theo thời

gian nuôi cấy, lượng acid tạo thành càng nhiều do đó giá trị pH có xu hướng giảm

dần. Sự biến đổi của pH môi trường có thể đã làm thay đổi trạng thái điện li của các

chất dinh dưỡng chính vì thế làm giảm khả năng sử dụng của chúng. Đây cũng có thể

là nguyên nhân làm giảm quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng LAB. Một lý

do nữa khiến lượng EPS tổng hợp được bị giảm khi kéo dài quá trình nuôi cấy có thể

do enzyme glycohydrolase có sẵn trong môi trường xúc tác quá trình phân hủy các

PS vừa tạo thành [126], [139].

Từ những kết quả thể hiện trên các Hình 3.7 (a, b, c, d) cũng cho thấy có những

mối liên quan nhất định giữa lượng EPS tạo thành với giá trị OD và sự thay đổi của

pH trong suốt thời gian nuôi cấy. Cụ thể chúng tôi nhận thấy rằng, lượng EPS tạo

thành của cả bốn chủng này đều có xu hướng tăng nhanh ở các thời điểm có giá trị

pH môi trường nằm trong khoảng 4,2-4,7. Đây có lẽ cũng là khoảng pH thích hợp

cho các vi khuẩn lactic hoạt động. Ở các giá trị pH khác tương ứng với các thời gian

nuôi cấy khác nhau, lượng EPS tạo thành không cao. Như vậy, sự thay đổi giá trị pH

trong môi trường theo thời gian có thể là yếu tố ảnh hưởng không nhỏ đến sự sinh

trưởng và phát triển của vi khuẩn. Và ở các giá trị pH môi trường thấp hoặc cao có

thể là nguyên nhân gây nên sự tổn thương đến tế bào của vi khuẩn; do đó, quá trình

sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp của nó bị giảm.

79

Đối với giá trị OD, nó có sự liên quan tương đối cao đối với sự sinh tổng hợp

EPS. Đa số các kết quả nghiên cứu đều thể hiện rằng, thời điểm mà EPS tổng hợp

được đạt cực đại cũng chính là thời điểm mà giá trị OD đo được từ môi trường cao

nhất. Cụ thể, đối với chủng Lb. fermentum MC3, lượng EPS đạt được cao nhất vào

thời điểm 48 giờ, đây cũng chính là thời điểm mà OD thu được đạt cao nhất (1,193).

Tương tự, quá trình sinh tổng hợp EPS và giá trị OD đo được từ môi trường đều đạt

cao nhất sau 48 giờ nuôi cấy chủng Lb. fermentum TC16. Như vậy, đối với hai chủng

Lb. fermentum TC16, MC3 thời điểm vi khuẩn phát triển mạnh nhất cũng chính là

thời điểm mà lượng sản phẩm trao đổi chất tạo ra nhiều nhất. Đối với chủng Lb.

fermentum TC13 và TC21, quá trình sinh tổng hợp EPS đạt cực đại không trùng khớp

với thời điểm vi khuẩn phát triển mạnh nhất (OD cao nhất). OD đo được từ môi

trường nuôi cấy chủng Lb. fermentum TC21 theo thời gian đạt cao nhất sau 48 giờ

nuôi cấy, trong lúc đó lượng EPS đạt được tốt nhất ở 36 giờ. Với chủng Lb. fermentum

TC13, giá trị OD đo được đạt cao nhất sau 36 giờ nuôi cấy, trong khi đó lượng EPS

lại thu được cao nhất ở 48 giờ. Như vậy, đối với chủng TC21, có thể nói rằng quá

trình sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp đạt cực đại xảy ra sớm hơn so với sự phát

triển của vi khuẩn. Ngược lại, quá trình tổng hợp EPS cực đại của chủng Lb.

fermentum TC13 lại xảy ra chậm hơn so với sự phát triển của vi khuẩn. Từ kết quả

nghiên cứu thu được, chúng tôi nhận thấy rằng, quá trình phát triển và sinh tổng hợp

các sản phẩm thứ cấp của mỗi loại vi khuẩn khác nhau còn phụ thuộc vào thành phần

môi trường cũng như điều kiện nuôi cấy. Giá trị OD trong các môi trường chúng tôi

đo được có thể thể hiện sự phát triển của vi khuẩn cũng như những sản phẩm thứ cấp

được tạo thành trong quá trình sinh trưởng của chúng. Những sản phẩm tạo thành này

có thể bao gồm những chất độc và có thể cản trở sự phát triển của vi sinh vật gây

giảm khả năng tổng hợp EPS. Chính vì vậy, dựa vào sự biến đổi của đường cong sinh

trưởng và sản phẩm cần thu để chọn thời điểm kết thúc quá trình nuôi cấy phù hợp

nhất.

Thời gian sinh trưởng và tổng hợp các hợp chất thứ cấp của các loài vi sinh vật

khác nhau thường khác nhau, đặc biệt là khi được nuôi cấy với điều kiện và thành

phần môi trường không giống nhau. Quá trình sinh trưởng và tổng hợp EPS từ Lb.

80

confusus TISTR 1498 đạt được cao nhất (đạt 38,2g/l) xảy ra sau 24 giờ nuôi cấy trong

môi trường MRS chứa 100 g/l suc ở điều kiện pH 5,5, nhiệt độ 35oC [111]. Kết quả

nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2011) cho thấy, chủng Lb. fermentum F6 sinh tổng

hợp EPS tăng dần từ khi bắt đầu nuôi cấy và đạt cực đại sau 32 giờ trong môi trường

chứa sữa tách béo, glc và dịch whey protein (WPC) [141]. Khả năng sinh tổng hợp

EPS của Lb. fermentum TDS030603 xảy ra ở các thời điểm khác nhau tùy vào thành

phần môi trường là kết luận của Fukuda và cộng sự (2010) khi nghiên cứu ảnh hưởng

của nguồn carbohydrate lên tính chất lý hóa của EPS sinh ra từ chủng này. Trong môi

trường MRS, lượng EPS thu được cao nhất chỉ sau khoảng 24 giờ nuôi cấy, trong khi

đó, với môi trường MRS có bổ sung thêm glc, lac, gal, quá trình tổng hợp EPS đạt

cực đại sau khoảng 48 giờ nuôi cấy, còn với môi trường MRS có bổ sung thêm suc

thì lượng EPS tạo thành tăng theo thời gian ủ đến khoảng 72 giờ [44]. Nghiên cứu

của Torino và cộng sự (2005) về quá trình sinh tổng hợp EPS của chủng Lb. helveticus

ATCC 15807 cho thấy, quá trình sinh EPS của chủng này xảy ra trong suốt pha phát

triển ở cả hai giá trị pH và đạt cực đại ở pha cân bằng. Lượng EPS tổng hợp được

trong điều kiện môi trường có pH 4,5 đạt cực đại sau 24 giờ nuôi cấy và có giá trị cao

hơn gấp 2,9 lần so với môi trường có pH 6,2. Sau 24 giờ nuôi cấy, quá trình tổng hợp

EPS giảm nhẹ ở pH 6,2 nhưng lại tiếp tục tăng ở pH 4,5 đến 30 giờ mới có chiều

hướng giảm [118]. Quá trình tổng hợp EPS bởi chủng S. salivarius ssp. thermophilus

đã không xảy ra pha phát triển (0-6 giờ) hoặc trước pha cân bằng (6-10 giờ) khi thực

hiện nuôi cấy ở 42 oC. Lượng EPS chỉ thu được với giá trị cực đại giữa thời điểm 14

và 18 giờ ủ [46]. Chủng Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus HP1 phân lập từ các hạt

kefir khi được ủ riêng biệt có khả năng sinh tổng hợp EPS đạt cực đại (472,6 mg/L)

sau 28 giờ nuôi cấy. Trong khi đó, hỗn hợp các chủng (gồm Lb. bulgaricus HP1 + S.

thermophilus T15 + Lb. lactis C15 + Lb. helveticus MP12 + S. cerevisiae A13) được

ủ cùng nhau lại sinh tổng hợp EPS đạt cao nhất sau 22 giờ nuôi cấy với lượng EPS

thu được khoảng 824,3 mg/L [43]. Công bố của Zhang và cộng sự (2011) về sự khác

nhau của quá trình sinh tổng hợp EPS bởi S. thermophilus ST1 khi được nuôi cấy ở

các mức nhiệt độ khác nhau (gồm 30, 37 và 42 oC). Theo đó, ở 42oC, lượng EPS thu

được tốt nhất với 59,06 mg/l sau 32 giờ nuôi cấy. Chủng này sinh EPS ít hơn ở 30 và

81

37oC với các giá trị tương ứng ở mức nhiệt độ này là 21,47 mg/l sau 24 giờ và 34,35

mg/l sau 16 giờ nuôi cấy. Trong môi trường sữa tách béo và môi trường sữa tách béo

có bổ sung thêm 0,5% WPC, chủng S. thermophilus ST1 có khả năng tổng hợp EPS

đạt cực đại tương ứng sau 16 giờ (41,10 mg/l) và 24 giờ (82,70 mg/l) ở 42 oC [140].

Tóm lại, quá trình sinh trưởng và phát triển chỉ xảy ra trong một khoảng thời

gian nhất định phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy

và chất lượng của tế bào nuôi cấy. Khả năng phát triển của vi sinh vật trong môi

trường sẽ xảy ra chậm khi các chất dinh dưỡng trong môi trường giảm và đến hết

khiến vi sinh vật không đủ chất dinh dưỡng để duy trì quá trình trao đổi chất. Mặt

khác, khi tế bào đã đến giai đoạn già hóa hoặc các sản phẩm trao đổi chất trong môi

trường quá nhiều đã gây ức chế quá trình trao đổi chất của tế bào. Chính vì vậy, với

mục đích thu các sản phẩm trao đổi chất thì quá trình nuôi cấy nên kết thúc vào thời

điểm cuối pha log là phù hợp nhất.

Kết luận 1:

Bảng 3.1. Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb. fermentum nghiên cứu

trong luận án

Các

chủng vi

khuẩn Lb.

fermentu

m

Điều kiện thu nhận Hiệu suất thu

nhận EPS ở

các điều kiện

đã khảo sát so

với môi

trường đối

chứng MRS

(%)

Thành phần môi

trường

Mật độ

tế bào

nuôi

cấy

ban

đầu

(cfu/ml

)

pH

ban

đầu

Nhiệt

độ

nuôi

cấy

(oC)

Thời

gian

lên

men

(giờ) Nguồn

C

Nguồn

N

TC13 4% glc 0,4%

cao nấm 107 5,5 40 48 353,56

TC16 3% suc 0,8%

cao thịt 106 6,0 35 48 356,95

TC21 4% lac 0,8%

cao thịt 106 6,0 35 36 414,51

MC3 4% glc 0,3%

cao nấm 106 6,0 35 48 479,14

* Số liệu tính hiệu suất thu nhận EPS được trình bày chi tiết ở phụ lục 4.7

82

Như vậy, mỗi chủng vi khuẩn khác nhau sẽ có những điều kiện sinh trưởng của

riêng chúng. Tổng lượng EPS tổng hợp bởi LAB phụ thuộc vào thành phần của môi

trường (nguồn C và N) và điều kiện mà các chủng đó phát triển, như nhiệt độ, pH ban

đầu và thời gian nuôi cấy. Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb. fermentum

nghiên cứu được tổng hợp ở Bảng 3.1.

Từ kết luận này và kết hợp đối chiếu kết quả thu nhận EPS từ các chủng Lb.

fermentum đã được công bố trước đây (Lb. fermentum TDS030603 [44]; Lb.

fermentum F6 [141]; Lb. fermentum CFR 2195 [136]) khi nuôi cấy chúng trong môi

trường chứa nguồn C, N khác nhau ở các điều kiện không giống nhau, chúng tôi nhận

thấy rằng cùng một loài vi khuẩn là fermentum khi được nuôi cấy trong những điều

kiện lên men khác nhau cũng thể hiện khả năng sinh trưởng, phát triển và sinh tổng

hợp EPS khác nhau nhất định. Sự khác biệt về hàm lượng EPS tạo thành này liên

quan đến sự tác động không nhỏ của nhiều yếu tố như nguồn phân lập của các vi

khuẩn, thành phần dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy.

3.1.4. Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men

3.1.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid trichloroacetic (TCA) lên khả năng loại bỏ

protein

Để thực hiện khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TCA lên khả năng loại bỏ protein

có trong dịch nuôi cấy các chủng vi khuẩn Lb. fermentum, chúng tôi đã tiến hành bổ

sung TCA vào các môi trường lên men ở các nồng độ khác nhau (10, 15, 20, 25, 30,

35, 40%). Thực hiện khuấy trong 24 giờ sau đó thu mẫu và tiến hành xác định hàm

lượng protein còn lại theo phương pháp Kjeldahl và hàm lượng EPS trong dịch nổi

được xác định theo phương pháp phenol – sulfuric.

Kết quả khảo sát thể hiện ở Hình 3.8, 3.9, 3.10, 3.11. Kết quả các số liệu nghiên

cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 5.1.

Kết quả trên các Hình 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 cho thấy, khi nồng độ TCA bổ sung

vào tăng lên, lượng protein còn lại trong dịch nuôi cấy đều có xu hướng giảm dần.

Khả năng loại bỏ protein bởi nồng độ TCA bổ sung vào trong dịch lên men của các

chủng khác nhau là không giống nhau.

83

491,053

289,680

0

100

200

300

400

0

100

200

300

400

500

600

10 15 20 25 30 35 40

Hàm

lư

ợng p

rote

in

còn l

ại (

µg

/ml)

EP

S (

µg/m

l)

Nồng độ TCA (%)

Lb. fermentum TC21

EPS Protein

432,110

289,207287,550

275

280

285

290

295

300

0

100

200

300

400

500

10 15 20 25 30 35 40 Hàm

lư

ợn

g p

rote

in

còn

lại

(µ

g/m

l)

EP

S (

µg

/ml)


Lb. fermentum TC16

EPS Protein

473,004

261,280

0

100

200

300

400

360380400420440460480

10 15 20 25 30 35 40 Hàm

lư

ợng p

rote

in

còn l

ại (

µg/m

l)

EP

S (

µg/m

l)


Lb. fermentum TC13

EPS Protein

Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein

và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC21





84

Đối với chủng Lb. fermentum TC13, khả năng loại bỏ protein hiệu quả nhất khi

nồng độ TCA bổ sung vào là 40%. Lượng protein còn lại trong dịch nổi trong trường

hợp này chỉ còn 231,933 µg/ml. Ở nồng độ TCA 40%, lượng EPS thu được tương

ứng rất thấp, chỉ đạt 407,72 µg/ml. Hàm lượng EPS quan sát được là cao nhất với

473,004 µg EPS /ml khi nồng độ TCA bổ sung vào là 15%. Ở nồng độ TCA bổ sung

này, lượng protein còn lại trong dịch nổi cũng tương đối thấp, còn khoảng 261,28

µg/ml. Hàm lượng protein còn lại trong dịch nổi là 261,28 µg/ml cũng là hàm lượng

protein đo được khi nồng độ TCA bổ sung vào là 20%. Tuy nhiên, lượng EPS ở nồng

độ TCA 20% thu được cũng thấp hơn so với EPS tại nồng độ 15% (Hình 3.8). Ở các

nồng độ TCA bổ sung vào cao hơn (25, 30, 35%), lượng EPS có sự khác nhau với

mức ý nghĩa p<0,05 nhưng lượng protein bị loại bỏ lại hầu như không có sự sai khác

khi xử lý thống kê (phụ lục 5.1). Như vậy, mặc dù ở nồng độ TCA là 40%, lượng

protein được loại bỏ tốt hơn so với ở nồng độ 15% nhưng hàm lượng EPS thu được

ở hai nồng độ này thì ngược lại. Do đó, với mục đích là thu nhận EPS hiệu quả chúng

tôi chọn nồng độ TCA bổ sung vào là 15%.

Với chủng Lb. fermentum TC16, lượng protein còn lại trong dịch lên men thấp

và lượng EPS thu được đạt cực đại khi quá trình tủa bằng TCA được thực hiện với

nồng độ bổ sung là 35%. Ở điều kiện này, lượng EPS đạt được khoảng 432,11 µg/ml

và lượng protein còn lại là 287,55 µg/ml. Ở các nồng độ TCA bổ sung vào dịch nuôi

498,817

244,240

0

50

100

150

200

250

300

350

380

400

420

440

460

480

500

520

10 15 20 25 30 35 40

Hàm

lư

ợng p

rote

in

còn l

ại (

µg/m

l)

EP

S (

µg/m

l)


Lb. fermentum MC3

EPS Protein


và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum MC3

85

cấy là 10, 15, 20, 25, 30 và 40%, EPS thu được thấp và lượng protein còn lại có giảm

theo chiều tăng của nồng độ TCA. Tuy nhiên, kết quả phân tích thống kê cho thấy,

hàm lượng EPS thay đổi và có sự khác nhau giữa các nồng độ nhưng khả năng loại

bỏ protein ở các nồng độ TCA bổ sung vào lại không có sự sai khác (p<0,05) (phụ

lục 5.1).

Khả năng loại bỏ protein trong dịch lên men của chủng Lb. fermentum TC21 đạt

hiệu quả cao hơn khi nồng độ TCA bổ sung vào tăng dần từ 10% đến 40% (Hình

3.10). Trong khi đó, khả năng thu EPS lại đạt được cao hơn với nồng độ TCA bổ

sung ở mức thấp là 10, 15, 20%. Đặc biệt, EPS đạt cao nhất với hàm lượng là 491,703

µg/ml khi nồng độ TCA bổ sung vào môi trường là 15%. Ở nồng độ TCA bổ sung

vào là 20%, lượng EPS thu được cũng tương đối cao, đạt 491,053 µg/ml (chiếm

99,87% so với EPS cực đại).

Kết quả phân tích thống kê cho thấy, hàm lượng protein còn lại trong dịch nổi

sau khi ly tâm chỉ có sự sai khác ở hai khoảng nồng độ TCA bổ sung là 10%, 15% và

từ 20 - 40%. Như vậy, mặc dù lượng EPS thu được ở dịch nổi có bổ sung 15% TCA

cao hơn so với EPS trong dịch nổi bổ sung 20% TCA. Tuy nhiên, xét về mối tương

quan để thu nhận EPS hiệu quả, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ TCA bổ sung vào

dịch nuôi cấy vừa có hiệu quả cho cả việc loại bỏ protein và việc thu nhận EPS là

20%.

Ở dịch lên men của Lb. fermentum MC3, lượng protein bị loại bỏ xảy ra theo

chiều hướng tăng dần khi tăng nồng độ TCA bổ sung vào. Khả năng loại bỏ protein

trong dịch lên men đạt cao nhất ở nồng độ TCA bổ sung vào là 40%. Lượng protein

còn lại trong dịch nổi chỉ còn 185,547 µg/ml. Tương ứng với khả năng loại bỏ protein

tốt nhất thì lượng EPS còn lại trong dịch nổi lại được xác định là giảm khá nhiều so

với lượng EPS ở các nồng độ khác. Lượng EPS thu được tốt nhất sau khi ly tâm dịch

nuôi cấy có bổ sung thêm 20% TCA, đạt khoảng 498,817 µg/ml. Kết quả phân tích

thống kê cho thấy, khả năng tách bỏ protein hầu như không có sự sai khác ở các nồng

độ 10% và 15%; 20%, 25% và 30%; 30% và 35%; 35% và 40%. Trong khi đó, sự sai

khác đã xảy ra đối với lượng EPS thu được khi xử lý thống kê (phụ lục 5.1). Cụ thể

là, lượng EPS thu được có sự sai khác rõ rệt với mức ý nghĩa p < 0,05 ở ba nồng độ

86

TCA là 15%, 20% và 25%. Ở các nồng độ 30%, 35%, 40% lượng EPS thu được

không có sự sai khác. Kết hợp các kết quả ở trên, chúng tôi chọn nồng độ TCA bổ

sung phù hợp nhất để loại bỏ protein trong dịch lên men của chủng Lb. fermentum

MC3 là 20%.

Nồng độ TCA sử dụng để loại bỏ protein ra khỏi dịch lên men trong nhiều

nghiên cứu thu nhận EPS từ LAB không cố định và thay đổi khác nhau tùy nhóm tác

giả. Chẳng hạn, nồng độ TCA sử dụng trong quá trình tách chiết EPS từ dịch lên men

của các chủng thuộc LAB trong các nghiên cứu tương ứng của Harding và cộng sự

(2005) [58] là 14%, Yuksekdag và cộng sự (2008) là 17% [138], Rabha và cộng sự

(2011) [99] là 12% và Seesuriyachan và cộng sự (2011) là 30% [111], ...

Với tất cả các chủng Lb. fermentum sử dụng trong nghiên cứu này, lượng EPS

có thể sẽ bị giảm xuống khi tăng nồng độ TCA bổ sung vào để loại bỏ protein. Điều

này có thể được lý giải là do bên cạnh việc tách bỏ protein tốt hơn ở nồng độ TCA

bổ sung vào cao thì acid này có thể gây nên sự phân hủy EPS có trong môi trường.

Chính vì vậy, từ mục đích là thu nhận EPS có hiệu quả, chúng tôi tiến hành chọn các

nồng độ TCA bổ sung vào nhằm tách chiết EPS đạt được tốt nhất tương ứng với các

chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 lần lượt là 15%, 35%, 20% và 20%.

Các nồng độ này sẽ được sử dụng để tiếp tục hoàn thiện quy trình tách chiết EPS tổng

hợp từ các chủng Lb. fermentum này hiệu quả hơn.

3.1.4.2. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS

Dịch nổi chứa EPS của các chủng vi khuẩn được bổ sung EtOH ở các tỉ lệ khác

nhau nhằm thu EPS dưới dạng tủa. Các tỉ lệ dịch nổi và EtOH được sử dụng trong

nghiên cứu này bao gồm: 1:0,5; 1:1,0; 1:1,5; 1:2,0; 1:2,5; 1:3,0. Kết quả khảo sát ảnh

hưởng của thể tích EtOH so với dịch nổi chứa EPS đến khả năng tách chiết EPS sau

24 giờ thể hiện ở Hình 3.12.

87

Hình 3.12. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS

Lượng EPS thu được từ các dịch nổi chứa EPS sinh ra bởi các chủng Lb.

fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 đạt tốt nhất khi tỉ lệ dịch nổi và EtOH là 1:1.

Lượng EPS thu được ở tỉ lệ này tương ứng với các chủng Lb. fermentum TC13, TC16,

TC21, MC3 lần lượt là 502,191 µg/ml; 450,24 µg/ml; 434,996 µg/ml; 450,646 µg/ml.

Ở tỉ lệ EtOH và dịch nổi là 0,5:1, lượng EPS tủa được ở tất cả các chủng thu được thấp

hơn rất nhiều so với thời điểm đạt cực đại (đạt dưới 200 µg EPS/ml). Khi thể tích EtOH

tăng lên (1,5; 2; 2,5; 3,0), lượng EPS tách ra không tăng nữa và có chiều hướng giảm

nhẹ (Hình 3.12). Khả năng kết tủa EPS có chiều hướng tách ra không hiệu quả ở các

thể tích EtOH bổ sung vào so với dịch nổi là 0,5; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0 có lẽ là do, lượng

EPS trong dịch nổi đã được kết tủa hết khi thể tích EtOH bổ sung vào dịch nổi là 1:1.

Do đó, khi tăng thể tích EtOH lên thì khả năng tách thêm EPS là không hiệu quả. Khả

năng tủa EPS bởi EtOH trong dịch nổi thu được từ quá trình tách chiết EPS trong dịch

nuôi cấy của Lb. fermentum TC13, TC16, TC21 và MC3 sẽ được chọn để khảo sát thời

gian tủa phù hợp là 1:1. Đây cũng là tỉ lệ được sử dụng khá phổ biến trong một vài

công trình nghiên cứu tách chiết EPS từ LAB [58], [130], [138].

3.1.4.3. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS

Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng EtOH lên khả năng tách chiết EPS từ dịch

nổi được thực hiện trong các khoảng thời gian khác nhau 12, 24, 36 và 48 giờ. Quá

trình kết tủa được thực hiện trong điều kiện lạnh (4oC).

0

100

200

300

400

500

600

1:0,5 1:1,0 1:1,5 1:2,0 1:2,5 1:3,0

EP

S (

µg/m

l)

Tỉ lệ dịch nổi : ethanol (v/v)

TC13

TC16

TC21

MC3

Các chủng Lb.

fermentum

88

Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 5.3

Kết quả từ Hình 3.13 cho thấy, sự chênh lệch về lượng EPS tủa của các chủng

Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 khi được duy trì trong các khoảng thời gian

tủa khác nhau từ 24 giờ đến 48 giờ hầu như rất thấp và đều không có sự sai khác khi

xử lý thống kê (p<0,05). Đối với mẫu chỉ thực hiện tủa trong 12 giờ, lượng EPS thu

được khá thấp, chỉ xấp xỉ đạt 50% so với các thời điểm còn lại (24, 36, 48 giờ). Như

vậy, việc kéo dài yếu tố thời gian tủa hầu như không tác động nhiều đến lượng EPS

tách ra. Do đó, với kết quả này, thời gian áp dụng thích hợp và hiệu quả để thu EPS

tủa bằng EtOH trong quá trình tách chiết EPS từ dịch nổi là 24 giờ. Đây cũng là thời

gian mà nhiều tác giả đã sử dụng trong quá trình nghiên cứu thu nhận cũng như dùng

để xác định một số đặc tính lý hóa và cấu trúc của các EPS từ một số chủng LAB

[46], [52], [140], [141].

