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Frecuencia de Toxoplasma gondii en murciélagos del departamento de
Córdoba y Santander- Colombia
Lina María Nieto Celis
Daniela Parra Guio
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar al título de:
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
Facultad de Ciencias
Departamento de Microbiología
Carrera de Microbiología Industrial
Grupo de Investigación en Enfermedades Infecciosas
Bogotá D.C.
1
Frecuencia de Toxoplasma gondii en murciélagos del departamento de
Córdoba y Santander- Colombia
Lina María Nieto Celis
Daniela Parra Guio
APROBADO:
Concepción Judith Puerta Bula Marcela Franco Correa
Decana Académica Directora de Carrera
Facultad de Ciencias Microbiología Industrial
2
Frecuencia de Toxoplasma gondii en murciélagos del departamento de
Córdoba y Santander- Colombia
Lina María Nieto Celis
Daniela Parra Guio
APROBADO:
Paola Andrea Nocua Martinez, Ph.D Claudia L. Cuervo P, Ph.D
Tutora Co-tutora
Clemencia Ovalle B, Ph.D
Jurado
3
NOTA DE ADVERTENCIA
"La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma
y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra
persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la Verdad y la Justicia".
Artículo 23 de la Resolución No13 de julio de 1946
4
Agradecimientos
A nuestros padres y hermanas, modelo de amor, constancia y apoyo permanente
para alcanzar nuestras metas, ya que han sido ellos aliento constante para nuestra
vida, razón e impulso para continuar cosechando éxitos en un entorno de felicidad y
comprensión.
Al grupo de Inmunoparasitología molecular de la Pontificia Universidad Javeriana
por abrirnos las puertas.
A la Dra. Paola Andrea Nocua y a la Dra. Claudia Cuervo por la confianza y apoyo
brindado a lo largo del desarrollo del presente estudio.
5
Tabla de contenido
1. Introducción……………………………………………………………………………….6
2. Justificación y planteamiento del problema…………………………………………...6
3. Marco teórico……………………………..……………………………..........................7
3.1 Generalidades de Toxoplasma gondii……………………………..……………...7
3.2 Ciclo de vida……………………………..…………………………………………..7
3.3 Toxoplasmosis……………………………..………………………………………...8
3.4 Epidemiología……………………………..…………………………………………8
3.5 Murciélagos……………………………..……………………………………………9
3.5.1 Presencia de T. gondii en murciélagos……………………………..…………10
4. Objetivo general……………………………..…………………………………………..10
4.1 Objetivos específicos……………………………..……………………………….11
5. Metodología……………………………..……………………………………………….11
5.1 Muestras de tejidos de órganos……………………………..…………………...11
5.2 Extracción de ADN……………………………..………………………………….11
5.3 Reacción de la cadena polimerasa para el gen cyt b …………………………11
5.4 Reacción en cadena de la polimerasa para la detección de T. gondii……….12
5.4.1 Prueba de especificidad para T. gondii………………………………………..12
6. Resultados……………………………..……………………………..………………….12
6.1 Prueba de especificidad para T. gondii ..…………………………………….....12
6.2 Presencia de T. gondii en murciélagos del departamento de Córdoba……...13
6.3 Presencia de T. gondii en murciélagos del departamento de Santander.......16
7. Discusión……………………………..……………………………..…………………...19
8. Conclusión……………………………..………………………………………………...21
9. Anexos…....………………………..……………………………..……………………...21
10. Bibliografía……..……………………..……………………………..…………………28
6
1. Introducción
Toxoplasma gondii es un protozoo perteneciente a la familia Sarcocystidae,
reconocido por tener la capacidad de infectar una variedad de animales de sangre
caliente, entre los que se encuentran los murciélagos [1]. Este parásito intracelular
obligado es transmitido a humanos y animales por vía oral, a través del consumo de
agua o alimentos contaminados con los ooquistes (estadio infectivo), los cuales son
liberados únicamente en las heces de los hospederos definitivos (Felinos), o por el
consumo de carne contaminada con los quistes tisulares (bradizoitos) y vía
transplacentaria [2-3]. Los murciélagos son mamíferos pertenecientes al Orden
Chiroptera y representan el 20% de todas las especies a nivel mundial. Los reportes
de la presencia de T. gondii en murciélagos son limitados, Rogério y colaboradores
en el año 2017, mediante detección molecular determinaron una prevalencia del 2%
de T. gondii en cerebros de murciélagos del Estado Bahía Brasil [4]. Cabe resaltar
que para Colombia, hasta la fecha no existen reportes.
Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, el presente estudio tuvo como
objetivo determinar la frecuencia de T. gondii en murciélagos de los departamentos
de Córdoba y Santander, Colombia, mediante reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Los resultados obtenidos mostraron la presencia de T. gondii en 3 individuos
de 2 especies de murciélagos (Lophostoma silvicolum y Saccopteryx leptura)
obteniendo una frecuencia de 21.4% en el departamento de Córdoba, y una
frecuencia de 6.94% en el departamento de Santander, en 3 especies de murciélagos
(Natalus tumidirostris, Mormoops megalophylla y Carollia perspicillata).
2. Justificación y planteamiento del problema
Colombia se encuentra localizada en una zona intertropical, debido a esto, los climas
en la región pueden variar considerablemente dependiendo de las diferentes altitudes
sobre el nivel del mar. Esta diversidad de climas favorece la existencia de una gran
variedad de vida silvestre, como lo son reptiles, anfibios, arácnidos y una
heterogeneidad de mamíferos, entre los que se encuentran los murciélagos; los
cuales desempeñan un papel ecosistémico fundamental, ya que ayudan en la
diseminación de semillas, polinización de flores y el control de la población de
insectos, entre otros [5]. Adicionalmente, estos mamíferos han sido identificados
como reservorios de diversos microorganismos infecciosos, entre los que se
encuentran parásitos del género Leishmania, Trypanosoma [6], Plasmodium, y
Toxoplasma causantes de infecciones de importancia en los humanos [7].
