Chromatography의 비교

GC와 LC의 선택

이동상의 극성

분자량

LC

GC

HPLC의 분리 방법

흡착 분배 이온 교환 크기 배제

액체 - 고체 (LSC) 액체 - 액체 (LLC) 고정상에 부착된 이온기 (IC) 분자 크기에 의한 크기 배제 (GPC)

전통적인 분배 크로마토그래피 - 지지체에 액체 고정상을 액막으로 형성시켜 사용 결합상 크로마토그래피 - 고정상의 화합물을 실리카 입자의 표면에 화학적으로 결합시켜 사용

1. 화합물의 극성에 관계없이 분리가 가능. 2. 분리는 시료 성분의 고정상과 이동상에 대한 분배 계수의 차이 3. 이동상으로는 두 가지 이상의 혼합 용매가 흔히 사용된다. 이동상에 사용되는 용매 종류, 농도, 완충액이나 변형제의 농도를 조절하여 시간에 따른 선택성과 elution strength를 변화시켜 분리 효율을 증가시킬 수 있다. 4. 컬럼의 재평형이 빠른 시간 내에 이루어지기 때문에 단일 용매나 기울기 용리를 모두 적용.

극성 고정상

Polar functional Group

O Si O H C2H5O Si

OC2H5

OC2H5

(CH2)3 NH2 +

O

O

O Si O Si

OC2H5

OC2H5

(CH2)3 NH2

O

O

비극성 고정상

O Si O H Cl Si

CH3

CH3

(CH2)7 CH3 +

O

O

O Si O Si

CH3

CH3

(CH2)7 CH3

O

O

Partition chromatography

가장 일반적 형태

고정상으로 사용되는 고체 지지체의 표면 액상과 이동상으로 사용되는 액체에 대한 분배력의 차이가 분리를 좌우

고정상은 다공성 지지체에 화학적으로 결합

1. Normal phase (순상 크로마토그래피) 고정상은 이동상보다 more polar 비극성 화합물이 먼저 용출 극성 고정상(Nitrile, Diol, Amino) 2. Reverse phase (역상 크로마토그래피) 비극성 고정상과 극성 이동상 사이의 분배정도 차이 이용 극성 화합물 먼저 용출 비극성 고정상 (C8, C18)

11

역상/순상 비교

역상 순상

적용화합물: 비극성 화합물 극성 화합물

고정상: alkyl-silanes alkyl-amines alkyl-nitriles

Solvent 강도: 극성 비극성 비극성 극성 (이동상)

Reverse Chromatography의 장점

• 상당히 재현성이 좋으며 안정하다.

• 주된 이동상인 물은 값이 싸고 구하기 쉽다.

• 가장 자주 쓰이는 이동상인 methanol, acetonitrile은

세계 어디서나 적정한 순도의 것을 쉽게 구할 수 있다.

• 분리하고자 하는 시료 분자의 소수성 정도에 따라 용리

순서의 예측이 용이하다.

분배 크로마토그래피의 이동상

Solvent

n-Pentane

Carbon Tetrachloride

Chloroform

Dichloromethane

Tetrahydrofuran

Dioxane

Acetonitrile

Methanol

Water

Reverse Phase

Normal Phase

HPLC의 구성 (p. 384)

* 탈기 장치 (Degasser)

* 송액 장치 (Solvent Delivery systems:펌프)

* 시료 주입기 (Injectors)

* 컬럼 (Columns)

* 컬럼 온도 조절기 (Thermostatted Column Compartment)

* 검출기 (Detectors)

탈기장치 펌프 시료 주입기

컬럼 및 컬럼온도조절기

검출기

탈기(Degassing) 1. 목적 : 이동상의 용존 산소, 질소 및

기포 등을 제거한다.