Kết luận 2:

510,687 506,175450,362 452,923

450,077

440,240451,419452,801

0

100

200

300

400

500

600

12 24 36 48

EP

S (

μg

/mL

)

Thời gian tủa (giờ)

Lb. fermentum TC13 Lb. fermentum TC16

Lb. fermentum TC21 Lb. fermentum MC3

89

Bảng 3.2. Các điều kiện tách EPS từ dịch nuôi cấy thích hợp của các chủng Lb.

fermentum trong luận án

Các chủng Lb.

fermentum

Nồng độ

TCA bổ

sung (%)

Tỉ lệ dịch nổi:

ethanol (v/v)

Thời gian

tủa bằng

ethanol

(giờ)

Hiệu suất thu

nhận tăng sau

khi tách EPS ở

các điều kiện

lựa chọn (%)

TC13 15 1:1 24 121,19

TC16 35 1:1 24 101,73

TC21 20 1:1 24 110,93

MC3 20 1:1 24 106,81

Quá trình khảo sát các điều kiện tách cho thấy, việc thay đổi nồng độ TCA có

ảnh hưởng đến khả năng loại bỏ protein. Hàm lượng protein đã được loại bỏ dần khỏi

dịch lên men nhiều hơn khi nồng độ TCA tăng lên. Trong khi đó, với tỉ lệ EtOH và

thời gian thực hiện tủa bằng EtOH, chúng tôi đã nhận thấy rằng, việc tăng tỉ lệ EtOH

so với dịch nổi cũng như việc kéo dài thời gian tủa bằng EtOH hầu như không ảnh

hưởng lớn đến quá trình tách chiết EPS. Do đó, xét mối tương quan với lượng EPS

trong mỗi dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn và hiệu quả kinh tế tốt nhất khi thu

nhận EPS từ các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3, chúng tôi đã chọn

được các điều kiện tách EPS tương ứng tóm tắt ở Bảng 3.2. Với kết quả khảo sát

được, chúng tôi đã tìm ra được điều kiện thích hợp mới cho quá trình thu nhận EPS

từ các chủng được sử dụng trong nghiên cứu này.

3.1. Kết quả khảo sát các tính chất của EPS sinh tổng hợp từ các chủng Lb. fermentum

(TC13, TC16, TC21, MC3) có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

3.2.1. Khả năng hòa tan trong nước

Polysaccharide là những hợp chất bao gồm hàng trăm đến hàng ngàn phân tử

monosaccharide kết hợp với nhau bằng liên kết glycoside. Do đó, các PS mang nhiều

tính chất khác với các mono và disaccharide như: khả năng hòa tan, không có vị ngọt,

không có phản ứng khử. Một trong những tính chất lý hóa được quan tâm chủ yếu

đặc biệt là trong công nghệ thực phẩm của PS đó là khả năng hòa tan trong nước.

90

Tính chất này đóng vai trò quan trọng trong chế biến như là khả năng làm đặc hoặc

là tác nhân ổn định trong một số sản phẩm như các loại bánh hoặc kẹo [90].

Với các EPS chế phẩm thu được sau khi đông khô, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu khảo sát và đánh giá khả năng hòa tan trong nước theo mục 2.3.6.1

Kết quả khảo sát khả năng hòa tan trong nước của các EPS từ chủng Lb.

fermentum thể hiện ở Bảng 3.3.

Bảng 3.3. Độ hòa tan trong nước của EPS từ các chủng Lb. fermentum

EPS tách chiết từ các chủng Lb.

fermentum Độ hòa tan (%)

EPS- TC13 73,33±3,81

EPS-TC16 75,33±5,17

EPS-TC21 64,00±4,97

EPS-MC3 87,00±2,49

Các EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) đều

có khả năng hòa tan trong nước khá cao (Bảng 3.3). Trong các EPS sử dụng ở nghiên

cứu này, EPS có khả năng hòa tan trong nước tốt nhất là EPS-MC3 đạt khoảng 87%,

tiếp đến là EPS-TC16 với 75,33%, sau đó là EPS-TC13 với 73,33% và cuối cùng là

64% đối với EPS-TC21.

Khả năng hòa tan trong nước của các EPS sinh ra từ các chủng Lb. fermentum

(TC13, TC16, TC21, MC3) có sự khác nhau tuy nhiên sự chênh lệch là không đáng

kể. Công bố của Ahmed và cộng sự (2013) về các tính chất công nghệ của EPS khi

các tác giả này tiến hành nghiên cứu về tính chất của EPS được tách chiết từ Lb.

kefiranofaciens ZW3. Với kết quả khảo sát được, nhóm tác giả đã kết luận rằng khả

năng hòa tan trong nước của EPS được sinh ra từ ZW3 là tương đối thấp, đạt khoảng

14,2% [10].

Như vậy, các EPS được sinh ra từ các chủng vi khuẩn khác nhau hoặc các chủng

vi khuẩn cùng loài nhưng nguồn phân lập khác nhau thì khả năng hòa tan trong nước

không giống nhau. Khả năng hòa tan trong nước của một PS phụ thuộc vào nhiều yếu

tố như sự có mặt của các nhóm phân cực như –OH, bản chất của các monosaccharide

91

cấu tạo nên PS đó, hoặc phụ thuộc vào các mối liên kết có trong các phân tử đường

(có thể là α hoặc β), hoặc khả năng liên kết bởi các tác động từ chính bên trong phân

tử đó [82]. Các monosaccharide thường được hòa tan dễ dàng trong nước, tuy nhiên,

với các PS thì lại khác, mặc dù chúng được tạo thành từ các monosaccharide liên kết

với nhau nhưng khả năng hòa tan của các PS này lại thấp. Sở dĩ, sự hòa tan của các

PS vào trong nước thấp có lẽ là do sự hình thành các mối liên kết giữa các phân tử

monosaccharide để tạo thành các polyme đã làm giảm hoạt tính phân cực của các

nhóm OH của đường do đó nó ngăn chặn sự tương tác với nước của các phân tử này;

chính vì thế khả năng hydrate hóa ít hơn. Bên cạnh đó, sự tập trung của các phân tử

monosaccharide trong quá trình trùng hợp để tạo thành polyme cũng có thể làm giảm

khả năng hoạt động của các nhóm hydroxy liền kề tương tác với nước. Thông thường sự

hình thành các polyme với mối liên kết α 16 giúp duy trì được một số tính chất hòa

tan trong nước của đường được tốt hơn [133].

Khả năng hòa tan trong nước của EPS từ LAB làm tăng độ nhớt và đặc tính

nhầy của môi trường nuôi cấy đã được công bố bởi Martensson và cộng sự [77]. Với

những kết quả này, nhóm tác giả đã chỉ ra được tiềm năng của cả hai chủng LAB là

có thể được sử dụng như các chủng khởi đầu trong quá trình lên men các sản phẩm

mới không phải từ sữa. Nhờ khả năng tạo độ nhớt của EPS từ Lb. fermentum CFR

2195 mà nó đã góp phần vào tính lưu biến và tạo kết cấu đặc trưng cho các sản phẩm

thực phẩm là kết luận của Yadav và cộng sự (2011) [136].

Tóm lại, khả năng hòa tan của các PS trong nước tuy không cao nhưng nó lại

có liên quan đến nhiều ứng dụng có lợi trong công nghiệp. Việc các EPS thu được từ

các chủng Lb. fermentum có thể hòa tan trong nước, dễ dàng phân tán đồng đều trong

dung dịch, tạo điều kiện thuận lợi cho các quá trình biến đổi như khả năng tạo gel, ổn

định khối nhũ tương …của thực phẩm, đặc biệt là đối với các thực phẩm dạng lỏng

(phần lớn là nước). EPS được ví như một tác nhân kết dính và chất nhũ hoá, làm tăng

độ nhớt cho sản phẩm. Khi phân tán đều trong khối thực phẩm, EPS có khả năng ổn

định cấu trúc, trạng thái của một số thực phẩm, hạn chế hiện tượng tách pha – là hiện

tượng có ý nghĩa quan trọng đối với một số sản phẩm như sữa, nước trái cây... [112].

3.2.2. Khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu

https://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=vi&prev=search&rurl=translate.google.com.vn&sl=en&u=http://www.britannica.com/science/emulsifier&usg=ALkJrhiQEY86tg6kfh4mlcYItLL7qwS0ew

92

Nghiên cứu về tính chất lưu biến của các sản phẩm từ sữa cho thấy, gần đây

hiện tượng tách nước lên trên bề mặt gel là một vấn đề cần được giải quyết. Để giải

quyết vấn đề này, người ta thường phải bổ sung các chất phụ gia vào các sản phẩm

sữa lên men như các chất tạo độ đặc, chất ổn định, hợp chất hóa học tổng hợp,...Các

hợp chất này thường bị một số nước trên thế giới không cho phép sử dụng. Vì vậy,

EPS được xem như là một polyme thiên nhiên có thể thay thế được các hợp chất hóa

học này [128].

Các tính chất vật lý liên quan đến khả năng giữ nước và giữ dầu của EPS được

coi là đặc tính có lợi trong sản xuất thực phẩm đặc biệt là sản xuất các sản phẩm như

sữa lên men, xúc xích, thịt xông khói,…Các tính chất chức năng này đóng vai trò

quan trọng đối với các đặc tính của sản phẩm thực phẩm trong suốt quá trình chế biến

cũng như đặc tính cuối cùng của sản phẩm tạo thành. Trong đó, khả năng giữ nước

đóng một vai trò quan trọng đối với chất lượng cuối cùng của một số sản phẩm chứa

nhiều nước như rau, quả, thịt, cá…

Khả năng giữ nước và giữ dầu của các EPS sinh tổng hợp từ các chủng Lb.

fermentum thể hiện ở Bảng 3.4 và Bảng 3.5

Bảng 3.4. Khả năng giữ nước của các EPS từ các chủng Lb. fermentum

EPS tách chiết từ các chủng Lb. fermentum Khả năng giữ nước (%)

EPS- TC13 140,55 ± 0,45

EPS-TC16 136,22 ± 0,60

EPS-TC21 120,63 ± 1,99

EPS-MC3 135,70 ± 3,11

Kết quả Bảng 3.4 cho thấy rằng, EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum

TC13, TC16, TC21, MC3 đều có khả năng giữ nước tốt. Trong đó, khả năng giữ nước

cao nhất là của EPS từ EPS- TC13, đạt 140,55% và thấp nhất so với các EPS còn lại

là EPS- TC21 chỉ đạt 120,63%. Đối với EPS từ hai chủng Lb. fermentum TC16 và

Lb. fermentum MC3 có giá trị tương đương nhau, đạt tỉ lệ lần lượt là 136,22 % và

135,7%.

93

Khả năng giữ nước của EPS có được có thể được coi là một trong những đặc

tính quan trọng của các thực phẩm tươi, nó góp phần duy trì độ tươi của sản phẩm

cũng như duy trì những tính chất vốn có của sản phẩm như độ đàn hồi, tăng giá trị

cảm quan giúp duy trì được sản phẩm trong một thời gian có thể từ đó đáp ứng được

yêu cầu thiết yếu của người tiêu dùng.

Nghiên cứu của Ahmed và cộng sự (2013) về tính chất của EPS tách chiết từ

Lb. kefiranofaciens ZW3 đã kết luận rằng, EPS sinh tổng hợp từ chủng này có khả

năng giữ nước rất tốt. Cụ thể, khả năng giữ nước của EPS sinh tổng hợp bởi Lb.

kefiranofaciens ZW3 đạt lên đến 496,00 % [10]. Điều này có thể cho thấy rằng EPS

được sinh tổng hợp từ các chủng LAB khác nhau hoặc các LAB thu nhận từ các

nguồn khác nhau thì khả năng giữ nước không giống nhau.

Khi khả năng giữ nước của EPS thấp thì tương ứng khả năng giữ dầu của chúng

lại tăng lên khá cao. Khả năng giữ dầu tương ứng của các EPS từ các chủng Lb.

Fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 lần lượt là 590,78%; 594,57%; 608,3% và

599,97% (Bảng 3.5).

Bảng 3.5. Khả năng giữ dầu của EPS từ các chủng Lb. fermentum

EPS tách chiết từ các chủng Lb. fermentum Khả năng giữ dầu (%)

EPS- TC13 590,78 ± 1,94

EPS-TC16 594,57 ± 1,42

EPS-TC21 608,30 ± 0,45

EPS-MC3 599,97 ± 1,14

EPS có khả năng giữ được nước hay giữ dầu có lẽ là do các mạch phân tử EPS

ở dạng sợi cuộn phân tán trong dung dịch, khi có sự thay đổi về một số yếu tố nào đó

của dung dịch (nhiệt độ, pH…) thì các mạch polyme sẽ liên kết, xoắn kép với nhau

tạo ra sợi kép. Các sợi xoắn này lại liên kết với nhau bằng các mối nối để hình thành

nên mạng lưới không gian ba chiều vững chắc, nhốt các phân tử chất lỏng (nước,

dầu…) bên trong. Phần xoắn vòng lò xo của các mạch PS chính là những mầm tạo

gel, chúng lôi kéo các phân tử dung môi vào vùng liên kết. Từ dạng dung dịch chuyển

94

sang dạng gel là do tương tác giữa các phân tử polyme hòa tan với các phân tử dung

môi ở bên trong, nhờ tương tác này mà gel tạo thành có độ bền cơ học cao hơn.

Mức độ giữ nước và giữ dầu của các EPS khác nhau với tỷ lệ chênh lệch lớn có

thể liên quan đến đặc điểm về cấu trúc của EPS. Ngoài ra còn có thể do có sự khác

nhau về độ nhớt giữa các dung môi này. Khả năng giữ dầu của các EPS thu được từ

các chủng Lb. fermentum cao hơn rất nhiều so với khả năng giữ nước. Điều này có

thể lý giải là do trạng thái của các dung môi này. Dầu là chất lỏng sánh, có độ nhớt

cao, các phân tử dầu có mức độ liên kết với nhau bền chặt hơn, trong khi đó, nước là

chất lỏng có độ nhớt thấp nên dễ dàng phân tán ra riêng rẽ. Chính vì vậy mà khi được

bổ sung EPS vào trong nước, sự phân tán của nước sẽ xảy ra tốt hơn nên các phân tử

nước bị lôi kéo vào bên trong mạng lưới của mạch PS ít hơn so với dầu.

Khả năng hòa tan cũng như khả năng giữ nước của EPS có ảnh hưởng rất lớn

trong việc tạo gel của dung dịch. Khả năng giữ và hòa tan tốt làm cho khối nhũ tương

có độ nhớt, độ sánh cao hơn, kết cấu của khối nhũ tương đồng nhất hơn, khó bị phá

vỡ, từ đó hạn chế được hiện tượng tách pha. Đồng thời khả năng tạo gel cũng tốt hơn,

cấu trúc khối gel bền chặt hơn. Pradip và cộng sự (2013) đã nghiên cứu các thuộc

tính lưu biến của EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum V10 trong môi trường sữa lên

men có hàm lượng chất béo thấp. Kết quả cho thấy khả năng tách whey thấp, sản

phẩm có độ nhớt cao, độ kết dính, và các thuộc tính cảm quan tốt [14].

Với khả năng giữ nước của EPS, các chủng lên men khởi đầu có khả năng sản

xuất EPS đã được sử dụng để cung cấp các tác nhân ổn định tự nhiên có sẵn. Ngoài

ra, các EPS có thể hoạt động như là các chất làm đặc tự nhiên, tạo cho sản phẩm có

độ nhớt cao hơn và giảm khả năng tách nước do đó mang lại cho sản phẩm sự cải tiến

về chất lượng mà không sử dụng các chất phụ gia [29]. Husein và cộng sự (2010) khi

nghiên cứu về sự tác động của EPS sinh tổng hợp từ Lb. helveticus lên chất lượng của

bánh quy đã kết luận rằng, việc sử dụng EPS sinh ra từ chủng này có tác dụng làm

tăng nhẹ mức độ hấp thụ nước và sự ổn định của bột nhào trong giai đoạn ủ [61].

Khả năng giữ nước và giữ dầu tốt của các chủng vi khuẩn lactic giúp chúng có thể

được ứng dụng trong các sản phẩm thực phẩm; đặc biệt là các sản phẩm lên men từ sữa,

kem, qua đó góp phần hoàn thiện cấu trúc của sản phẩm. Chẳng hạn như, đối với các sản

95

phẩm như các loại sốt có chứa chất béo, khả năng giữ dầu của các PS có mặt trong sản

phẩm sẽ hạn chế được sự tách pha, giúp hệ nhũ tương trong sản phẩm này bền hơn.

Wang và cộng sự (2010) đã nghiên cứu và kết luận rằng, khả năng giữ nước của các sản

phẩm sữa chua tăng lên khi bổ sung các vi khuẩn lactic có khả năng sinh EPS cao trong

quá trình lên men [130]. Hoặc đối với sản phẩm pho mát, khả năng giữ nước của EPS

được hình thành trong quá trình sản xuất pho mát đã đáp ứng yêu cầu quan trọng trong

việc cải thiện kết cấu của các loại pho mát và cho phép giảm lượng năng lượng trong sản

phẩm cuối cùng [15].

Với những tính chất có lợi như vậy, trong tương lai EPS sản xuất từ các chủng

Lb. fermentum hoàn toàn có thể thay thế một số loại phụ gia tổng hợp trong sản xuất

thực phẩm mà vẫn giữ được tính chất, đặc điểm của sản phẩm đồng thời đảm bảo an

toàn cho sức khỏe.

Kết luận 3

Từ kết quả khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ

thực phẩm của EPS tổng hợp từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3)

bao gồm khả năng hòa tan trong nước, khả năng giữ nước, giữ dầu chúng tôi đã nhận

thấy rằng, các EPS thu được từ quá trình nuôi cấy các chủng Lb. fermentum (TC13,

TC16, TC21, MC3) đều thể hiện được các tính chất này khá tốt. Đây là những tính

chất rất quan trọng trong việc thể hiện tính chất lưu biến và khả năng ổn định trạng

thái của sản phẩm. Do đó, EPS sinh ra từ các chủng này đều có thể ứng dụng trong

công nghệ chế biến các sản phẩm như sữa chua, các sản phẩm chế biến từ thịt (xúc

xích, thịt nguội, …), và các loại bánh hoặc kẹo cũng như giúp duy trì tốt chất lượng

của các sản phẩm có hàm lượng nước cao như rau quả, thịt, cá, …

3.2.3. Khả năng chống oxy hóa

Chất béo nói chung và các thực phẩm chứa chất béo thường bị biến đổi theo

chiều hướng không có lợi khi chế biến nhiệt hoặc bảo quản trong thời gian dài. Các

quá trình biến đổi này xảy ra chủ yếu là do phản ứng oxy hóa và sự phân hủy các sản

phẩm oxy hóa từ đó dẫn đến giá trị dinh dưỡng và cảm quan của sản phẩm bị giảm.

Các chất chống oxy hóa được coi là những phụ gia quan trọng trong quá trình

chế biến thực phẩm. Chúng có tác dụng hạn chế sự phát triển của quá trình oxy hóa

trong các sản phẩm chứa nhiều chất béo như thịt, các sản phẩm từ sữa, sản phẩm

96

chiên. Hoạt động chống oxy hóa của một loại phụ gia bất kỳ phụ thuộc vào khá nhiều

yếu tố như hàm lượng lipid, nồng độ chất chống oxy hóa, nhiệt độ, oxy, sự có mặt

của các chất chống oxy hóa và các thành phần khác trong thực phẩm như nước và

protein. Sử dụng DPPH là một gốc tự do ổn định và có khả năng nhận điện tử hoặc

hydrogen để trở thành phân tử không ổn định nhằm khảo sát khả năng chống oxy hóa

của các EPS thu nhận. Acid ascorbic được sử dụng như là chất chuẩn đối chứng.

Kết quả chống oxy hóa của các EPS sinh tổng hợp từ các chủng Lb. fermentum

và acid ascorbic thể hiện ở Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) của các EPS thu được từ các chủng Lb.

fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3)

Nồng độ

(mg/mL)

Hoạt lực chống oxy hóa (%) Acid ascorbic

EPS-

TC13

EPS-

TC16

EPS-

TC21

EPS-

MC3

Nồng độ

(mg/mL)

Hoạt lực

chống

oxy hóa

(%)

1,0 - - 36,94 ±

0,35 -

1,5 - - 57,14 ±

0,32

27,14 ±

0,30

2,0 29,14 ±

0,52

27,34 ±

0,32

67,41 ±

0,30

47,66 ±

0,55 0,00125

27,05 ±

0,12

2,5 38,56 ±

0,37

35,95 ±

0,52

78,99 ±

0,30

68,05 ±

0,47 0,0025

58,30 ±

0,17

3,0 55,01 ±

0,25

51,08 ±

0,22 -

80,93 ±

0,45 0,0050

89,57 ±

0,1

3,5 76,01 ±

0,35

72,11 ±

0,45 - - 0,1250

93,12 ±

0,12

IC50 2,85 2,96 1,32 2,06 0,00217

Kết quả từ Bảng 3.6 cho thấy, các EPS sinh tổng hợp từ 4 chủng Lb. fermentum

TC13, TC16, TC21, MC3 đều có khả năng chống oxy hóa. Khả năng chống oxy hóa

tăng dần theo chiều tăng của nồng độ EPS và sự thay đổi này là không giống nhau

khi so sánh giữa các EPS từ các chủng khác nhau. Khả năng bắt gốc tự do của EPS

sinh tổng hợp từ chủng Lb. fermentum TC21 đạt được tương đối cao, ở nồng độ 1,0

mg/ml, EPS từ chủng này đã có tỉ lệ bắt gốc tự do đạt 36,94% và tăng nhanh khi nồng

độ EPS tăng lên 1,5 mg/ml (đạt 57,14%). Khả năng này bắt đầu tăng chậm hơn khi

nồng độ EPS thử nghiệm là 2,0 mg/ml và 2,5 mg/ml. Ở hai nồng độ này, tỉ lệ bắt gốc

97

tự do của EPS lên DPPH đạt được lần lượt là 67,14% 78,99%. Với chủng Lb.

fermentum MC3, khả năng chống oxy hóa của EPS từ chủng này chỉ đạt 27,14% khi

nồng độ EPS là 1,5 mg/ml. Tỉ lệ bắt gốc tự do tăng dần và đạt 80,93% khi nồng độ

EPS sử dụng tăng gấp đôi (3,0 mg/ml). Khả năng chống oxy hóa của các EPS tổng

hợp từ hai chủng Lb. fermentum TC13 và TC16 đạt được đều tương đối thấp giống

nhau khi ở cùng các mức nồng độ như nhau. Ở nồng độ EPS sử dụng là 3,0 mg/ml, tỉ

lệ bắt gốc tự do của EPS từ hai chủng này chỉ đạt 51,08 - 55,01%. Khi nồng độ EPS

tăng lên 3,5 mg/ml, khả năng chống oxy hóa của EPS từ hai chủng này cũng chỉ tăng

lên 72,11 – 76,01%.

Các dữ liệu từ Bảng 3.6 cũng chỉ ra rằng, khả năng chống oxy hóa của EPS sinh

tổng hợp từ Lb. fermentum TC21 thể hiện tốt nhất. Tỉ lệ bắt gốc tự do của các EPS

sinh tổng hợp từ 4 chủng LAB này được so sánh cụ thể hơn thể hiện thông qua giá trị

IC50. Khả năng bắt 50% gốc tự do của các EPS từ các chủng Lb. fermentum TC13,

TC16, TC21 và MC3 xảy ra ở các nồng độ tương ứng là 2,85 mg/ml, 2,96 mg/ml,

1,32 mg/ml, 2,06 mg/ml. Khả năng chống oxy hóa của các EPS có thể liên quan trực

tiếp đến mối liên kết trong phân tử EPS với các ion có gốc oxy hóa tạo nên các gốc

ổn định, chính vì thế mà nó ngăn chặn được chuỗi tác nhân phản ứng. Thêm vào đó,

sự có mặt của một lượng lớn các nhóm hydroxyl trong phân tử EPS cũng có thể tạo

ra những phản ứng mà chính sự kết hợp của chúng với nhau để tạo thành những sản

phẩm vô hại thông qua việc cung cấp các nguyên tử hydro kết hợp với các gốc

hydroxyl để tạo thành nước và những gốc tự do C bị oxy hóa tiếp nhằm tạo nên các

gốc peroxy [124].

