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ヒトT 細胞白血病ウイルス1型の生体内維持機構と発がんにおける役割
安永純一朗京都大学ウイルス・再生医科学研究所
無症候
悪性疾患
炎症性疾患
脊髄症
気管支炎
ぶどう膜炎
関節炎
成人T細胞白血病(ATL)
ヒトT細胞白血病ウイルス1型HTLV-1
> 90% of carriers
日和見感染症
ヒトT細胞白血病ウイルス1型(HTLV-1)感染者の分布
全世界で1000~2000万人?
Nat Med. 2018
日本は世界最大のHTLV-1蔓延国である
u約80万人の感染者が国内に存在する(約30年前は120万人と推定)。
u都市部で感染者が増えている。
u水平感染(男女間の感染)がおそらく年間4000例程起こっている。
u感染者の5%が生涯の内にATLを発症する。
u年間1000例以上のATL患者が報告されている。
u一旦発症すると、ほとんどの症例が治療抵抗性であり、強力な化学療法をもってしても、1年前後で死亡する。
ATL
ATL細胞
正常リンパ球
Ø HTLV-1感染細胞のモノクローナル増殖Ø CD4+CD25+CCR4+CADM1+T細胞Ø Foxp3を高頻度に発現し、Tregに類似した免疫形質を呈する
Provirus
Viral RNA
Env
Gag
Virion
Virological synapse
MTOC
HTLV-1はcell-to-cellでのみ感染する(母乳、精液、血液中の感染細胞)
Extracellular viral assemblies
Biofilm-like extracellular assemblies
Infected cells Target cells
このためHTLV-1は生体内で感染細胞を増加させている
Cell-to-cell��
���%ATL&
���� �(��Tax CTL)
"#$!��
���������(de novo infection)
������������(clonal expansion)
HTLV-1の生体内動態
������������� ���� �
ORF I
ORF II
ORF II
ORF III
p12(I)
p13(II)
p30(II)
rex(III)
ORF IV tax(IV)
Spliced HBZ*
Unspliced HBZ*
HTLV-1 provirusgag pol env pX5’LTR 3’LTR Oncogenic
*HBZ: HTLV-1 bZIP factor
HTLV-1のがん遺伝子taxとHBZ
Wnt pathway
NFkB pathway
������
��� ��
����
1. ���! "#�����
2. ��������
SAC function (MAD1)
Centrosome amplification (RANBP1, TAX1BP2)�������
3. DNA �����DNA damage checkpoint (p53, CHK1, CHK2)
DNA repair (BER, NMR, MMR)
Telomerase (hTERT)
DNA ����
Tax
Tax
Tax
AP-1 pathway
TGF-b pathway
CREB pathway
Tax の多彩な機能
Taxトランスジェニックマウスは腫瘍及び炎症を発症する
Nerenberg M et al. Science, 1987.
Hasegawa H et al. Nat Med, 2006.
Iwakura Y et al. Science, 1991.
Grossman WJ et al. PNAS, 1995.
tax
GAPDH
HBZ
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ATL 患者 HTLV-I 感染者
Proviral load was very low (less than 0.1 %)
Satou Y et al, PNAS, 2006
多くのATL 症例ではTaxの発現が著しく低い
RT-PCR
Taxは宿主免疫の主要な標的であることが知られている
Age (weeks)
Inci
denc
e (%
)
0
20
40
60
80
100
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19
HBZ-Tg (n=10)non-Tg (n=10)
HBZ-Tg
non-Tg
Skin
Chronic inflammation T-cell lymphoma
LN LN
Lung Bone marrow
Months
Inci
denc
e (%
)
4 8 12 16 3220 24 28
non-Tg (n=27)HBZ-Tg (n=37)
0
10
20
30
40
50
P < 0.001
HBZ geneCD4
Enh Sil poly A Prom
HBZ-Tg mouse
Satou Y et al, PLoS Pathog, 2011
HBZトランスジェニックマウスも腫瘍及び炎症を発症する
IKKa IKKbIKKg/NEMO
IkBap65
p50
p65p50
TRAF6
TRAF2
RIP
IL-1RsTLRs TNFR
TRADD
TRAF3
LTbRCD40
NIK
p100
RelB
p52 RelB
p52
RelB
IRAK
ProteasomalDegradation
TAK1TAB
Nucleus
Cytopla
sm
IKKa IKKaIKKg/NEMOTax Tax
���NF-kB�� ����NF-kB��
Taxは古典的・非古典的NF-κB経路を活性化する
