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ライフサイエンス分野
ヒト羊膜由来幹細胞を用いた細胞遺伝子治療の細胞ベクターの開発研究
研究課題名
開発代表者 桜川宣男
北里大学医療衛生学部再生医学（ニデック）寄附講座
起業家 横山安伸
（株）ステムセルプロセッシング
1. 技 術 の 概 要
インフォームドコンセントを施行して入手した胎盤から羊膜を分離し、細胞分離装置(FACS)を使ってSP(side population)細胞の分離・培養する技術を確立した(図 1-A).本SP細胞は幹細胞の性質を持ち、免疫学的に幼弱で、他家移植による急性拒絶を惹
起しない細胞である。この性質を用いて、抗癌作用のあるサイトカインやオンコリテックアデノウイルス（図 1-B）を感染させた細胞ベクターを構築し、癌の細胞遺
伝子治療法を開発することを目的とした。動物モデルによる治療効果を判定し、近い将来における臨床応用と製品化を目指している。また本研究期間中に本細胞の濃縮法と長期未分化能の維持培養法を開発した。
一方、羊膜から細胞成分を除去し、酸処理を行って溶液化（可溶化羊膜）する方法の開発に成功した。この可溶化羊膜の構成成分分析では、蛋白、コラーゲンおよび脂質（燐脂質、糖脂質、ガングリオシド）などが検出され、生体膜に類似の組成を持つ事が判明した。この可溶化羊膜を培養皿にコートした培養器材は、間葉系細胞の増殖培養に有効であることを証明した（図 2-A、図 2-B)。さらにこの培養器材はサルの未熟卵子の体外成熟法（IVM : in vitro maturation) にも有効であることを見いだした（図 3）。またマウスの未熟卵の体外成熟法にも同様の有効性を確認した。
他の動物種および不妊症治療への応用について検討中である。
本研究期間中に開発したこれらの技術を活用して製品化を行い、販売する企業の設立を立案している。
羊膜
胎盤（母体組織）
臍帯
①羊水②羊膜上皮細胞層③羊膜基底膜④羊膜間葉細胞層⑤絨毛膜 (母体組織)
胎盤と羊膜の外観
①羊水
②③④⑤絨毛膜
羊膜上皮細胞羊膜基底膜羊膜間葉細胞
（胎児組織）
羊膜の再生医学研究の概要
羊膜
羊膜由来幹細胞（羊膜由来SP細胞）
羊膜細胞 (-)
未加工羊膜
可溶化羊膜
羊膜単独または角膜移植(小泉範子他、2005)
Repair ruptured fetal membranes(Portmann-Lanz et al. 2006)
Amniotic membrane matrix(Sasai et al. 2006)
培養粘膜上皮移植術
(Kim JC et al, 1995)
コーティング培養デッシュ幹細胞増殖培養用器材（特許出願）未成熟卵子の体外成熟用器材（特許出願）
人工膜 (特許化へ)火傷、熱傷、角膜潰瘍治療用被覆材
抗腫瘍作用蛋白＆ウイルスのキャリアー細胞
／免疫細胞治療用ベクター（特許化へ）
歯の製造方法,歯形成用間葉系細胞(特許出願）
AminoGraft TM (ヒト羊膜片-研究用市販）
1)HLA1)HLA--I I low /low /--/II/II--
他家移植可能2)倫理問題少ない3)供給豊富4)幹細胞分離, 培養5)遺伝子導入容易6)癌化していない
SP細胞の濃縮法と長期未分化維持培養 (特許出願）
羊膜抽出物 未熟卵子の対外成熟培養用培地（特許化へ）
羊膜由来幹細胞をキャリアー
細胞とする癌の細胞遺伝子治療
図 1-A. 羊膜由来幹細胞（SP細胞）の分離、培養と分化誘導
Hoechst red
Hoe
chst
blu
e
0 0 1023
1023
SP 0%SP 0.2%
A B
C D
a b c
d e f
.