Như vậy, khả năng chống oxy hóa của các chủng khác nhau là không giống

nhau. Các EPS sinh tổng hợp bởi các chủng vi khuẩn thuộc LAB trong nghiên cứu

này đều có khả năng chống oxy hóa. Tuy nhiên, so với acid ascorbic thì khả năng bắt

gốc tự do của EPS từ các chủng này đều tương đối thấp. Khả năng chống oxy hóa của

acid ascorbic là rất tốt, ở nồng độ rất thấp (chỉ 0,00217 mg/ml) tỉ lệ bắt gốc tự do

DPPH của acid ascorbic đã đạt được 50%. Khả năng chống oxy hóa của hợp chất này

tăng lên rất nhanh khi tăng nồng độ. Khả năng bắt gốc tự do của acid ascorbic chỉ

tăng chậm khi nồng độ tăng lên từ 0,005 mg/ml đến 0,125 mg/ml (chỉ tăng lên gần

98

4%). Dù khả năng chống oxy hóa của các EPS sinh tổng hợp từ các chủng Lb.

fermentum TC13, TC16, TC21 và MC3 là tương đối thấp, tuy nhiên, ưu điểm lớn và

trọng yếu của các EPS này là tổng hợp sẵn ngay trong sản phẩm. Điều này giúp cho

thực phẩm có được khả năng chống oxy hóa vốn có từ ban đầu. Bên cạnh đó, việc sử

dụng các thành phần được sinh ra trực tiếp trong sản phẩm có thể tạo nên cho thực

phẩm bản chất tự nhiên, hướng đến các loại thực phẩm an toàn, không sử dụng phụ

gia tổng hợp.

Khả năng chống oxy hóa của EPS sinh tổng hợp từ các vi khuẩn thuộc LAB

cũng được nhiều nhà nghiên cứu công bố. Liu và cộng sự (2011) đã kết luận rằng,

EPS sinh tổng hợp từ Lactobacillus có tác dụng lên quá trình sản xuất cytokine (gồm

IL-6, TNF-α, IL-1β) và có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự oxy hóa các acid linoleic

trong điều kiện in vitro [75]. Hoạt tính chống oxy hóa của EPS (LPC-1) thu nhận

được từ L. plantarum C88 đã được nghiên cứu bởi Zhang và cộng sự (2013) [139].

Kết quả nghiên cứu cho thấy, EPS từ Lb. plantarum C88 có khả năng loại bỏ tốt đối

với các gốc hydroxyl. Mặt khác, hiệu quả bảo vệ của LPC-1 đối với H2O2 – là tác

nhân gây ra sự tổn thương do oxy hóa tế bào Caco-2 đã được kháo sát. Kết quả cũng

đã chỉ ra rằng khả năng ức chế sự hình thành của malondialdehyde (MDA- là chất

oxy hóa) và sự tăng hoạt động của superoxide dismutase (SOD) và tổng hoạt lực

chống oxy hóa (T-AOC) của LPC-1 phụ thuộc vào nồng độ. EPS từ Lb. plantarum

C88 có tác dụng chống oxy hóa và liên quan đến khả năng loại bỏ phản ứng oxy hóa

(ROS), tăng hoạt lực của enzyme và các hoạt động chống oxy hóa phi enzyme cũng

như giảm sự hình thành peroxy của lipid. Tương tự, khả năng chống oxy hóa của hai

EPS (r-EPS1 và r-EPS2) được tách chiết từ chủng Lb. plantarum 70810 cũng được

công bố bởi Wang và cộng sự (2014) [126] trong điều kiện in vitro. Cả r-EPS1 và r-

EPS2 đều có khả năng chống oxy hóa mạnh đối với nhóm hydroxyl và gốc tự do

DPPH. Từ kết quả đó, nhóm tác giả dự đoán rằng, hai EPS này có thể được sử dụng

để sản xuất thuốc chống oxy hóa. Hoạt tính chống oxy của EPS sinh tổng hợp từ

chủng Lb. plantarum YW32 cũng được Wang và cộng sự (2015) [124] nghiên cứu

và kết luận trong điều kiện in vitro. Ở điều kiện nghiên cứu của mình, nhóm tác giả

đã xác định được khả năng chống oxy hóa của EPS lên chất oxy hóa DPPH, các gốc

99

hydroxyl và gốc oxy hóa khác. Khả năng bắt gốc tự do của EPS sinh tổng hợp từ

chủng này đạt 66,5% ở nồng độ 5,0 mg/ml và có xu hướng tăng lên theo chiều tăng

của nồng độ. Với kết quả này, nhóm nghiên cứu cũng kết luận EPS từ Lb. plantarum

YW32 có thể là một tác nhân chống oxy hóa hiệu quả, có khả năng ngăn ngừa những

tổn thương do quá trình oxy hóa trong các điều kiện sinh lý và khả năng chống oxy

hóa của EPS chịu tác động bởi nhiều nhân tố như thành phần đường, khối lượng phân

tử, các liên kết trong cấu trúc cũng như những phương pháp tách chiết và thu nhận đã

sử dụng. Xu và cộng sự (2011) [135] đã nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa của

EPS sinh tổng hợp từ Bifidobacterium animalis RH trong điều kiện in vitro và in vivo.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, các EPS (EPSa- EPS trung tính, EPSb- EPS acid) tinh

chế từ chủng này đều có tác dụng ức chế đáng kể quá trình oxy hóa lipid và khả năng

loại bỏ gốc từ do DPPH, loại bỏ gốc hydroxyl và hoạt động chống oxy hóa triệt để.

Kết quả nghiên cứu còn chỉ ra rằng, các phân đoạn EPS từ Bifidobacterium animalis

RH có khả năng chống oxy hóa trực tiếp. Trong điều kiện in vitro và in vivo, EPSb

thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao hơn rất nhiều so với EPSa. Các EPS tương ứng

sinh tổng hợp từ Bifidobacterium bifidum WBIN03 (B-EPS) và Lb. plantarum R315

(L-EPS) thể hiện hoạt tính chống oxy hóa và có khả năng kháng khuẩn là công bố

của Li và cộng sự (2014) [72]. Thông qua các thử nghiệm thể hiện hoạt tính sinh học

của hai EPS thu được, nhóm tác giả đã kết luận rằng, cả hai EPS này đều có thể ứng

dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm.

3.2. Kết quả phân tích khối lượng phân tử và một số đặc điểm về cấu trúc của

các EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3

Các EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 trong môi trường chứa nguồn C

và N thích hợp được tiến hành tách chiết TCA để loại bỏ protein. Sau đó, các EPS

trong dịch nổi được thu nhận bằng cách bổ sung EtOH. EPS tủa thu được sau khi ly

tâm sẽ được tiến hành hòa tan vào nước (vừa đủ) và thực hiện thẩm tích nhằm loại bỏ

các phân tử đường đơn, các thành phần hòa tan khác. Tiến hành đông khô mẫu sau

quá trình thẩm tích và thu mẫu và thực hiện phân tích khối lượng phân tử, các đặc

điểm về cấu trúc.

3.3.1. Khối lượng phân tử

100

Các EPS (10 mg) sau khi đông khô được hòa tan lại trong NaNO3 0,1M. Tiến

hành tiêm 20 µl dung dịch chứa EPS vào cột sắc kí lỏng cao áp hiệu Agilent 1100

(USA). Thực hiện rửa giải bằng NaNO3 0,1M với tốc độ 1 ml/phút. Thời gian xuất

hiện tương ứng của EPS được thể hiện trên sắc kí đồ. Kết hợp với chất chuẩn, khối

lượng của các EPS phân tích được xác định (Hình 3.14).

Hình 3.14. Sắc kí đồ khối lượng phân tử của EPS-MC3 bằng phương pháp sắc ký

thẩm thấu gel

Kết quả phân tích khối lượng phân tử các EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum

MC3 (EPS-MC3) trên sắc kí đồ cho thấy sự đồng nhất với một peak ở 8,366 phút

(phụ lục 8). Dựa vào đường cong rửa giải kết hợp đối chứng với chất chuẩn pullulan

có khối lượng phân tử khác nhau (bao gồm 20, 50, 100, 200 kDa) chúng tôi nhận thấy

rằng EPS sinh tổng hợp Lb. fermentum MC3 chỉ chứa một phân tử với khối lượng

trung bình khoảng 98,5 kD (Hình 3.14).

Sự biến thiên về khối lượng phân tử của các EPS sinh tổng hợp từ các chủng LAB

khác nhau cũng đã được nhiều tác giả công bố. Nghiên cứu của Cerning và cộng sự

(1986) đã chỉ ra rằng, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus 416a sinh tổng hợp một EPS

với khối lượng phân tử tương ứng 5 x 105 Da [21]. Công bố của Marshall và cộng sự

(1995) cho thấy rằng, chủng La. lactis subsp. cremoris LC 330 có khả năng sinh tổng

a) b)

Khối lượng phân tử (D) Khối lượng phân tử (D)

Khối lượng trung bình (Da)

101

hợp đồng thời hai EPS với một EPS có khối lượng phân tử lớn hơn 1,0x106 Da và một

EPS có khối lượng phân tử thấp với 1,0x104 Da. Trái ngược với EPS có khối lượng

phân tử cao, quá trình sinh tổng hợp EPS có khối lượng phân tử thấp không chịu ảnh

hưởng bởi điều kiện lên men (trong môi trường bị giới hạn về nguồn N) [80].

Bằng phương pháp HPLC, khối lượng phân tử các phân đoạn của các EPS sinh

tổng hợp từ chủng Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB 2772 trong môi trường

chứa nguồn C khác nhau đã được xác định. Trong môi trường chứa glc, EPS sinh

tổng hợp từ chủng này đã được xác định với sự xuất hiện của hai peak với một phân

tử có khối lượng phân tử cao là 1,7 x 106 Da và một phân tử có khối lượng phân tử

thấp hơn là 4,2 x 104 Da. EPS sinh tổng hợp trong môi trường chứa fruc cũng chứa

hai peak với khối lượng phân tử lần lượt là 1,3 x 106 Da và 3,8 x 104 Da. Các EPS có

khối lượng phân tử thấp hình thành trong môi trường nuôi cấy được tổng hợp với số

lượng thấp hơn. Qua việc xác định được các phân đoạn EPS sinh tổng hợp từ chủng

Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB 2772, nhóm tác giả cũng giải thích rằng, quá

trình sinh tổng hợp nên các EPS có phân tử lượng cao có thể phụ thuộc vào nguồn C,

trong khi đó, việc tổng hợp các EPS có khối lượng phân tử thấp lại không liên quan

đến cơ chất của sự sinh trưởng và phát triển có trong môi trường [55]. Degeest và de

Vuyst (1999) công bố kết quả về khả năng sinh tổng hợp một phân tử EPS giống nhau

trong cả môi trường chứa sữa và MRS lỏng từ S. thermophilus LY03. Nhóm tác giả

kết luận, thực tế cả hai loại EPS này đều được tổng hợp đồng thời và mặc dù chúng

có cùng thành phần các monome cấu tạo nên, tuy nhiên phân tử lượng của chúng lại

khác nhau. Kết quả phân tích theo phương pháp sắc kí thẩm thấu gel cho thấy một EPS

có khối lượng phân tử cao (1,8x 106 Da) và một phân tử EPS có khối lượng thấp

(4,1x105 Da). Tỉ lệ của các EPS này phụ thuộc rất nhiều vào tỉ lệ C/N trong môi trường

lên men. Quan sát từ thực nghiệm, nhóm nghiên cứu đã nhận thấy sự chuyển từ một

EPS có khối lượng phân tử cao thành một EPS có khối lượng phân tử thấp hơn cùng

với việc tăng nồng độ N phức tạp ban đầu [32]. Trong môi trường sữa tách béo, chủng

Lb. acidophilus 5e2 sinh tổng hợp EPS với ba phân đoạn có khối lượng phân tử khác

nhau: peak xuất hiện sớm nhất có khối lượng phân tử cao khoảng 400 kDa (chiếm 10%

so với tổng); tiếp đó là một peak khác có khối lượng phân tử trung bình khoảng 150

102

kDa (chiếm 50% so với tổng); và peak được rửa giải cuối cùng có khối lượng thấp hơn

khoảng 130 kDa (chiếm 40% so với tổng) là công bố của Laws và cộng sự (2008) [68].

Dịch thô chứa EPS trong môi trường nuôi cấy chủng Lb. helveticus thu được qua quá

trình kết tủa bởi EtOH. Tiến hành phân đoạn trên cột Sephacryl S-200 cho thấy có hai

EPS với kí hiệu là LB1 và LB2. Bằng phương pháp sắc kí thẩm thấu gel với chất chuẩn

là các Dextran có khối lượng khác nhau (2x106, 5x105, 4x104 Da), khối lượng phân tử

của hai EPS này cũng được công bố là khác nhau với khối lượng tương ứng là 5,4 x

105 Da của LB1 và 20,3 x 105 Da của LB2 [61].

Khối lượng phân tử của EPS sinh tổng hợp từ Lb. kefiranofaciens ZW3 phân lập

từ một loại rượu của Tây Tạng đã được Ahmed và cộng sự (2013) kết luận khi nhóm

tác giả này nghiên cứu một số đặc điểm của EPS này [10]. Bằng phương pháp thẩm

thấu gel HPLC, sắc kí đồ thu được của EPS này cho thấy chỉ có một đỉnh duy nhất với

khối lượng phân tử ước tính là 5,5 x 104 Da. Một EPS (LPC-1) khác sinh tổng hợp từ

Lb. plantarum C88 được tinh chế bằng sắc kí trao đổi ion và sắc ký thẩm thấu gel có

khối lượng phân tử trung bình là 1,15 x 106 Da [139]. Đặc tính lý hóa của các EPS sinh

tổng hợp bởi chủng Lb. rhamnosus E/N trong môi trường có chứa các nguồn C khác

nhau đã được nghiên cứu bởi Polak-Berecka và cộng sự (2013). Sự khác nhau về khối

lượng phân tử các EPS sinh tổng hợp từ chủng Lb. rhamnosus E/N khi nuôi cấy trong

môi trường MRS có bổ sung vào năm nguồn C khác nhau gồm suc (EPS-Suc), gal

(EPS-Gal), maltose (EPS-Mal), glc (EPS-Glc), lac (EPS-Lac) được xác định bằng

phương pháp sắc kí thẩm thấu gel. Khối lượng của các EPS lần lượt như sau: EPS-Mal

là 195 kDa, EPS-glc là 548,7 kDa, EPS-Gal là 3901 kDa, EPS-Lac là 7027 kDa và

EPS-Suc là 11130 kDa. Từ kết quả này, nhóm tác giả đã kết luận rằng, một chủng vi

khuẩn bất kỳ có thể sinh tổng hợp những EPS khác nhau với những đặc tính lý hóa

không giống nhau tùy thuộc vào nguồn C trong môi trường nuôi cấy [96].

Như vậy, khối lượng phân tử của các EPS sinh tổng hợp bởi các loài thuộc LAB

là không giống nhau. Chúng thường dao động từ 1,0x104 đến 6,0x106 Da. Trong quá

trình phát triển, một số chủng LAB có thể tổng hợp một EPS với một khối lượng phân

tử nhất định hoặc cũng có thể tổng hợp nên các EPS với khối lượng phân tử khác

nhau. Sự khác biệt về khối lượng phân tử của các chủng vi khuẩn thuộc LAB có thể

liên quan đến loài, nguồn tách chiết hoặc tùy thuộc vào thành phần dinh dưỡng trong

103

môi trường mà vi khuẩn đó sinh trưởng và phát triển. Kết quả khối lượng phân tử của

EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3 hoàn toàn phù hợp với các công bố trước

đây về thông tin khối lượng phân tử của EPS tách chiết từ LAB.

3.3.2. Đặc điểm về cấu trúc của EPS-MC3

3.3.2.1. Thành phần monosaccharide của các EPS

Mẫu EPS được tiến hành methyl hóa bằng (CH3)2SO4, sau đó tiếp tục thủy phân,

khử hóa, tạo dẫn xuất acetyl theo mục 2.3.8.2 và 2.3.8.3 và phân tích trên thiết bị GC-

MS -Shimadzu (2010). Từ kết quả GC-MS phân tích được, chúng tôi đã xác định được

các dẫn xuất của monnosaccharide trong EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3.

Thông tin về các dẫn xuất của monosaccharide trong EPS-MC3 được thể hiện

ở Bảng 3.7.

Từ kết quả Bảng 3.7 chúng tôi nhận thấy rằng các thành phần monosaccharide

tương ứng trong cấu trúc của EPS-MC3 gồm D-glc, D-man.

Bảng 3.7. Các dẫn xuất monosaccharide thu được từ EPS sinh tổng hợp bởi Lb.

fermentum MC3

STT Hợp chất Thời gian

lưu (phút)

Diện tích

peak

1 1,5,6-tri-O-acetyl-2,3,4-tri-O-methyl- D- glucitol 5,134 6665390

2 1,3,5 tri-O-acetyl-2,4,6-tri-O-methyl-D-mannitol 6,025 6034772

Từ diện tích peak của các dẫn xuất có mặt trong kết quả phân tích GC-MS chúng

tôi suy ra được tỷ lệ và thành phần phần trăm của các monosacharide. Kết quả được

xác định ở Bảng 3.8.

Bảng 3.8. Tỷ lệ, thành phần (%) các monosaccharide trong cấu trúc EPS sinh tổng

hợp bởi Lb. fermentum MC3

STT Thành phần Tỷ lệ Thành phần (%)

1 D-glucose 1,00 52,48

2 D-mannose 0,91 47,52

Với EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3 (EPS-MC3), kết quả dữ liệu

Bảng 3.8 cho thấy, thành phần D-glc chiếm tỉ lệ cao nhất với 52,48% trong tổng số

104

các thành phần monosaccharide còn lại là D-man với tỉ lệ phần trăm tương ứng là

47,52%. Tỉ lệ phân tử tương ứng của glc và man trong EPS-MC 3 lần lượt là 1,00 :

0,91. Điều đó cho thấy, EPS-MC3 chứa chủ yếu là glucomanan (cấu thành từ D-glc

và D-Man). Từ các kết quả phân tích thành phần monosaccharide, chúng tôi kết luận

rằng EPS sinh tổng hợp từ chủng Lb. fermentum MC3 là một HePS với bộ khung chủ

yếu của EPS-MC3 là glucan.

Kết luận của một số công trình nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc của EPS tổng

hợp từ các chủng Lb. fermentum tách chiết từ các nguồn khác nhau bao gồm các

chủng: Lb. fermentum F6, Lb. fermentum Lf2 và Lb. fermentum TDS030603 với

thành phần đường đều chứa glc và gal, tuy nhiên tỉ lệ của hai đường này trong phân

tử EPS lại có sự khác nhau. Tỉ lệ glc và gal của EPS tách chiết từ Lb. fermentum F6

được công bố là 4:3 [141], EPS từ Lb. fermentum Lf2 là 2:1 [12], trong khi đó tỉ lệ

của glc và gal trong EPS của Lb. fermentum TDS030603 là 2,6:1,0 [49]. Với các kết

quả công bố về thành phần monosaccharide của EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum

chúng tôi tham khảo được đến thời điểm hiện tại, sự có mặt của man trong thành phần

của EPS-MC3 được coi là một điểm mới và có sự khác biệt so với thành phần

monosaccharide của các EPS đã được công bố trước đây.

Với mỗi chủng LAB khác nhau sẽ sinh tổng hợp nên một loại EPS có cấu trúc

khác nhau. Cấu trúc của một số EPS sinh tổng hợp bởi các chủng khác nhau thuộc

loài Lb. helveticus là khác nhau là kết quả được công bố bởi Yang và cộng sự (2000)

[137]. Exopolysaccharide được sinh tổng hợp bởi các chủng Lb. helveticus 776 và

TN-4 có cấu trúc lặp lại của các hexasaccharide D-gal và D-glc với tỷ lệ mol tương

ứng là 1:2 và 1:1 [103]. Trong khi đó, EPS của chủng TY1-2 là một heptamer có chứa

thêm N-acetyl-D-glucasamine. Nhóm tác giả này cũng đã công bố rằng EPS của Lb.

helveticus Aki4 và Lb161 chứa các hexa- và heptasaccharide và có lần lượt 1 và 2

mạch nhánh [137].

Sự đa dạng về thành phần các monosaccharide và các tỉ lệ tương ứng trong cấu

trúc của các EPS tổng hợp từ các LAB khác nhau (thậm chí là trong cùng một loài)

cũng được nhiều tác giả nghiên cứu công bố. Kết luận của Harding và cộng sự (2005)

về đặc điểm cấu trúc của một PS phân nhánh tổng hợp từ Lb. delbrueckii subsp.

105

bulgaricus NCFB2074 gồm D-glc và D-gal với tỷ lệ mol tương ứng là 3: 4 [58]. Với

chủng Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus rr phát triển trong môi trường chứa sữa tách

béo sinh tổng hợp EPS đã được thu nhận. Thực hiện kết tủa phân đoạn EPS thu được

bằng aceton và tinh chế bằng phương pháp lọc gel trên Sephacryl S-500 cho thấy

thành phần của hỗn hợp thu được không chứa protein. Polysaccharide thu được gồm

100% carbohydrate với thành phần monosaccharide gồm D-gal, L-rha, và D-glc ở tỉ

lệ tương ứng là 5:1:1 là kết luận của Gruter và cộng sự (1993) [56]. Một số EPS sinh

tổng hợp từ các chủng vi khuẩn thuộc loài Lb. delbriickii subsp. bulgaticus trong môi

trường sữa tách béo cũng đã được nghiên cứu và công bố về các thành phần

monosaccharide không giống nhau bởi nhiều nhóm tác giả khác nhau. Một dạng chất

nhờn sinh tổng hợp bởi chủng Lb. delbriickii subsp. bulgaticus rr với thành phần gồm

các loại đường như gal và glc ở tỉ lệ mol tương ứng là 2:1 [110]. Các PS khác từ một

số chủng như Lb. delbriickii subsp. bulgaticus CNRZ 416, CNRZ737 có thành phần

gồm gal, glc và rha với cùng một tỉ lệ tương ứng giống nhau là 4:1:1 [21]. Trong khi

đó, Wang và cộng sự (2014) đã kết luận về sự có mặt của các monosaccharide gồm

glc, gal và man trong EPS sinh tổng hợp từ chủng Lb. plantarum 70810. Thực hiện

tách chiết và tinh chế bằng EtOH cùng các phương pháp sắc ký lọc gel, sắc kí trao

đổi ion đã chọn ra được hai phân đoạn EPS khác nhau (r-EPS1 và r-EPS2). Từ kết

quả GC-MS của hai EPS này cho thấy, thành phần các monosaccharide trong r-EPS1

và r-EPS2 thu được đều chứa các monosaccharide giống nhau là glc, man và gal với

các tỉ lệ tương ứng khác nhau lần lượt là 18,21:78,76:3,03 và 12,92:30,89:56,19

[109].

Với EPS từ Lb. plantarum YW32, thành phần của EPS tổng hợp được gồm man,

fruc, gal và glc ở tỉ lệ mol tương ứng là 8,2:1:4,1:4,2 là kết luận của Wang và cộng

sự (2015) [124]. Công bố của Robjin và cộng sự (1996) về đặc điểm cấu trúc của EPS

sinh tổng hợp từ Lb. acidophilus LMG9433 là một heteropolyme bao gồm các thành

phần D-glc, D-gal, acid D-glucuronic, và 2-acetamido-2-deoxy-D-glc với tỉ lệ mol

2:1:1:1 [102].

Một PS sinh tổng hợp bởi Lb. rhamnosus KL37B đã được tiến hành tách chiết

và tinh chế bằng các phương pháp khác nhau với hai phân đoạn được gọi là EPS-1 và

106

EPS-2. Thành phần monosaccharide của hai EPS này đã được kết luận bởi Górska-

Fraczek và cộng sự (2011) với hai loại đường trong phân tử là glc và gal ở cùng một

tỉ lệ giống nhau là 1:2. Sự khác nhau chỉ thể hiện ở các vị trí liên kết giữa các

monosaccharide chi tiết của hai EPS này. Cụ thể như sau: với EPS-1 gồm các dẫn

xuất 3-galactofuranose (1,3,4-tri-O-acetyl-2,5,6-tri-O-methyl-D-galactitol), 2-

galactofuranose (1,2,4-tri-Oacetyl-3,5,6-tri-O-methyl-D-galactitol), 6-

galactofuranose (1,4,6,-tri-O-acetyl-2,3,5-tri-O-methyl-D-galactitol), 6-

glucopyranose (1,5,6-tri-Oacetyl-2,3,4-tri-O-methyl-D-glucitol) và 3-glucopyranose

(1,3,5-tri-O-acetyl-2,4,6-tri-O-methyl-D-glucitol) với tỉ lệ mol tương ứng là

0,6:0,5:0,6:1:1; với EPS-2 lại gồm các dẫn xuất 6-galactofuranose (1,4,6,-tri-O-

acetyl-2,3,5-tri-O-methyl-D-galactitol), 3,6- galactofuranose (1,3,4,6-tetra-O-acetyl-

2,5-di-O-methyl-D-galactitol), 4-galactopyranose hoặc 5-galactofuranose (1,4,5-tri-

O-acetyl-2,3,6-tri-O-methyl-D-galactitol), 6-galactopyranose (1,5,6-tri-O-acetyl-

2,3,4-tri-O-methyl-D-galactitol), 2- glucopyranose (1,2,5-tri-O-acetyl-3,4,6-tri-O-

methyl-D-glucitol), 3-glucopyranose (1,3,5-tri-O-acetyl-2,4,6-tri-Omethyl-D-

glucitol), và glucopyranose (1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-glucitol) với

tỉ lệ tương ứng là 1,2:1,0:0,9:2,0:1,0:1,0:0,8 [54].

