8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

1/25

Epigenetik modifikasyonlarla

alma yntemleri

www.plantcell.org/cgi/doi/10.1105/tpc.110.tt0110b

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

2/25

Epigenetik modifikasyonlarlaalma yntemleri

DNA metilasyonu bislfitdizileme

Histon modifikasyonu kromatinimmunopresipitasyonu (ChIP)

DNA adenosin metilasyon tayini (DamID)

siRNA retimi derindizileme

TTCGCCGACTAA TTCGCCGAuTAA

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

3/25

Bislfit uygulamassitosin ve metilsitosini ayrr

Bislfit

uygulamas

TTCGCCGACTAA

Uygulamayok

TTCGCCGACTAA

TTCGCCGAuTAA

Metil-sitosin

DNAyabislfituygulandnda,metillenmemisitosinlerurasilednr.Metilsitosinetkilenmez.

O N

NH2

N

~

O N

NH2

N

~

CH3

sitosin 5-metilsitosin

O N

NH2

N

~

CH3

O N

O

N

~urasil 5-metilsitosin

Bislfituygulamas

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

4/25

Bislfit uygulamassitosin ve metilsitosini ayrr

Bislfituygulamas

TTCGCCGACTAA

Uygulamayok

TTCGCCGACTAA

TTCGCCGAuTAA

TTCGCCGACTAA TTCGCCGATTAA

Metil-sitosin

BislfituygulamasndansonraC lerT olarak

okunur veuygulamal veuygulamaszrneklerdefarkldrlar.

Bunakarnmetil-C iseaynirnekteC olarak

okunur.

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

5/25

Kromatin immnopresipitasyonu(ChiP)

DNA nnhistonaaprazbalan

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

6/25

DNA nnhistonaaprazbalan

DNAyufakparalaraayr ve modifiyehistonazgnantikorekle,affinitesaflatrmasile

antikorvebalhistonkompleksiniayr.

Kromatin immnopresipitasyonu(ChiP)

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

7/25

DNA nnhistonaaprazbalan

aprazbalantyyoket, DNAysaflatrvePCR,dizileme veyamikroarrayileanalizyap.

Kromatin immnopresipitasyonu(ChiP)

DNAyufakparalaraayr ve modifiyehistonazgnantikorekle,affinitesaflatrmasileantikorvebalhistonkompleksiniayr.

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

8/25

DNA adenin metilasyonu ID(DamID)

Dammetilaz(E.Coliden)

lgilenilenprotein

(rn. LHP1)

Birfsyonproteini Dam veilgilenilenbirprotein

Fsyonproteinikromatininseilenblgesine(rn.H3K27me3) balanrve GATCblgesiyaknndaki metiller.adeninleri

Dam biradeninemetiltransferaz veGATC dizizgllvardr.

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

9/25

Metilasyon metilasyona duyarlenzimlerle tanmlanabilir.

Balanmablgesi

yaknndakiyer

RNOLUUR

GATC

DpnIIrestriksiyonendonukleazsindirimi

(metilasyonduyarl)

GATC GATC

PCRamplifikasyonu

GATCGATC

RN YOK

Balanmablgesi

yaknndaolamayan

yer

GATC

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

10/25

Derin dizilemegelecek generasyonDNA dizileme yntemleri

Klasik DNAdizileme Bir

seferdebirmolekldizilenir.

GelecekgenerasyonDNA dizileme one

milyonlarca moleklbirseferdedizilenir.

Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE copyright 2005. Margulies, M., et al., ( 2005)

Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437: 376-380.

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

11/25

Klasik DNA dizileme

Fluorescently-labeledddNTPs

Primer 5CCGGTTAATemplate strand 3GGCCAATTAAGCGGCTGATT

G

T

A

C

Base

DrtstandartdNTPs

+

+

+ DNA Polimeraz

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

12/25

Klasik DNA dizileme

Primer 5CCGGTTAATemplate strand 3GGCCAATTAAGCGGCTGATT

Primer 5CCGGTTAATTemplate strand 3GGCCAATTAAGCGGCTGATT

Primer 5CCGGTTAATTCTemplate strand 3GGCCAATTAAGCGGCTGATTT

DNA polimeraz etiketlenmemidNTPlere veyaetiketliddNPTlerebalanr,sonutaetiketlifarklboyutta moleklleroluur.