a b
c d図 3-A : SP細胞の分離 (A,B)、培養細胞 (C,D)
図 3-B : SP 細胞の分化誘導。骨 (a,b,c) 軟骨 (d,e) 脂肪 (f)
図 3-C : SP 細胞の神経細胞への分化誘導a: Musashi-1, b: Tuj-1, c : NF-M, d : MAP2
SP細胞は、神経細胞、骨、軟骨、
脂肪細胞へ分化誘導できる。
羊膜の再生医学研究の概要
羊膜
羊膜由来幹細胞（羊膜由来SP細胞）
羊膜細胞 (-)
未加工羊膜
可溶化羊膜
羊膜単独または角膜移植(小泉範子他、2005)
Repair ruptured fetal membranes(Portmann-Lanz et al. 2006)
Amniotic membrane matrix(Sasai et al. 2006)
培養粘膜上皮移植術
(Kim JC et al, 1995)
コーティング培養デッシュ幹細胞増殖培養用器材（特許出願）未成熟卵子の体外成熟用器材（特許出願）
人工膜 (特許化へ)火傷、熱傷、角膜潰瘍治療用被覆材
抗腫瘍作用蛋白＆ウイルスのキャリアー細胞
／免疫細胞治療用ベクター（特許化へ）
歯の製造方法,歯形成用間葉系細胞
AminoGraft TM (ヒト羊膜片-研究用市販）
1)HLA1)HLA--I I low /low /--/II/II--
他家移植可能2)倫理問題少ない3)供給豊富4)幹細胞分離, 培養5)遺伝子導入容易6)癌化していない
SP細胞の濃縮法と長期未分化維持培養
羊膜抽出物 未熟卵子の対外成熟培養用培地（特許化へ）
正常細胞
癌細胞
細胞融解（細胞死）
正常細胞
+ 抗体
癌細胞
＋抗体
羊膜幹細胞キャリアー細胞
細胞融解（細胞死）
オンコリティックアデノウイルス
腫瘍特異的IAI.3B, SCCA1
プロモーター
細胞断片化
断片化羊膜幹細胞キャリアー細胞
+ 癌特異的癒合
蛋白発現
図 1-B. オンコリティック
アデノウイルスに感染した羊膜幹細胞による癌の細胞遺伝子治療の理論
羊膜の再生医学研究の概要
羊膜
羊膜由来幹細胞（羊膜由来SP細胞）
羊膜細胞 (-)
未加工羊膜
可溶化羊膜
羊膜単独または角膜移植(小泉範子他、2005)
Repair ruptured fetal membranes(Portmann-Lanz et al. 2006)
Amniotic membrane matrix(Sasai et al. 2006)
培養粘膜上皮移植術
(Kim JC et al, 1995)
コーティング培養デッシュ幹細胞増殖培養用器材（特許出願）未成熟卵子の体外成熟用器材（特許出願）
人工膜 (特許化へ)火傷、熱傷、角膜潰瘍治療用被覆材
抗腫瘍作用蛋白＆ウイルスのキャリアー細胞
／免疫細胞治療用ベクター（特許化へ）
歯の製造方法,歯形成用間葉系細胞(特許出願）
AminoGraft TM (ヒト羊膜片-研究用市販）
1)HLA1)HLA--I I low /low /--/II/II--
他家移植可能2)倫理問題少ない3)供給豊富4)幹細胞分離, 培養5)遺伝子導入容易6)癌化していない
SP細胞の濃縮法と長期未分化維持培養 (特許出願）
羊膜抽出物 未熟卵子の対外成熟培養用培地（特許化へ）
可溶化羊膜の脂質分析（１）
可溶化羊膜は、生体膜と同様の燐脂質およびｶﾞﾝｸﾞﾘｵｼﾄﾞを含有している
可溶化羊膜の組成分析：蛋白、コラーゲン、各種脂質を含有
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７SM CL GD3
CHCl3-MeOH(2:1, v/v)にて２回抽出
薄相クロマトグラフィーにて展開
プリムリン試薬にて総脂質を検出
