GenHort: Modulo B10 Metodi di selezione genomica in ... lezione 2.pdf · genetica in zucchino Modulo B.10 GENHORT: Metodi di selezione genomica in zucchino I moderni strumenti della

Metodi di selezione genomica in zucchino

Dott.ssa Formisano Gelsomina

Modulo B.10 GENHORT: Metodi di selezione genomica in zucchino

GenHort: Modulo B10


Programma 30-4-14 Lo zucchino: origine, gruppi varietali, risorse genetiche, miglioramento genetico e metodi di selezione 6-5-14 Strumenti di analisi genomica: analisi della diversità genetica in zucchino usando marcatori molecolari 8;13-5-14 Mappe genetiche e popolazioni di mapping (magic population) 15-5-14 Sistema CRISPR/CAS in pianta (Dott. Paolo Ioviene) e lettura paper 19-5-14 Discussione paper e test finale 20-5-14 Visita azienda la Semiorto Sementi srl e campi /serre di zucchino

Strumenti di analisi genomica

Un settore di notevole interesse e grandi potenzialità è quello dell’analisi del genoma basata sulla rilevazione di marcatori molecolari. Si tratta di un settore in rapida evoluzione che si avvantaggia da una parte dello sviluppo di tecnologie sempre più sensibili ed affidabili e dall’altro della conoscenza sempre più approfondita della struttura, organizzazione e funzione degli acidi nucleici. Un MARCATORE MOLECOLARE può essere definito come quel locus genomico che, in virtù della sua presenza, contraddistingue in modo caratteristico ed inequivocabile il tratto cromosomico con il quale si identifica.



Vantaggi dei Marcatori molecolari:

1. Non subiscono interferenze da parte dell’ambiente

2. Coprono qualsiasi parte del genoma trascritta o non (quindi anche introni e regioni di regolazione), e consentono pertanto di rilevare differenze anche tra individui geneticamente molto simili ma distinguibili fenotipicamente

3. Non presentano effetti epistatici o pleiotropici

4. In molti casi hanno espressione codominante consentendo di distinguere l’eterozigote dagli omozigoti


Modulo B.10 GENHORT: Metodi di slezione genomica in zucchino

Strumenti di analisi genomica Essi si distinguono per il tipo di sequenze analizzate e/o per il tipo di

tecnica impiegata

Schema sinottico delle principali classi di marcatori molecolari utilizzabili per l’analisi del genoma. La classificazione adottata si basa sulla tecnologia utilizzata (SBH-Southern Blot Hybridization o PCR, Polymerase Chain Reaction) e sul numero di loci saggiati (single-locus o multi-locus).


L’Uso dei Marcatori molecolari in campo vegetale:

1. Caratterizzazione della variabilità genetica 2. Tipizzazione ed identificazione varietale 3. Costruzione di mappe genetiche 4. Mappaggio genetico 5. Selezione assistita (MAS)



L’Uso dei Marcatori molecolari in campo vegetale:

1. Caratterizzazione della variabilità genetica 2. Tipizzazione ed identificazione varietale 3. Costruzione di mappe genetiche 4. Mappaggio genetico 5. Selezione assistita (MAS)


Caratterizzazione della variabilità genetica

Per iniziare un lavoro di miglioramento genetico dello zucchino è importante conoscere la natura della diversità genetica all’interno e tra i diversi gruppi della specie C. pepo. Tale studio consente: 1. L’analisi della variabilità genetica all’interno e tra diversi gruppi di cv 2. L’identificazione delle stesse 3. L’introgressione di geni utili dal germoplasma disponibile alle specie coltivate 4. La ricostruzione della storia evolutiva e del processo di domesticazione delle specie e la definizione delle distanze genetiche tra di esse


5.  Di individuare popolazioni di origine al fine di generare appropriate linee e produrre ibridi superiori massimizzando l’espressione di eterosi. Si assume che la superiorità della combinazione ibrida è maggiore se i due genitori sono geneticamente più distanti (Hallauer e Miranda 1988).

Caratterizzazione della variabilità genetica


Per lo studio dei polimorfismi sono stati utilizzati diversi marcatori come RFLP, RAPD, AFLP e SSR.