Debido a la degradación de zonas boscosas tropicales en las últimas décadas, se ha
dado un aumento en la migración de los murciélagos de áreas silvestres a zonas
urbanas [4], generando así, un aumento de poblaciones silvestres en áreas donde
normalmente estas no residen, lo cual favorece la diseminación de una amplia
variedad de patógenos, y el mantenimiento de estos de forma constante en los
ecosistemas urbanos.
7
T. gondii es un parásito que tiene la capacidad de infectar una amplia variedad de
hospederos entre los que se encuentran las aves, y los mamíferos, incluidos los
humanos en los cuales causa la toxoplasmosis. Esta enfermedad, es una zoonosis
originaria de América del Sur, y es una de las enfermedades parasitarias más
frecuentes en el mundo [8-9], y constituye un problema de salud pública, el cual
requiere ser atendido y adoptar medidas tendientes a reducir los costos sociales y
económicos provocados por este parásito.
En consecuencia con lo mencionado anteriormente, y teniendo en cuenta que los
murciélagos son reservorios de diversos microorganismos infecciosos, en este trabajo
se propone evaluar la presencia de T. gondii en murciélagos procedentes de dos
regiones geográficas colombianas, a partir de técnicas moleculares, con el propósito
de generar información que contribuya a plantear a futuro medidas de control.
3. Marco teórico
3.1 Generalidades de Toxoplasma gondii
T. gondii es un miembro del phylum Apicomplexa, un grupo que comprende más de
5000 protozoos que son exclusivamente patógenos intracelulares de animales
vertebrados e invertebrados, fue descubierto por primera vez en 1908 por Nicolle y
Manceaux como un parásito intracelular obligado en bazo e hígado del roedor
Ctenodactylus gundi [1]. En ese mismo año, en Brasil, Splendore logró su
identificación en los tejidos de un conejo [9], y en 1939 fue reconocido como el
causante de la toxoplasmosis [10]. Este protozoo perteneciente a la familia
Sarcocystidae, actualmente tiene una alta distribución a nivel mundial y es de gran
prevalencia en hospederos de sangre caliente, incluidos los humanos [1-11].
3.2 Ciclo de vida
T. gondii es un parásito intracelular obligado, capaz de infectar una gran variedad de
hospederos mamíferos y aves; sin embargo, los miembros de la familia Felidae han
sido descritos como su único hospedero definitivo, ya que ellos presentan la fase
sexual del ciclo de vida del parásito [3]. Esta fase se caracteriza por ser altamente
específica; y ocurre dentro de células epiteliales intestinales del hospedero definitivo
y los productos de la fusión de los gametos, los ooquistes, son eliminados en las
heces. Estos al entrar en contacto con el medio ambiente esporulan, diferenciándose
en estadios infectivos tanto para los hospederos definitivos como intermediarios. La
etapa asexual, se caracteriza por la falta de especificidad del parásito, tanto por el
hospedero como por el tejido a infectar. Esta etapa se da posterior a la ingesta del
parásito, a través de alimentos o agua contaminada con ooquistes esporulados o a
través de carne mal cocida, donde se encuentren los bradizoítos del parásito. En el
hospedero intermediario, después de la ingesta del parásito ocurre la liberación de
8
los esporozoitos o bradizoítos, infectando células epiteliales e intestinales, en donde
se transforman en taquizoítos, los cuales se multiplican intracelularmente por
endodiogenia dentro de una vacuola parasitófora [3].
Cuando las células del hospedero se encuentran llenas de taquizoítos, ocurre una
lisis celular y los parásitos se liberan al medio extracelular, distribuyéndose por el
torrente sanguíneo y linfático, alcanzando de esta forma diversos órganos, como el
cerebro, corazón y pulmones. Los taquizoitos forman agregados quísticos
(bradizoítos), generalmente en el tejido cerebral y muscular, los cuales pueden
permanecer latentes durante toda la vida del hospedero, experimentando una
reactivación, la cual es exclusiva de individuos inmunocomprometidos [12].
3.3 Toxoplasmosis
La toxoplasmosis es una enfermedad zoonótica, causada por el parásito intracelular
obligado T. gondii [12], la infección con el parásito, se da a través de dos vías de
transmisión, (i) transmisión horizontal, que se presenta por la ingesta de agua o
alimentos contaminados con los ooquistes esporulados presentes en el medio
ambiente, eliminados a través de las heces, por parte de los Félidos o el consumo de
quistes tisulares (bradizoitos) presentes en la carne de una gran variedad de animales
[2], y (ii) transmisión vertical, de madre a hijo, debido a la capacidad que tienen los
taquizoitos para atravesar la placenta y de esta forma, llegar al feto [3].
En individuos inmunocompetentes la toxoplasmosis generalmente es asintomática o
cursa con una sintomatología similar a la ocasionada por el virus de la gripe: ganglios
linfáticos inflamados o dolores musculares, los cuales pueden llegar a tener una
duración de un mes o más [13]. Sin embargo, la infección primaria durante el
embarazo y la infección en individuos inmunocomprometidos son condiciones que
confieren alto riesgo para el desarrollo de casos severos; y toxoplasmosis aguda, los
cuales pueden cursar con manifestaciones como miocarditis, toxoplasmosis ocular
(coriorretinitis), encefalitis e hidrocefalia [13]. Los bebés que resultan infectados con
toxoplasmosis durante el embarazo, generalmente nacen antes de tiempo y la
infección puede causar daño a los ojos, el sistema nervioso, la piel y los oídos [14].