TaxsHBZ
--
++
usHBZ -
+-- - -
++- -
0
5
10
15
20
25
30
Fold
luci
fera
seac
tivty
**
**
*
++- -
HBZTTG- -
- - - - - -
Zhao et al. Blood, 2008
HBZ �RelA�����v RelA�DNA����v RelA����������������
0
1
2
3
4
5
6
7
Fold
Luci
fera
se a
ctiv
ity
p52
sHBZ
-
-
++
-
+
���NF-kB ����NF-kB
HBZはTaxによる古典的NF-κB活性化を抑制する
TGF-b receptor
SARA
SMAD2/3
Tax
TGF-b
SMAD2/3
SMAD4
SMAD2/3
SMAD4
CBP/p300
HBZ
NucleusCytoplasm
TGF-bTax
sHBZ
+ + + +
- + - +
- - + +
0
2
4
6
8
10
12
3TP
-Lu
x F
old
Act
ivat
ion
Zhao et al. Blood, 2011
HBZとTaxはTGF-β/SMAD経路にて相反する作用を有する
v HBZ �SMAD2/3����
v p300������������ ����
WNT3a
GSK3APC
DVL
b-cat
AXIN
LEF/TCF Target
LRP5/6
b-cat
b-cat
Ca2+
Ror1/2
PKC
Rac RhoA
JNK
Cdc42
Ca2+ pathway Planar cell polarity pathway
Target
WNT5a
P
���Wnt�� ����Wnt��
古典的Wnt 経路と非古典的Wnt 経路
0
2
4
6
8
10
Fold
act
ivat
ion
0
100
200
300
400
Fold
act
ivatio
n
Dvl2 - + + + + +DAPLE - + + + + +Tax - + + + + +HBZ - -
TopFop
TopFop
WT b-cat - + + - -CA b-cat - - - + +HBZ - - + - +
GSK3APC
DVLAXIN
LEF/TCF Target
b-cat
b-cat
PTax
DAPLE
HBZ
HBZはTaxによる古典的Wnt経路の活性化を抑制する
Ma et al, Oncogene, 2012
CBP/p300LEF/TCF
IKKa IKKbIKKg/
NEMO
IkBap65
p50
p65p50
NIK
p100
RelB
p52 RelB
p52
RelB
IKKa IKKaIKKg/
NEMOTax Tax
Classical NF-kB pathway
Alternative NF-kBpathway
Cytoplasm
Nucleus
SARA
SMAD2/3
Tax
SMAD2/3
SMAD4
SMAD2/3
SMAD4HBZ
TaxとHBZの相反する機能
TGF-b / SMADsignaling
GSK3APC
DVLAXIN
LEF/TCF
b-cat
b-cat
P
DAPLE
Wnt/b-cateninpathway
Tax
HBZ
Cytoplasm
Nucleus
CREBCBP/p
300
Tax
CREBCBP/p
300
HBZ
CREB pathway
Nucleus
AP-1 signaling
PI3K
Tax
AktP
c-Jun / JunB
HBZ
Cytoplasm
Nucleus
JUN FOS
Cytoplasm
NucleusHBZ
Curr Opin Virol, 2013
まとめ(その1)Ø TaxとHBZは炎症と発がんに重要な役割を果たしている。
Ø TaxとHBZは同じシグナル伝達経路、宿主因子を標的とし、多くの場合相反する機能を有している。
Ø HTLV-1感染細胞ではこれらの発現、機能は厳密に制御されていることが示唆される。
tax
GAPDH
HBZ
1 2 3 4 5 6 7ATL patients
Satou Y et al, PNAS, 2006
RT-PCR
TaxとHBZのATL細胞における発現
01234510
15
20
25
ATL patients
qRT-PCR
tax/GA
PDH
Tax (+)34%
5’LTR deletion 30%
Mutations12%
Methylation10%
Unknown14%
Tax (-)66%
tax
GAPDH
HBZ
1 2 3 4 5 6 7ATL patients
Satou Y et al, PNAS, 2006
RT-PCR
TaxとHBZのATL細胞における発現
01234510
15
20
25
ATL patients
qRT-PCR
tax/GA
PDH
Tax (+)34%
5’LTR deletion 30%
Mutations12%
Methylation10%
Unknown14%
���ATL���Tax����
ATL細胞株 MT-1はごく一部の細胞がウイルス抗原を発現している
taxHBZ
Global Z score-2 -1 0 1 2
MT-1の一部がTaxを発現しているSingle-cell qRT-PCR
Tax
EGFP
102
103
105
104
0
102
103
105
104
0
102 103 1051040 102 103 1051040
0 % 0 %
99.5 % 0.5 %
0.1 % 0.3 %
99.5 % 0.1 %
Isotype control anti-Tax antibody
18x21 TREs
d2EGFP
MT-1