1. sphingomyelin(standard)2. First extract 5μl/1ml3. First extract 10μl/2ml4. First extract 20μl/1ml5. Second extract 20μl/0.5ml6. ceramide lactoside7. GD3 ganglioside
ｽﾌｨﾝｺﾞﾐｴﾘﾝ (1)とｾﾗﾐﾄﾞﾗｸﾄｼﾄﾞ (2)が 高濃度に含有されている
可溶化羊膜の脂質分析（２）
(1)
(2)
100
200
300C
ell n
umbe
r (x
104 )
5
50
150
250
Day 0 Day 15Day 5 Day 10
100 µL
10 µL
1 µL
DDW
Control
µL SAP/ Dish
図 2-A. 可溶化羊膜でコートの量による比較検討
ヒト骨髄由来幹細胞を、可溶化羊膜コート培養皿上で培養した。可溶化羊膜の量（100μL, 10μL, 1.0μL)、DDW(蒸留水を添加して
乾燥）、コントロール（非コート）と比較した。コート量が多い培養皿は、細胞の増殖を有意に亢進した。
可溶化羊膜をコートした培養皿は幹細胞の増殖する
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
非コ
ート
再蒸
留水
可溶
化羊
膜ヒ
ト細胞
外基
質
ラミニ
ンフ
ィブロ
ネク
チン
コラ
ーゲ
ンI
abso
rban
ce（494/630 n
m）
***
+
n.s.
図 2-B. 可溶化羊膜コートと他のコート材との比較
可溶化羊膜でコートした培養皿でヒト骨髄由来幹細胞を培養し、他のコート材と比較した。ヒト細胞外基質、ラミニン、フィブロネクチンでコートした培養皿で培養した条件より、有意に細胞増殖率が亢進した。コラーゲン I でコートした培養皿とは、有意差は認め
られないが、細胞増殖率は良好であった。
0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.31.41.5
3日目 6日目 8日目
培養日数（日）
吸光
度
controlDDWamnionHEMlamininfibronectincollagen l
可溶化羊膜、コラーゲン、フィブロネクチンと他をデッシュに添加して比較する
可溶化羊膜コーティング
コラーゲンコーティングフィブロネクチン
可溶化羊膜の培養器材への応用
〔可溶化羊膜コーティングした培養ディシュは細胞増殖を亢進する〕
可溶化羊膜のコート器材と他のコート器材との比較
可溶化羊膜をコートした培養デッシュ
幹細胞の増殖培養
特許出願済
羊膜の再生医学研究の概要
羊膜
羊膜由来幹細胞（羊膜由来SP細胞）
羊膜細胞 (-)
未加工羊膜
可溶化羊膜
羊膜単独または角膜移植(小泉範子他、2005)
Repair ruptured fetal membranes(Portmann-Lanz et al. 2006)
Amniotic membrane matrix(Sasai et al. 2006)
培養粘膜上皮移植術
(Kim JC et al, 1995)
コーティング培養デッシュ幹細胞増殖培養用器材（特許出願）未成熟卵子の体外成熟用器材（特許出願）
人工膜 (特許化へ)火傷、熱傷、角膜潰瘍治療用被覆材
抗腫瘍作用蛋白＆ウイルスのキャリアー細胞
／免疫細胞治療用ベクター（特許化へ）
歯の製造方法,歯形成用間葉系細胞(特許出願）
AminoGraft TM (ヒト羊膜片-研究用市販）
1)HLA1)HLA--I I low /low /--/II/II--
他家移植可能2)倫理問題少ない3)供給豊富4)幹細胞分離, 培養5)遺伝子導入容易6)癌化していない
SP細胞の濃縮法と長期未分化維持培養 (特許出願）
羊膜抽出物 未熟卵子の対外成熟培養用培地（特許化へ）
羊膜素材を用いた未成熟卵の体外成熟法 (IVM)
サル未成熟卵
M I期卵子 M II期卵子