Bên cạnh yếu tố liên quan đến loài vi khuẩn, nguồn thu nhận, điều kiện thu nhận

ảnh hưởng đến thành phần monosaccharide trong cấu trúc lặp lại của PS, sự đa dạng

này còn liên quan đến hệ enzyme nội bào và hoạt độ của chúng có mặt trong chính

các chủng vi khuẩn đó. Quá trình sinh tổng hợp các HePS liên quan đến quá trình vận

chuyển các nguồn carbon từ môi trường ngoài vào tế bào chất theo cơ chế khuếch tán

và vận chuyển tích cực và có sự tham gia xúc tác của các enzyme khác nhau. Trong

tế bào, dưới tác dụng đặc hiệu của hệ các enzyme nội bào, các cơ chất đường được

chuyển hóa thành các dạng khác nhau. Cụ thể là, glc có trong môi trường nuôi cấy

Lb. fermentum MC3 được vận chuyển vào tế bào theo cơ chế vận tải tích cực. Ở bên

trong tế bào, dưới tác dụng của enzym hexokinase, glc chuyển hóa thành Glc-6-P,

sau đó nhờ xúc tác của enzyme PGM, Glc-6-P chuyển thành Glc-1-P. Theo cơ chế

quá trình sinh tổng hợp, Glc-1-P dưới tác dụng của hệ enzym pyrophosphorylase,

dehydrogenase khác nhau để tạo thành các nucleotide đường bao gồm Rha, Gal, Glc

107

trong phân tử EPS. Sự có mặt của monosaccharide là glc trong đơn vị lặp lại của PS

từ LAB có thể được giải thích là do sự có mặt của hệ enzyme tham gia vào quá trình

phosphoryl hóa là UDP-Glc pyrophosphorylase. Chính enzyme này sẽ xúc tác quá

trình chuyển hóa tạo thành nucleotide đường của glc trước khi hình thành đơn vị lặp

lại là glc trong cấu trúc của PS. Một nhánh khác, Glc-1-P dưới tác dụng của enzyme

PMM để hình thành nên Man-6-P sau đó tạo thành Man-1-P dưới tác dụng của man-

1-P guanylyltransferase có trong tế bào. Thành phần monosaccharide lặp lại fruc

trong phân tử EPS có được là do sự xúc tác đặc hiệu của GDP-man dehydratase lên

GDP-Man. Như vậy, kết quả của quá trình xúc tác này tạo thành các đơn vị tiền thân

lặp đi lặp lại trong phân tử của EPS gồm Glc, Gal, Rha, Fruc (Hình 1.5). Tuy nhiên,

với kết quả phân tích được về thành phần đường của EPS-MC3, PS tổng hợp được

chỉ gồm đường glc và man trong thành phần của chúng. Điều này có thể lý giải rằng,

sự hình thành các đơn vị lặp lại monnosaccharide khác nhau trong EPS tổng hợp từ

LAB ngoài liên quan đến nguồn cơ chất khác nhau, nó còn liên quan đến hoạt độ của

các enzym đặc hiệu bên trong tế bào của chúng. Với quá trình tổng hợp EPS-MC3,

hoạt độ của enzyme xúc tác sự hình thành GDP-fruc từ GDP-man có thể rất thấp hoặc

đã bị bất hoạt trong quá trình nuôi cấy do một số điều kiện nuôi cấy chủng Lb.

fermentum MC3 gây nên. Chính vì thế, thay vì sự hình thành fruc trong PS thì đơn vị

lặp lại man được hình thành và tham gia vào cấu tạo nên thành phần của EPS-MC3.

Trong nghiên cứu này, bên cạnh sự có mặt của các monnosaccharide như glc,

man, sự vắng mặt của một số monnosaccharide như fruc hoặc rha, gal có thể được

giải thích là do hoạt độ của các enzym xúc tác sự hình thành các loại đường này ở

giai đoạn chuyển hóa từ glc-1-P thấp hơn nhiều so với hoạt độ của các enzym khác.

Với mỗi enzyme tương ứng có trong tế bào của vi khuẩn, chúng có khả năng

xúc tác lên một cơ chất nhất định để tạo thành các sản phẩm khác nhau. Hoạt độ xúc

tác của chính các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp HePS sẽ quyết định

trực tiếp lên sự tạo thành các phân tử đường lặp lại trong chính cấu trúc của PS tổng

hợp được. Kết quả của nhiều nghiên cứu trước đây về thành phần monosaccharide

tham gia cấu tạo nên PS tổng hợp từ các chủng thuộc LAB đa phần đều chứa glc và

gal. Chỉ một số rất ít các công bố về sự có mặt của man hay fruc hoặc rha. Qua đó,

108

có thể thấy, cấu trúc EPS-MC3 với sự có mặt của man và glc có thể là một điểm khác

biệt chủ yếu trong thành phần EPS so với đại đa số các EPS sinh tổng hợp từ LAB đã

được công bố trước đây.

Tương ứng với sự có mặt của các thành phần monosaccharide trong mỗi EPS

tổng hợp được từ LAB được tạo thành là hoạt độ xúc tác của chính các enzyme đó

chiếm ưu thế. Hoạt độ của một enzyme trong tế bào vi khuẩn mạnh hay yếu chịu tác

động bởi nhiều yếu tố lý hóa khác nhau như nhiệt độ, pH, hoạt độ của nước cũng như

sự có mặt của các cơ chất trong môi trường. Đa phần các chủng LAB đã nghiên cứu

đều được tiến hành trong những điều kiện lý hóa khác nhau điều này đã tạo nên những

ảnh hưởng nhất định đến hoạt độ xúc tác của enzyme trong quá trình tạo thành các

phân tử đường lặp lại.

Thành phần monosaccharide và tỷ lệ giữa các monome trong EPS cũng như sự

phân bố khối lượng phân tử của EPS có thể thay đổi phụ thuộc vào các nguồn

carbohydrate được bổ sung vào trong quá trình nuôi cấy là kết luận của nhiều công

trình nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu được công bố bởi Cerning và cộng sự (1994)

cho thấy rằng thành phần đường của EPS thu được chủ yếu là glc khi EPS được hình

thành bởi chủng Lb. casei CG11 và hai chủng Lb. casei CG11-NB, Lb. casei CG1-

ST trong môi trường BMM (buffer minimal medium - Môi trường tối ưu) có chứa

nguồn carbohydrate duy nhất là glc. Tỉ lệ glc (86,6-88%) trong EPS sinh tổng hợp từ

Lb. casei CG11-NB, Lb. casei CG1-ST cao hơn so với tỉ lệ glc trong EPS được hình

thành bởi Lb. casei CG11 (75,6%). Một kết luận khác trong nghiên cứu này đã chỉ ra

rằng, có một lượng nhỏ gal cũng có mặt trong các EPS sinh tổng hợp từ cả ba chủng

Lb. casei. Ngược lại, khi nuôi cấy các chủng này trong môi trường chứa lac như là

nguồn carbohydrate duy nhất, thành phần monosaccharide của những EPS này khác

với EPS sinh tổng hợp trong môi trường BMM chỉ chứa glc. Có 63% glc trong thành

phần của EPS sinh tổng hợp bởi chủng CG11, trong khi đó, lượng glc trong EPS được

tổng hợp bởi hai chủng Lb. casei CG11-NB, Lb. casei CG1-ST lại chiếm ít hơn rất

nhiều. Tỉ lệ glc trong các EPS từ hai chủng này lần lượt là: 37% cho chủng CG11-

NB và 39,2% cho chủng CG1-ST. Bên cạnh đó, nghiên cứu còn cho thấy, khi môi

trường nuôi cấy chứa nguồn carbohydrate là lac, lượng gal ở các EPS thu nhận được

109

lớn hơn so với lượng gal trong các EPS tách chiết từ môi trường BMM có chứa glc.

Lượng gal chiếm tỉ lệ cao hơn ở EPS được sinh tổng hợp bởi các chủng Lb. casei

CG11-NB, (47,1%) và Lb. casei CG1-ST (49,7%) so với gal trong EPS tổng hợp từ

chủng Lb. casei CG11 (13,2%). Trong điều kiện nuôi cấy này, một lượng nhỏ man

cũng đã được tìm thấy trong EPS được sinh tổng hợp bởi cả ba chủng Lb. casei. Như

vậy, sự phân bố của các loại đường trong EPS được sản xuất bởi các chủng thuộc Lb.

casei CG11 khác nhau tùy thuộc vào các nguồn carbohydrate [22]. Trong một nghiên

cứu trước đây, Cerning và cộng sự (1992) cũng công bố rằng có một sự khác biệt về

thành phần monosaccharide của EPS sinh tổng hợp bởi Lb. casei CG11 trong môi

trường chứa sữa hoặc sữa có bổ sung glc hoặc suc và trong môi trường BMM có chứa

glc hoặc suc [20]. Grobben và cộng sự (1996) cũng đã công bố rằng thành phần

monosaccharide của EPS được sinh tổng hợp bởi Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus

NCFB 2772 khi nuôi trong môi trường bổ sung fruc bao gồm glc và gal với tỷ lệ mol

1,0:2,4. Trong môi trường có bổ sung hỗn hợp fruc và glc, thành phần monosaccharide

của EPS tổng hợp được là glc, gal, rha với tỷ lệ mol 1,0 : 7,0 : 0,8 [55].

Bên cạnh những công bố về ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự hình thành các

monosaccharide trong phân tử EPS, một số công trình nghiên cứu khác lại kết luận

rằng, các nguồn carbohydrate bổ sung vào môi trường nuôi cấy ban đầu hầu như

không ảnh hưởng đến thành phần monosaccharide và tỷ lệ giữa các monome trong

EPS mà chỉ ảnh hưởng đến sự phân bố khối lượng phân tử và độ nhớt của EPS. Van

Den Berg (1995) đã công bố rằng thành phần monosaccharide của EPS sinh bởi chủng

Lb. sake 0-1 là không có sự khác nhau khi bổ sung các nguồn carbohydrate khác nhau

[119]. Đây cũng là kết quả nghiên cứu của Laws và cộng sự (2008) khi nghiên cứu

đặc điểm về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ chủng Lb. acidophilus 5e2 [68]. Polak-

Berecka và cộng sự (2013) cũng đã công bố rằng các EPS sinh tổng hợp bởi chủng

Lb. rhamnosus E/N có cấu trúc cơ bản độc lập với việc bổ sung các nguồn

carbohydrate khác nhau trong môi trường MRS. Các thành phần monosaccharide của

EPS sinh tổng hợp bởi chủng Lb. rhamnosus E/N gồm 4 rha, 2 glc, 1 gal và một lượng

dư với một nhóm thế pyruvate. Nghiên cứu cho thấy những khác biệt trong phân bố

khối lượng phân tử của EPS sinh tổng hợp bởi chủng Lb. rhamnosus E/N với những

110

phân đoạn chứa EPS có khối lượng phân tử cao và thấp gồm EPS-Gal, EPS-Suc và

EPS-Lac. Trong khi đó Polak-Berecka (2013) cũng chỉ phát hiện được một phân đoạn

duy nhất chứa EPS có khối lượng phân tử cao đó là EPS-Mal và EPS-Glc khi nuôi

cấy trong hai nguồn C khác nhau [96].

Như vậy, các HePS quan trọng chủ yếu sinh tổng hợp bởi các chủng LAB công

nghiệp thường chứa các loại đường như D-gal, D-glc và L-rha, D-man ở tỉ lệ khác

nhau. Trong đó, glc như là một thành phần mặc định có mặt trong các đơn vị lặp lại

của các EPS sinh tổng hợp từ các chủng thuộc LAB. Từ những kết quả này chúng tôi

nhận thấy rằng, sự không giống nhau về thành phần monosaccharide và tỉ lệ phân tử

trong EPS sinh tổng hợp từ các chủng vi khuẩn thuộc LAB khác nhau một phần có

thể là do thành phần môi trường nuôi cấy (nguồn C và nguồn N), một phần nữa có

thể do sự khác nhau về nguồn thu nhận và hoạt độ của chính các enzym nội bào tham

gia vào quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng LAB.

3.3.2.2. Xác định vị trí liên kết glycoside trong các EPS

Sử dụng GC-MS để xác định vị trí liên kết

Mẫu EPS-MC3 sau khi methyl hoá được tiếp tục tiến hành thuỷ phân, khử hoá,

tạo dẫn xuất alditol acetate và phân tích trên thiết bị GC-MS (sơ đồ hình 2.5). Từ vị

trí C được methyl hóa trong dẫn xuất alditol acetate thu được, cho phép xác định các

liên kết glycoside tương ứng trong các mẫu PS. Các liên kết glycoside tương ứng

trong EPS-MC3 được trình bày ở Bảng 3.9.

Bảng 3.9. Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide thu được và liên kết

glycoside tương ứng của EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3

STT Hợp chất Liên kết glycoside Tỷ lệ

1 1,5,6-tri-O-acetyl-2,3,4-tri-O-

methyl-D-glucitol

→6)-D- glucopyranoside-(1→ 1,00

2 1,3,5-tri-O-acetyl-2,4,6-Tri-O-

methyl-D-mannitol

→3)-D- mannopyranoside-(1→ 0,91

Kết quả phân tích liên kết glycoside với mẫu EPS-MC3 đã methyl hóa bằng GC-

MS cho thấy có hai thành phần chính là 1,5,6-tri-O-acetyl-2,3,4-tri-O-methyl- D- glucitol

111

và 1,3,5-tri-O-acetyl-2,4,6-Tri-O-Methyl-β-D-Mannitol, với tỉ lệ phân tử tương ứng là

1,00 : 0,91 (Bảng 3.9). Từ kết quả thu được ở Bảng 3.9, chúng tôi nhận thấy rằng, bộ

khung của EPS-MC3 sinh tổng hợp được có dạng manno-glucan với hai liên kết chủ yếu

là (1→6) glucoside và (1→3) mannoside. Kết quả này một lần nữa khẳng định EPS sinh

tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 thuộc bộ khung hetero-mannan-glucan.

Sự có mặt của các thành phần monosaccharide và các dạng liên kết khác nhau trong

bộ khung của các EPS-MC3 sẽ tiếp tục được xác định bằng phương pháp phổ cộng

hưởng từ hạt nhân một chiểu (1H-NMR và 13C-NMR) và hai chiều (HMBC, HSQC,

NOESY, COSY).

Sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định đặc điểm về cấu trúc của EPS-

MC3

Chế phẩm EPS trước khi phân tích bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt

nhân được tiến hành xử lý theo sơ đồ Hình 3.15.

Mẫu EPS được tách chiết và tinh sạch một phần nhờ phương pháp thẩm tích với

nước trong 4 -5 ngày bằng máy khuấy. Tiến hành thu mẫu bằng phương pháp đông

khô ở nhiệt độ thấp. Mẫu này tiếp tục được thủy phân, cắt mạch PS với TFA 2M

trong 8 giờ ở 80oC để tạo thành các PS mạch ngắn hơn nhằm tăng khả năng hòa tan

Chế phẩm EPS

Thẩm tích

(4-5 ngày)

Đông khô

Thủy phân bằng TFA

2M, ở 80oC trong 8 giờ

Đông khô

Hình 3.15. Sơ đồ xử lý mẫu cho phân tích NMR

112

của mẫu. Thực hiện loại bỏ TFA dư và tiến hành đông khô thu mẫu. Mẫu thu được

dưới dạng xốp, có khả năng hòa tan trong nước tốt hơn.

Kết quả phân tích phổ NMR một chiều và hai chiều thể hiện ở trên các hình

3.16, hình 3.17, hình 3.18, hình 3.19, hình 3.20, hình 3.21.

Các tín hiệu của EPS-MC3 đã được thủy phân một phần hiện diện trong phổ 1H

-NMR, 13C – NMR và các dạng tương tác trong phổ 2D –NMR (HMBC, HSQC,

NOESY và COSY) cho phép xác định thành phần cũng như liên kết trong phân tử PS

của EPS-MC3.

Các tín hiệu trong phổ 1H-NMR của EPS-MC3 cho thấy, trong vùng từ 4,5 đến

4,9 có sự hiện diện của 2 thành phần đường thông qua các tín hiệu đặc trưng của

hai proton anomer ở độ chuyển dịch 4,87 ppm và 4,55 ppm; các proton của nhóm O-

methyl từ H 3,00 đến 3,62 ppm (Hình 3.16). Dạng liên kết glycoside trong cấu trúc

của PS qua phương pháp phân tích NMR cho thấy, với liên kết α-pyranoside thì độ

chuyển dịch hóa học của các proton anomer có giá trị lớn hơn 5,0 ppm và liên kết β-

pyranoside thì proton anomer có độ chuyển dịch hóa học nhỏ hơn 5,0 ppm [9]. Với độ

chuyển dịch hóa học của proton anomer từ 4,5 – 5,5 ppm trong phổ 1H NMR, Zhou và

cộng sự (2016) đã kết luận rằng, EPS sinh tổng hợp bởi chủng Lb. plantarum BC-25

các proton của nhóm O-methyl Proton anomer

A B

Hình 3.16. Phổ 1H-NMR của EPS-MC3

113

chứa cả hai dạng liên kết α và β [142]. Tương tự, sự có mặt của cả hai cấu hình dạng α

và dạng β của các phân tử cấu thành EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum TDS030603

cũng được kết luận với các độ chuyển dịch hóa học của proton anomer tương ứng tại δ

5,674, δ 5,325 δ 4,985 ppm và δ 4,731 ppm [49]. Cấu hình của các đơn vị lặp đi lặp lại

trong EPS sinh tổng hợp từ Lb. delbrueckii. subsp. bulgaricus EU23 được xác định dựa

trên sự kết hợp của độ chuyển dịch hóa học của proton anomer và hệ số ghép cặp của

các proton cũng đã được công bố bởi Harding và cộng sự (2003). Kết quả cho thấy, cấu

hình của Glc với H1 5,14 ppm và JH1,2 3,0 Hz và một phân tử Glc khác với H1 5,02 ppm

và JH1,2 3,0 Hz được xác định đều là dạng α-D-Glc; trong khi đó phân tử Glc với H1 4,32

ppm và JH1,2 7,5 Hz lại được xác định là β-D-Glc [57]. Do đó, kết hợp các kết quả đã

được công bố trước đây cùng với độ chuyển dịch hóa học của hai proton anomer trong

phổ 1H-NMR của EPS-MC3 ở Hình 3.16 cho thấy, cấu trúc của EPS-MC3 chỉ chứa liên

kết glycoside dạng β. Bên cạnh đó, kết quả từ phổ 1H-NMR cũng chỉ ra rằng, EPS-MC3

chứa hai đơn vị monosaccharide chính trong cấu trúc lặp lại của nó. Hai monosaccharide

này được chúng tôi kí hiệu là A và B theo chiều giảm dần của độ chuyển dịch hóa học.

Carbon anomer

Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của EPS-MC3

114

Kết quả ở Hình 3.17 của phổ 13C –NMR cho thấy EPS-MC3 có sự xuất hiện

của hai tín hiệu carbon ở độ chuyển dịch hóa học là 94,1 và 94,0 ppm và các vùng

carbon trong mạch vòng của nó từ 61,5 đến 77,2 ppm. Từ các công trình nghiên cứu

trước cho thấy, các tín hiệu của carbon anomer nằm trong khoảng 93,0 - 96,8 ppm

có thể được xác định là glc [9], [41], [49], [108] và có thể là man khi tín hiệu đó

nằm trong khoảng 94,5 - 95,0 [9], [98]. Ở độ chuyển dịch hóa học của carbon

anomer δ 93,0 ppm, EPS từ Lb. delbrueckii. subsp. bulgaricus EU23 được kết luận là

D-glc [57]. Gerwig và cộng sự (2013) đã xác định được phân tử glc trong cấu trúc của

EPS từ Lb. fermentum TDS030603 khi kết quả phân tích phổ 13C-NMR cho thấy sự xuất

hiện của tín hiệu carbon anomer ở δ 96,4 ppm [49]. Kết luận của Rani và cộng sự

(2018) cho thấy sự xuất hiện của phân tử man trong cấu trúc của EPS tách chiết từ

Lb. gasseri FR4 khi độ chuyển dịch hóa học của carbon anomer là 94,81 ppm [101].

Công bố của Agrawal (1998) về sự có mặt của các monosaccharide dựa vào kết quả

trên phổ 1H, 13C NMR cho thấy rằng, ở δH1 4,64 và δC1 93,0 hoặc δC1 96,8 được xác

định là phân tử glc; trong khi đó, ở δH1 4,89 và δC1 94,5 hoặc δC1 94,9 được xác định

là phân tử man [9]. Bên cạnh đó, với độ chuyển dịch hóa học của carbon anomer

(C1) của các oligosaccharide nằm trong khoảng từ 103 – 112 ppm, cấu trúc của

chúng thường ở dạng furanose. Cấu trúc dạng pyranose của các monosaccharide cấu

thành các PS thường gặp hơn ở những độ chuyển dịch hóa học của C1 dưới 103 ppm [9].

Cấu trúc của EPS từ Lb. rhamnosus KL37C là một pentasaccharide với sự cấu thành của

các monnosaccharide ở dạng furanose và pyranose là công bố của Lipi’nski và cộng sự

(2003). Theo đó, các tín hiệu C1 của các phân tử gal với độ chuyển dịch hóa học lần lượt

là 108,53; 106,01 ppm đều là cấu trúc dạng vòng furanose; trong khi đó, ba

monnosaccharide còn lại là hai glc và gal với độ chuyển dịch hóa học của C1 tương ứng

là 98,07; 99,16; 98,30 ppm đều là cấu trúc dạng pyranose [74]. Kết quả công bố tương

tự về sự có mặt của cấu trúc dạng pyranose và furanose trong cấu trúc lặp lại của các

monnosaccharide cấu tạo nên PS sinh tổng hợp từ Lb. johnsonii 142. Cấu trúc dạng

pyranose của các phân tử glc, gal đã được kết luận khi δC1 của chúng tương ứng nằm

trong khoảng 95 – 102 ppm. Trong khi đó sự xuất hiện của tín hiệu carbon anomer ở độ

chuyển dịch hóa học là 109,4 ppm được xác định là dạng furanose [52]. Các

115

monosaccharide trong cấu trúc của EPS từ Lb. plantarum C88 đã được kết luậnu đều có

dạng pyranose với các giá trị δC1 nằm trong khoảng từ 96 – 97 ppm [41]. Kết hợp các

kết luận này và từ phổ 1H, 13C-NMR của EPS-MC3 có tín hiệu carbon anomer ở

94,1 nên có thể được quy cho là của β-D-mannopyranose và tín hiệu ở C1 94,0 sẽ

là β-D-glucopyranose.

Như vậy, kết quả NMR đã chỉ ra sự có mặt của glc và man trong cấu trúc của

oligosaccharide là hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích thành phần

monosaccharide theo phương pháp GC-MS ở mục 3.3.2.1.

Hơn nữa, các đỉnh của đường cắt ngang trong phổ HSQC giúp xác định được vị

trí của các phân tử carbon và proton trong cấu trúc dạng vòng từ 1 đến 6 của chúng.

Cụ thể, thông tin trên phổ HSQC đã chỉ ra các peak carbon lần lượt là 94,1; 94,0;

77,2; 73,8; 73,2; 71,6; 71,4; 70,6; 67,4; 67,1; 61,5; 61,5 ppm có sự tương tác tương

ứng với các proton 4,55; 4,87; 3,01; 3,28; 3,47; 3,53; 3,51; 3,49; 3,50; 3,27; 3,43;

3,62 ppm (Hình 3.18). Điều này cho phép xác định vị trí của proton nối trực tiếp với

nguyên tử carbon trong cấu trúc phân tử của EPS-MC3.

a)

116

b)

c)

Hình 3.18. Phổ HSQC (a, b, c) của EPS-MC3

117

Những tương tác 1H → 1H trong phổ COSY đã chỉ ra các tương tác giữa các proton

của carbon cận kề nhau trong cấu trúc EPS-MC3 sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum

MC3. Các tương tác đó bao gồm tương tác giữa A H-2 (δ 3,53)/A H-3 (δ 3,62)/A H-

4 (δ 3,49), giữa A H-4 (δ 3,49)/A H-3 (δ 3,62)/ A H-5 (δ 3,28), giữa B H-3 (δ 3,47)/B

H-4 (δ 3,27)/B H-5 (δ 3,50), và giữa B H-5 (δ 3,50)/B H-4 (δ 3,27)/B H-6 (δ 3,43).

Kết quả này cho phép thiết lập trật tự liên kết carbon trong các thành phần đường

tương ứng trong cấu trúc phân tử của EPS-MC3 (Hình 3.19).

Đối chiếu với các tài liệu tham khảo [41], [54], [101], [137], [142] cùng những

phân tích trên các phổ 1H -NMR, 13C – NMR, COSY và HSQC, chúng tôi đã xác định

được độ chuyển dịch hóa học của các thành phần đường trong EPS-MC3 (Bảng 3.10).