Stable transfectant
Tax protein
Mahgoub et al. PNAS, 2018
18x21 TREsd2EGFP
Tax
EGFP
102
103
105
104
0102
103
105
104
0
102 103 1051040 102 103 1051040
0 % 0 %
99.5 % 0.5 %
0.1 % 0.3 %
99.5 % 0.1 %
Isotype control anti-Tax antibody
MT-1
Stable transfectant
Mahgoub et al. PNAS, 2018
MT-1の一部がTaxを発現している
8
(hrs)
16
24
8
16
24
18x21 TREsd2EGFP
Tax
EGFP
102
103
105
104
0102
103
105
104
0
102 103 1051040 102 103 1051040
0 % 0 %
99.5 % 0.5 %
0.1 % 0.3 %
99.5 % 0.1 %
Isotype control anti-Tax antibody
MT-1
Stable transfectant
Transient(76%)
Fluctuating(6%)
Continuous(18%)
0
50
100
150
200200300400
Max
ium
umin
tens
ity
Taxの発現は一過性である
Mahgoub et al. PNAS, 2018
一部の細胞に発現するTaxは細胞集団全体の生存に必須である
3.6% 16.7%
Annexin-V
103
105
104
0
102 103 1051040
shNC shTax4
7-AA
D
Days
Dea
d ce
lls (%
)
MT-1
GFP competition assay
Tax knockdown
103
105
104
0
102 103 1051040
MT-1
0
20
40
60
60 3 9 12
80
15 18 21
shNCshTax1shTax4
shR
NA-
trans
duce
d ce
lls (%
)
Days
0
20
40
60
200 10 30 40
shNCshTax4
shRNA+GFP+
lentivirus
%GFP=~50%
MT-1 cells
Disadvantage Neutral AdvantageMahgoub et al. PNAS, 2018
5’LTR tax
5’LTR tax
Tax
5’LTR taxTax
5’LTROFF
5’LTRON
5’LTRON-Tax
tax mRNA
Tax protein
kon koff
km
kp
kbind
kunbind
kbind
kunbind
ka
ϕ
ϕ
dm
dp
Decay
Decay
Time (days)
Cum
ulat
ive d
istrib
utio
n of
Tax
-inte
rval
0
0.25
0.50
100 200 3000
1.00
0.75
Time (hours)
Dist
ribut
ion
of T
ax-p
erio
d
0
0.02
0.04
20 40 600
ExperimentSimulation
Tax発現の数理モデル化とコンピューターシミュレーション
九州大学数理生物学、岩見真吾先生との共同研究
5’LTR tax
5’LTR tax
Tax
5’LTR taxTax
5’LTROFF
5’LTRON
5’LTRON-Tax
tax mRNA
Tax protein
kon koff
km
kp
kbind
kunbind
kbind
kunbind
ka
ϕ
ϕ
dm
dp
Decay
Decay
Time (days)
Cum
ulat
ive d
istrib
utio
n of
Tax
-inte
rval
0
0.25
0.50
100 200 3000
1.00
0.75
Time (hours)
Dist
ribut
ion
of T
ax-p
erio
d
0
0.02
0.04
20 40 600
ExperimentSimulation
Tax発現の数理モデル化とコンピューターシミュレーション
九州大学数理生物学、岩見真吾先生との共同研究
90%の細胞がTax発現を経験するためには約150日もの日数が必要
↓ノックダウンの結果と合わない
[0 - 40]
[0 - 40]
[0 - 600]
[0 - 600]
10kb
TNFRSF9
40
40
600
600
(-)
(+)
(-)
(+)
MT1
KK1
d2EGFP
[0 - 220]
[0 - 220]
[0 - 2200]
[0 - 2200]
TRAF1
(-)
(+)
(-)
(+)
MT1
KK1
d2EGFP220
220
2200
2200
10kb
MT1 KK1
Up-regulated genes in Tax+ cells
Down-regulated genes in Tax+ cells
136 31 1000 134 19 705
MT1 KK1
Tax発現細胞と非発現細胞 (HBZ発現細胞)における網羅的発現解析
RNA-seq
Mahgoub et al. PNAS, 2018
HBZtaxTNFRSF9LSP1CCL22RGS1NR4A2GADD45BID2LY75BCL2L1STAT4TNFAIP3TRAF1CD82CFLARSTAT3PHF13NR4A1DUSP2CCND2NFKBIANFKB2MAP3K14STAT5ASTAT5BSMAD7CADM1
IL2RAACTB
CCR4
Bulk cells Sorted EGFP+ cellsGlobal Z score-2 -1 0 1 2