マウス未成熟卵
GV期卵子 M II期卵子
可溶化羊膜コートデッシュ
羊膜上皮細胞の培養上清
羊膜上皮細胞をフィーダー細胞
GV: 卵核胞 M I: 第一減数分裂中期 M II: 第二減数分裂中期IVM: 未熟卵体外成熟法 (in vitro maturation)
可溶化羊膜を素材とする物質が哺乳類の未成熟卵子を体外培養により成熟させる効果がある。
IVF: 体外受精胚移植法in vitro fertilization and embryo transfer
A B C
D E F
図 羊膜上皮細胞を用いたマウス卵子の体外成熟
A. 卵丘細胞付着GV期卵子（CEO）（矢印：卵丘細胞） B. CEOと羊膜上皮細胞の共培養 C. 裸化GV期卵子（DO)と羊膜上皮細胞の共培養（矢印：GV） D. DO由来M-II期卵子（培養上清群、矢印：第一極体） E. CEO由来M-II期卵子（培養上清群、矢印：第一極体） F. 図1-EのM-II期卵子のHoechst染色像（矢印：第一極体、矢頭：赤道面に並ぶ卵子染色体）. Bar = 50 µm
3. 事業計画・将来展望・今後の予定
上述の研究開発の成果のうち、製品化として完成している「間葉系細胞の増殖培養に有効である可溶化羊膜」を培養皿のコート材として販売することを基軸にした企業の設立を計画している。さらにこの可溶化羊膜でコートした培養皿が哺乳類の IVM （未成熟卵子の体外成熟法） にも有効であるという付加価値を見いだした。このIVMは畜産・育種、絶滅危惧種の保存、不妊
症治療などへの応用が期待される。この不可価値により、本製品の市場性がさらに拡大すると予想される。
癌治療を目的にした細胞遺伝子治療用の細胞ベクターは動物実験による治療効果がみられ、近未来における臨床応用を目指す。
社名 ：生物資源応用研究所Bioresource Application Institute, Co. LTD
資本金 ：2,000 万円（出資者；桜川と株式会社ニデック）設立 ：平成19 年10月（予定）
所在地 ：神奈川県相模原市役員 ：代表取締役 桜川宣男 [（株）ニデックは経営にも参加]
4. 企 業 概 要
１ 歯の製造方法および歯形成用間葉細胞出願人：東京理科大学、北里学園、（株）ニデック 発明者 辻 孝、桜川宣男特願：2007-049128 出願日：2007/2/28
２ サイドポピュレーション細胞分画の濃縮方法出願人：北里学園、（株）ニデック 発明者 横山安伸、桜川宣男特願：2007-107812 出願日：2007/4/17
３ 可溶化羊膜組成物およびその用途出願人：北里学園、（株）ニデック 発明者 加茂 功、桜川宣男特願：2007-108077 出願日：2007/4/17
４ 未成熟卵子の体外成熟培養用添加剤及びそれを用いた成熟卵子の作出方法 発明者 鳥居隆三、桜川宣男、
出願人：滋賀医科大学、北里学園、（株）ニデック 小林 護特願：2007-165929 出願日：2007/6/29
1 ヒト羊由来サイドポピュレーション細胞およびその用途出願人：桜川宣男、内田彩子、（株）SRL 発明者 桜川宣男、横山安伸特願：2003-367258 特開：2004-245682
２ Side Population Cells Originated from HumanAmnion and Their uses
出願人：桜川宣男、（株）SRL 発明者 桜川宣男、横山安伸出願番号：10/919310 公開番号：2005-89513
本研究に関する基本特許
研究期間中の特許
2. 研究開発の概要（達成事項）
胎盤
羊膜
羊膜由来幹細胞（SP細胞）
可溶化羊膜
培養皿にコート
間葉系細胞培養
IVM(製品)
細胞遺伝子治療用のキャリアー細胞【製品化】
(用途)
畜産・育種、絶滅危惧種の保存【不妊症治療用】
細胞除去、化学的処理
(使用方法)