3.4 Epidemiología
En promedio, se considera que un tercio de la población mundial tiene una infección
crónica por T. gondii. Esto depende de cada país y puede variar entre 10-80% de
acuerdo con las condiciones climáticas, que permiten o no la viabilidad de los
ooquistes en el medio, y de factores humanos como condiciones de higiene, hábitos
alimenticios, calidad del agua potable, tipo de ganado, etc [10].
La prevalencia en América del Norte oscila entre el 10-30%; estudios realizados en
Estados Unidos, han determinado que entre un 8-22% de las personas están
infectadas con el parásito; observándose una prevalencia similar en Reino Unido [15].
9
En Estados Unidos, T. gondii es considerado como el segundo agente causal de
muertes atribuibles a enfermedades transmitidas por alimentos, asociadas al
consumo de carne de aves de corral, de cerdo y de res, con un estimado de 327
muertes al año. Adicionalmente, este parásito infecta alrededor de un millón de
personas cada año, y se estima que 21.000 de los infectados resultan anualmente
con una enfermedad ocular aguda y un rango de 400 a 4000 de los casos anuales
terminan en problemas congénitos [16].
En algunos países del Sudeste Asiático, como Japón, en el norte de Europa, en las
zonas sahelianas de África, se reporta una prevalencia entre 30-50% [17, 18, 19].
Las prevalencias más elevadas, a menudo superiores al 70%, están en regiones
tropicales húmedas de los países de América Latina y África. Sin embargo, en un
mismo país estos datos pueden cambiar en función del nivel socioeconómico,
encontrándose prevalencias más elevadas en el sector más pobre de la población
[17, 18, 19].
En América Latina los porcentajes de seropositividad en humanos en el 2001 en
países como México, Argentina y Brasil fueron de 35%, 72% y 59% respectivamente
[16-20]. En Colombia, un estudio realizado en el 2007 en 201 donantes de sangre
encontró que el 29.9% (60 pacientes) presentaron anticuerpos (IgG) contra T. gondii.
Así mismo, estudios realizados en mujeres embarazadas, han determinado
seroprevalencias de 60% para mujeres procedentes del municipio de Armenia y de
48% para el municipio de Manizales [20].
A partir de información de fuentes oficiales, en Colombia, en el transcurso de los años,
la Toxoplasmosis ha incrementado, pasando de 220 casos en el 2009 a 416 en el año
2014, reportando una prevalencia de 0.49 por cada 100.000 habitantes en el 2009 y
de 0.87 en el 2014. En cuanto a la prevalencia estimada de toxoplasmosis en los
departamentos de Colombia, se evidencia que Huila (5.56), Putumayo (0.81), Boyacá
(0.79), Norte de Santander (0.78) y Antioquia (0.76) tienen las prevalencias más altas
para el periodo 2009-2014. En contraste con Magdalena, Chocó y Vaupés que
reportan las prevalencias más bajas para el mismo período (0.00- 0.13/ 100.000) [21].
3.5 Murciélagos
Los murciélagos son mamíferos pertenecientes al Orden Chiroptera. Estos mamíferos
son los únicos capaces de volar, tienen amplia distribución en el planeta, y son
especialmente diversos en el Neotrópico [22]. Ellos se encuentran en una gran
variedad de nichos [23]; juegan un papel ecosistémico importante en la naturaleza,
pues contribuyen en la diseminación de semillas, polinización de flores y el control
de la población de insectos, entre otros [24]. Los murciélagos constituyen el segundo
orden taxonómico más diverso entre los mamíferos de Colombia, ya que cuenta con
205 especies [25], y ocupa el primer lugar en América y el segundo a nivel mundial
10
en cuanto a la diversidad de quirópteros. En los últimos años se ha dado un aumento
en la migración de la población de murciélagos a zonas urbanas, debido a la
destrucción de su hábitat, su alta movilidad, y su interacción con el hombre [26].
Adicional a lo anterior, los murciélagos han sido ampliamente estudiados ya que están
involucrados en la epidemiología de importantes zoonosis como la rabia y la
histoplasmosis (hongo que al entrar en los humanos causa una severa enfermedad
pulmonar). Adicionalmente, estos se caracterizan por ser portadores y reservorios de
diferentes microorganismos infecciosos, entre los que se encuentran parásitos,
bacterias, hongos y virus, como lo son los protozoos del género Leishmania,
Trypanosoma [6], y parásitos del género Plasmodium, causantes de la malaria en
humanos [7]. Los murciélagos han sido implicados como importantes reservorios de
virus, entre los que se encuentran, henipavirus Hendra y Nipah, los filovirus del Ébola
y Marburgo, el virus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y el virus del
síndrome respiratorio del Medio Oriente (MERS) [27].
3.5.1 Presencia de T. gondii en murciélagos
Diferentes estudios han sido realizados, tendientes a evaluar la presencia del parásito
y la infección en murciélagos. En el 2012, Sangster y colaboradores, realizaron el
primer reporte de toxoplasmosis en megaquirópteros cautivos en Australia, ellos
reportaron la presencia de taquizoítos y bradizoitos en pulmón y cerebro de
murciélago respectivamente, sugiriendo que la toxoplasmosis también podría
esperarse en los murciélagos que se desplazan libremente [28]. Por otro lado, Jiang
y colaboradores en el año 2014, examinaron 608 murciélagos procedentes del sur de
China, y mediante detección molecular del parásito encontraron una prevalencia del
9.7% [29].
Para América Latina, Cabral y colaboradores en el año 2012, informaron el primer
aislamiento y caracterización genotípica de dos aislamientos de T. gondii, en
murciélagos del estado de São Paulo [28]. Así mismo, Rogério y colaboradores en el
año 2017, mediante detección molecular determinaron la infección con T. gondii en
cerebros de murciélagos del Estado Bahía Brasil, y una prevalencia del 2% [4].