1510
50
1510
50
HBZ ID2TRAF1 CD82DUSP2 CCND2TNFAIP3
1510
50
1510
50
tax LSP1NR4A2PHF13 NR4A1TNFRSF9GADD45B
Expr
essi
on (l
og2)
tax (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)
1510
50
CCL22RGS1 LY75STAT4 CFLARNFKBIA NFKB2
1510
50
BCL2L1 STAT3STAT5A SMAD7 CADM1ACTBMAP3K14
(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)
Single-cell qPCR
Tax発現細胞では抗アポトーシス遺伝子の発現が上昇している
1510
50
CFLAR
NFKBIA
TNFAIP3
tax
TRAF1
CCND2
HBZ
NR4A1
TNFRSF9
GADD45B
Expr
essi
on (l
og2)
Apoptosis-related genes
Viral genes
-5
20
1510
50
-5
20
1510
50
-5
20
1510
50
-5
20
Bulk cells
Sorted EGFP+
cells
Expr
essi
on (l
og2)
-4-2
02
4
-6
-10-5
05
1015
-4-2
02
4
d2EGFP+ (Tax+)
d2EGFP- (Tax-)
DUSP1
Anti-apoptotic genes high
Anti-apoptotic genes med
Anti-apoptotic genes low
Tax非発現細胞はアポトーシス関連分子の発現が異なる2つの集団が存在する
Mahgoub et al. PNAS, 2018
0 5 1510 200
5
10
15
Ratio
of T
ax-o
n ce
lls (%
)
Time (days)
0 5 1510 200
30
40
10
20
50
% o
f cel
ls th
at a
re
shRN
A-tra
nsdu
ced
Time (days)
shNCshTax4Transition On to Off
(sampling from t-period)
Transition On to Off(sampling from t-period)
Transition Off to On(sampling from t-interval)Ton ToffAhigh ToffAlow Apoptosis
ApoptosisTon ToffAhigh ToffAlow
(sampling from t-interval)
gon
gon
g
g
g
g
p
p* δ
δ
Taxノックダウンによる細胞死誘導のシミュレーション
九州大学数理生物学、岩見真吾先生との共同研究
Mahgoub et al. PNAS, 2018
Tax+ (normal condition)
Tax-Anti-apoptoticProliferative
Cell population is maintained
Tax-Apoptotic
Tax+Anti-apoptotic
TonToff Ahigh
Toff Alow
Tax- (Tax knockdown)
Tax-Anti-apoptoticProliferative
Cell number is decreased
Tax-Apoptotic
Ton
Toff Ahigh
Toff Alow
ApoptosisApoptosis
TaxによるATL細胞集団の維持機構
Mahgoub et al. PNAS, 2018
Cel
l num
ber (
x105
)d2
EGFP
+(%
)
Time (days)1 3 5 7
8
4
0
10
5
0
Passage (-)Passage (+)
Passage (-)Passage (+)
0
5
10
15
20
25 24 hours48 hours
H2O2
d2EG
FP+
(%)
(uM)25 500 100
0
5
10
15
20
25 0 uM1 uM2 uM
Cisplatin
d2EG
FP+
(%)
Mock NAC
Overgrowth
Taxはストレスによって誘導される
Mahgoub et al. PNAS, 2018
Tax/HBZ statusAnti-apoptotic genes
Expr
essio
n le
vels
Time
HBZ
Tax
ApoptosisAnti-apoptotic
����������� ��
Cytotoxic stresses
まとめ(その2)
Proliferative
�����(ATL)
������
HTLV-1感染から発がんまでの経過
�%&���
��� �� ����
DNA��� !�" $�'#��
Tax HBZ
ATL患者
治療への展開:治療ワクチン開発の試み九州がんセンター、九州大学などの施設で医師主導治験「成人T細胞白血病/リンパ腫の治癒を目指したHTLV-1ウイルス標的樹状細胞ワクチン療法の確立: 薬事承認
を目的とした第II相医師主導治験 」が行われている
採血単球分離
樹状細胞樹立
抗原で刺激
Tax ペプチド
活性化した樹状細胞患者に接種
��� 5���������6320/533 (60%)
ワクチン開発に有用な霊長類モデルSTLV-1感染ニホンザル
STLV-1 '����"$ )/14-3
CD3
CD4
�'%!#240�
,3T �����+*3.1�5STLV-16(HTLV-1 &��'� ��+*3.