研究用,【再生医療用】
【 】将来構想
6. 製 品 概 要
I. C.
妊婦
FACS(細胞分離装置)で細胞分取
I.C. : informed consentSP 細胞 : side population 細胞
IVM : In vitro maturation
販売委託先
7. 事 業 形 態
生物資源応用研究所
研究機関
委託販売
医療関連機関
培養製剤
共同開発先
畜産関連機関
直販 (国内、国外)
人工膜外注先
細胞ベクター外注先
IVM 法の
共同開発先培養皿コート材羊膜由来人工膜羊膜幹細胞ベクター
Bioresource Application Institute, Co. LTD
細胞培養研究IVM研究
IVMへの応用
畜産、育種絶滅危惧種の保存
再生医療用細胞培養治療用細胞ベクター(不妊症治療)(IVM : in vitro maturation)
サル、ウシ、ブタイヌ、マウス
抗癌作用を持つサイトカイン,オンコリティックウイルス導入羊膜幹細胞の構築IVMに有効な
培養製剤の開発
羊膜を素材とする臨床応用の人工膜
科
大学発ベンチャー事業の展開構想
凍結羊膜
関西ローマテリアル
購入
可溶化羊膜コートデッシュの作成
企業名称 (仮称)：（株）生物資源応用研究所
人工膜の製品化
研究用に限定（株）エアーブラウン（株）池田理科
羊膜
形成外科救急外来皮膚科
実用化を意識した製造場所＝GMPやGLP
羊 膜
可溶化羊膜コートデッシュの製品化
ヒトIVM
羊膜細胞（SP細胞）
不妊症クリニック
癌治療の専門病院
羊膜細胞
ウシ、ブタ畜産育種に使用
歯科
細胞分泌物質
ウシ,ブタの IVM
製品販売
GMP : Good Manufacturing PracticeBioresources Application Institute
(BRA Institute)
培養上清物質分離, 精製
眼科
不妊症治療多嚢胞性卵巣
症候群
火傷、熱傷創傷被覆材
角膜潰瘍被覆材
人工歯
癌治療用細胞ベクター
（平成19年10月会社設立予定）
細胞培養デッシュ
GMP: 医薬品の製造管理および品質管理にかんする基準
再生医学臨床
幹細胞培養
機能性ペプチド研究所と共同開発開始
企業理念：再生医学的な技術を活用して、羊膜などの生物資源の応用開発を行い、病気を克服して人類の健康と福祉に貢献する。
製品販売
将来構想
5. 参 考 資料
1) Parlolini O, Albiano F, Bagnara GP, Bilic G, Buhring H-J, Evangelista M, Hennerbichler S, Liu B, Magatti M, Mao N, Miki T, Marongiu F, Nakajima H, Nikaido T, Portmann-Lanz B, Sankar V,Soncini M, Stadler G, Surbek D, Takahashi T, Redl H, Sakuragawa N, Wolbank S, Zeisberger S, Zisch A, Strom SC:
Isolation and Characterization of Cells from Human Term Placenta: STEM CELLS, In press.
2) Kobayashi M, Yakuwa T, Sasaki K, Sato K, Kikuchi A, Kamo I,Yokoyama Y, and Sakuragawa N：
Multilineage potential of side population cells from human amnionmesenchymal layer. Cell Transplantation. In press.
新聞報道
体外成熟促進に効果：卵子も育む羊膜成分。不妊患者の負担軽減に期待東京新聞（夕刊）2007.9.22。 他の地方新聞（共同通信発信）
英文誌