2. 방법 :

* He (N2) sparging

* Vacuum (filtration)

* Ultrasonication

* On-line Degassing

On-line degasser 작동 원리

Special plastic membrane tubing

Solvent reservoir

To pump

Vacuum chamber

송액 장치 :Solvent delivery system(pump)

1. 역할 : 이동상을 이동상 저장용기에서 끌어들여

시료 주입기로 연속적으로 밀어 준다.

2. 요건 : 일정한 유속과 압력을 유지할 것.

다양한 용매를 사용할 수 있을 것.

3. Isocratic 및 Gradient

* Isocratic - 분석시간 동안 이동상 조성의 변화가 없다.

* Gradient - 분석시간 동안 이동상 조성이 시간의 흐름에 따라 변한다.

단일 용매 펌프 (Isocratic pump)

From solvent bottle

Inlet valve

To mixing chamber

To waste

Seal Piston

Ball screw drive

Gear

Motor with encoder

Damper

2 용매 펌프 (Binary Pump)

Pump outlet

Purge valve Mixer Dampe

r

To waste Mixing chamber

Inlet valve

From Solvent bottle

Seal

Piston

Seal

Piston

From Solvent bottle

Inlet valve

Pump head A Pump head B

시료 주입기 (Injectors)

1. 역할 : 분석하고자 하는 시료를 용매의

흐름에 실어 준다.

2. 종류 :

* 수동 (Manual Injection Valve)

* 자동 (Auto Injector)

Injector

수동 시료 주입기 (Manual injector)

Load Position Pump

Column

2 1

6 3

4 5

Sample Loop

Injection Position

Pump

Column

Needle Port

Sample Loop

1 2

3

4 5

6

Needle Port

자동 시료 주입기 (AutoInjector)

From pump

To column

Metering device

6-port valve

Sampling unit

To waste

Vial gripper

컬럼 (Columns)

1. 구성 : 관 모양의 용기에 충진제를 채워서 사용.

분석하고자 하는 시료의 종류에 따라

컬럼의 크기 및 충진제의 종류를 선택하여

사용할 수 있다.

2. 역할 : 혼합 상태의 시료를 화학적/물리적 특성에

따른 머무름 정도의 차이에 의해 분리한다.

컬럼 온도 조절기 (TCC): 분리능 향상 및 분석 결

과의 재현성 보장을 위해 컬럼 온도를 적절하게 설정, 유지한다.

Detectors

1. 역할 : 컬럼에서 분리된 시료가 일정한 간격으로 검출기

를 통과할 때 시료의 존재 및 양을 일정한 규칙에

의해 인식하여 전기적인 신호로 바꾸어 준다.

2. 종류 :

* 가변파장 검출기(Variable Wavelength Detector)

* 다이오드 어레이 검출기(Diode-Array Detector)

* 형광 검출기(Fluorescence)

* 굴절률 검출기(Refractive Detector)

* 전기화학 검출기(electrochemical Detector)

* 전도도 검출기(Conductivity Detector) Fluorescence 10.0%

DAD(UV/VIS) 22.0%

Refractive Index 8.0%

Others 4.0%

UV/VIS(VWD) 43.0%

Electrochemical 7.0% Conductivity 5.0%

Mass spec 1.0%

UV/VIS Detector 검출 원리

Energy

Excitation

S1

S0

Absorbance

1/Energy E S1 = excited electronics state

S0 = ground electronics state

E = excitation energy

검출 원리

Detector Cell

Io I

Log Io

I = A = bc

Io = 입사광의 세기 = 몰 흡광도 I = 투과된 빛의 세기 b = 광로의 길이 A = 흡광도 c = 시료 농도

대표적인 발색단

Chromophore Structure l max(nm)