A1

B1

Hình 3.19. Phổ đồ COSY của EPS-MC3

118

Bảng 3.10. Độ chuyển dịch hóa học 1H –NMR và 13C – NMR của EPS-MC3 đo

trong DMSO

Đơn vị: ppm

Phần đường H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6 Ký

hiệu

→6)-β- D-

glucopyranoside-(1→

4,87 3,53 3,62 3,49 3,28 3,51 A

→3)-β-D-

mannopyranoside-(1→

4,55 3,01 3,47 3,27 3,50 3,43 B

Phần đường C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6

→6)-β- D-

glucopyranoside-(1→

94,0 71,6 61,5 70,6 73,8 71,4 A

→3)-β-D-

mannopyranoside-(1→

94,1 77,2 73,2 67,1 67,4 61,5 B

Từ Hình 3.20 cho thấy, phổ HMBC của EPS-MC3 xuất hiện các tương tác giữa

proton anomer A H-1 ( 4,87) với carbon B C-3 ( 73,2); giữa proton anomer B H-1

( 4,55) với carbon A C-6 ( 71,4). Kết quả này chỉ ra các mối liên kết glycoside

trong cấu trúc của EPS-MC3 tương ứng là A(1→3)B và B(1→6)A.

( 4,87)

( 73,2)

( 4,55)

( 71,4)

A

AH-1 BC-3

B

BH-1 AC-6

A(13)B glycoside

B(16)A glycoside

Hình 3.20. Phổ đồ HMBC của EPS-MC3

119

Thêm vào đó, với những tương tác mạnh giữa các proton anomer với các proton

khác trong không gian thể hiện trên phổ NOESY (Hình 3.21) bao gồm giữa A H-1 (

4,87) với B H-3 ( 3,47); giữa B H-1 ( 4,55) với A H-6 ( 3,51). Thông tin này cho

phép chúng tôi định vị được các gốc đường (Bảng 3.11).

Bảng 3.11. Các dạng liên kết trong cấu trúc của EPS-MC3 qua phổ NOESY, HMBC

Đơn vị: ppm

Phần đường Ký

hiệu H1 NOESY HMBC Mối liên kết

(1→6)-β-D-glucopyranoside A 4,87

3,47

73,2

A: H1 với B: H3

A: H1 với B: C3

(1→3)-β-D-

mannopyranoside

B 4,55

3,51

71,4

B: H1 với A: H6

B: H1 với A: C6

Từ kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phân tích thành phần

monosacharide của EPS-MC3 cho phép sắp xếp đơn vị mắt xích lặp lại với dạng liên

Hình 3.21. Phổ đồ NOESY của EPS-MC3

120

kết cụ thể như sau: [6)-β-D-Glcp-(13)-β-D-Manp-(16)-β-D-Glc-(1]n (Hình

3.22)

Như vậy, từ kết quả phân tích các mối liên kết và giải phổ NMR 1D/2D trên

oligosaccharide từ PS đã thủy phân một phần bằng acid chúng tôi dự đoán rằng, cấu

trúc của EPS được tách chiết từ dịch nuôi cấy của chủng Lb. fermentum MC3 là một

HePS chứa các đơn vị lặp đi lặp lại là D-glc và D-man trong mạch chính của nó. Sự

liên kết giữa hai thành phần này trong cấu trúc của EPS-MC3 thông qua các mối liên

kết 1,3- và 1,6- glycoside cũng phù hợp với rất nhiều các công bố trước đây.

Sự đa dạng về các mối liên kết với các thành phần monosaccharide khác nhau

trong cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB nói chung và từ chi Lactobacillus nói

riêng đặc biệt là loài Lb. fermentum đã được nhiều công trình nghiên cứu kết luận.

Về thành phần monosaccharide của PS tổng hợp từ các chủng vi khuẩn thuộc chi

Lactobacillus nói chung chủ yếu thường gặp là glc và gal ở tỉ lệ rất khác nhau với các

mối liên kết trong mạch chính cũng khác nhau như Lb. helveticus K16 [137], Lb.

johnsonii FI9785 [33]. Bên cạnh sự có mặt gần như thường xuyên của thành phần glc

và gal, có rất ít các công bố về thành phần monosaccharide của EPS từ loài

Lactobacillus có sự tham gia của man [101], [125], [127]; rha [47] [101], [104], [109];

1

2 3 4

5

1 6

1

6

6

2 3

4

5

5 4

3

2

Hình 3.22. Các đơn vị lặp lại trong cấu trúc của EPS-MC3 đã được thủy

phân một phần

121

fruc [125]. Các mối liên kết chủ yếu được công bố trong các nghiên cứu về cấu trúc

EPS từ chi Lactobacillus cũng thay đổi khác nhau, có thể chứa liên kết β-1,4- hoặc

liên kết β-1,3- hoặc liên kết β-1,6- và α-1,2-, α-1,3- hay α-1,4- hay các liên kết α-

1,6- glycoside [17], [33], [34], [49]. Sự khác nhau về đặc điểm cấu trúc như thành

phần monosaccharide, loại liên kết không chỉ xảy ra trong cùng một chi mà thậm chí

sự khác nhau này còn xảy ra trong cùng một loài (Bảng 3.12).

Đối với loài fermentum, các công bố trước đây về thành phần monosaccharide

của các EPS được kết luận chủ yếu chỉ chứa glc, gal và rha. Với kết quả nghiên cứu

của luận án, thành phần monosaccharide của EPS sinh tổng hợp bởi chủng Lb.

fermentum MC3 không chứa thành phần gal và rha mà chỉ chứa glc và man trong cấu

trúc lặp lại của nó. Điều này cho phép chúng tôi có thể khẳng định rằng các đơn vị

lặp lại trong cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3, đặc biệt là sự có

mặt của man được coi là một điểm mới so với các cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ

các chủng vi khuẩn thuộc loài fermentum đã công bố trước đây.

Hoạt tính sinh hóa của các EPS sinh tổng hợp từ các chủng thuộc LAB liên quan

trực tiếp đến các liên kết cấu tạo nên một phần cấu trúc của chúng. Di và cộng sự

(2017) đã công bố về đặc điểm cấu trúc của hai phân đoạn EPS từ Lb. casei SB27

(LW1 và LW2) có chứa các liên kết chủ yếu là (14)- galactoside; (14)- glucoside

[34]; dạng liên kết chủ yếu trong cấu trúc của LCP1-EPS tách chiết từ Lb. casei bao

gồm liên kết (14)- glucoside và (1)- glucoside là kết luận của Ai và cộng sự

(2015) [11]; c-EPS từ Lb. plantarum 70810 chứa (14)- galactoside và (1)-

galactoside [127]; liên kết (12)- glucoside và (12)- mannoside trong Lb.

plantarum BC-25 [142], EPS từ Lb. gasseri FR4 chứa liên kết (16)- glucoside,

(14)- galactoside, (13,4)- mannoside, (13)- rhamnoside, (14)- fucoside,

(14)- glucoside và (1)- galactoside [101] và EPS từ Lb. fermentum TDS 030603

chứa liên kết (13)- glucoside ở dạng α, trong mạch chính cùng với liên kết (16)-

galactoside ở mạch nhánh… Sự khác biệt về thành phần monosaccharide của EPS và

các dạng liên kết trong cấu trúc của nó một lần nữa được cụ thể hóa ở Bảng 3.12.

Từ các kết quả công bố trước đây về thành phần monosaccharide, các dạng liên

122

kết trong cấu trúc EPS của các chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus đặc biệt là loài

fermentum (Bảng 3.12) một lần nữa khẳng định rằng, EPS tách từ chủng Lb.

fermentum MC3 trong nghiên cứu của luận án là một PS mới với các đặc điểm về

thành phần monosaccharide và dạng liên kết trong cấu trúc của PS có sự khác biệt

nhất định.

Như vậy, sự đa dạng về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn liên quan

rất nhiều đến các yếu tố như chủng vi khuẩn, thành phần môi trường, điều kiện nuôi

cấy, điều kiện tách chiết và đặc biệt là liên quan đến tính xúc tác đặc hiệu của hệ

enzyme nội bào của chính các vi khuẩn tổng hợp nên các EPS đó. Tính đặc hiệu của

các enzyme tham gia vào sự chuyển hóa qua lại giữa các thành phần để tạo thành các

monosaccharide đặc trưng trong cấu trúc của EPS tổng hợp được sẽ phụ thuộc vào

cơ chất trong môi trường và hoạt độ của các enzyme tham gia xúc tác đó. Sự khác

nhau về thành phần monosacharide có thể cải thiện được một số tính chất lý hóa của

EPS sinh tổng hợp từ các chủng vi khuẩn.

123

Bảng 3.12. Đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ chi Lactobacillus đã công bố và của EPS-MC3 của luận án

Chủng vi

khuẩn thuộc

chi

Lactobacillus

(Lb.)

Khối

lượng

phân tử

(Da)


phân tử tương ứng Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…)

Tác giả

(năm)

[TLTK]

Lb. delbrueckii

subsp.

bulgaricus 291

1,4 x 106 D-glc : D-gal = 3:2

β-D-Galp-(14)- β-D-Glcp (16)

|

4)-β-Glcp-(14)-α-Glcp-(14)- β-D-Galp-(1 Faber và

cộng sự

(2001) [39]

Lb. delbrueckii

ssp. bulgaricus

LBB.B332

D-glc:D-gal:L-rha =

1:2:2 3)-α-D-Glcp-(13)-α -D-Galp-(13)-α-L-Rhap -(12)-α-L-Rhap 12)- α-D-

Galp-(1

Sanchez-

Medina

(2007)

[108]

Lb. delbrueckii

ssp. bulgaricus

LBB.B26

D-glc:D-gal = 2:3

α-D-Glcp (16)

|

3)-α-Galp-(13)-β-Galp-(14)- β-D-Glcp-(13)- β-D-Galf-(1

Sanchez-

Medina

(2007)

[108]

124

Chủng vi

khuẩn thuộc

chi

Lactobacillus

(Lb.)

Khối

lượng

phân tử

(Da)



Tác giả

(năm)

[TLTK]

Lb. delbrueckii

subsp.

bulgaricus

OLL1073R-1

5,0 x 106 D-glc:D-gal =

1,0:1,5 β-D-Galp (14)

|

[2)-α-D-Glcp-(13)-β-D-Glcp-(13) β-D-Galp-(14)- α-D-Galp-(1]n

Calsteren

và cộng sự

(2015) [17]

Lactobacillus

delbrueckii

ssp. bulgaricus

SRFM-1

3,97 x

105

3,86 x

105

gal:glc = 1,00:1,34 α -D-Glcp (16)

|

→6-( β-D-Galp-(1→4)- β -D-Glcp-(1→4)- α -D-Galp-(1→4)- β -D-Galp-(1→6)- β -

D-Galp-(1→4)- β -D-Glcp-(1→4)- α -D-Galp-(1→4)- β -D-Galp-(1→4)- α -D-Glcp-

(1→

| |

β -D-Glcp (16) α -D-Glcp (16)

→6-( β -D-Galp-(1→4)- β -D-Glcp-(1→6)- α -D-Galp-(1→

|

α -D-Glcp (16)

Tang và

cộng (sự

2017) [116]

Lb. johnsonii

FI9785

D-glc:D-gal = 4:2 6)-α-Glcp-(13)- β -Glcp-(15) β -Galf-(16)- α -Glcp-(1 4)- β -Galp-(1 4)-

β -Glcp-(1

Dertli và

cộng sự

(2013) [33]

125

Chủng vi

khuẩn thuộc

chi

Lactobacillus

(Lb.)

Khối

lượng

phân tử

(Da)



Tác giả

(năm)

[TLTK]

Lb. johnsonii

142

1,0 x 105 D-glc:D-gal = 2:4 3)-α-Glcp-(12)-β-D-Galp-(16)-α-D-Galp-(16)-α-D-Glcp-(13)-β-D-

Galf(1

Górska và

cộng sự

(2010) [52]

Lb. rhamnosus

KL37C

D-glc:D-gal = 2:3 3)-α-Glcp-(12)-β-D-Galp-(16)-α-D-Galp-(16)-α-D-Glcp-(13)-β-D-

Galf(1

Lipin’ski

(2003) [74]

Lb. rhamnosus

KL37B

D-glc:D-gal = 3:6

4)-α-D-Galp-(16)- α-D -Galp-(16)- β-D-Galp-

(16)- β -D-Galf-(1 3)- β -Glcp-(1 6)- β -Galf-(16)- β -Galf-(1

|

α-D-Glcp-(12)- β -Glcp (13)

Górska-

Fra˛ czek và

cộng sự

(2011) [54]

Lb. plantarum

70810

r-EPS1: D-glc:D-

man:D-gal =

18,21:78,76:3,03

r-EPS2: D-glc:D-

man:D-gal = 12,92 :

30, 89 : 56,19

Wang và

cộng sự

(2014)

[126]

Lb. plantarum

YW11

D-glc:D-gal =

2,71:1,00

Wang và

cộng sự

(2015)

[123]

Lb. plantarum

YW32

D-man:D-fruc: D-

gal: D-glc =

8,2:1,0:4,1:4,2

Wang và

cộng sự

(2015)

[124]

126

Chủng vi

khuẩn thuộc

chi

Lactobacillus

(Lb.)

Khối

lượng

phân tử

(Da)


phân tử tương ứng


Tác giả

(năm)

[TLTK]

Lb. plantarum

C88

D-glc:D-gal = 3:2

β- D-Galp-(16)

|

4)-α-D-Galp2Ac-(12)-α -D-Glcp-(13)-β- D-Glcp-(1

|

β- D-Glcp-(13)

Fontana và

cộng sự

(2015) [41]

Lb. plantarum

BC-25

1,83x104

1,33x104

D-man: D-gal: D-glc

= 92,21:1,79:6,00

D-man: D-gal: D-glc

= 91,36:2,44:6,20

R’6)-β-D-Manp-(26)- β -D- Manp-(26)

|

[2)-α-D-Glcp-(12)- β -D-Manp-(12)-α- D-Glcp-(12)-α-D-Glcp-(1]n

| |

R”6)-β-D-Manp-(26)- α-D-Galp(26) 6)-β-D-Manp-(26)- β -D- Manp-

(26)

Zhou và

cộng sự

(2016)

[142]

Lb. plantarum

KX041

38,67

x103

D-man:D-glc: D-

gal: D-arabinose =

12,94:7,26:3,31:0,95

Wang và

cộng sự

(2017)

[127]

127

Chủng vi

khuẩn thuộc

chi

Lactobacillus

(Lb.)

Khối

lượng

phân tử

(Da)



Tác giả

(năm)

[TLTK]

Lb. fermentum

TDS030603

D-glc:D-gal = 3:1 [3)-β-D-Glcp-(13)-α -D-Glcp-(1]n

|

α-D-Glcp-(16)- α-D-Galp(12)

Gerwig và

cộng sự

(2013) [49]

Lb. fermentum

V10

5,7 x 105 Glc: Rha: Gal =

1:13:1,5

Behare và

cộng sự

(2013) [14]

Lb. fermentum

Lf2

D-glc:D-gal = 2:1 Ale và cộng

sự (2016)

[12]

Lb. fermentum

MC3

9,85 x

104

D-glc:D-man =

1,00:0,91 [6)-β-D-Glcp-(13)-β-D-Manp-(16)-β-D-Glc-(1]n Công bố

của luận án

128

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Từ các kết quả nghiên cứu thu được trong luận án cho phép chúng tôi có những

kết luận như sau:

1. Về hiệu suất thu nhận EPS:

- Từ các chủng LAB sử dụng trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn ra được

04 chủng có khả năng sinh tổng hợp EPS tốt. Đó là các chủng Lb. fermentum TC13,

Lb. fermentum TC1, Lb. fermentum TC21 và Lb. fermentum MC3.

- Đối với các chủng vi khuẩn khác nhau, không có một quy trình nào chung để

tiến hành thu nhận các sản phẩm trao đổi chất của chúng. Từ kết quả nghiên cứu,

chúng tôi đã xác định được nguồn dinh dưỡng (nguồn C, N) và điều kiện nuôi cấy

(mật độ gieo cấy ban đầu, pH ban đầu, nhiệt độ, thời gian) thích hợp và hiệu quả cao

cho quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn sử dụng. Cụ thể như sau:

+ Chủng Lb. fermentum TC13 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao khi phát triển

trong môi trường MRS có bổ sung thêm 4% glucose, 0,4% cao nấm với điều kiện lên

men ở 40 oC, pH ban đầu 5,5, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu 107 CFU/mL trong thời

gian 48 giờ.

+ Chủng Lb. fermentum TC16 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao trong môi

trường MRS có bổ sung thêm 3% sucrose, 0,8% cao thịt sau 48 giờ ở điều kiện lên

men bao gồm mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu là 106 CFU/mL, pH ban đầu 6,0 và

nhiệt độ nuôi cấy là 35 oC.

+ Chủng Lb. fermentum TC21 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao sau 36 giờ

lên men ở nhiệt độ 35 oC, pH ban đầu 6,0, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu 106 CFU/mL

trong môi trường MRS có bổ sung thêm 4% lactose, 0,8% cao thịt.

+ Ở điều kiện lên men là 35 oC, pH ban đầu 6,0, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu

106 CFU/mL trong thời gian 48 giờ với môi trường MRS có bổ sung thêm 4% glucose,

0,3% cao nấm, chủng Lb. fermentum MC3 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao nhất.

- Từ dịch lên men thu nhận được bởi các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16,

TC21, MC3) chúng tôi đã xác định được điều kiện tách EPS hiệu quả tương ứng.

129

+ Nồng độ TCA bổ sung vào dịch lên men của các chủng Lb. fermentum TC13,

TC16 phù hợp nhất nhằm loại bỏ protein và thu EPS tốt được làm sáng tỏ trong nghiên

cứu này lần lượt là 15%, 35% và 20% cho cả hai chủng Lb. fermentum TC21, MC3

+ Quá trình tách EPS đạt hiệu quả tốt khi thời gian tủa bằng EtOH được thực

hiện trong 24 giờ với tỉ lệ dịch nổi và EtOH là 1:1 cho tất cả các chủng sử dụng nghiên

cứu.

2. Về một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm:

Các EPS sinh tổng hợp từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3)

đều thể hiện tốt các tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm. Cụ

thể là:

- Khả năng hòa tan trong nước của các EPS thu nhận được từ các chủng Lb.

fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 theo thứ tự giảm dần như sau: EPS-MC3 > EPS-

TC16 > EPS-TC13 > EPS-TC21.

- Khả năng giữ nước của các EPS này tăng theo trình tự như sau: EPS-TC21 <

EPS-MC3 < EPS-TC16 < EPS-TC13.

- Khả năng giữ dầu của các EPS đạt được trong nghiên cứu này là tương đối

cao. EPS có khả năng giữ dầu cao nhất là EPS-TC21, tiếp đến là EPS-MC3, tiếp theo

là EPS-TC16 và thấp hơn cả là EPS-TC13.

- Dịch chiết của các EPS thu nhận được trong các điều kiện lên men đã được

khảo sát đều thể hiện khả năng chống oxy hóa tốt và có xu hướng tăng dần theo nồng

độ. Khả năng chống oxy hóa của các EPS sinh tổng hợp được từ các chủng Lb.

fermentum khác nhau theo trình tự giảm dần như sau: TC21 > MC3 > TC13 > TC16.

Cụ thể là, tỉ lệ bắt gốc tự do DPPH của các EPS đạt 50% tại các nồng độ 1,32 mg/mL

đối với Lb. fermentum TC21, 2,06 mg/mL đối với Lb. fermentum MC3, 2,85 mg/mL

đối với Lb. fermentum TC13 và 2,96 mg/mL đối với Lb. fermentum TC16.

3. Về khối lượng phân tử và một số đặc điểm cấu trúc của EPS-MC3

- Đã xác định được khối lượng phân tử của EPS-MC3 là 98,5 kD nhờ phương

pháp sắc ký thẩm thấu gel.

130

- Một số thông tin mới về cấu trúc của EPS-MC3 bao gồm thành phần, tỉ lệ các

monosaccharide và các loại liên kết chủ yếu trong bộ khung đã lần lượt được làm

sáng tỏ.

+ Thành phần monosaccharide có trong EPS-MC3 bao gồm các đơn vị lặp đi

lặp lại là D-glucose, D-mannose với tỉ lệ phân tử tương ứng là 1,00:0,91.

+ Các loại liên kết chủ yếu tạo nên bộ khung chính của EPS-MC3 là (1→6)

glucoside và (1→3) mannoside.

+ EPS-MC3 là một PS mới so với các PS từ các chủng thuộc loài Lb. fermentum

đã được công bố trước đó.

2. Kiến nghị

Do thời gian tiến hành đề tài nghiên cứu có hạn, đồng thời, trong quá trình thực

hiện luận án, chúng tôi đã gặp một số khó khăn về vấn đề trang thiết bị do đó chúng

tôi vẫn chưa thể thực hiện sâu hơn các thông tin liên quan đến kết quả cũng như phạm

vi ứng dụng thực tiễn. Vì vậy, để các kết quả từ luận án này có thể được ứng dụng tốt

hơn trong thực tiễn, chúng tôi xin được phép kiến nghị tiếp tục:

1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng khác nhau lên đặc điểm về

cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp được từ các chủng Lb. fermentum này.

2. Tiến hành nghiên cứu ứng dụng của EPS thu được lên một số sản phẩm lên

men cụ thể về việc cải thiện tính chất lưu biến của sản phẩm như khả năng giữ nước,

khả năng tạo gel, khả năng làm đặc,...

3. Tiến hành nghiên cứu một số tính chất sinh lý tác động đến sức khỏe con

người của các EPS này như: khả năng kháng khuẩn, tác động làm giảm cholesterol,

hoạt tính chống khối u,...

131

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ

1. Trần Thị Ái Luyến, Trần Bảo Khánh, Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Văn Thi

(2017), Nghiên cứu điều kiện tách chiết và đặc điểm về cấu trúc của các

exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum MC3 và Lactobacillus

plantarum W12, Tạp chí Hóa học, Số 55 (4E23), 243-249.

2. Trần Bảo Khánh, Trần Thị Ái Luyến, Đỗ Thị Bích Thủy (2017), Xác định

khối lượng phân tử và một số tính chất lý hóa của các exopolysaccharide được sinh

tổng hợp bởi Lactobacillus fermentum MC3 và Lactobacillus plantarum W12, Tạp

chí Hóa học, Số 55 (4E34), 17-21.

3. Trần Thị Ái Luyến, Đỗ Thị Bích Thủy (2016), Optimal conditions for the

production of exopolysaccharide by Lactobacillus fermentum TC16, Tạp chí Khoa

học kỹ thuật nông lâm nghiệp, Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh, số 06, 50-

62.

4. Trần Thị Ái Luyến, Đỗ Thị Bích Thủy (2016), Ảnh hưởng của các nguồn

dinh dưỡng khác nhau và điều kiện nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp

exopolysaccharide từ Lactobacillus fermentum TC13, Kỷ yếu hội thảo khoa học toàn

quốc về tiến bộ khoa học thực phẩm và kỹ thuật sinh học: từ nghiên cứu đến sản xuất,

Đại học Bách khoa Hà nội, 58-66.

5. Trần Thị Ái Luyến, Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Bảo Khánh, Nguyễn Quốc

Khánh (2016), Effect of some factors on exopolysaccharide production of

Lactobacillus fermentum TC21 isolated from ‘tom chua’ in Hue, Vietnam, Tạp chí

khoa học Đại học Huế: Khoa học tự nhiên, Tập 116, số 02, 55-66

6. Trần Thị Ái Luyến, Đỗ Thị Bích Thủy, Hoàng Thị Hồng Ánh (2016), Ảnh

hưởng của nguồn nitơ và điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp

exopolysaccharide của Lactobacillus fermentum MC3, Tạp chí Khoa học Đại học

Huế: Kỹ thuật và công nghệ, Tập 121, số 07, 89-100.

7. Trần Thị Ái Luyến, Đỗ Thị Bích Thủy (2018), Nghiên cứu ảnh hưởng của

một số yếu tố lên quá trình tách chiết và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng

hợp bởi Lactobacillus fermentum phân lập từ tôm chua, Tạp chí Khoa học và Công

nghệ, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế: Khoa học tự nhiên, Kỹ thuật và công

nghệ, Tập 11, số 11, 71-82.

http://csdlkhoahoc.hueuni.edu.vn/index.php/nhakhoahoc/chitiet/1014



http://csdlkhoahoc.hueuni.edu.vn/index.php/congtrinhkhoahoc/chitiet/25213








132

8. Trần Thị Ái Luyến, Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Văn Thi, Phan Thị Thu

Huyền (2018), Study on the biosynthesis and structure characterization of

exopolysaccharide from Lactobacillus fermentum MC3, Tạp chí khoa học Đại học

Huế: Khoa học tự nhiên, Tập 127, số 01, 13-22.

133

TÀI LIÊU THAM KHẢO

TIẾNG VIÊT

1 Trần Thị Hồng Hà, Lưu Văn Chính, Lê Hữu Cường, Trần Thị Như Hằng, Đỗ

Hữu Nghị, Trương Ngọc Hùng, Nguyễn Thị Nga, Lê Mai Hương (2013), Đánh

giá hoạt tính sinh học của polysaccharide và các hợp chất tách chiết từ nấm

hương (Lentinus edodes),Tạp chí sinh học, 35(4), 445-453.