Para Colombia, actualmente no existen reportes de la presencia de T. gondii en
murciélagos.
4. Objetivo general
Determinar la frecuencia de Toxoplasma gondii en murciélagos de los departamentos
de Córdoba y Santander, Colombia.
11
4.1 Objetivos específicos
Evaluar la presencia de T. gondii en hígado de murciélagos del departamento de
Córdoba.
Evaluar la presencia de T. gondii en hígado de murciélagos del departamento de
Santander.
5. Metodología
5.1 Muestras de tejidos de órganos
Las muestras del departamento de Córdoba corresponden a murciélagos
capturados en los municipios de Buenavista, Montería, Los Córdoba, y Canalete
entre agosto de 2011 y enero de 2012. Y las muestras de Santander corresponden
a murciélagos residentes de la cueva Macaregua, los cuales fueron colectados entre
febrero y septiembre del 2015. Los murciélagos colectados se depositaron en la
Colección de Mamíferos del Museo Javeriano de Historia Natural y los hígados de
los murciélagos fueron amablemente cedidos por el Laboratorio de Ecología
Funcional de la Pontificia Universidad Javeriana, los cuales se encontraban
almacenados en alcohol al 70% (Anexo 1 y 2).
Los murciélagos fueron colectados en el marco del proyecto titulado “Murciélagos
procedentes de dos regiones de Colombia y su papel como reservorios de agentes
infecciosos” el cual contó con el Permiso marco de recolección de especímenes de
especies silvestres de la diversidad biológica para investigación con fines no
comerciales, Resolución 0546, Ministerio del Medio Ambiente y Desarrollo
Sostenible; ANLA; y en su momento no requirió FUA para la colecta.
5.2 Extracción de ADN
La extracción del ADN se realizó a partir de aproximadamente 25 mg de tejido de
hígado, usando el estuche comercial “High pure PCR template preparation kit”
(Roche), siguiendo las recomendaciones de la casa comercial.
5.3 Reacción de la cadena polimerasa para el gen cyt b
Con el propósito de evaluar la calidad del ADN se realizó una PCR para el gen cyt b
de mamífero [30] bajo las siguientes condiciones: Denaturación a 94°C durante 3
minutos, 30 ciclos: 94°C durante 1 minuto, 63°C por 1 minuto y 72°C por 2 minutos.
Y una extensión final a 72°C durante 10 minutos. Con las siguientes condiciones de
reacción: Buffer 1X, MgCl2 1,5 mM, dNTPS 200 μM, 10 pM de cada oligonucleótido
(cyt b Uni rev y cyt b Uni fw) y 0,06 U/µL de Taq ADN polimerasa (Corpogen). Los
productos de la amplificación se evaluaron mediante electroforesis en gel de agarosa
12
al 1%, teñido con HydraGreen™ Safe DNA Dye (ACTGene).
5.4 Reacción en cadena de la polimerasa para la detección de T. gondii
Para determinar la presencia de T. gondii se realizó una PCR dirigida a un fragmento
repetido presente en el genoma del parásito, de acuerdo con lo reportado previamente
[30]. Para esto, se emplearon los oligonucleótidos TOX 4 (5´ CGCTGCAGGG
AGGAAGACGA AAGTTG 3´) y TOX 5 (5´ CGCTGCAGACACAGTGCATC TGGATT
3´), bajo las siguientes condiciones de amplificación: denaturación a 94° C por 7 min
seguida de 35 ciclos 94°C por 1 min, 55°C por 1 min, 72°C por 1 min y una incubación
final a 72°C por 10 min; y las siguientes condiciones de reacción: en un volumen final
de 25 μl de reacción: 0,5 μM de cada oligonucleótido, dNTP 200 μM, MgCl2 Mm, Taq
0,06 U/uL, Buffer 1X, y 5 uL de ADN.
Para la PCR se usaron los siguientes controles negativos: blanco (agua adicionada
en el sitio donde se monta la reacción), gris (agua adicionada en el sitio donde se
añade la muestra de ADN) y positivo (ADN genómico de T. gondii)
Los productos de la amplificación se evaluaron mediante electroforesis en gel de
agarosa al 1%, teñido con HydraGreen™ Safe DNA Dye (ACTGene).
5.4.1 Prueba de especificidad para la PCR de T. gondii
Con el fin de evaluar la especificidad de la PCR para la detección de T. gondii y
teniendo en cuenta que los órganos procesados son de murciélagos, en los cuales
previamente se detectó la presencia de Trypanosoma cruzi y Leishmania spp. [31],
se realizó la PCR bajo las condiciones previamente mencionadas, usando como
muestras ADN de: Murciélago, ratón, humano, T. cruzi, Leishmania spp. y T. gondii.
6. Resultados
6.1 Prueba de especificidad para la PCR de T. gondii
Con el fin de evaluar la especificidad de los oligonucleótidos usados en la PCR de T.
gondii, se procesó ADN de diferentes organismos. Tal como se evidencia en la Figura
1, en el pozo 8 se observa la amplificación del fragmento esperado (529 pb) a partir
del ADN de T. gondii, y ninguno de los demás ADN evaluados amplifico la banda
esperada. Sin embargo en el pozo 6, el cual corresponde al ADN de Leishmania spp.,
se observan bandas, las cuales tienen un peso molecular mayor al de la banda
esperada. Teniendo en cuenta este resultado, se utilizó esta PCR para evaluar la
presencia de T. gondii en las muestras de los murciélagos.
13
Figura 1. PCR para evaluar la especificidad de amplificación del ADN de T. gondii.