l max = wavelength of absorption maximum

Amine - NH2 195

Ethylene - C = C - 190

Kethone = C = O 195

Ester - COOR 205

Aldehyde - CHO 210

Carboxyl - COOH 200-210

Nitro - NO2 310

Phenyl 202, 255

Naphthyl 220, 275

Fluorescence Detector검출 원리

Absorption(excitation) Emission

Eo

E*

Eo

E*

E E

Ea = E* - Eo ex) : 빛, 화학 에너지

Ee = E* - Eo ex) : 열, 빛

Refractive Index Detector 검출 원리

Reference compartment

Sample compartment

1

2

n = n1

n2 =

sin2 sin1

Tangent = n1

(n1 - n2)

n : medium 1에 대한 medium 2의 굴절 지수 n1 n2 : medium 1,2 의 굴절 지수 1 2 : medium 1,2에 투사되는 광원의 각도 : reference cell 과 sample cell의 굴절 차이

RID의 기기 구조

From column Sample

Reference 3-way fitting

A

B

A = Normally closed (Flush mode) B = Normally open

To waste

일반 화합물의 비 선택적 검출

고분자 / 당

RID를 이용한 당 분석

Sample Matrix sweets, corn, beverages Column 300 X 7 .8mm, Bio-Rad HPX-87P (80도) Mobile phase Water Detector RID

Conductivity Detector검출 원리

R = KA

1

R : 두 전극간의 전기적 저항 K : 용액의 전도도 A : 전극의 면적 L : 전극사이의 거리 L/A : 검출실 고유 상수

S (or µS) = R

= KA 1

음이온 분석 1. Fluoride (2ppm) 2. Chloride (4ppm) 3. Nitrite (4ppm) 4. Bromide (4ppm) 5. Nitrate (4ppm) 6. Phosphate (ppm) 7. Sulfate (6ppm) Column : Durasep A-1, 100x4.6mm Mobile Phase : 0.68mM NaHCO2/ 0.72mM Na2CO3 in 10% MeOH Detector Suppressed Conductivity

Detector별 특성 Detector 종류 감도 선택성 물질에 따른

적용도(%)

장점/주응용

VWD ng/pg - 80 저비용, 어느정도 일반적

DAD ng/pg ++ 80 피크순도확인/물질확인

Fluorescence pg/fg ++ 10 고감도

Electrochemical pg/fg + >20 고감도

Conductivity ng/pg - 10 이온 분석

Refractive Index ug/ng - 100 일반적/Polymer, 당

Mass

Specrtometer

ng/pg ++ <100 MW & 구조 정보

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이온 교환 크로마토그래피

고정상 음이온 또는 양이온 교환 수지 폴리스티렌 이나 실리카겔 의 표면에 이온성을

가진 물질을 화학적으로 결합

이동상 aqueous/buffer counter ion

대상 시료 이온성 화합물 및 무기 이온류 시료 분리는 pH, 이온세기, 이동상에 포함된 이온 종류에 영향을 받음.

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이온 교환 크로마토그래피의 분리 기전

Strong Cation Exchanger

Polystyrene

or

Silica (CH2 CH2) SO3

- R4 N+

R1

R2

R3

Strong Anion Exchanger

Polystyrene

or

Silica CH2 CH2 CH2 NR3

+ -OOC R

* 시료의 분리는 pH, 이온 세기, 이동상에 포함된 이온 종류의 영향을 받는다.

Size Exclusion (크기 배제)chromatography

• 일정한 크기의 공극을 형성시킨 다공성 polystyrene이나 silica gel을 충진입자로 사용한다.

• 공극의 크기에 따라 분리되는 시료의 분자량대가 다르다.

• 시료의 물리적 특성(크기)에 따른 분리이다.

• 이동상은 고정상에 대해 비활성이며

– 수용성 용매일 경우 GFC (gel filtration -)

– 지용성 용매일 경우 GPC (gel permeation -)

•Thin layer chromatography (TLC) is an important

technique for identification and separation of mixtures

of organic compounds. It is useful in:

• Identification of components of a mixture (using appropriate

standards)

• following the course of a reaction,

• analyzing fractions collected during purification,

• analyzing the purity of a compound.