2 Lê Thị Thúy Hằng, Trần Đặng Mỹ Ngân, Nguyễn Thị Kim Hậu, Nguyễn Thành

Sơn, Đinh Minh Hiệp, Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Thị Kim Oanh (2017), Khảo

sát ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps

sinensis thu nhận polysacharide ngoại bào (eps) có hoạt tính kháng oxy

hoá, Tạp chí khoa học và công nghệ, đại học Đà Nẵng, 5 (114), 95-103.

3 Lê Thị Thúy Hằng, Bạch Thị Bích Phượng , Nguyễn Thị Thu Tuyết, Trần Minh

Trang, Huỳnh Thư, Nguyễn Tiến Thắng, Đinh Minh Hiệp (2017), Tối ưu hóa

thành phần dầu ô liu trong môi trường nuôi cấy nấm Ophiocordyceps sinensis

để thu nhận exopolysaccharide, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự

nhiên và Công nghệ, 33 (1S), 174-181.

4 Trần Thị Hằng, Vũ Đình Ngọ, Maiko Okajima, Tatsuo Kaneko (2015), Nghiên

cứu cấu trúc và tính chất của polysacarit tách chiết từ tảo sinh trưởng và phát

triển tại ruộng lúa tỉnh Phú Thọ, Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học, 20 (4),

171-176.

5 Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội,

NXB Đại học Quốc gia Hà Nội

6 Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp, NXB xây dựng Hà Nội.

7 Trần Thị Văn Thi, Lê Trung Hiếu (2012), Các thông số chất lượng của fucoidan

và một số sản phẩm khác được phân lập từ rong mơ (Sargassum) Thừa Thiên

Huế, Tạp chí Hóa học, 50 (5A), 29-33.

8 Trần Thị Văn Thi, Lê Trung Hiếu, Nguyễn Thị Hoài (2012), Chiết xuất, xác định

hàm lượng và khảo sát tác dụng dược lý của phân đoạn polysaccharid từ nấm

Linh chi (Ganoderma lucidum), Tạp chí Dược học (Bộ Y tế), 5 (433), 18-23.

TIẾNG ANH

9 Agrawal P. K. (1992). NMR spectroscopy in the structural elucidation of

oligosaccharides and glycosides, Phytochemistry, 31(10), 3307–3330.

134

10 Ahmed Z., Wang Y., Anjum N., Ahmad A., Khan S.T. (2013), Characterization

of exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 isolated

from Tibet kefir e Part II, Food Hydrocolloids 30, 343-350.

11 Ai L., Guo Q., Ding H., Guo B., Chen W., Cui S. W. (2015), Structure

Characterization of exopolysaccharides from Lactobacillus casei LC2W from

skim milk, Food Hydrocolloids 56, 134-143

12 Ale E.C., Perezlindo M.J., Pavón Y., Peralta G.H., Costa S., Sabbag N.,

Bergamini C., Reinheimer J.A., Binetti A.G. (2016), Technological, rheological

and sensory characterizations of a yogurt containing anexopolysaccharide

extract from Lactobacillus fermentum Lf2, a new food additive, Food Research

International 90, 259-267

13 Badel S., Bernardib T., Michaud P. (2011), New perspectives for Lactobacilli

exopolysaccharides, Biotechnology Advances 29, 54–66

14 Behare P. V., Singh R., Nagpal R., Rao K.H. (2013), Exopolysaccharides

producing Lactobacillus fermentum strain for enhancing rheological and sensory

attributes of low-fat dahi, J. Food Sci. Technol. 50 (6), 1228–1232.

15 Bouzar F., Cerning J., Desmazeaud M. (1997), Exopolysaccharide production

and texturepromoting abilities of mixed-strain starter cultures in yogurt

production, J. Dairy Sci. 80, 2310–2317.

16 Brandt M., Roth J.K., Hammes W.P. (2003), Effect of an exopolysaccharide

produced by LactoBacillus sanfranciscensis LTH1729 on dough and bread

quality. Sourdough from fundamentals to applications (p 80) Brussels: Vrije

Universiteit Brussel (VUB) IMDO

17 Calsteren M.V., Gagnon F., Nishimura J., Makino S. (2015), Structure

determination of the neutral exopolysaccharide produced by Lactobacillus

delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1, Carbohydrate Research 413, 115-

122

18 Cerning J. (1990), Exocellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria,

FEMS Microbiology Reviews 87, 113-130

19 Cerning J. (1995), Production of exopolysaccharides by lactic acid bacteria and

dairy propionibacteria, Lait 75, 463-472.

20 Cerning J., Bouillanne C., Landon M., Desmazeaud Y. (1992), Isolation and

characterization of exopolysaccharides from slime-forming mesophilic lactic

acid bacteria, J. Dairy Sci. 75, 692-699.

135

21 Cerning J., Bouillanne M., Desmazeaud M., Landon M. (1986), Isolation and

characterization of exocellular polysaccharides by Lactobacillus bulgaricus,

Biotechnol. Lett. 8, 625-628.

22 Cerning J., Renard C.M.G., Thibault J.E., Bouillance C., Landon M.,

Desmazeand M., Topisirovic L. (1994), Carbon source requirements for

exopolysaccharide production by Lactobacillus casei CG11 and partial structure

analysis of the polymer, Appl. Environ. Microbiol. 60, 3914-3919.

23 Coeuret V., Dubernet S., Bernardeau M., Gueguen M., Vernoux J.P. (2003)

Isolation, characterization and identification of lactobacilli focusing on cheeses

and others dairy products, Lait 83, 269–306.

24 Cross. M.L., Stevenson L.M. and Gill H.S. (2001), Anti-allergy properties of

fermented foods: An important immunoregulatory mechanism of lactic acid

bacteria, Int. munopharmacol 1, 891–901.

25 De Souza A.M.D., Sutherland I.W. (1994), Exopolysaccharide and storage

polymer production in Enterobacter aerogenes type 8 strains, Journal of Applied

Bacteriology 76, 463-468.

26 de Vos W., Vaughan M. (1994), Genetics of lactulose utilisation in Lactic acid

bacteria, FEMS Microbiol. Re. 15, 217–317.

27 De Vuyst L. and De Vin F. (2007), Exopolysaccharides from Lactic Acid

Bacteria, 478 – 519.

28 De Vuyst L., and Vandamme E. J. (1994), Bacteriocins of Lactic acid bacteria:

Microbiology, Genetics and Applications, Laboratory of Industrial

Microbiology and Biocatalysis, University of Gent, Belgium.

29 De Vuyst L., Degeest B. (1999), Heteropolysaccharides from lactic acid

bacteria, FEMS Microbiology Reviews 23, 153-177.

30 De Vuyst L., Vanderveken F., Van De Ven S., Degeest B. (1998), Production by

and isolation of exopolysaccharides from Streptococcus thermophilus grown in

a milk medium and evidence for their growth-associated biosynthesis, J. Appl.

Microbiol. 84, 1059-1068.

31 Degeest B., Vaningelgem F., De Vuyst L. (2001), Microbial physiology,

fermentation kinetics, and process engineering of heteropolysaccharide

production by lactic acid bacteria, International Dairy Journal 11, 747–757.

32 Degeest, B., and L. De Vuyst. (1999), Indication that the nitrogen source

influences both amount and size of exopolysaccharides produced by

136

Streptococcus thermophilus LY03 and modelling of the bacterial growth and

exopolysaccharide production in a complex medium, Appl. Environ. Microbiol.

65, 2863-2870.

33 Dertli E.,Colquhoun I.J., Gunning A.P., Bongaerts R.J., Mayer G.L.G M.J., and

Narbad A., Bonev B.B. (2013), Structure and Biosynthesis of Two

Exopolysaccharides Produced by Lactobacillus johnsonii FI9785, The Journal

of Biological Chemistry, 288 (44), 31938–31951.

34 Di W., Zhang L., Wang S., Yi H., Han X., Fan R., Zhang Y. (2017),

Physicochemical characterization and antitumour activity of exopolysaccharides

produced by Lactobacillus casei SB27 from yak milk, Carbohydrate Polymers,

171, 307-315.

35 Dick J.C., Van Den Berg D., Robijn G.W., Janssen A.C., Giuseppin M., Vreeker

R., Kamerling J.P., Vliegenthart J.G., Ledeboer A.M., Verrips C.T. (1995),

Production of a novel extracellular polysaccharide by Lactobacillus sake 0-1 and

characterization of the polysaccharide, Appl. Environ. Microbiol. 61, 2840-2844.

36 Doco T., Wieruszeski J.M., Fournet B., Carcano D., Ramos P., Loones A.

(1990), Structure of an exocellular polysaccharide produced by Streptococcus

thermophilus, Carbohydr. Res. 198, 313–321.

37 Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., and Smith F. (1956),

Colorimetric method for determinationof sugars and related substances.

Analytical Chemistry 28, 350-356.

38 Dueñas-Chascoa M.T., Rodriguez-Carvajalb M. A., Tejero-Mateob P.,

Esparteroc J.L., Irastorza-Iribasa A., Gil-Serranob A.M. (1998), Structural

analysis of the exopolysaccharides produced by Lactobacillus spp. G-77,

Carbohydrate Research 307, 125-133.

39 Faber E.J., Kamerling J.P., Vliegenthart J.F.G. (2001), Structure of the

extracellular polysaccharide produced by Lactobacillus delbrueckii subsp.

bulgaricus 291, Carbohydrate Research 331, 183-194.

40 Farres J., Caminal G. and Lopez-Santin J. (1997), Influence of phosphate on

rhamnose-containing exopolysaccharide rheology and production by Klebsiella

I-174, Appl. Microbiol. Biotechnol. 48, 522–527.

41 Fontana C., Li S., Yang Z., Widmalm G. (2015), Structural studies of the

exopolysaccharide from Lactobacillus plantarum C88 using NMR spectroscopy

and the program CASPER, Carbohydrate Research 402, 87–94.

137

42 Freitas F., Alves V.D. and Reis M.A.M. (2011), Advances in bacterial

exopolysaccharides: from production to biotechnological applications, Trends in

Biotechnology 29(8), 388-399

43 Frengova G.I., Simova E.D., Beshkova D.M. and Simov Z.I. (2002),

Exopolysaccharides Produced by Lactic Acid Bacteria of Kefir Grains,

Exopolysaccharide and Lactic Acid Bacretia, 805-810.

44 Fukuda K., Shi T., Nagami K., Leo F., Nakamura T., Yasuda K., Senda A.,

Motoshima H., Urashima T. (2010), Effects of carbon source on

physicochemical properties of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus

fermentum TDS030603 in achemically defined medium, Carbon Polymers 79,

1040–1045.

45 Gamar-Nourani L., Blondeau K. and Simonet J.M. (1998), Influence of culture

conditions on exopolysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus strain

C83, Journal of Applied Microbiology 85, 664–672.

46 Gancel F. and Nove G. (1994), Exopolysaccharide Production by Streptococcus

salivarius ssp. thermophilus Cultures. 1. Conditions of Production, J. Dairy Sci.

77, 685-688.

47 Gangoiti M. V., Puertas A. I., Hamet M. F., Peruzzo P. J., Llamas M. G.,

Medrano M., Prieto A., Due˜nas M. T., Abraham A.G. (2017), Lactobacillus

plantarum CIDCA 8327: An α-glucan producing-strain isolated from kefir

grains, Carbohydrate Polymers 170, 52-59.

48 Garcia-Garibay M,, Marshall V.M.E. (1991), Polymer production by

Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, J. Appl. Bacteriol. 70, 325-328.

49 Gerwig G.J., Dobruchowska J.M., Shi T., Urashima T., Kamerling J.P. (2013),

Structure determination of the exopolysaccharide of Lactobacillus fermentum

TDS030603—A revision, Carbohydrate Research 378, 84–90.

50 Gill H.S. (1998), Stimulation of the immune system by lactic cultures, Int. Dairy

J. 8, 535–544.

51 Gorret N., Maubois J.L., Engasser J.M. and Ghoul M. (2001), Study of the

effects of temperature, pH and yeast extract on growth and exopolysaccharides

production by Propionibacterium acidi-propionici on milk microfiltrate using a

response surface methodology, Journal of Applied Microbiology 90, 788-796.

138

52 Gorska S., Jachymek W., Rybka J., Strus M., Heczko P.B., Gamian A. (2010),

Structural and immunochemical studies of neutral exopolysaccharide produced

by Lactobacillus johnsonii 142, Carbohydrate Research 345, 108–114.

53 Gorska-Fra˛czek S., Sandstrom C., Kenne L., Pas´ciak M., Brzozowska E., Strus

M., Heczko P., Gamian A. (2013), The structure and immunoreactivity of

exopolysaccharide isolated from Lactobacillus johnsonii strain 151,

Carbohydrate Research 378, 148–153.

54 Gorska-Fra˛czek S., Sandstrom C., Kenne L., Rybka J., Strus M., Heczko P.,

Gamian A. (2011), Structural studies of the exopolysaccharide consisting of a

nonasaccharide repeating unit isolated from Lactobacillus rhamnosus KL37B,

Carbohydrate Research 346, 2926–2932.

55 Grobben G.J., Smith M.R., Sikkema J. and De Bont J.A.M. (1996), Influence of

fructose and glucose on the production of exopolysaccharides and the activities

of enzymes involved in the sugar metabolism and the synthesis of sugar

nucleotides in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB 2772, Appl.

Microbiol. Biotechnol. 46, 279-284.

56 Gruter M., Leeflang B.R., Kuiper J., Kamerling J.P. and Vliegenthart J.F.G.

(1993), Structural characterisation of the exopolysaccharide produced by

Lactobacillus delbtickii subspecies bulgaricus rr grown in skimmed milk,

Carbohydrate Research 239, 209-226

57 Harding L. P., Marshall V. M., Elvin M., Gu Y., Laws A. P. (2003), Structural

characterisation of a perdeuteriomethylated exopolysaccharide by NMR

spectroscopy: characterisation of the novel exopolysaccharide produced by

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus EU23, Carbohydrate Research 338,

61–67.

58 Harding L.P., Marshall V.M., Hernandez Y., Gu Y., Maqsood M., McLay N.

and Laws A.P. (2005), Structural characterisation of a highly branched

exopolysaccharide produced by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

NCFB2074, Carbohydrate Research 340, 1107–1111.

59 Harutoshi T. (2013), Exopolysaccharides of Lactic Acid Bacteria for Food and

Colon Health Applications, Lactic Acid Bacteria – R & D for Food, Health and

Livestock Purposes 2, 515 - 538

60 Hess S.J., Roberts R.F., Ziegler G.R. (1997), Rheological properties of nonfat

yogurt stabilized using Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus producing

139

exopolysaccharide or using commercial stabilizer systems, J. Dairy Sci. 80, 252-

263.

61 Hussein A.S., Ibrahim G.S., Asker M.M.S. and Mahmoud M.G. (2010),

Exopolysaccharide from Lactobacillus helveticus: Identification of Chemical

Structure and Effect on Biscuit Quality, Czech J. Food Sci. 28(3), 225–232.

62 Kamerling J.P., Gerwig G.J. (2007), Strategies for structural analysis of

carbohydrates. Comprehensive GlycoscienceOxford: Elsevier, 1-67.

63 Kim Y., Oh S., Kim S.H. (2009), Released exopolysaccharide (r-EPS) produced

from probiotic bacteria reduce biofilm formation of enterohemorrhagic

Escherichia coli O157:H7, Biochemical and Biophysical Research

Communications 379, 324–329.

64 Kitazawa H., Yamaguchi T., Itoh T. (1992), B-cell mitogenic activity of slime

products produced from slime-forming, encapsulated Lactococcus Lactis ssp.

Cremoris, J. Dairy Sci. 75, 2946-2951.

65 Kodali V.P. and Sen R. (2008), Antioxidant and free radical scavenging

activities of an exopolysaccharide from a probiotic bacterium, Biotechnol. J. 3,

245–251

66 Kumar A.S., Mody K. and Jha B. (2007), Review Article: Bacterial

exopolysaccharides – a perception, Journal of Basic Microbiology 47, 103 –117.

67 Lapasin R., Pricl S. (1995), Rheology of Industrial Polysaccharides: Theory and

Application, 1st edition.

68 Laws A., Gu Y., Marshall V. (2001), Biosynthesis, characterisation, and design

of bacterial exopolysaccharides from lactic acid bacteria, Biotechnology

Advances 19, 597–625.

69 Laws A.P., Chadha M.J., Chacon-Romero M., Marshall V.M. and Maqsood M.

(2008), Determination of the structure and molecular weights of the

exopolysaccharide produced by Lactobacillus acidophilus 5e2 when grown on

different carbon feeds, Carbohydrate Research 343, 301–307.

70 Lebeer S., Claes I.J.J., Verhoeven T.L.A., Vanderleyden J., De Keersmaecker

S.C.J. (2010), Exopolysaccharides of LactoBacillus rhamnosus GG form a

protective shield against innate immune factors in the intestine, Microb.

Biotechnol., 1-7.

140

71 Levander F., Svensson M., and Rådström P. (2002), Enhanced

Exopolysaccharide Production by Metabolic Engineering of Streptococcus

thermophilus, Applied and Environmental Microbiology 68(2), 784–790.

72 Li L., Huang R., Shah N.P., Tao X., Xiong Y., Wei H. (2014), Antioxidant and

antibacterial activities of exopolysaccharides from Bifidobacterium bifidum

WBIN03 and Lactobacillus plantarum R315, Journal of Dairy Science, 97(12),

7334-7343.

73 Li W., Ji J., Chen X., Jiang M., Rui X., Dong M. (2014), Structural elucidation

and antioxidant activities of exopolysaccharides from Lactobacillus helveticus

MB2-1, Carbohydrate Polymers 102, 351– 359.

74 Lipin´ ski T., Jones C., Lemercinier X., Korzeniowska-Kowal A., Strus M.,

Rybka J., Gamian A., Heczko P.B. (2003), Structural analysis of the

Lactobacillus rhamnosus strain KL37C exopolysaccharide, Carbohydrate

Research 338, 605–609.

75 Liu C.F., Hsu W.H., Tseng K.C., Pan T.M., Chiang C.C. (2011),

Immunomodulatory and antioxidant potential of Lactobacillus

exopolysaccharides, Sci. Food Agric. 91, 2284–2291.

76 Low D., Ahlgren J.A., Oberg C.J., Horne D., Broadbent J.R., Mahon D.J.M.

(1998), Role of Streptococcus thermophilus MR-1C Capsular

Exopolysaccharide in Cheese Moisture Retention, Applied and Environmental

Microbiology, 2147-2151.

77 Ma(rtenssona O., Duen˜ as-Chascob M., Irastorzab A., Stea R.O., Hols O.

(2003), Comparison of growth characteristics and exopolysaccharide formation

of two lactic acid bacteria strains, Pediococcus damnosus 2.6 and Lactobacillus

brevis G-77, in an oat-based, nondairy medium, Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 36,

353–357.

78 Makino S., Ikegami S., Kano H., Sashihara T., Sugano H., Horiuchi H., Saito T.,

Oda M. (2006), Immunomodulatory Effects of Polysaccharides Produced by

Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1, Journal of Dairy

Science 89 (8), 2873-2881.

79 Marshall V. M., Cowie E. N. and Moreton R. S. (1995), Analysis and production

of two exopolysaccharides from Lactococcus lactis subsp. Cremoris LC330, J.

Dairy Res. 62, 621-628.

141

80 Marshall V. M., Rawson H. L. (1999), Effects of exopolysaccharide-producing

strains of thermophilic lactic acid bacteria on the texture of stirred yoghurt, Int.

J. Food Sci. Technology 34, 137–43.

81 Mikelsaar M. and Zilmer M. (2009), Lactobacillus fermentum ME-3 An

antimicrobial and antioxidative probiotic, Microbial Ecology in Health and

Disease 21(1), 1-27.

82 Mirhosseini H. and Amid B.T. (2012), Influence of Chemical Extraction

Conditions on the Physicochemical and Functional Properties of Polysaccharide

Gum from Durian (Durio zibethinus) Seed, Molecules 17, 6465-6480.

83 Morin A. (1998), Screening of polysaccharide-producing microorganisms,

factors influencing the production and recovery of microbial polysaccharides.

In: Polysaccharides –Structural Diversity and Functional Versatility. Dumitriu,

S. (Ed.), Marcel Dekker Inc. Publication, New York, 275–296.

84 Nagaoka M., Hashimoto S., Watanabe T., Yokokura T., Moro Y. (1994), Anti-

ulcer effects of lactic acid bacteria and their cell wall polysaccharides, Biol.

Pharm Bull 17, 1012–1017.

85 Nakajima H., Hirota T., Toba T., Itoh T., Adachi S. (1992), Structure of the

extracellular polysaccharide from slime-forming Lactococcus Lactis subsp

cremoris SBT 0495, Carbohydr. Res. 224, 245–253.

86 Nicolaus B., Schiano M.V., Lama L., Poli A., Gambacorta A. (2004),

Polysaccharides from extremophilic microorganisms, Origins of Life and

Evolution of the Biosphere 34, 159–169.

87 Nwodo U.U., Green E. and Okoh A.I. (2012), Bacterial Exopolysaccharides:

Functionality and Prospects, Int. J. Mol. Sci. 13, 14002-14015.

88 Oda M., Hasegawa, H., Komatsu S., Kambe M. and Tsuchiya F. (1983), Anti-

tumor polysaccharide from Lactobacillus sp., Agricultural and Biological

Chemistry 47, 1623-1625.

89 Pan D. D., Zeng X. Q., and Yan T. (2011), Characterization of Lactobacillus

fermentum SM-7 isolated from koumiss, a potential probiotic bacterium with

cholesterol-lowering effects, Journal of the Science of Food and Agriculture

91(1), 512-518.

90 Patel A. and Prajapati J.B. (2013), Food and Health Applications of

Exopolysaccharides produced by Lactic acid Bacteria, Adv. Dairy Res., 1-2

142

91 Patel S., Majumder A., Goyal A. (2012), Potentials of Exopolysaccharides from

Lactic Acid Bacteria, Indian J. Microbiol., 52(1), 3–12.

92 Perry D. B., Mc Mahon D. J., Oberg C. J. (1997), Effect of exopolysaccharide-

producing cultures on moisture retention in low fat mozzarella cheese, Journal

Dairy Science 80, 799–805

93 Petersen B.L., Dave R.I., McMahon D.J., Oberg C.J., Broadben J.R. (2000),

Influence of Capsular and Ropy Exopolysaccharide-Producing Streptococcus

thermophilus on Mozzarella Cheese and Cheese Whey, J. Dairy Sci. 83, 1952–

1956.

94 Petry S., Furlan S., Crepeau M.J., Cerning J. and Desmazeaud M. (2000), Factors

affecting exocellular polysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii

subsp. bulgaricus grown in a chemically defined medium, Appl.

Environ.Microbiol., 66 (8), 3427 –3431.

95 Pham L., Dupont I., Roy D., Lapointe G. (2000), Production of

exopolysaccharide by Lactobacillus rhamnosus R and analysis of its enzymatic

degradation during prolonged fermentation, Appl. Environ. Microbiol. 66, 2302-

2310.

96 Polak M. & Berecka, Wasko A., Szwajgier D. and Choma A. (2013),

Bifidogenic and Antioxidant Activity of Exopolysaccharides Produced by

Lactobacillus rhamnosus E/N Cultivated on Different Carbon Sources, Polish

Journal of Microbiology, 62(2), 181–189.

97 Poolman B. (1993), Energy transduction in lactic acid bacteria, FEMS Microbiol

Revs. 12, pp. 125–8

98 Postma P. W., Lengeler J. W., Jacobson G. R. (1993), Phosphoenolpyruvate:

Carbohydrate phosphotransferase systems of bacteria, Microbiol. Rev. 57, 543–

594.

99 Rabha B., Victor L., Miguel A., María F. and Ahmed B. (2011), Effect of

fermentation conditions (culture media and incubation temperature) on

exopolysaccharide production by Streptococcus thermophilus BN1, IPCBEE 24,

1-5.

100 Ramos A., Boels I.C., de Vos W.M., Santos H. (2001), Relationship between

glycolysis and exopolysaccharide biosynthesis in Lactococcus lactis., Appl.

Environ. Microbiol. 67, 33–41.

143

101 Rani R. P., Anandharaj M., Ravindran A. D. (2018), Characterization of a novel

exopolysaccharide produced by Lactobacillus gasseri FR4 and demonstration of

its in vitro biological properties, International Journal of Biological

Macromolecules 109, 772-783.

102 Robijn G.W., Gallego R.G., van den Berg D.J.C., Haas H., Kamerling J.P.,

Vliegenthart J.F.G. (1996), Structural characterization of the exopolysaccharide

produced by Lactobacillus acidophilus LMG9433, Carbohydrate Research 288,

203-218.

103 Robijn G.W., Thomas J.R., Haas H., van den Berg D.J.C., Kamerling J.P.,

Vliegenthart J.F.G. (1995), The structure of the exopolysaccharide produced by

Lactobacillus helveticus 766, Carbohydrate Research 276, 137-154.

104 Rodríguez A., Gil-Serran A.M. (2008), Structure of the high-molecular weight

exopolysaccharide isolated from Lactobacillus pentosus LPS26, Carbohydrate

Research 343, 3066–3070.