Caratterizzazione della variabilità genetica in zucchino


Al fine di identificare e caratterizzare una popolazione utile a generare parentali che potrebbero produrre ibridi superiori

1.  Reperimento di una collezione di germoplasma di zucchino e

sua caratterizzazione morfologica 2.  Analisi molecolare con AFLP, SSR, RAPD



Reperimento di germoplasma Gruppo Accessione Resistenza/ Ditta sementiera o

tolleranza referenza Cocozelle GS2386 F1 PM, ZYMV Syngenta Cocozelle Ortolana di Faenza -- La Semiorto Sementi Cocozelle Lungo Bianco -- La Semiorto Sementi Cocozelle San Pasquale -- La Semiorto Sementi Cocozelle Alberello Sel. Valery -- La Semiorto Sementi Cocozelle Lungo Fiorentino -- La Semiorto Sementi Cocozelle Romanesco -- La Semiorto Sementi Cocozelle Bianca di Trieste -- La Semiorto Sementi Cocozelle Altea F1 -- Syngenta

Vegetable Marrow Carisma F1 PM, ZYMV Syngenta Vegetable Marrow Tonya F1 ZYMV Syngenta

Zucchini Afrodite F1 CMV, WMV, ZYMV Syngenta Zucchini Giove F1 WMV, ZYMV Petoseed

Zucchini Mikonos F1 PM, CMV, WMV, ZYMV Syngenta Zucchini Nano Verde di Milano -- La Semiorto Sementi

Zucchini Quine F1 PM, CMV, WMV, ZYMV Syngenta Zucchini True French -- Thompson & Morgan Zucchini Panter F1 PM, CMV, PRSV, ZYMV Peotecseed Zucchini ZU1805 F1 PM, CMV, WMV, ZYMV Peotecseed Zucchini President F1 -- La Semiorto Sementi Zucchini Diamant F1 -- La Semiorto Sementi Zucchini Obsidian F1 PM, ZYMV -- Zucchini 381e ZYMV Paris and Cohen, 2000 Zucchini 968Rb PM Cohen et al., 2003 Pumpkin Tondo di Piacenza -- La Semiorto Sementi Pumpkin Tondo chiaro di Nizza -- La Semiorto Sementi

Sono state reperite 57 cv. di zucchino suddivise in: •  10 varietà (Italia)

•  3 linee (Israele)

•  13 ibridi commerciali



Ø  Sono state ottenute dal Dott. H.S. Paris del Centro di Ricerca Newe Ya’ar, Israele i semi:

1.  linea inbred della cv. True French 2.  linea isogenica (BC6F4) della cv.True French resistente all’oidio (Sf)

(968Rb) (Cohen e al. 2003) 3.  linea isogenica (BC6F10) della cv.True French resistente allo ZYMV

(381e) (Paris e Cohen 2000)

Reperimento di germoplasma

•  31 varietà

(Spagna)

Gruppo Codice Origine Cocozelle A CU 2 Sarrión;Teruel Cocozelle AN CU 75 Cabra;Córdoba Cocozelle C CU 9 Torelló;Barcelona Cocozelle V CU 74 Valencia Cocozelle V CU 116 Giraba;Castellón Cocozelle V CU 185 Cañada;Alicante Cocozelle PAS 15834 viver, castellon

Vegetable marrow A CU 12 Quicena;Huesca Vegetable marrow AFR CU 12 Khmelat

AN CU 23 Ronda dirección Arriate;Málaga Vegetable marrow AN CU 113 Beires;Almería Vegetable marrow CL CU 19 Hontalbilla;Segovia Vegetable marrow CL CU 21 Simancas;Valladolid Vegetable marrow CM CU 32 Mariana;Cuenca Vegetable marrow CM CU 47 Almodóvar del Campo;Ciudad Real Vegetable marrow V CU 10 Utiel;Valencia Vegetable marrow 949 Mondéjar;Guadalajara Vegetable marrow V 21 / Vegetable marrow AN CU 27\1 algeciras direccion el riconcillo cadiz

Zucchini A CU 13 Quicena;Huesca Zucchini E CU 27 Madrigal de la Vera;Cáceres Zucchini MU CU 16 Ñorica.Totana;Murcia Zucchini MU CU 20 Altobordo.Lorca;Murcia Zucchini BBC6 / Zucchini E CU 10 Garganta; caceres Zucchini E CU 227 / Pumpkin PJI 71628 / Pumpkin Styrian / Acorn BGU 8238 /

Crookneck NSL 5227 / Scallop V CU 196 /

Reperimento di germoplasma

Caratterizzazione morfologica

6 Caratteri •  portamento

•  ramificazioni •  incisioni fogliari

•  chiazze argentee sulle foglie •  forma frutto •  colore frutto

Caratterizzazione morfologica

cultivar Portamento Ramificazioni Incisioni Chiazze Forma frutto

Colore frutto

eretto Semi

strisciante strisciante assenti presenti lievi medie profonde assenti presenti cilindrica clavata tonda verde crema Italiane + Israeliane 22 3 1 19 7 2 11 13 10 16 21 3 3 23 3

Spagnole 4 15 7 4 23 7 16 4 8 19 16 8 3 18 6


Al fine di identificare e caratterizzare una popolazione utile a generare parentali che potrebbero produrre ibridi superiori

1.  Reperimento di una collezione di germoplasma di zucchino e

sua caratterizzazione morfologica 2.  Analisi molecolare con AFLP, SSR, RAPD



I moderni strumenti della genetica molecolare e della genomica contribuiscono agli studi della diversità genetica, permettendo di affiancare ai dati tradizionalmente usati, quali dati morfologici, quelli dei marcatori molecolari del DNA che sono estremamente informativi.

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

Procedura per la rilevazione di marcatori AFLP comprendente la digestione del DNA con due distinti enzimi di restrizione, la ligazione di adattatori, la pre-amplificazione e l’amplificazione finale con primer aventi una o più basi selettive.

Vantaggi • Sono marcatori altamente polimorfici e potenti per studi intraspecifici • Sono riproducibili • E’ una tecnica facile ed i primer sono standard Svantaggi • La procedura è lunga • Spesso i risultati sono difficili da analizzare • E’ una tecnica costosa



RAPD Random Amplified Polymorphic DNA Una semplice PCR con un solo primer (normalmente di 10 basi) di sequenza casuale

Vantaggi •  E’ una metodica facile e veloce • Alto polimorfismo • Occorrono solo piccole quantità di DNA •  Permette di individuare e caratterizzare tramite il sequenziamento utili marcatori a partire dal prodotto RAPD (bande) Svantaggi • Sono marcatori dominanti •  Problemi di riproducibilità • Comigrazione di frammenti


SSR Simple Sequence Repeat o Microsatelliti

Polimorfismo determinato dal diverso numero di basi ripetute

Vantaggi degli SSR • Altamente polimorfici e particolarmente adatti alla tipizzazione genotipica e all’identificazione varietale • Codominanti •  Alta riproducibilità

Svantaggi degli SSR • Sono necessarie informazioni sulla sequenza per poter disegnare i primer nelle zone fiancheggianti ed i procedimenti per ottenerle sono molto dispendiose e lunghe • Di solito è necessario testare librerie genomiche per individuare e caratterizzare i loci microsatellite per quelle specie oggetto di studio

Analisi a livello molecolare: AFLP

Sono state analizzate 17 linee tra i diversi ibridi, le varietà standard e le tre linee isogeniche con 4 combinazioni di primer

Primer N° totale di bande

% di bande polimorfiche

N° totale di bande accessioni-specifiche

E-AGC M-CAG 126 98 28 E-AGC M-CAC 217 100 45 E-ACT M-CAT 154 98 15 E-ACT M-CAC 147 94 19

Totale 644 -- 107 Media 161 97 27

I diversi profili AFLP sono stati confrontati e i polimorfismi sono stati designati con 1 (presenza del frammneto) o con 0 (assenza dei frammenti)

Analisi a livello molecolare

•  L’analisi della variabilità genetica prevede la stima di particolari coefficienti di similarità genetica (SG) o dissimilarità genetica (DG).

• A tal fine, i dati relativi all’insieme dei marcatori molecolari raccolti nel campione di individui in esame sono utilizzati per costruire le matrici di similarità o dissimilarità, calcolando i coefficienti relativi in tutte le possibili combinazioni a coppia tra tutti gli individui di una popolazione

•  I coefficienti di similarità utilizzabili a tale scopo sono molteplici.

•  In tutti i casi, un valore di similarità pari a 1 indica completa identità tra la coppia di individui considerati mentre un valore uguale a 0 completa diversità.


Analisi a livello molecolare: AFLP

La similarità genetica tra le diverse accessioni è stata ottenuta usando il coefficiente simple matching (SoKal e Michener 1958)


Analisi a livello molecolare

•  Le matrici sono necessarie per condurre le analisi di raggruppamento attraverso la costruzioni dei dendrogrammi. •  I metodi di costruzione dei dendrogrammi si possono classificare in due famiglie: quelli basati su matrici di distanza e quelli basati sulla condivisione dei caratteri.

•  Nel primo caso si calcola separatamente la distanza fra tutte le possibili coppie di specie (i metodi di calcolo della distanza sono molteplici): UPGMA e Neighbor Joining

•  Nel secondo caso i caratteri che sono condivisi da una o più specie vengono inclusi nell’analisi uno alla volta e danno luogo ad una gerarchia di ramificazioni senza che si passi attraverso il calcolo di una distanza


Analisi a livello molecolare:AFLP •  Nel nostro caso, è stato costruito un albero filogenetico con neighbour-joining usando il programma PHYLIP 3.62 (Felsenstein 1993).

•  Con l’approccio dell’algoritmo neighbour-joining si inizia con un albero a stella in cui tutte le branche sono della stessa lunghezza, e le diramazioni vengono poi risolte una alla volta. Il risultato finale è un dendrogramma in cui la lunghezza di ciascuna branca è proporzionale alla distanza media di ciascuna specie da tutte le altre.

•  tale algoritmo è considerato un buon compromesso fra velocità di calcolo e accuratezza del risultato



Dendogramma: I codici dei nomi presentano le doppie lettere riferite al gruppo di appartenenza e le triple riferite all’accessione. I numeri ai nodi sono i valori bootstrap (%).

AFLP

Analisi a livello molecolare: SSR

1.  Sono state analizzate mediante 60 SSR:

•  10 varietà standard di derivazione italiana •  31 varietà di derivazione spagnola •  5 ibridi commerciali

2.  Sono stati utilizzati 30 SSR-EST e 30 SSR genomici


SSRg Primer Gruppo

di linkage

N° alleli attesi

N° alleli

osservati

% di alleli

polimorfici

N° di alleli acces.

specifici

motivo N° ripetiz. SSR

dimensioni attese (bp)

dimensioni osservate + coda (bp)

CMTp193 1 5 2 100 0 ga 18 186 177-200 CMTp98 2 3 6 100 1 aag 9 213 224-255 CMTp131 3a 3 3 100 0 ccg 7 117 109-135 CMTp187 3b 3 2 100 0 cag+caa 6+4 189 200-300 CMTp63 4 3 4 100 0 ttc 10 152 145-175 CMTp88 5 5 3 100 0 tc 12 167 178-197

CMTp235 5 6 9 100 3 gtt 12 148 145-200 CMTp256 6 2 3 66 0 atc 5 154 175-200 CMTp224 6 5 3 100 0 caa 7 151 169-175 CMTp248 7 4 1 0 0 gga 5 154 145-200 CMTp142 8 7 6 100 0 tc 12+5 158 145-240 CMTp257 9 3 5 100 1 cgt 11 138 100-200 CMTp58 9 2 1 100 0 ga+t 6+10 102 100 CMTp145 10a 4 4 100 1 cat 7 100 117-128 CMTp66 10a 3 4 100 2 gaa 9 128 120-175

CMTp260 11 4 4 100 0 cat 7 155 140-174 CMTp245 11 5 3 100 0 gcg 9 134 100-200 CMTp36 12 3 4 100 1 aac 5 151 164-185 CMTp69 13 3 4 100 1 tatt 4 70 77-92 CMTp176 14 4 4 100 2 tc 12 111 100-145 CMTp33 14 4 3 100 0 gaa 3+4 171 189-210 CMTp86 15 3 3 66 0 cca 9 133 151-192 CMTp169 15 2 4 100 1 gaa 11 158 175-200 CMTp231 16 9 -- -- -- ag 38 170 -- CMTp208 17 2 4 100 0 gtt 5 117 133-136 CMTp209 17 3 3 100 0 gtt 6 116 100-145 CMTp183 18 3 5 100 0 cat 6 196 216-303 CMTp188 18 2 4 100 0 cat 7 147 145-350 CMTp132 19 4 5 100 1 gat 12 151 145-200 CMTp47 20 3 3 66 0 ag 9 154 165-173

Totale 109 -- 14 Media 3,6 90 0,5

Primer N° alleli

% di alleli

polimorfici

N° di alleli acces.

specifici

motivo N° ripetiz. SSR

dimensioni (bp)

funzione genica

CUTC022867 5 100 1 cag 8 145-175 nascent polypeptide-associated complex (NAC) domain containing protein

CUTC010796 -- -- -- tct 8 -- eukariotic initiation factor iso4E (cucumis melo)

CUTC008409 3 100 0 tgc 8 120-145 protein binding CUTC004991 4 100 0 agc 7 175-200 aconitate hydratase, cytoplasmatic, putative

CUTC009607 4 100 0 ctt 11 145-200 Os07g0573400 (oryza sativa)

CUTC004158 2 100 0 gaa 7 200-204 ABC-type Co2+ transport system, permease component (Zea mays)

CUTC004399 3 100 0 cgt 7 175-200 hypothetical protein (Vitis vinifera)

CUTC004782 2 100 0 cct 8 175-200 Hypothetical protein CUTC008659 1 0 0 gaa 7 241 NDH-dependent cyclic electron flow 1

CUTC006703 2 100 0 ggt 7 145 UV-B-insensitive 4 CUTC018879 2 100 0 ctt 7 175-200 Hypothetical protein (Vitis vinifera)

CUTC012342 2 100 0 gaa 7 200-204 Hypothetical protein CUTC009316 2 100 0 cag 7 320 RNA binding CUTC009760 2 100 0 caa 7 179 EIN3- like protein (Cucumis melo) CUTC008419 -- -- -- ctt 6 -- zinc finger (C2H2 Type) family protein CUTC023363 2 50 1 agc 7 264 glycine-rich protein

Totale 84 -- 5 Media 2,8 83 0,2

SSR-EST

SSR

Dendrogramma derivato dall’analisi di 48 accessioni di Cucurbita, basata su 193 bande SSR. I numeri ai nodi sono i valori bootstrap.

Sono state analizzate 17 linee tra i diversi ibridi, le varietà standard e le tre linee isogeniche con 7 primer

Analisi a livello molecolare: RAPD

Primer N° totale

di bande


N° di bande accessioni specifiche

OPAA17 15 47 2 OPG02 13 69 1 OPK15 17 70 0 OPN20 11 36 0 OPV20 14 86 0 OPAJ03 15 100 0 OPM03 19 58 0 Totale 104 -- 3 Media 14 66 0,4


codici linee M 1 5 6 7 14 2 3 4 8 9 19 20 21 22 M 1kb

0.65

M 1 5 6 7 14 2 3 4 8 9 19 24 25 26 20 21 22 M

1.2

1Kb

codici linee

OPAA17 OPAJ03

Analisi a livello molecolare: RAPD

Profilo elettroforetico RAPD


Analisi a livello molecolare:

AFLP-SSR-RAPD

Marker N° totale di bande


N° di bande accessioni specifiche

AFLP 161 97 27 SSR 3,2 87 0,3 RAPD 14 66 0,4



AFLP-SSR-RAPD


•  Il valore informativo di ogni marcatore può essere valutato basandosi sul suo valore PIC (Polymorphic Information Content).

•  Si basa sul calcolo del numero di alleli (o bande) che un marcatore ha e la frequenza di ciascuno di questi alleli nel germoplasma studiato.

• I marcatori con pochi alleli (o bande) hanno meno potere di distinguere i diversi genotipi che costituiscono il germoplasma

• Sono preferiti i marcatori che posseggono un elevato valore PIC.

Analisi a livello molecolare: PIC


•  La formula è :


AFLP-SSR-RAPD

•  L’analisi con i marcatori molecolari ha permesso di valutare la variabilità genetica e le relazioni genetiche presenti tra le diverse accessioni ma anche lo stadio di introgressione di caratteri di interesse e fornire possibili vie per superare le difficoltà di introgressione

•  Confrontando le potenzialità dei tre metodi molecolari: gli AFLP e gli SSR sono più efficienti nel rilevare polimorfismi, nell’automazione del sistema, nell’interpretazione dei dati e nella loro riproducibilità


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