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

13/25

Klasik DNA dizileme

Detektr

Laser

DNA

molekllerielektroforezile

ayrlr.

TTCGCCGACTAA

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

14/25

Gelecek generasyon dizilemeyntemleri: Pyrodizileme

PyrodizilemedeetiketlinuklotidlerveddNTPlerkullanlmaz.

Pyrophosphatenukleotideklenmesiileaa karvesubstrat...

Primer 5CCGGTTAATemplate strand 3GGCCAATTAAGCGGCTGATT

Primer 5CCGGTTAATTemplate strand 3GGCCAATTAAGCGGCTGATT

T

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

15/25

Pyrodizileme - Kimya

PYROPOSFAT

+ Adenosin5posfatsulfat ATP

....veya ATP

sufurilaz, ATPOluturur....

ATP Sulfurilaz

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

16/25

Pyrodizileme - Kimya

+PYROFOSFAT

Adenosin5fosfatsulfat ATP

ATP luciferaztarafndankuyarmntetikler.

+

ATP

Luciferin

LUCIFERAEZ

Ikoluumu

ATP Sulfurilaz

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

17/25

Pyrodizileme - Kimya

T

T

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

18/25

Pyrodizileme datadeerlendirilmesi

dTTP

dTTP

Reaksiyonyok

5CCGGTTAA

3GGCCAATTGAGC....

5CCGGTTAAT

3GGCCAATTACGA...

PPi ATP

dNTPseklenirve

eklenmekoluumuileizlenir.

BRNCDNG

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

19/25

Pyrosequencing datadeerlendirilmesi

dCTP

dCTP

5CCGGTTAAC

3GGCCAATTGAGC....

5CCGGTTAAT

3GGCCAATTACGA...

KNC DN

PPi ATP

NoReaction

dNTPseklenirve

eklenmekoluumuileizlenir.

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

20/25

Pyrodizileme datadeerlendirilmesi

dTTP dGTP dCTP dATP dTTP dGTP dCTP dATP

TIME

AG

AC

Herbirnoktadan

koluumu(flowgram) DNAdizileriniaklar.

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

21/25

A pyrodizileme flowgram

Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE copyright 2005. Margulies, M., et al., ( 2005)

Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437: 376-380.

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

22/25

Dier gelecek generasyondizileme yntemleri

Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE Biotechnology Copyright 2008.

Shendure, J., and Ji, H. (2008) Next-generation DNA sequencing. Nature Biotech. 26: 1135-1145.

highthroughput, vemassiveparallelismyntemler igcn vekimyasalkullanmnazaltmaktadrlar.

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

23/25

Gelecek generasyon dizileme ile ,epigenetik modifikasyonlar da tmgenom dzeyinde incelenebirler:

EPGENOMK

KasschauKD, Fahlgren N, Chapman EJ, Sullivan CM, Cumbie JS, et al. 2007 Genome-Wide Profiling and Analysis ofArabidopsis siRNAs. PLoS Biol 5(3): e57.

Zhang, X., Clarenz, O., Cokus, S., Bernatavichute, Y.V., Pellegrini, M., Goodrich, J., Jacobsen, S.E. (2007) Whole-genome analysis of histone H3 lysine 27

trimethylation inArabidopsis. PLoS Biol. 5: e129.

AbundanceofsiRNAs

GREEN =H3K27me3PURPLE =

methylcytosine

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

24/25

Zilbermanandhenikoff(2007) Development134, 3959

8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)

25/25

Epigenetik/Epigenomik

http://www.nature.com/jid/journal/v125/n2/extref/5603467x1.jpg

ChIP-chip