105 Rodríguez C., Medici M., Rodríguez A. V., Mozzi F., de Valdez F. G. (2009),

Prevention of chronic gastritis by fermented milks made with

exopolysaccharideproducing Streptococcus thermophiles strains, J. Dairy Sci.

92, 2423-2434.

106 Ruas-Madiedo P., Hugenholtz J., Zoon P. (2002), An overview of the

functionality of exopolysaccharides produced by lactic acidbacteria,

International Dairy Journal 12, 163–171.

107 Salazar N., Gueimonde M., Hernandez-Barranco A.M., Ruas-Madiedo P., de los

Reyes-Gavilan C.G. (2008), Exopolysaccharides produced by intestinal

Bifidobacterium strains act as fermentable substrates for human intestinal

bacteria, Applied and Environmental Microbiology 74, 4737-4745.

108 Sánchez-Medina I., Gerwig G.J., Urshev Z.L., Kamerling J.P. (2007), Structure

of a neutral exopolysaccharide produced by Lactobacillus delbrueckii ssp.

bulgaricus LBB.B26, Carbohydrate Research 342 (16), 2430-2439.

109 Savadogo A., Ouattara C.A.T., Savadogo P.W., Barro N., Ouattara A.S., &

Traoré A.S. (2004), Identification of exopolysaccharides-producing lactic acid

bacteria from Burkina Faso fermented milk samples. African Journal of

Biotechnology 3(3), 189-194

144

110 Schellhaass S.M., and Morris H.A. (1985), Rheological and scanning electron

microscopic examination of skim milk gels obtained by fermenting with ropy

and non-ropy strains of lactic acid bacteria, Food Microstruct., 274-279.

111 Seesuriyachan P., Kuntiya A., Hanmoungjai P. and Techapun C. (2011),

Exopolysaccharide production by Lactobacillus confusus TISTR 1498

usingcoconut water as an alternative carbon source: the effect of peptone, yeast

extract and beef extract, Songklanakarin J. Sci. Technol. 33(4), 379-387.

112 Sila A., Bayar N., Ghazala I., Bougatef A., Ellouz-Ghorbel R., Ellouz-

Chaabouni S. (2014), Water-soluble polysaccharides from agro-industrial by-

products: Functional and biological properties, International Journal of

Biological Macromolecules 69, 236–243.

113 Soh H.S., Kim C.S., Lee S.P. (2003), A New In vitro Assay of Cholesterol

Adsorption by Food and Microbial Polysaccharides, J. Med. Food 6, 225-230.

114 Stephen A.M., Phillips G.O., Williams P.A. (2006), Food polysaccharides and

their applications, 2nd edition.

115 Sutherland I.W. (1972), Bacterial exopolysaccharides, Adv. Microb. Physiol. 8,

143-213.

116 Tang W., Dong M., Wang W., Han S., Rui X., Chen X., Jiang M., Zhang Q., Wu

J. Li W. (2017), Structural characterization and antioxidant property of released

exopolysaccharides from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus SRFM-1,

Carbohydrate Polymers 173, 654-664.

117 Tok E. and Aslim B. (2010), Cholesterol removal by some lactic acid bacteria

that can be used as probiotic, Microbiol Immunol 54, 257–264.

118 Torino M.I., Mozzi F. and Font de Valdez G. (2005), Exopolysaccharide

biosynthesis by Lactobacillus helveticus ATCC 15807. Appl. Microbiol.

Biotechnol. 68, 259-265.

119 Van den Berg D.J.C., Robijn G.W., Janssen A.C., Giuseppin M.L.F., Vreeker

R., Kamerling J.P., Vliegenthart J.F.G., Ledeboer A.M., Verrips C.T. (1995),

Production of a novel extracellular polysaccharide by Lactobacillus sake 0-1 and

characterization of the polysaccharide, Appl Environ Microbiol 61, 2840-2844.

120 Vaningelgem F., Zamfir M., Adriany T. and De Vuyst L. (2004), Fermentation

conditions affecting the bacterial growth and exopolysaccharide production by

Streptococcus thermophilus ST 111 in milk-based medium, Journal of Applied

Microbiology 97, 1257–1273.

145

121 Vergas-Garcia, M.C., Lopez, M.J., Elorrieta, Suarez F. and Moreno, J. (2001),

Influence of nutritional and environmental factors on polysaccharide production

by Azotobacter vinelandii cultured on 4-hydroxybenzoic acid, J. Ind. Microbiol.

Biotechnol. 27, 5 –10.

122 Vermani M.V., Kelkar S.M. and Kamat Y. (1997), Novel exopolysaccharide

production by Azotobacter vinelandii MTCC 2459, a plant rhizosphere isolate,

Lett. Appl. Bacteriol. 24, 379–383.

123 Wang J., Zhao X., Tian Z., Yang Y., Yang Z. (2015), Characterization of an

exopolysaccharide produced by Lactobacillus plantarum YW11 isolated from

Tibet Kefir, Carbohydrate Polymers 125, 16-25.

124 Wang J., Zhao X., Yang Y., Zhao A., Yang Z. (2015), Characterization and

bioactivities of an exopolysaccharide produced by Lactobacillus plantarum

YW32, International Journal of Biological Macromolecules 74, 119–126

125 Wang K., Li W., Rui X, Chen X., Jiang M., Dong M. (2014), Characterization

of a novel exopolysaccharide with antitumor activityfrom Lactobacillus

plantarum 70810, International Journal of Biological Macromolecules 63, 133–

139

126 Wang K., Li W., Rui X, Chen X., Jiang M., Dong M. (2014), Structural

characterization and bioactivity of released exopolysaccharides from

Lactobacillus plantarum 70810, International Journal of Biological

Macromolecules 67, 71–78.

127 Wang X., Shao C., Liu L., Guo X, Xu Y., Lü X. (2017), Optimization, partial

characterization and antioxidant activity of an exopolysaccharide from

Lactobacillus plantarum KX041, International Journal of Biological

Macromolecules 103, 1173-1184.

128 Wang Y., Ahmed Z., Feng W., Li C., Song S. (2008), Physicochemical

properties of exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens

ZW3 isolated from Tibet kefir, International Journal of Biological

Macromolecules 43, 283–288.

129 Wang Y., Ga¨nzle M.G., Schwab C. (2010), Exopolysaccharide Synthesized by

Lactobacillus reuteri Decreases the Ability of Enterotoxigenic Escherichia coli

To Bind to Porcine Erythrocytes, Applied and Environmental Microbiology,

4863–4866.

146

130 Wang Y., Li C., Liu P., Ahmed Z., Xiao P., Bai X., (2010), Physical

characterization of exopolysaccharide produced by Lactobacillus plantarum

KF5 isolated from Tibet Kefir, Carbohydrate Polymers 82, 895–903.

131 Welman A. D. (2015), Exopolysaccharides from fermented dairy products and

health promotion, Advances in Fermented Foods and Beverages 2, 23-38.

132 Welman A. D. and Maddox I. S. (2003), Exopolysaccharides from lactic acid

bacteria: perspectives and challenges. Trends in Biotechnology 21, 269-274.

133 Whistler R. L. (1973), Solubility of Polysaccharides and Their Behavior in

Solution, Advances in Chemistry; American Chemical Society: Washington,

DC.

134 Wu C., Liang Z., Lu C., Wu S. (2008), Effect of carbon and nitrogen sources on

the production and carbon composition of exopolysaccharide by submerged

culture of Pleurotus citrinopileatus, Journal of Food and Drug Analysis 16(2),

61-67

135 Xu R., Shang N., Li P. (2011), In vitro and in vivo antioxidant activity of

exopolysaccharide fractions from Bifidobacterium animalis RH, Anaerobe 17,

226-231

136 Yadav V., Prappulla S.G., Jha A., Poonia A. (2011), A novel exopolysaccharide

from probiotic Lactobacillus fermentum CFR 2195: Production, purification and

characterization, Research article, Biotechnol. Bioinf. Bioeng I(4), 415-421.

137 Yang Z., Staaf M., Huttunen E., Widmalm G. (2000), Structure of a viscous

exopolysaccharide produced by Lactobacillus helveticus K16, Carbohydrate

Research 329, 465–469

138 Yuksekdag Z.N. and Aslim B. (2008), Influence of Different Carbon Sources

on Exopolysaccharide Production by Lactobacillus delbrueckii Subsp.

bulgaricus (B3, G12) and Streptococcus thermophilus (W22), Brazilian

Archives Of Biology And Technology 51(3), 581-585.

139 Zhang L., Liu C., Li D., Zhao Y., Zhang X., Zeng X., Yang Z., Li S. (2013),

Antioxidant activity of an exopolysaccharide isolated from Lactobacillus

plantarum C88, International Journal of Biological Macromolecules 54, 270–

275.

140 Zhang T., Zhang C., Li S., Zhang Y., Yang Z. (2011), Growth and

exopolysaccharide production by Streptococcus thermophilus ST1 in skim milk,

Brazilian Journal of Microbiology 42, 1470-1478.

147

141 Zhang Y., Li S., Zhang C., Luo Y., Zhang H., Yang Z. (2011), Growth

andexopolysaccharide production by Lactobacillus fermentum F6 in skim milk,

African Journal of Biotechnology 10(11), 2080-2091.

142 Zhou K., Zeng Y., Yang M., Chen S., He L., Ao X., Zou L., Liu S. (2016),

Production, purification and structural study of an exopolysaccharide from

Lactobacillus plantarum BC-25, Carbohydrate Polymers 144, 205-214

143 Zhou X., Li Y. (2015), Atlas of oral microbiology: From healthy Microflora to

Disease, Academic Press.

144 Zisu B., Shah N. P. (2007), Texture characteristics and pizza bake properties of

low-fat mozzarella cheese as influenced by pre-acidification with citric acid and

use of encapsulated and ropy exopolysaccharide producing cultures, Int. Dairy

J. 17, 985–997.

i

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phương trình đường chuẩn D-glucose

Phụ lục 2: Một số hóa chất sử dụng và độ tinh khiết

2.1. Thành phần môi trường MRS lỏng

Thành phần Khối lượng (g/l)

Pepton 10,0

Cao thịt 8,0

Cao nấm 4,0

Glucose 20,0

K2HPO4 2,0

MgSO4 0,2

MnSO4 0,04

(NH4)3C6H5O7 2,0

CH3COONa 5,0

Tween 80 1,0

Nước cất Định mức 1 lít

2.2. Một số hóa chất chủ yếu sử dụng trong nghiên cứu

Hóa chất Nhà sản xuất Độ tinh kiết

MeOH Merck P

CHCl3 Merck P

NaBH4 Merck P

TFA Merck P

TCA Merck P

(CH3)2SO Daejung Chemicals & Metals PA

(CH3CO)2O Daejung Chemicals & Metals PA

C6H6 Daejung Chemicals & Metals PA

CH3COOC2H5 Daejung Chemicals & Metals PA

MRS lỏng Scharlau PA

Phụ lục 3: Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb. fermentum sinh tổng hợp EPS cao

Thí

nghiệm

Các chủng vi khuẩn

Lb. fermentum

OD490nm Hàm lượng

EPS trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 TC12 0,342 0,351 0,347 35,484i

2 TC13 1,008 1,03 1,06 119,142a

3 TC14 0,565 0,568 0,572 62,516e

y = 0,0082x + 0,0557

R² = 0,9954

0

0.5

1

1.5

2

0 50 100 150 200 250

Độ

hấ

p t

hụ

(O

D4

90

nm

)

Nồng độ D-glucose (µg/ml)

Hình 2.1. Phương trình đường chuẩn D-glucose

ii

4 TC15 0,619 0,621 0,624 68,980d

5 TC16 1,005 1,004 1,03 116,744a

6 TC18 0,621 0,613 0,615 68,370d

7 TC19 0,407 0,413 0,411 43,248h

8 TC20 0,456 0,457 0,502 50,728g

9 TC21 0,852 0,848 0,946 100,768b

10 MC2 0,523 0,517 0,519 56,581f

11 MC3 0,781 0,783 0,787 88,776c

12 N9 0,539 0,537 0,541 58,939ef

13 N10 0,627 0,622 0,628 69,508d

Phụ lục 4: Kết quả khảo sát điều kiện thu nhận EPS từ các chủng Lb. fermentum có khả năng sinh tổng

hợp EPS cao (Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3)

4.1. Ảnh hưởng của nguồn C và nồng độ của chúng lên khả năng sinh tổng hợp EPS

Lb. fermentum TC13

Thí

nghiệm

Nguồn C Nồng độ bổ

sung (%)

OD490nm Hàm lượng EPS

trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1

Glucose

0 1,020 1,050 1,029 119,183d

2 2 1,743 1,689 1,707 202,110c

3 3 1,713 1,722 1,737 203,451bc

4 4 2,016 2,007 2,019 238,817a

5 5 1,752 1,773 1,728 206,744b

6 6 1,767 1,743 1,737 206,500b

7

Lactose

0 1,020 1,050 1,029 119,183d

8 2 1,425 1,458 1,584 174,793c

9 3 1,671 1,695 1,626 196,134b

10 4 1,731 1,632 1,644 196,744b

11 5 1,833 1,824 1,848 216,988a

12 6 1,797 1,845 1,818 215,159a

13

Sucrose

0 1,020 1,050 1,029 119,183d

14 2 1,248 1,266 1,386 151,744c

15 3 1,5 1,374 1,362 165,402b

16 4 1,365 1,455 1,5 168,817b

17 5 1,803 1,761 1,797 211,134a

18 6 1,806 1,782 1,749 210,158a

Lb. fermentum TC16

Thí

nghiệm


sung (%)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1

Glucose

0 1,062 0,933 0,975 113,939d

2 2 1,359 1,335 1,425 160,646c

3 3 1,401 1,503 1,362 166,622c

4 4 1,461 1,473 1,359 167,719c

5 5 1,893 1,887 1,902 224,183a

6 6 1,737 1,614 1,692 198,208b

7

0 1,062 0,933 0,975 113,939c

8 2 0,921 0,957 0,939 107,720c

9 3 0,969 0,975 0,981 112,110c

10 4 1,272 1,338 1,335 153,573b

11 5 1,557 1,524 1,605 183,695a

12 6 1,266 1,299 1,323 151,256b

13

Sucrose

0 1,062 0,933 0,975 113,939e

14 2 1,404 1,407 1,41 164,793c

15 3 1,953 1,935 1,986 231,988a

iii

16 4 1,497 1,509 1,518 177,110b

17 5 1,356 1,305 1,272 153,085d

18 6 1,275 1,245 1,233 145,768d

Lb. fermentum TC21

Thí

nghiệm


sung (%)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1

Glucose

0 0,816 0,896 0,863 97,882d

2 2 1,163 1,16 1,215 137,029c

3 3 1,201 1,02 1,214 132,842c

4 4 1,481 1,414 1,417 168,492a

5 5 1,341 1,334 1,339 156,378b

6 6 1,302 1,262 1,297 150,159b

7

Lactose

0 0,816 0,896 0,863 97,882e

8 2 1,293 1,301 1,306 151,744d

9 3 1,351 1,353 1,336 157,435c

10 4 1,533 1,525 1,531 179,752a

11 5 1,492 1,502 1,517 176,581a

12 6 1,442 1,462 1,485 171,622b

13

Sucrose

0 0,816 0,896 0,863 97,882d

14 2 0,936 0,891 0,994 107,882c

15 3 0,956 0,999 1,113 117,923b

16 4 1,106 1,106 1,147 129,752a

17 5 1,095 1,106 1,148 129,345a

18 6 0,808 0,779 0,769 88,980d

Lb. fermentum MC3

Thí

nghiệm


sung (%)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1

Glucose

0 0,755 0,804 0,778 88,207e

2 2 1,131 1,101 1,137 130,159c

3 3 1,208 1,226 1,211 141,378b

4 4 1,525 1,534 1,492 178,207a

5 5 0,969 0,945 0,946 109,467d

6 6 0,986 0,952 0,945 110,402d

7

Lactose

0 0,755 0,804 0,778 88,207d

8 2 0,856 0,876 0,877 99,265c

9 3 0,957 1,07 1,171 123,207b

10 4 1,27 1,275 1,278 148,614a

11 5 1,07 1,093 1,075 124,833b

12 6 1,063 1,054 1,094 123,736b

13

Sucrose

0 0,755 0,804 0,778 88,207e

14 2 0,979 1,077 0,985 116,825d

15 3 1,126 1,159 1,139 132,394c

16 4 1,309 1,299 1,305 152,272a

17 5 1,223 1,236 1,228 143,085b

18 6 1,216 1,241 1,222 142,760b

* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các nồng độ bổ sung

4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen và nồng độ của chúng lên khả năng sinh tổng hợp EPS

Lb. fermentum TC13

Thí

nghiệm Nguồn N

Nồng độ bổ

sung (%)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 Pepton 0 2,016 2,025 2,022 239,671d

iv

2 0,2 2,061 2,04 2,004 241,378d

3 0,4 1,98 2,046 2,061 240,647d

4 0,6 2,286 2,301 2,31 273,573c

5 0,8 2,691 2,682 2,706 321,622a

6 1,0 2,604 2,616 2,592 310,768b

7

Cao thịt

0 2,016 2,025 2,022 239,671e

8 0,2 2,214 2,151 2,118 256,744d

9 0,4 2,55 2,493 2,541 301,500c

10 0,6 2,589 2,64 2,607 320,524b

11 0,8 2,904 2,943 2,976 347,476a

12 1,0 2,898 2,922 2,889 343,817a

13

Cao nấm

0 2,016 2,025 2,022 239,671e

14 0,1 2,196 2,217 2,202 262,110d

15 0,2 2,286 2,397 2,313 277,597c

16 0,3 2,535 2,523 2,556 315,646b

17 0,4 2,769 2,799 2,64 357,354a

18 0,5 2,562 2,43 2,499 319,183b

Lb. fermentum TC16

Thí

nghiệm Nguồn N

Nồng độ bổ

sung (%)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1

Pepton

0 1,923 1,935 1,947 229,183c

2 0,2 1,581 1,536 1,557 183,207e

3 0,4 1,569 1,575 1,59 185,646de

4 0,6 1,617 1,581 1,794 196,134d

5 0,8 2,682 2,646 2,571 314,305a

6 1,0 2,202 2,244 2,226 264,427b

7

Cao thịt

0 1,923 1,935 1,947 229,183d

8 0,2 1,656 1,647 1,665 195,159e

9 0,4 1,884 1,797 1,893 219,793d

10 0,6 2,358 2,172 2,163 265,280c

11 0,8 2,874 2,886 2,877 344,305a

12 1,0 2,628 2,595 2,598 311,134b

13

Cao nấm

0 1,923 1,935 1,947 229,183c

14 0,1 1,395 1,482 1,434 168,451e

15 0,2 1,647 1,632 1,548 189,427d

16 0,3 2,274 2,202 2,28 267,841b

17 0,4 2,616 2,502 2,559 305,280a

18 0,5 2,226 2,268 2,328 270,525b

Lb. fermentum TC21

Thí

nghiệm Nguồn N

Nồng độ bổ

sung (%)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1

Pepton

0 1,548 1,533 1,527 180,525e

2 0,2 1,626 1,665 1,695 195,890d

3 0,4 1,776 1,8 1,869 214,549c

4 0,6 2,427 2,34 2,379 283,695a

5 0,8 2,421 2,394 2,193 278,085a

6 1,0 2,121 2,223 2,133 256,500b

7

Cao thịt

0 1,548 1,533 1,527 180,525f

8 0,2 1,731 1,785 1,659 203,573e

9 0,4 2,133 2,097 2,163 253,085d

10 0,6 2,211 2,268 2,226 265,768c

11 0,8 2,532 2,517 2,547 301,988a

12 1,0 2,469 2,445 2,427 291,622b

13 Cao nấm 0 1,548 1,533 1,527 180,525f

v

14 0,1 1,89 1,881 1,848 221,622d

15 0,2 2,193 2,166 2,145 257,598c

16 0,3 2,247 2,199 2,187 262,842b

17 0,4 2,352 2,361 2,376 281,378a

18 0,5 1,785 1,761 1,818 211,256e

Lb. fermentum MC3

Thí

nghiệm Nguồn N

Nồng độ bổ

sung (%)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1

Pepton

0 1,41 1,521 1,539 174,915c

2 0,2 1,119 1,131 1,127 130,484d

3 0,4 1,448 1,389 1,505 169,712c

4 0,6 1,689 1,664 1,685 198,004b

5 0,8 2,147 2,165 2,15 255,890a

6 1,0 2,084 2,096 2,103 248,614a

7

Cao thịt

0 1,41 1,521 1,539 174,915a

8 0,2 0,693 0,711 0,702 78,817d

9 0,4 1,038 1,02 1,011 117,964c

10 0,6 1,056 1,182 1,071 127,720bc

11 0,8 1,179 1,221 1,125 136,500b

12 1,0 1,176 1,188 1,155 136,256b

13

Cao nấm

0 1,41 1,521 1,539 174,915f

14 0,1 2,488 2,515 2,531 299,468d

15 0,2 2,878 2,923 2,892 346,581b

16 0,3 3,147 3,245 3,196 382,963a

17 0,4 2,735 2,738 2,807 329,793c

18 0,5 2,379 2,353 2,328 280,199e

* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các nồng độ bổ sung

4.3. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu

Lb. fermentum TC13

Thí

nghiệm

Mật độ tế bào nuôi

cấy ban đầu


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 104 2,597 2,573 2,541 306,663d

2 105 2,736 2,787 2,829 332,719c

3 106 2,948 2,958 2,954 353,370b

4 107 3,267 3,251 3,276 391,338a

5 108 2,666 2,541 2,627 311,662d

Lb. fermentum TC16

Thí

nghiệm


cấy ban đầu


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 104 2,585 2,541 2,558 305,565c

2 105 2,885 2,888 2,907 346,053a

3 106 2,972 2,865 2,913 348,898a

4 107 2,67 2,705 2,699 321,419b

5 108 2,027 2,039 2,054 241,988d

Lb. fermentum TC21

Thí

nghiệm


cấy ban đầu


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 104 1,866 1,919 1,847 222,150b

2 105 1,958 1,902 1,944 229,142b

3 106 2,55 2,538 2,57 304,508a

vi

4 107 2,006 1,911 1,865 228,248b

5 108 1,697 1,634 1,674 196,663c

Lb. fermentum MC3

Thí

nghiệm


cấy ban đầu


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 104 1,625 1,554 1,616 188,126e

2 105 3,033 3,014 3,02 361,784b

3 106 3,212 3,2 3,201 383,980a

4 107 2,972 2,984 2,979 356,419c

5 108 2,814 2,82 2,784 335,403d

* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các mật độ tế bào nuôi

cấy ban đầu

4.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu

Lb. fermentum TC13

Thí

nghiệm pH ban đầu


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 Đối chứng 3,228 3,224 3,299 389,589c

2 4,0 2,466 2,459 2,429 292,150e

3 4,5 2,963 2,981 2,978 355,890d

4 5,0 3,222 3,267 3,242 388,776c

5 5,5 3,399 3,348 3,384 405,037a

6 6,0 3,324 3,321 3,312 397,963b

7 6,5 3,272 3,264 3,26 391,419c

Lb. fermentum TC16

Thí



trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 Đối chứng 2,769 2,798 2,826 334,386c

2 4,0 2,148 2,129 2,174 255,443e

3 4,5 2,669 2,715 2,741 323,492a

4 5,0 2,847 2,868 2,889 342,963b

5 5,5 2,922 2,886 2,897 347,069b

6 6,0 3,185 3,159 3,183 380,484a

7 6,5 2,844 2,792 2,795 335,931c

Lb. fermentum TC21

Thí



trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 Đối chứng 2,058 2,09 2,102 247,272c

2 4,0 1,479 1,512 1,562 178,289f

3 4,5 1,673 1,701 1,694 199,224e

4 5,0 1,802 1,763 1,745 209,061d

5 5,5 2,042 2,1 2,03 244,102c

6 6,0 2,724 2,769 2,759 328,654a

7 6,5 2,507 2,573 2,462 299,793b

Lb. fermentum MC3

Thí



trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 Đối chứng 3,168 3,174 3,176 380,118d

2 4,0 2,253 2,246 2,27 268,370g

3 4,5 2,829 2,828 2,783 336,297f

vii

4 5,0 2,993 2,972 2,964 356,175e

5 5,5 3,341 3,35 3,356 401,622b

6 6,0 3,503 3,509 3,507 420,809a

7 6,5 3,198 3,197 3,216 383,898c

* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các mức pH ban đầu

4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Lb. fermentum TC13

Thí

nghiệm Nhiệt độ (oC)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 30 2,984 3,014 3,092 362,719c

2 35 3,233 3,116 3,236 382,841b

3 40 3,528 3,483 3,468 419,183a

4 45 3,006 3,062 2,964 360,362c

Lb. fermentum TC16

Thí



trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 30 3,071 3,063 3,074 367,516c

2 35 3,386 3,389 3,365 405,402a

3 40 3,144 3,125 3,128 375,199b

4 45 3,05 3,059 3,053 365,646c

Lb. fermentum TC21

Thí



trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 30 2,277 2,33 2,307 274,264d

2 35 3,155 3,128 3,137 376,134a

3 40 2,835 2,81 2,822 337,394b

4 45 2,447 2,481 2,477 294,223c

Lb. fermentum MC3

Thí



trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 30 1,989 1,947 2,04 236,134d

