マウスES細胞からの新規心筋細胞分化誘導法の確立

心筋ミオシン

0 3

Wnt3a

5 10

Wnt-阻害薬

0 3 5 10

ES細胞の効率的な心筋細胞分化誘導の標的分子～Wnt蛋白

EB形成期(0~day3)

分化誘導(day3~5)

分化誘導(day5~10)

Naito AT et al. Proc Natl Acad Sci USA . 103: 19812-7, 2006

マウスES細胞からの新規心筋細胞分化誘導法の確立

ES細胞の効率的な心筋細胞分化誘導の標的分子～Noggin

Yuasa S et al. Nature Biotechnol 23: 607-611, 2005

EB形成(day0)

LIF+Noggin(day-3)

LIF添加培養液（未分化状態で培養）

LIF+Noggin

LIF

Noggin

EB形成(day1~)

Myosin Toroponin I Actinin MLC ANP

Noggin

(-)

一過性にNogginを作用させることにより、ES細胞の心筋細胞への分化効率が上昇する。

拍動EB%

マウスES細胞から心筋細胞への効率よい分化誘導法ES細胞由来心筋幹細胞の細胞表面分子～Flk-1、CXCR4分化誘導feeder layer細胞～OP9

ES細胞

平面培養

Flk1陽性E-cadherin陰性細胞を分取

OP9細胞

OP9細胞Flk1陽性CXCR4陽性

E-cadherin陰性細胞を分取

ES細胞からenrichmentされた心筋細胞

Yamashita JK et al. FASEB J. 19:1534-6 2005.

96-108ｈ

E-cadherin

心臓発生研究を基礎としたマウスES細胞研究はES細胞の心筋細胞への効率よい分化誘導法の端緒となる

Wnt

FGFIGFErythropoietinRetinoic acid

BMPBMP antagonist

Wnt antagonist

心臓発生 ES細胞分化内因性因子

Feeder 細胞

その他の因子

OP9細胞

5-azacytidineDMSOdynorphin Bascorbic acid

細胞表面マーカー

Flk1 CXCR4

NO

マウスES細胞と胎仔心臓には共通マーカーを持つ多能性幹細胞が存在する

マウスES細胞

マウス胎仔心臓

Flk+CXCR4+

Flk+

心筋細胞内皮細胞平滑筋細胞

Isl1+

心筋細胞内皮細胞平滑筋細胞

心筋細胞平滑筋細胞

c-kit+

Garry DJ et al. Cell. 127:1101-4 2006.

マウスES細胞と心臓発生の基礎研究は心筋組織再生研究の両輪をなすため、ともに重要である

マウスES細胞は細胞表面マーカー、成長因子受容体、サイトカイン受容体などの発現がヒトES細胞と異なるため、マウスES細胞で得られた上記知見をはじめ、遺伝子導入方法、分化誘導方法、心筋誘導因子、心筋前駆細胞のマーカー分子等については必ずしもヒトES細胞にあてはまらない。

ヒトES細胞由来心筋細胞研究の必要性

マウスES細胞

ES細胞移植心筋再生の有用性・問題点

ES細胞から心筋細胞への分化機序解明ー心筋誘導因子の同定

ES細胞と心臓発生の協調的研究ー心筋前駆細胞の同定

霊長類（サル）ES細胞由来心筋細胞

培養日数

カニクイザルES細胞由来心筋細胞の自律拍動

カニクイザルES細胞の心筋細胞への分化

心筋収縮蛋白発現

拍動する

の％

EB

Nagata M et al. J Gene Med. 5: 921-928, 2003

核 心筋トロポニンT

霊長類（サル）ES細胞への遺伝子導入・誘導法の確立

Nagata M et al. J Gene Med. 5: 921-928, 2003

レンチウイルスによる緑色蛍光色素遺伝子導入

遺伝子導入後日数

緑色蛍光色素陽性心筋細胞の％

心筋トロポニンT/緑色蛍光色素

Adachi K et al. Stem Cell. 24: 2566-2572, 2006

ドキソルビシン依存性(tet off)遺伝子誘導システム

内胚葉

外胚葉

中胚葉

霊長類（サル）ES細胞由来心筋細胞の研究現状

必要性：ヒトES細胞はマウスES細胞と同様に機能的な作業心筋細胞・ペースメーカー細胞のみならず、血管内皮、平滑筋などの心筋構成細胞へ分化し、細胞移植治療の有望な細胞ソースである。したがって、前臨床試験として、ES細胞移植治療の安全性、有効性を確認するためにはマウスよりも霊長類の移植モデルが必要である。カニクイザル (Cynomolgus monkey) 1)とアカゲザル(Rhesus

monkey)2)はヒトと近縁の狭鼻下目に属し、医学研究に広く用いられてきた種である。したがって、ES細胞の臨床前研究に役に立つと考えられるが、サルには利用できる抗体や遺伝子情報が限られており、研究をすすめることが困難である。

2) Thomson JA et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 7844-7848, 19951) Suemori H et al. Dev. Dyn. 222: 273-279, 2001

ヒトES細胞を使用した十分な基礎研究も必要である

心筋細胞分化促進因子のヒトES細胞とマウスES細胞の相違

5-azacytidineDMSOdynorphin Bascorbic acidNOoxytocin

retinoic acid

FGF

BMP2

Wnt

OP9細胞

マウスES細胞 ヒトES細胞

5-azadeoxycytidine

Xu C et al. Circ. Res. 2002;91;501-508

Activin A + BMP4

cont

Yao Shuyuan et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006;103;6907-12

END-2細胞 Mummery C et al. Circ 2002;107;2733-40心筋αミオシン重鎖

発現レベル

5-azadeoxycytidine処理時間と濃度

Activin ABMP4

Activin A+BMP4 cont

ヒトES細胞由来心筋細胞研究の課題胚胞期 ヒトES細胞 移植 ヒトES細胞由来心筋細胞

採取

再現性のある

採取技術

倫理的問題

培養

染色体の安定性

非ヒト動物種を

使用しない培養環境

分化

再現性のある分化

誘導システム

単離

奇形種形成

移植方法

筋肉内、冠動脈内

経静脈

移植床

生着

電気的機械的結合

パラクライン機能

免疫拒絶反応

Swijnenburg RJ et al. Curr opinion in biotechnology 18:38-45 2007

ヒトES細胞由来心筋細胞研究の現状～ヒトES細胞は構造的・機能的に成熟した心筋細胞に分化する～

分化誘導後の日数

拍動

EBの％

未分化ヒトES細胞

胚様体（EB)形成

収縮蛋白の発現

心筋転写因子の発現

拍動EB数の薬物応答

Xu C et al. Circ. Res. 2002;91;501-508