• In TLC, components of the mixture are partitioned

between an adsorbent (the stationary phase, usually

silica gel, SiO2) and a solvent ( the mobile phase) which

flows through the adsorbent.

THIN LAYER CHROMATOGRAPHY

THIN LAYER CHROMATOGRAPHY

In TLC, a plastic, glass or aluminum sheet is coated

with a thin layer of silica gel.

A very small amount of a solution of the substance

to be analyzed is applied in a small spot with a

capillary tube, ~1cm from the bottom of the

TLC plate

The TLC is developed in a chamber

which contains the developing solvent

(the mobile phase). A truncated filter

paper placed in the chamber serves to

saturate the chamber with mobile phase.

A B CU D

A B CU

filter paper

D

As the mobile phase rises up the TLC

plate by capillary action, the

components dissolve in the solvent

and move up the TLC plate.

Individual components move up at

different rates, depending on

intermolecular forces between the

component and the silica gel stationary

phase and the component and the

mobile phase.

THIN LAYER CHROMATOGRAPHY

The stationary phase is SiO2 and is very “polar”.

More polar analytes interact more strongly with the stationary phase in move

very slowly up the TLC plate.

By comparison, the mobile phase is relatively nonpolar.

More nonpolar analytes interact less strongly with the polar silica gel and more

strongly with the less polar mobile phase and move higher up the TLC plate.

http://www.instructables.com/id/EW1YDCYF4REC0IU/

Once the solvent is within ~1-2 cm of the top of

the TLC sheet, the TLC is removed from the

developing chamber and the farthest extent of

the solvent (the solvent front) is marked with a

pencil.

The solvent is allowed to evaporate from the

TLC sheet in the hood.

The spots are visualized using a UV lamp.

A fluorescent compound, usually Manganese-

activated Zinc Silicate, is added to the adsorbent

that allows the visualization of spots under a

blacklight (UV254). The adsorbent layer will

fluoresce light green by itself, but spots of analyte

quench this fluorescence and appear as a dark spot.

THIN LAYER CHROMATOGRAPHY

http://orgchem.colorado.edu/hndbksupport/TLC/TLCprocedure.html

THIN LAYER CHROMATOGRAPHY - Visualization

As the chemicals being separated may be

colorless, several methods exist to visualize

the spots:

• Visualization of spots under a UV254 lamp. The

adsorbent layer will thus fluoresce light green by

itself, but spots of analyte quench this

fluorescence.

• Iodine vapors are a general unspecific color.

• Specific color reagents exist into which the TLC

plate is dipped or which are sprayed onto the

plate.

• Once visible, the Rf value of each spot can be

determined

Chromatogram of 10 essential oils,

Stained with vanillin reagent.

THIN LAYER CHROMATOGRAPHY Calculation of Rf’s

The Rf is defined as the distance the center of the spot moved divided

by the distance the solvent front moved (both measured from the origin)

A B CU

x xx x

Solvent Front

Origen

Distance solvent

migrated = 5.0 cm

Distance A

migrated = 3.0 cm

Distance B

migrated = 2.0 cm

Distance C

migrated = 0.8 cm0.8 cm

3.0 cm

Rf (A) =

Rf (B) =

Rf (C) =

Rf (U1) =

Rf (U2) =

2.0 cm

5.0 cm= 0.40

= 0.60

= 0.16

= 0.60

= 0.16

3.0 cm

5.0 cm

0.8 cm

5.0 cm

3.0 cm

5.0 cm

0.8 cm

5.0 cm

D

x

Rf (D) = = 0.804.0 cm

5.0 cm

4.0 cm

Rf values can be used to aid in the identification of a

substance by comparison to standards.

The Rf value is not a physical constant, and

comparison should be made only between spots on

the same sheet, run at the same time.

Two substances that have the same Rf value may be

identical; those with different Rf values are not

identical.

THIN LAYER CHROMATOGRAPHY – Rf’s