Miura et al. Retrovirology, 2013
TaxおよびHBZ (SBZ)搭載ワクシニアウイルス
����*��� *+)')-#+
�(-%$#( $#(#
�&�,'%"
�#'�$$&.-%(%( ���� $#(#
;679354:8 �����'� ��
�)')&)$.,
+#!)' %(�-%)(
����;679354:8
�� $#(#
�(-%$#( $#(#
��Tax: M22/21S258A���HBZ: LL/AA���
Tax
a-tubulin
rVV-TaxNT M
ock
M22
S258
A<
< N.S.
HBZ
a-tubulin
NT Moc
kHBZ
LL/A
A������
RK13
��0��
(WB)
東京都医学総合研究所、小原道法先生との共同研究
Sugata et al. Blood, 2015
Post-vaccination (week)
rVV-sTax
�������
(%)
0
10
20
30
0 10 20 30
rVV-SBZ
JM09
0 10 20 300
40
80
120
160CD4- PBMCs
CD8- PBMCsSBZ peptide
0
5
10
15
20
0 10 20 30Post-vaccination (week)
Nu
mb
er
of
clo
ne
s i
n 1
06
PB
MC
s
0
3000
2000
1000
5 clonesJM08
400
40
10000
8000
6000
4000
2000
00
Post-vaccination (weeks)
45 clonesJM09
Post-vaccination (weeks)
JM08
Vaccination
0 10 20 30
IFN
-gsp
ots
/ 105
cells
0
200
400
600
800CD4- PBMCs
CD8- PBMCssTax peptide
STLV-1感染ニホンザルへのSTLV-1抗原発現ワクシニアウイルスの接種
Sugata et al. Sci Rep, 2016
048121620
0246810
-50 0 5 10 15 20 25 -50 0 5 10 15 20 25
0 55 60 65 70 75 8053 0 55 60 65 70 75 8053
JM10 JM11STLV
-1 P
VL (%
)
����� (weeks)
CD
4+ ,s
Tax+
cells
(%)
0246810
-50 0 5 10 15 20 25
JM10JM11
Mogamulizumab��� (week)0 55 60 65 70 75 8053
JM10JM11
Mogamulizumab
0 1 2 3 53(week)
rVV sTax M22 + SBZ LL/AA
57 61 65 69
����� (weeks)
Mogamulizumab��� (week)
����� (weeks)
Mogamulizumab��� (week)
抗CCR4抗体投与後のTax+SBZワクチンにてTax発現細胞がさらに減少する
謝辞京都大学
ウイルス・再生医科学研究所ウイルス制御松岡 雅雄
(熊本大学医学部血液膠原病感染症内科兼任)Guangyong Ma
Mohamed Mahgoub菅田 謙治
ウイルス感染症モデル明里 宏文
久留米大学医学部病理学
大島 孝一
国立病院機構九州がんセンター血液内科・細胞治療科
末廣 陽子
九州大学理学研究院数理生物学岩見 真吾小泉 吉輝
北海道大学先端生命科学研究院
数理生物学中岡 慎治
東京都医学総合研究所感染制御プロジェクト
小原 道法