Electroforesis en gel de agarosa al 1% con 10 μl del producto de amplificación. (1) Marcador de peso
molecular (100 pb; Invitrogen); (2) ADN de murciélago; (3) ADN de ratón; (4) ADN de humano; (5)
ADN de T. cruzi; (6) ADN de Leishmania spp.; (7) Control gris; (8) Control positivo (ADN de T. gondii).
A la izquierda se indican el tamaño de la banda esperada.
6.2 Presencia de T. gondii en murciélagos del departamento de Córdoba
Para evaluar la presencia T. gondii en los murciélagos de Córdoba se procesó ADN,
obtenido a partir de hígado, almacenado en el banco de muestras del Laboratorio de
Inmunoparasitología Molecular de la PUJ. Las muestras corresponden a murciélagos
provenientes del departamento de Córdoba, municipios de Buenavista, Montería, Los
Córdoba y Canalete (Anexo 1).
Inicialmente y para evaluar la calidad del ADN se realizó una PCR dirigida al gen cyt
b de mamíferos pequeños [30], de 29 muestras procesadas 14 fueron positivas para
esta PCR, obteniendo la amplificación de la banda esperada de 940 pb (Figura 2), por
otro lado las 15 muestras que dieron negativa para esta PCR, no amplificaron el
fragmento esperado debido a la pérdida de la viabilidad del ADN. Las muestras
positivas pertenecen a 7 especies de murciélagos: Dermanura phaeotis, Glossophaga
soricina, Carollia perspicillata, Artibeus planirostris, Sturnira lilium, Lophostoma
silvicolum y Saccopteryx leptura. En la (Tabla 1) se muestra la procedencia y el
número de muestras positivas para cada una de las especies.
14
Figura 2. PCR para la amplificación del gen cyt b de mamífero en muestras de ADN obtenido
de hígado. Electroforesis en gel de agarosa al 1% con 10 μl del producto de amplificación. (1)
Marcador de peso molecular (100 pb; Invitrogen); (2) Muestra SL 191; (3) G 267; (4) G 324; (5) G
279; (6) G 208; (7) G 160; (8) G 119; (9) G 245; (10) Control positivo (ADN de riñón de murciélago);
(11) Control blanco; (12) Control gris (controles en el cual se usó agua destilada en reemplazo del
ADN). A la izquierda se indican el tamaño de la banda esperada
Tabla 1. Muestras de ADN de los murciélagos procedentes de Córdoba positivas
para la PCR de cyt b
Especie Procedencia
(Municipio)
Número de muestras
positivas para la PCR de cyt b
Dermanura phaeotis Buenavista, Los
Córdoba
2
Glossophaga soricina Canalete 2
Carollia perspicillata Buenavista 1
Artibeus planirostris Buenavista 2
Sturnira lilium Buenavista 1
Lophostoma silvicolum Buenavista 3
Saccopteryx leptura Buenavista 3
Total 14
15
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la PCR dirigida al gen cyt b, las 14
muestras se procesaron para la detección de T. gondii. Para esto se realizó
amplificación de un fragmento de 529 pb, correspondiente a una secuencia repetida
presente en el genoma de T. gondii [31]. De las 14 muestras, 3 muestras (frecuencia
21.4%) amplificaron el fragmento esperado. Las muestras positivas corresponden a
las especies: L. silvicolum (muestra G 132) y S. leptura (muestra G 320 y G 324). En
la Figura 3 se muestra la amplificación de una de las muestras positivas (G 132) para
T. gondii.
Figura 3. PCR para la detección de T. gondii en muestras de murciélagos procedentes de
Córdoba. Electroforesis en gel de agarosa al 1% con 10 μl del producto de amplificación. (1) Marcador de peso molecular (100 pb; Invitrogen); (2) Muestra G 119; (3) G 132; (4) G 223; (5) G 267; (6) control positivo (ADN de T. gondii); (7) Control blanco; (8) Control gris. A la izquierda se indican el
tamaño de la banda esperada
Al evaluar la presencia y el hábito alimenticio de las especies de murciélagos positivos
para la presencia de T. gondii se encontró que todos los murciélagos habían sido
colectados en el municipio de Buenavista y las dos especies eran insectívoras (Tabla
2).
16
Tabla 2. Frecuencia, especie, procedencia y hábito alimenticio de los murciélagos
que dieron positivo para la presencia de T. gondii en la región de Córdoba.
Especie Municipio Hábito alimenticio
Lophostoma silvicolum Buenavista Insectívoro
Saccopteryx leptura Buenavista Insectívoro
Saccopteryx leptura Buenavista Insectívoro
Frecuencia: 21.4%
6.3 Presencia de T. gondii en murciélagos del departamento de Santander
La presencia T. gondii en los murciélagos de Santander, se evaluó a partir de ADN
obtenido de hígado, almacenados en alcohol al 70%, de murciélagos capturados en
la cueva Macaregua, Santander. Las muestras procesadas pertenecían a tres
especies de murciélagos, C. perspicillata, N. tumidirostris, M. megalophylla (Anexo 2).
La evaluación de la calidad del ADN, se realizó mediante la PCR dirigida al gen cyt b
de mamíferos pequeños [30]. De 88 muestras procesadas, 72 fueron positivas para
esta PCR, obteniendo la amplificación de la banda esperada de 940 pb (Figura 4). La
Tabla 3 muestra el número de muestras positivas para cada una de las especies
evaluadas.
Figura 4. PCR para la amplificación del gen cyt b de mamífero en muestras de ADN obtenido
del hígado de murciélago. Electroforesis en gel de agarosa al 1% con 10 μl del producto de
17
amplificación. (1) Marcador de peso molecular (100 pb; Invitrogen); (2) Muestra MT 101; (3) MT 102;
(4) MT 103; (5) MT 104; (6) MT 105; (7) control de extracción; (8) MT 106; (9) MT 107; (10) MT 108;
(11) MT 109; (12) MT 110; (13) control de extracción; (14) MT 111; (15) MT 112, (16) MT 113; (17)
MT 114; (18) Control positivo (ADN de riñón de murciélago); (19) Control blanco; (20) Control gris
(controles en el cual se usó agua destilada en reemplazo del ADN). A la izquierda se indica el tamaño
de la banda esperada
Tabla 3. Muestras de ADN positivas para la PCR de cyt b de los murciélagos
procedentes de Santander.
Especie Número de muestras positivas para
la PCR de cyt b
Natalus tumidirostris 24
Mormoops megalophylla 24
Carollia perspicillata 24
Total 72
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la PCR dirigida al gen cyt b, las 72
muestras se procesaron para la detección de T. gondii. Para esto se realizó
nuevamente la amplificación del fragmento de 529 pb, correspondiente a la secuencia
repetida presente en el genoma de T. gondii [31]. De 72 muestras, 5 muestras
(frecuencia 6.94%) amplificaron el fragmento esperado. En la Figura 5 se muestra la
amplificación de la muestra MT 140 (N. tumidirostris) positiva para la presencia de T.
gondii.
18
Figura 5. PCR para la detección de T. gondii en muestras de murciélagos procedentes de
Santander. Electroforesis en gel de agarosa al 1% con 25 μl del producto de amplificación. (1)
Marcador de peso molecular (1 Kb; Invitrogen); (2) Muestra MT 136 ; (3) MT 140; (4) MT 145; (5) MT
146; (6) MT 147. A la izquierda se indica el tamaño de la banda esperada.
Al evaluar las especies de murciélagos, se encontró que las tres especies evaluadas
(C. perspicillata, N. tumidirostris, y M. megalophylla) fueron positivas para la presencia
de T. gondii, y adicional a lo observado para los murciélagos de Córdoba, en donde
las especies positivas también son insectívoras, la especie C. perspicillata, que es
frugívora, fue positiva para la presencia del parásito.
Tabla 4. Frecuencia, especie, procedencia y hábito alimenticio de los murciélagos
que dieron positivo para la presencia de T. gondii en la región de Santander.
Especie Hábito alimenticio Número de muestras
positivas
Mormoops megalophylla Insectívoro 1
Carollia perspicillata Frugívoro 3
Natalus tumidirostris Insectívoro 1
Frecuencia: 6.94%
19
7. Discusión
Los murciélagos representan el 20% de las especies de mamíferos en el mundo [29],
y Colombia es el segundo país con mayor diversidad de especies de murciélagos,
después de Indonesia [33]. Sin embargo, hasta el momento no existen estudios
relacionados con la presencia de T. gondii en murciélagos de Colombia.
El departamento de Córdoba, el cual se encuentra ubicado en el norte de Colombia,
en la zona Caribe, representa una región estratégica de estudio, pues allí se han
identificado 8 familias, 37 géneros y 66 especies de murciélagos [34]. En el presente
estudio, se analizaron 14 especímenes pertenecientes a 7 géneros y 7 especies
(Tabla 3). Los resultados mostraron la presencia de T. gondii, mediante detección
molecular (PCR), en 3 individuos de 2 especies (L. silvicolum y S. leptura), ambas
insectívoras, para una frecuencia de infección de 21.4%. Las especies, L. silvicolum
y S. leptura han sido reportadas desde el sur de México, Centroamérica y Suramérica
(Colombia, Venezuela, Guayanas, Ecuador, este de Perú, norte de Bolivia y norte,
centro y sureste de Brasil) [35] como especies raras, con bajas probabilidades de
captura [36].
Por otra parte, en cuanto al departamento de Santander, este se encuentra ubicado
en la zona norte central de Colombia, en la cordillera de los Andes. La cueva
Macaregua está ubicada en el condado de San Francisco, municipio de Curití en un
bosque seco tropical dominado por especies de las familias Boraginaceae, Fabaceae,
Myrsinaceae, Rubiaceae y Caesalpiniaceae. En esta cueva se calcula una población
de 20.000 individuos de 9 especies con diferentes hábitos alimenticios [37].
En esta región, se analizaron 3 especies (C. perspicillata, N. tumidirostris y M.
megalophylla) de murciélagos, las cuales se encuentran como residentes
permanentes en la cueva, encontrando una frecuencia de infección de 6.94%. Las
especies N. tumidirostris y M. megalophylla son insectívoras, mientras que la especie
C. perspicillata es frugívora, siendo esta última especie en la que mayor número de
individuos fueron positivos para la presencia de T. gondii. Estas especies se
encuentran distribuidas en Perú, Ecuador, Venezuela, Guyana, y Guyana Francesa
[38-39].
De manera interesante, la mayoría de las especies positivas para la presencia de T.
gondii fueron insectívoras, la dieta alimenticia de estas especies de murciélagos (L.
silvicolum, S. leptura, N. tumidirostris y M. megalophylla), se basa principalmente en
coleópteros, himenópteros y dípteros. Ha sido demostrado que los insectos pueden
actuar como vectores mecánicos, en el transporte de los estadios infectivos
(ooquistes) [26, 40, 41]. No obstante, la dieta alimenticia de la especie frugívora
positiva para la presencia de T. gondii (C. perspicillata), se basa principalmente en el
consumo de frutos del género Ficus, Cecropia, néctar y polen [42-43].
20
Igualmente, aunque los resultados obtenidos en el presente estudio son el primer
reporte de toxoplasmosis en murciélagos insectívoros y frugívoros en Colombia, para
otros países la presencia del parásito en murciélagos insectívoros ya había sido
previamente reportada, en diferentes áreas geográficas. Un estudio realizado en
China, demostró una frecuencia del 10% (55/549) en murciélagos insectívoros de las
especies Miniopterus schreibersii, Hipposideros fulvus, Hipposideros armiger, entre
otros [29], mientras que un estudio realizado en Gran Bretaña reportó una frecuencia
de 10.39% en murciélagos insectívoros de la especie Pipistrellus pipistrellus y
Pipistrellus pygmaeus [44]; en tanto que en Birmania fue del 29.3% en murciélagos
de las especies Miniopterus fuliginosus, Rhinolophus ferrumequinum, Myotis
chinensis, Hipposideros fulvus, Hipposideros armiger, y Megaderma lyra [45].
Así mismo, estudios realizados en China han demostrado la presencia de T. gondii
en murciélagos frugívoros, Jiang y colaboradores demostraron una frecuencia de
infección de 6.8% (4/59) [29]; mientras que Zi y colaboradores obtuvieron una
frecuencia de 13.6% (12/88) en murciélagos frugívoros de la especie Rousettus
leschenaulti [46]. Por consiguiente los resultados obtenidos en el presente estudio y
los reportados anteriormente, demuestran la capacidad del parásito de infectar una
amplia variedad de especies de murciélagos.
Por otra parte y dado que el parásito T. gondii fue identificado en murciélagos de
Córdoba y Santander, y que en efecto, los felinos son el grupo de mamíferos más
importante en el ciclo de vida de T. gondii, debido que son el hospedero definitivo del
parásito y pueden liberar los ooquistes en las heces, en el momento de la infección.
Por ende, la presencia y la abundancia de estos mamíferos puede influir tanto en la
prevalencia como en la diseminación de las formas infectivas del parásito, teniendo
en cuenta lo mencionado anteriormente, en estos departamentos se registra la
presencia de Tigrillo (Leopardus pardalis), Tigrillo pinta menuda (Leopardus wiedii),
Gato de monte (Puma yaguardi), León colorado (Puma cancolor) y Tigre (Panthera
onca), especies que representan el 12% del total de mamíferos identificados en
Córdoba [47]; en tanto que para el departamento de Santander se registra la
presencia de Jaguar (Panthera onca) [48]. Estos datos son de vital importancia debido
a que la cantidad de felinos presentes en un ambiente silvestre, fomenta el
desprendimiento de ooquistes y la cantidad de estos influyen en sus contribuciones
relativas a la carga ambiental, fomentando la infección del parásito a otras especies
de mamíferos [49].
En efecto para el 2018, Colombia ocupó el cuarto puesto con mayor deforestación a
nivel mundial, con una pérdida de 176.977 hectáreas [50], factor que promueve la
pérdida de hábitat de los murciélagos y por lo tanto la migración a zonas donde
normalmente no residen, aumentando consigo la probabilidad de contacto de estos
mamíferos con el gato doméstico, teniendo en cuenta que al gato cazar y consumir
los murciélagos hace que estos animales se infecten con los bradizoitos que pueden
llegar a estar presentes en los tejidos de los murciélagos.
21
Ligado a lo anterior, cabe resaltar que, de acuerdo con la información reportada por
el Ministerio de Salud y Protección social, relacionada con la vacunación antirrábica
de gatos en Colombia, para el año 2017, en el departamento de Córdoba se
reportaron aproximadamente 87.510 gatos domésticos, y en Santander 63.260 [51].
De manera que la prevalencia de T. gondii en murciélagos de Córdoba y Santander
se ve favorecida por la alta población de felinos reportados, así mismo, la presencia
de T. gondii en murciélagos favorece la dispersión del parásito a la población humana.
En consecuencia, la presencia de T. gondii en murciélagos de los departamentos
evaluados, aporta información sobre los posibles riesgos a los que se enfrentan las
poblaciones aledañas a las áreas de estudio y a partir de estos generar a futuro
medidas de control y conservación de los ecosistemas, con el objetivo de reducir las
fuentes de diseminación del parásito en áreas urbanas.
8. Conclusión
Se encontró una frecuencia de infección por T. gondii de 21.4% y 6.94% en los
murciélagos de Córdoba y Santander, respectivamente.
9. Anexos
Anexo 1
Tabla 3. Muestras evaluadas del departamento de Córdoba
Muestra Género Categoria/especie Municipio cyt b T.
gondii
1 CH 125 Dermanura phaeotis Canalete Negativo Negativo
2 CH 126 Carollia perspicillata Canalete Negativo Negativo
3 CH 127 Glossophaga soricina Canalete Positivo Negativo
4 CH 133* Glossophaga soricina Canalete Positivo Negativo
5 CH 172 Artibeus lituratus Canalete Negativo Negativo
6 G 007* Uroderma bilobatum Buenavista Negativo Negativo
22
7 G 030 Carollia perspicillata Buenavista Positivo Negativo
8 G 043 Uroderma bilobatum Buenavista Negativo Negativo
9 G 070 Carollia perspicillata Buenavista Negativo Negativo
10 G 073 Vampiriscus nymphaea Buenavista Negativo Negativo
11 G 082 Artibeus planirostris Buenavista Negativo Negativo
12 G 119 Artibeus planirostris Buenavista Positivo Negativo
13 G 120 Artibeus planirostris Buenavista Positivo Negativo
14 G 126 ND ND ND Negativo Negativo
15 G 131 Sturnira lilium Buenavista Positivo Negativo
16 G 132 Lophostoma silvicolum Buenavista Positivo Positivo
17 G 133 Lophostoma silvicolum Buenavista Positivo Negativo
18 G 154 Molossus molossus Buenavista Negativo Negativo
19 G 160 Artibeus planirostris Buenavista Negativo Negativo
20 G 208 Saccopteryx leptura Buenavista Positivo Negativo
21 G 223 Dermanura phaeotis Buenavista Positivo Negativo
22 G 245 Saccopteryx leptura Buenavista Positivo Negativo
23 G 267 Lophostoma silvicolum Buenavista Positivo Negativo
24 G 279 Saccopteryx leptura Buenavista Positivo Negativo
25 G 320 Saccopteryx leptura Buenavista Positivo Positivo
23
26 G 324 Saccopteryx leptura Buenavista Positivo Positivo
27 G 368 Saccopteryx leptura Buenavista Negativo Negativo
28 LG 084 Saccopteryx leptura Buenavista Positivo Negativo
29 SL 191 Dermanura phaeotis Los
Córdoba
Positivo Negativo
* Muestras de las que ya no hay ADN
Anexo 2.
Tabla 4. Muestras evaluadas del departamento de Santander
Código Sexo Género cyt b T. gondii
MT 70 Hembra Natalus Positivo Negativo
MT 71 Hembra Natalus Positivo Negativo
MT 72 Macho Natalus Positivo Negativo
MT 73 Macho Natalus Positivo Negativo
MT 74 Hembra Natalus Positivo Negativo
MT 75 Macho Natalus Negativo Negativo
MT 76 Hembra Natalus Positivo Negativo
MT 77 Hembra Natalus Positivo Negativo
MT 78 Macho Natalus Positivo Negativo
MT 79 Macho Natalus Positivo Negativo
MT 80 Hembra Natalus Positivo Negativo
24
MT 81 Hembra Natalus Positivo Negativo
MT 82 Macho Natalus Positivo Negativo
MT 83 Hembra Natalus Positivo Negativo
MT 84 Hembra Natalus Positivo Negativo
MT 85 Macho Mormoops Positivo Negativo
MT 86 Macho Mormoops Positivo Negativo
MT 87 Hembra Mormoops Positivo Negativo
MT 88 Hembra Carollia Positivo Negativo
MT 89 Macho Mormoops Positivo Negativo
MT 90 Hembra Mormoops Positivo Positiva
MT 91 Macho Mormoops Positivo Negativo
MT 92 Macho Mormoops Positivo Negativo
MT 93 Macho Mormoops Negativo Negativo
MT 95 Macho Mormoops Positivo Negativo
MT 96 Macho Mormoops Positivo Negativo
MT 97 Macho Mormoops Positivo Negativo
MT 98 Hembra Mormoops Positivo Negativo
MT 99 Hembra Natalus Positivo Negativo
MT 100 Macho Natalus Positivo Negativo
25
MT 101 Macho Mormoops Positivo Negativo
MT 102 Hembra Mormoops Positivo Negativo
MT 103 Hembra Mormoops Positivo Negativo
MT 104 Hembra Mormoops Positivo Negativo
MT 105 Hembra Mormoops Positivo Negativo
MT 106 Hembra Mormoops Positivo Negativo
MT 107 Hembra Mormoops Positivo Negativo
MT 108 Hembra Mormoops Positivo Negativo
MT 109 Hembra Mormoops Positivo Negativo
MT 110 Hembra Mormoops Positivo Negativo
MT 111 Hembra Carollia Positivo Negativo
MT 112 Hembra Carollia Positivo Negativo
MT 113 Hembra Carollia Positivo Negativo
MT 114 Macho Natalus Positivo Negativo
MT 115 Macho Natalus Positivo Negativo
MT 116 Hembra Carollia Positivo Negativo
MT 117 Hembra Carollia Positivo Negativo
MT 118 Macho Carollia Positivo Positiva
MT 119 Hembra Carollia Positivo Negativo
26
MT 121 Macho Carollia Positivo Negativo
MT 122 Hembra Carollia Negativo Positiva
MT 123 Macho Carollia Negativo Negativo
MT 124 Macho Carollia Negativo Negativo
MT 125 Macho Carollia Positivo Negativo
MT 126 Macho Carollia Positivo Negativo
MT 127 Macho Carollia Positivo Negativo
MT 128 Macho Carollia Positivo Negativo
MT 129 Hembra Carollia Positivo Negativo
MT 130 Macho Carollia Positivo Negativo
MT 131 Macho Carollia Positivo Negativo
MT 132 Macho Mormoops Negativo Negativo
MT 134 Macho Natalus Positivo Negativo
MT 135 Macho Natalus Negativo Negativo
MT 136 Macho Natalus Positivo Negativo
MT 137 Macho Natalus Negativo Negativo
MT 140 Macho Natalus Positivo Positiva
MT 141 Macho Carollia Negativo Negativo
MT 144 Macho Mormoops Negativo Negativo
27
MT 145 Macho Mormoops Positivo Negativo
MT 146 Macho Natalus Positivo Negativo
MT 147 Macho Mormoops Positivo Negativo
MT 148 Macho Mormoops Negativo Negativo
MT 149 Macho Mormoops Positivo Negativo
MT 150 Macho Mormoops Negativo Negativo
MT 152 Macho Carollia Negativo Negativo
MT 153 Macho Carollia Negativo Negativo
MT 154 Macho Carollia Positivo Negativo
MT 155 Macho Carollia Positivo Positiva
MT 158 Hembra Carollia Positivo Negativo
MT 161 Hembra Carollia Positivo Negativo
MT 163 Macho Natalus Positivo Negativo
MT 165 Macho Natalus Positivo Negativo
MT 166 Macho Carollia Negativo Negativo
MT 169 Macho Carollia Positivo Negativo
MT 172 Macho Carollia Positivo Negativo
MT 176 Hembra Carollia Positivo Negativo
MT 177 Macho Carollia Negativo Negativo
28
MT 178 Macho Carollia Positivo Negativo
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