2 35 3,516 3,513 3,518 421,947a

3 40 3,267 3,284 3,278 392,760b

4 45 2,528 2,561 2,495 301,500c

* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các nhiệt độ nuôi cấy

4.6. Đường cong sinh trưởng và ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp EPS của các

chủng Lb. fermentum

Lb. fermentum TC13

Thí

nghiệm Thời gian (giờ)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 12 2,892 2,843 2,886 343,655d

2 24 2,889 2,879 2,982 348,898cd

3 36 2,961 2,904 3,114 358,207bc

4 48 3,537 3,507 3,489 421,378a

5 60 3,054 3,093 3,114 369,670b

6 72 2,301 2,334 2,255 273,288e

Thí


OD600nm OD600nm trung

bình X1 X2 X3

viii

1 12 1,057 1,058 1,059 1,058d

2 24 1,158 1,156 1,16 1,158c

3 36 1,225 1,225 1,28 1,243a

4 48 1,218 1,214 1,211 1,214b

5 60 1,198 1,202 1,202 1,201b

6 72 1,174 1,174 1,179 1,176c

Thí


pH pH môi trường

trung bình X1 X2 X3

1 12 5,51 5,46 5,49 5,49a

2 24 5,25 5,27 5,22 5,25b

3 36 4,59 4,61 4,58 4,59c

4 48 4,35 4,36 4,32 4,34d

5 60 4,22 4,25 4,23 4,23e

6 72 4,15 4,13 4,15 4,14f

Lb. fermentum TC16

Thí



trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 12 3,246 3,222 3,134 383,532b

2 24 3,102 3,173 3,207 378,655b

3 36 3,282 3,203 3,182 386,175b

4 48 3,389 3,396 3,387 406,703a

5 60 3,029 3,018 3,024 361,947c

6 72 3,02 3,017 3,006 360,809c

Thí



bình X1 X2 X3

1 12 1,034 1,031 1,036 1,034e

2 24 1,168 1,167 1,172 1,169d

3 36 1,196 1,197 1,195 1,196b

4 48 1,203 1,209 1,21 1,207a

5 60 1,184 1,188 1,182 1,185c

6 72 1,179 1,183 1,178 1,180c

Thí




1 12 5,53 5,55 5,56 5,55a

2 24 5,39 5,42 5,43 5,41b

3 36 4,33 4,34 4,29 4,32c

4 48 4,22 4,27 4,25 4,25d

5 60 4,13 4,11 4,12 4,12e

6 72 4,11 4,1 4,09 4,1e

Lb. fermentum TC21

Thí



trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 12 2,312 2,369 2,345 278,817e

2 24 2,448 2,511 2,445 294,183d

3 36 3,396 3,408 3,344 405,728a

4 48 3,194 3,188 3,192 382,395b

5 60 3,186 3,197 3,2 382,760b

6 72 2,825 2,879 2,856 341,175c

Thí



bình X1 X2 X3

ix

1 12 1,103 1,109 1,101 1,104d

2 24 1,134 1,151 1,156 1,147c

3 36 1,179 1,183 1,185 1,182b

4 48 1,196 1,197 1,195 1,196a

5 60 1,178 1,177 1,18 1,178b

6 72 1,174 1,178 1,172 1,175b

Thí




1 12 5,67 5,68 5,67 5,67a

2 24 5,19 5,21 5,22 5,21b

3 36 4,66 4,65 4,66 4,66c

4 48 4,39 4,36 4,39 4,38d

5 60 4,31 4,31 4,28 4,30e

6 72 4,23 4,23 4,21 4,22f

Lb. fermentum MC3

Thí



trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 12 1,539 1,547 1,544 181,419e

2 24 2,013 2,087 2,004 241,338d

3 36 2,915 3,027 2,921 353,492b

4 48 3,513 3,509 3,542 422,638a

5 60 2,913 3,108 3,003 360,037b

6 72 2,844 2,844 2,861 340,728c

Thí



bình X1 X2 X3

1 12 0,871 0,875 0,874 0,873f

2 24 1,052 1,049 1,051 1,051e

3 36 1,118 1,124 1,126 1,123c

4 48 1,187 1,19 1,201 1,193a

5 60 1,141 1,148 1,143 1,144b

6 72 1,108 1,106 1,115 1,110d

Thí




1 12 5,49 5,51 5,52 5,51a

2 24 5,16 5,17 5,16 5,16b

3 36 4,7 4,71 4,72 4,71c

4 48 4,61 4,63 4,64 4,63d

5 60 4,38 4,35 4,39 4,37e

6 72 4,28 4,27 4,27 4,27f

* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các mốc thời gian nuôi

cấy

4.7. Hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum

Các chủng Lb.

fermentum

EPS thu được trong

môi trường MRS

(µg/ml)

EPS thu được ở các

điều kiện lên men

thích hợp (µg/ml)

Hiệu suất thu nhận EPS ở

các điều kiện đã khảo sát

so với môi trường MRS

(%)

TC13 119,183 421,378 353,56

TC16 113,939 406,703 356,95

TC21 97,882 405,728 414,51

MC3 88,207 422,638 479,14

x

Phụ lục 5: Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch nuôi cấy

5.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid trichloroacetic (TCA) lên khả năng loại bỏ protein và hàm lượng EPS

thu được

Lb. fermentum TC13

Thí

nghiệm

Nồng độ TCA bổ sung

(%)

Hàm lượng

protein còn lại

trung bình

(µg/mL)

X1 X2 X3

1 10 1,90 1,90 1,80 291,573c

2 15 1,60 1,50 1,70 261,280b

3 20 1,50 1,50 1,60 261,280b

4 25 1,40 1,30 1,40 242,583ab

5 30 1,30 1,30 1,40 246,133ab

6 35 1,40 1,20 1,30 249,210ab

7 40 1,20 1,20 1,10 231,933a

Thí

nghiệm


(%)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 10 3,655 3,658 3,659 439,224c

2 15 3,933 3,936 3,934 473,004a

3 20 3,792 3,787 3,791 455,402b

4 25 3,639 3,637 3,641 436,988d

5 30 3,513 3,499 3,511 420,972e

6 35 3,488 3,486 3,485 418,370f

7 40 3,398 3,397 3,402 407,720g

Lb. fermentum TC16

Thí

nghiệm


(%)

Hàm lượng

protein còn lại

trung bình

(µg/mL)

X1 X2 X3

1 10 1,80 2,00 1,90 296,780b

2 15 1,80 1,70 1,90 293,940b

3 20 1,80 1,60 1,70 289,680ab

4 25 1,60 1,60 1,70 289,917ab

5 30 1,50 1,60 1,60 289,207ab

6 35 1,40 1,50 1,60 287,550ab

7 40 1,30 1,30 1,40 284,950a

Thí

nghiệm


(%)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 10 2,997 3,011 3,012 359,874g

2 15 3,121 3,125 3,129 374,305f

3 20 3,215 3,218 3,212 385,280e

4 25 3,345 3,349 3,343 401,215d

5 30 3,396 3,392 3,410 407,760c

6 35 3,599 3,597 3,601 432,110a

7 40 3,499 3,498 3,493 419,630b

Lb. fermentum TC21

Thí

nghiệm


(%)

Hàm lượng

protein còn lại X1 X2 X3

xi

trung bình

(µg/mL)

1 10 2,10 2,20 2,00 328,020b

2 15 1,90 2,00 2,10 326,600b

3 20 1,60 1,80 1,70 289,680a

4 25 1,60 1,60 1,70 289,917a

5 30 1,40 1,60 1,50 276,900a

6 35 1,40 1,40 1,50 274,770a

7 40 1,40 1,30 1,40 271,690a

Thí

nghiệm


(%)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 10 3,767 3,769 3,771 452,841c

2 15 4,087 4,091 4,085 491,703a

3 20 4,08 4,085 4,082 491,053b

4 25 3,734 3,736 3,739 448,858d

5 30 3,417 3,421 3,419 410,159e

6 35 3,307 3,312 3,308 396,744f

7 40 3,283 3,281 3,286 393,614g

Lb. fermentum MC3

Thí

nghiệm


(%)

Hàm lượng

protein còn lại

trung bình

(µg/mL)

X1 X2 X3

1 10 1,90 2,00 2,00 307,193d

2 15 2,00 1,90 1,90 315,713d

3 20 1,40 1,40 1,50 244,240c

4 25 1,30 1,40 1,20 230,750c

5 30 1,30 1,10 1,20 221,52bc

6 35 1,10 1,10 1,00 204,480ab

7 40 0,90 1,00 0,90 185,547a

Thí

nghiệm


(%)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 10 3,497 3,512 3,505 420,606e

2 15 3,985 3,981 4,001 479,671b

3 20 4,144 4,149 4,145 498,817a

4 25 3,974 3,972 3,961 477,232c

5 30 3,524 3,526 3,528 423,207d

6 35 3,526 3,523 3,524 423,004d

7 40 3,525 3,519 3,523 422,760d

* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các nồng độ TCA bổ sung

5.2. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nuôi cấy đến khả năng tách chiết EPS

Lb. fermentum TC13

Thí

nghiệm

Tỉ lệ dịch nổi:EtOH

(v/v)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 1,0:0,5 1,451 1,513 1,506 174,915d

2 1,0:1,0 4,277 4,335 3,909 502,191a

3 1,0:1,5 3,887 3,945 3,957 472,435b

4 1,0:2,0 3,537 3,518 3,506 422,516c

5 1,0:2,5 3,509 3,512 3,519 421,663c

xii

6 1,0:3,0 3,524 3,518 3,525 422,760c

Lb. fermentum TC16

Thí

nghiệm


(v/v)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 1,0:0,5 1,123 1,097 1,086 127,598e

2 1,0:1,0 3,722 3,753 3,768 450,24a

3 1,0:1,5 3,56 3,618 3,611 431,785b

4 1,0:2,0 3,389 3,413 3,417 408,614c

5 1,0:2,5 3,323 3,32 3,324 398,370d

6 1,0:3,0 3,33 3,326 3,302 398,004d

Lb. fermentum TC21

Thí

nghiệm


(v/v)

OD490nm) Hàm lượng EPS

trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 1,0:0,5 1,118 1,123 1,088 128,533d

2 1,0:1,0 3,627 3,62 3,621 434,996a

3 1,0:1,5 3,615 3,585 3,596 432,069b

4 1,0:2,0 3,414 3,411 3,405 409,061c

5 1,0:2,5 3,398 3,392 3,387 406,907c

6 1,0:3,0 3,395 3,401 3,39 407,272c

Lb. fermentum MC3

Thí

nghiệm


(v/v)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 1,0:0,5 1,157 1,16 1,159 134,508e

2 1,0:1,0 3,752 3,731 3,770 450,646a

3 1,0:1,5 3,686 3,683 3,678 442,273b

4 1,0:2,0 3,534 3,527 3,53 423,736c

5 1,0:2,5 3,342 3,401 3,465 408,166d

6 1,0:3,0 3,338 3,417 3,404 406,175d

* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các tỉ lệ dịch nổi và EtOH

nghiên cứu

5.3. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách chiết EPS

Lb. fermentum TC13

Thí

nghiệm

Thời gian tủa bằng

EtOH (giờ)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 12 2,015 2,007 2,012 238,492c

2 24 4,247 4,244 4,239 510,687a

3 36 4,215 4,178 4,226 506,175b

4 48 4,175 4,208 4,226 505,768b

Lb. fermentum TC16

Thí

nghiệm


EtOH (giờ)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 12 1,727 1,724 1,736 204,061c

2 24 3,767 3,768 3,764 450,362b

3 36 3,767 3,774 3,768 452,923b

4 48 3,797 3,809 3,807 457,151a

Lb. fermentum TC21

Thí

nghiệm


EtOH (giờ)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 12 1,565 1,571 1,566 184,346c

xiii

2 24 3,768 3,740 3,731 450,077a

3 36 3,669 3,662 3,666 440,240b

4 48 3,654 3,659 3,660 439,264b

Lb. fermentum MC3

Thí

nghiệm


EtOH (giờ)


trung bình

(µg/mL) X1 X2 X3

1 12 1,839 1,845 1,838 217,679b

2 24 3,767 3,734 3,771 451,419a

3 36 3,768 3,767 3,771 452,801a

4 48 3,767 3,746 3,764 451,622a

* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các mốc thời gian thực

hiện tủa bằng EtOH

Phụ lục 6: Kết quả khảo sát các tính chất của các EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum (TC13,

TC16, TC21, MC3) có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

6.1. Khả năng hòa tan trong nước

Thí

nghiệm

EPS sinh tổng hợp từ

các chủng Lb.

fermentum

Khối lượng EPS trong 0,2 ml (g) Khả năng hòa tan

trong nước (%)

m1 m2 m3

1 EPS-TC13 0,0375 0,0365 0,0360 73,33 ± 3,81

2 EPS-TC16 0,0385 0,0365 0,0380 75,33 ± 5,17

3 EPS-TC21 0,0330 0,0320 0,0310 64,00 ± 2,49

4 EPS-MC3 0,0435 0,0430 0,0440 87,00 ± 4,97

6.2. Khảo sát khả năng giữ nước

Thí

nghiệm


các chủng Lb.

fermentum

Khối lượng EPS trong 0,2 ml (g) Khả năng giữ nước

(%)

m1 m2 m3

1 EPS-TC13 0,2807 0,2812 0,2814 140,55 ± 0,45

2 EPS-TC16 0,2712 0,2726 0,2719 136,22 ± 0,60

3 EPS-TC21 0,2429 0,2397 0,2412 120,63 ± 1,99

4 EPS-MC3 0,2740 0,2690 0,2712 135,70 ± 3,11

6.3. Khảo sát khả năng giữ dầu

Thí

nghiệm


các chủng Lb.

fermentum

Khối lượng EPS trong 0,2 ml (g) Khả năng giữ dầu

(%) m1 m2 m3

1 EPS-TC13 1,1799 1,1830 1,1818 590,78 ± 1,94

2 EPS-TC16 1,1888 1,1904 1,1882 594,57 ± 1,42

3 EPS-TC21 1,2162 1,2169 1,2167 608,30 ± 0,45

4 EPS-MC3 1,2002 1,2007 1,1989 599,97 ± 1,14

6.4. Khả năng chống oxy hóa

EPS từ Lb. fermentum TC13

Thí

nghiệm

Nồng độ EPS

(mg/L)

OD517nm Tỉ lệ bắt gốc tự do

DPPH (%)

X1 X2 X3

1 2,00 0,186 0,1871 0,1868 29,14 ± 0,52

2 2,50 0,1614 0,1622 0,1619 38,56 ± 0,37

3 2,75 0,1188 0,1184 0,1183 55,01 ± 0,25

4 3,00 0,0633 0,0635 0,0628 76,01 ± 0,35


OD517nm

xiv

Thí

nghiệm

Nồng độ EPS

(mg/L)

X1 X2 X3 Tỉ lệ bắt gốc tự do

DPPH (%)

1 2,00 0,1964 0,1971 0,1968 27,34 ± 0,32

2 2,50 0,1739 0,1728 0,1736 35,95 ± 0,52

3 3,00 0,1327 0,1322 0,1325 51,08 ± 0,22

4 3,50 0,0752 0,0761 0,0753 72,11 ± 0,45


Thí

nghiệm

Nồng độ EPS

(mg/L)


DPPH (%)

X1 X2 X3

1 1,00 0,1835 0,1831 0,1839 36,94 ± 0,35

2 1,50 0,1249 0,1243 0,125 57,14 ± 0,32

3 2,00 0,0948 0,0945 0,0952 67,41 ± 0,30

4 2,50 0,0608 0,0611 0,0615 78,99 ± 0,30

EPS từ Lb. fermentum MC3

Thí

nghiệm

Nồng độ EPS

(mg/L)


DPPH (%)

X1 X2 X3

1 1,50 0,1877 0,1882 0,1876 27,14 ± 0,30

2 2,00 0,1343 0,1351 0,1354 47,66 ± 0,55

3 2,50 0,0818 0,0826 0,0827 68,05 ± 0,47

4 3,00 0,0496 0,0492 0,0487 80,93 ± 0,45

Acid ascorbic

Thí

nghiệm

Nồng độ EPS (mg/L) OD517nm Tỉ lệ bắt gốc tự do

DPPH (%)

X1 X2 X3

1 0,00125 0,2204 0,2201 0,2202 27,05 ± 0,12

2 0,0025 0,1261 0,1259 0,1257 58,3 ± 0,17

3 0,005 0,0316 0,0314 0,0315 89,57 ± 0,10

4 0,125 0,0209 0,0206 0,0208 93,12 ± 0,12

5 0,5 0,0167 0,0163 0,0166 94,52 ± 0,17

6 ODDPPH 0,3019 0,3018 0,3019

Phụ lục 7: Sắc ký đồ phổ GC-MS của EPS-MC3

xv

Phụ lục 8: Sắc ký đồ phân tích khối lượng phân tử bằng sắc ký thẩm thấu gel

xvi

xvii

xviii

Phụ lục 9: Sắc ký đồ phổ NMR

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

2.497

2.500

2.503

2.994

3.002

3.007

3.012

3.020

3.025

3.037

3.419

3.432

3.444

3.454

3.466

3.487

3.491

3.503

3.509

3.527

3.552

3.595

3.615

3.637

3.659

3.662

3.671

3.682

3.685

4.545

4.872

1.00

0.45

2.50

5.27

4.09

1.12

2.07

MC3-DMSO-1H

Current Data ParametersNAME 110LUYEN_MC3EXPNO 1PROCNO 1

F2 - Acquisition ParametersDate_ 20180425Time 7.26INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBO BB/PULPROG zgprTD 32768SOLVENT DMSONS 16DS 2SWH 10000.000 HzFIDRES 0.305176 HzAQ 1.6384000 secRG 79.36DW 50.000 usecDE 6.50 usecTE 302.9 KD1 2.00000000 secD12 0.00002000 secTD0 1

======== CHANNEL f1 ========SFO1 500.2016657 MHzNUC1 1HP1 10.00 usecPLW1 22.00000000 WPLW9 0.00008800 W

F2 - Processing parametersSI 32768SF 500.2000051 MHzWDW noSSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.00

2.93.0

3.13.2

3.33.4

3.53.6

3.73.8

3.94.0

4.14.2

4.34.4

4.54.6

4.74.8

4.95.0

5.1p

pm

2.9943.0023.0073.0123.0203.0253.037

3.4193.4323.4443.4543.4663.4873.4913.5033.5093.5273.5523.5953.6153.6373.6593.6623.6713.6823.685

4.545

4.872

1.00

0.45

2.50

5.27

4.09

1.12

2.07

MC3-DMSO-1H

3.003.05

3.103.15

3.203.25

3.303.35

3.403.45

3.503.55

3.603.65

3.703.75

pp

m

2.9943.0023.0073.0123.0203.0253.037

3.4193.4323.4443.4543.4663.4873.4913.5033.5093.527

3.552

3.595

3.615

3.6373.6593.6623.6713.6823.685

1.00

0.45

2.50

5.27

4.09

MC3-DMSO-1H

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm38.99

39.16

39.33

39.50

39.66

39.83

40.00

61.47

61.54

67.07

67.40

70.60

71.41

71.60

73.15

73.81

77.18

93.98

94.14

MC3-DMSO-C13CPD


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20180425Time 11.40INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBO BB/PULPROG zgpg30TD 65536SOLVENT DMSONS 3074DS 4SWH 31250.000 HzFIDRES 0.476837 HzAQ 1.0485760 secRG 198.57DW 16.000 usecDE 6.50 usecTE 302.5 KD1 2.00000000 secD11 0.03000000 secTD0 1

======== CHANNEL f1 ========SFO1 125.7892253 MHzNUC1 13CP1 10.00 usecPLW1 88.00000000 W

======== CHANNEL f2 ========SFO2 500.2020008 MHzNUC2 1HCPDPRG[2 waltz16PCPD2 80.00 usecPLW2 22.00000000 WPLW12 0.34375000 WPLW13 0.22000000 W

F2 - Processing parametersSI 32768SF 125.7754500 MHzWDW EMSSB 0LB 1.00 HzGB 0PC 1.40

6570

7580

8590

95p

pm

61.4761.54

67.0767.40

70.60

71.4171.60

73.15

73.81

77.18

93.9894.14

MC3-DMSO-C13CPD

ppm

2.53.03.54.04.55.0 ppm

2.4

2.6

2.8

3.0

3.2

3.4

3.6

3.8

4.0

4.2

4.4

4.6

4.8

5.0

MC3-DMSO-COSYGP


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20180425Time 13.33INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBO BB/PULPROG cosygpppqfTD 2048SOLVENT DMSONS 4DS 8SWH 5000.000 HzFIDRES 2.441406 HzAQ 0.2048000 secRG 142.98DW 100.000 usecDE 6.50 usecTE 300.9 KD0 0.00000300 secD1 2.00000000 secD11 0.03000000 secD12 0.00002000 secD13 0.00000400 secD16 0.00020000 secIN0 0.00020000 sec

======== CHANNEL f1 ========SFO1 500.2022509 MHzNUC1 1HP0 10.00 usecP1 10.00 usecP17 2500.00 usecPLW1 22.00000000 WPLW10 3.25440001 W

====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM[1] SMSQ10.100GPZ1 10.00 %P16 1000.00 usec

F1 - Acquisition parametersTD 128SFO1 500.2023 MHzFIDRES 78.125000 HzSW 9.996 ppmFnMODE QF

F2 - Processing parametersSI 1024SF 500.2000109 MHzWDW QSINESSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.00

F1 - Processing parametersSI 1024MC2 QFSF 500.2000087 MHzWDW QSINESSB 0LB 0 HzGB 0

ppm

3.23.43.63.84.04.24.44.64.85.0 ppm

3.4

3.6

3.8

4.0

4.2

4.4

4.6

4.8

MC3-DMSO-COSYGP








ppm

3.03.13.23.33.43.53.63.7 ppm

3.0

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.6

3.7

MC3-DMSO-COSYGP








ppm

3.23.33.43.53.63.7 ppm

3.20

3.25

3.30

3.35

3.40

3.45

3.50

3.55

3.60

3.65

3.70

MC3-DMSO-COSYGP








ppm

2.53.03.54.04.55.0 ppm

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

MC3-DMSO-HMBC

ppm

4.04.14.24.34.44.54.64.74.84.95.05.1 ppm

68

70

72

74

76

78

80

82

84

86

88

90

92

94

96

98

MC3-DMSO-HMBC

ppm

3.03.13.23.33.43.53.63.73.8 ppm

56

58

60

62

64

66

68

70

72

74

76

78

80

MC3-DMSO-HMBC

ppm

2.53.03.54.04.55.0 ppm

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

MC3-DMSO-HSQC

ppm

4.54.64.74.84.9 ppm

92.0

92.5

93.0

93.5

94.0

94.5

95.0

95.5

96.0

MC3-DMSO-HSQC

ppm

3.03.13.23.33.43.53.63.73.8 ppm

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

MC3-DMSO-HSQC

ppm

2.53.03.54.04.55.05.5 ppm

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

MC3-DMSO-NOESY


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20180425Time 13.53INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBO BB/PULPROG noesygpphppTD 2048SOLVENT DMSONS 8DS 8SWH 6009.615 HzFIDRES 2.934382 HzAQ 0.1703936 secRG 89.63DW 83.200 usecDE 6.50 usecTE 300.8 KD0 0.00007057 secD1 1.98156798 secD8 0.44999999 secD11 0.03000000 secD12 0.00002000 secD16 0.00020000 secIN0 0.00016660 sec



F1 - Acquisition parametersTD 256SFO1 500.2018 MHzFIDRES 46.893757 HzSW 12.000 ppmFnMODE States-TPPI


F1 - Processing parametersSI 1024MC2 States-TPPISF 500.2000619 MHzWDW QSINESSB 2LB 0 HzGB 0

ppm

3.03.23.43.63.84.04.24.44.64.85.0 ppm

3.0

3.2

3.4

3.6

3.8

4.0

4.2

4.4

4.6

4.8

MC3-DMSO-NOESY


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20180425Time 13.53INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBO BB/PULPROG noesygpphppTD 2048SOLVENT DMSONS 8DS 8SWH 6009.615 HzFIDRES 2.934382 HzAQ 0.1703936 secRG 89.63DW 83.200 usecDE 6.50 usecTE 300.8 KD0 0.00007057 secD1 1.98156798 secD8 0.44999999 secD11 0.03000000 secD12 0.00002000 secD16 0.00020000 secIN0 0.00016660 sec



F1 - Acquisition parametersTD 256SFO1 500.2018 MHzFIDRES 46.893757 HzSW 12.000 ppmFnMODE States-TPPI


F1 - Processing parametersSI 1024MC2 States-TPPISF 500.2000619 MHzWDW QSINESSB 2LB 0 HzGB 0

xix

Phụ lục 10: Một số hình ảnh thao tác trong quá trình nghiên cứu

Documents

FF ĐẠI HỌC HUẾ Trần Thị Ái Luyến NGHIÊN CỨU THU NHẬN, …hueuni.edu.vn/sdh/attachments/article/1307/NOIDUNGLA.pdf · 2019-11-18 · FF ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG