Função das Membranas Celulares

5_Transporte Activo Transmembranar

Licenciatura em Engenharia Biomédica

Luís Martinho do Rosário[Depto. de Bioquímica / FCTUC]

#46

EQUILÍBRIO DE DONNAN

K+

A- Cl-K+

i

proteínas carregadasnegativamente

membrana permeável a K+ e Cl-

(impermeável a A-)

volume constante(não há fluxos líquidos de H2O)

Inicialmente [KA]i,t=0 = [KCl]o,t=0

o

Gradiente de concentração para Cl-

Fluxo de Cl- de o para i

Fluxo de K+ de o para i de igual magnitudeAo fim de t=∆t

[K+]i ≠ [K+]o e [Cl-]i ≠ [Cl-]o

[K+]i [Cl-]i = [K+]o [Cl-]o

Em = RT/F ln([K+]o/[K+]i) = RT/F ln([Cl-]i/[Cl-]o)

Regra de Donnan

(electroneutralidade)

Pela regra de Donnan e aplicando o princípio da electroneutralidade a ambos os compartimentos... [K+]i

2 = [K+]o2 + [A-]i[K+]i

[K+]i > [K+]o e [Cl-]o > [Cl-]i

K+> K+

Cl- < Cl-A-i

o

33 67

133 67166 134

Cl-

K+

Total

i o

(mM)

Exemplo [KA]i,t=0 = [KCl]o,t=0 = 100 mM

+ A- (100 mM)

Osmolaridade em i > Osmolaridade em o

Fluxo de H2O de o para i

Aumento de volume e ruptura da célula

(membrana elástica)

Na+ como compensador osmótico

[K+]i + [Cl-]i + [A-]i + [Na+]i ≅[K+]o + [Cl-]o + [Na+]o

Bomba de Na+

Na+/K+-ATPase#47

Exercícios

1 – Aplicando a Regra de Donnan e o princípio da electroneutralidadea ambos os compartimentos considerados em #50, derive a expressão indicada no topo de #51

Na+/K+-ATPase

Estequiometria 3Na+/2K+

Energética Transporta iões contra gradiente electroquímico(acoplamento à hidrólise de ATP)

Inibidores Glicosídeos cardíacos (ex: ouabaína)

Substratos Na+ e MgATP no lado intracelular; K+ (ou Rb+, NH4

+...) no lado extracelular

Estrutura Heterodímero (subunidades α e β)

Mecanismo Transições E1-E2 promovidas por fosforilação /desfosforilação)

Fosforilação Transição E1 → E2E2~P tem elevada afinidade a K+ e baixaafinidade a Na+

Desfosforilação Transição E2 → E1E1 tem elevada afinidade a Na+ e baixaafinidade a K+

#48

Ca2+-ATPases

Estequiometria 1Ca2+ / CicloEnergética Transporta iões contra gradiente electroquímico (acoplamento à hidrólise de ATP)

Inibidor Vanadato

Substratos Ca2+ e MgATP no lado intracelular

Mecanismo Transições E1-E2 promovidas por fosforilação / desfosforilação (E1: alta afinidade a Ca2+; E2~P: baixa afinidade a Ca2+)

Regulação Calmodulina

Função Neutralização da entrada passiva de Ca2+

Membrana plasmática

[Ca2+]o >> [Ca2+]i

[Ca2+]i (rep.) ≅ 100 nM

Retículo endoplasmático / sarcoplasmático

Estequiometria 2 Ca2+ / Ciclo

Inibidor Tapsigargina

Regulação Fosfolambana

Função Armazenamento intracelular de Ca2+

E

E-Ca++2

2Ca++

ER cytosol membrane lumen

2Ca++

E~P-Ca++2 E~P-Ca++

2 ADP

Pi

ATP

#49

Ca++

enzyme phosphorylation

phosphate hydrolysis

SERCA Conformational Cycle

Structure/Function Relationships in the Calcium ATPasehttp://www.utoronto.ca/maclennan/rint1.htm

Toyoshima Lab – Movie, see “Resources”http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/StrBiol/E1-E2 transition

Stokes Structural Biology Labhttp://skirball.med.nyu.edu/~stokes/Download movie (reaction cycle of Ca-ATPase)

Alguns sites e animações de interesse

ATPases

ATPases tipo P

eg. Na+/K+-ATPase, Ca2+-ATPases, H+/K+-ATPases (mucosa gástrica)

Fosforilação reversível de um resíduo de ácido aspárticodurante o ciclo catalítico

Outras ATPases

eg. H+-ATPase mitocondrial (F1.F0-ATPase, tipo F)H+-ATPases de outros organelos (tipo V)

P-Class Pumps

ATP

C

O

O P O-

O-

O

C

O

OH

ADP

Enzyme-

Enzyme-

Pi

H2O

#50

Transporte activo

◘ Primário Uso directo de ATP como fonte de energia (ATPases). Proteína de transporte alterada por ligação covalente de fosfato

◘ Secundário Uso do gradiente electroquímico de um ião como fonte de energia.Proteína de transporte alterada por modulação alostérica, como resultado da ligação de iões (ex: Na+, Cl-)

Soluto

Soluto

Na+

Na+

[Na+] elevada

[Na+] baixa

►Co-transporte Soluto transportado no mesmosentido do ião

►Contra-transporte Soluto e ião transportados em sentidos opostos

Na+

Na+ X

X

Na+

Na+

X

X#51

Trocador Na+/Ca2+

Ca2+

3Na+

i

o

Estequiometria 3Na+/1Ca2+

Energética Transporta iões Ca2+ contra gradiente electroquímico(acoplamento ao contra-transporte de Na+)

Afinidade a Ca2+ Baixa em repouso. Aumenta quando a [Ca2+]iaumenta (regulação alostérica)

Reversão Potencial de reversão ENa/Ca = 3ENa – 2ECa

Modos Directo / inverso

Modo directo (efluxo)Em < ENa/Ca

Modo inverso (influxo)Em > ENa/Ca

Potencial de acção

Influxo de Ca2+

ENa/Ca

Efluxo de Ca2+

Digitalis e insuficiência cardíaca

Digitalis Inibição bomba Na+ [Na+]i [Ca2+]i Força contracção músculocardíaco

#52

Transportadores de equivalentes ácidos e regulação do pH citossólico

H+

-- - - -

Em

pHipHo

Distribuição passiva de H+s: EH ≈ Em

EH = RT/F ln ([H+]o/[H+]i) = 60(pHi-pHo)

Em repouso

Em = -60 mV pHi = pHo–1 (ou ∆pH = 1.0)Em = -90 mV pHi = pHo–1.5 (ou ∆pH = 1.5)

previsão para pHo = 7.4: pHi (repouso) ~ 5.9-6.4na realidade 6.9-7.2

H+

Na+

i

o

sítio de regulaçãoalostérica

Trocador Na+/H+

Bloqueado por amilorida e derivados

Alostericamente activado por H+sInibido quando pHi → 7.2

#53

Exercícios

1 – Derive a expressão que define o potencial de reversão do trocador Na+/Ca2+, considerando que a energia livre associada ao gradiente electroquímico de um ião X+ é dada por ∆GX=zF(Em-EX)

2 – Calcule o potencial de reversão do trocador Na+/Ca2+ para um miócitocardíaco em repouso, sabendo que [Na+]i/o ~ 10/140 mM e [Ca2+]i/o ~ 100 nM/2 mM. Qual é o modo de funcionamento do trocador nestas condições?

3 – O trocador Na+/H+ é um dispositivo fundamental para a regulação do pH intracelular. Explique por que razão o trocador contraria a tendência para a acidificação intracelular causada pelo influxo passivo de protões através da membrana celular (ou por exposição das células a pulsos breves de baixas concentrações de nigericina, um trocador K+/H+ artificial)

4 – A K+/H+-ATPase localizada na face luminal das células parietais do estômago está na base da acidificação do lúmen estomacal (essencial para a digestão de proteínas). Explique por que razão certos inibidores terapêuticos da bomba de H+ são comummente utilizados na terapia do excesso de acidez estomacal